CN117651547A

CN117651547A - 个性化疫苗施用

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Publication number: CN117651547A
Application number: CN202280048504.3A
Authority: CN
Inventors: 坂口奈央树; 山下邦彦; 寺居和宏
Original assignee: Daicel Corp
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2022-07-06
Publication date: 2024-03-05
Also published as: EP4366693A1; WO2023281418A1

Abstract

本文提供了一种制造针对受试者个性化的封装疫苗的方法。还提供了一种向受试者施用个性化疫苗的方法。进一步提供了一种注射器，该注射器具有点火器和可拆卸药筒。

Description

个性化疫苗施用

背景技术

目前疫苗学的医疗实践是在没有禁忌症的情况下，向人群中的每个人普遍施用同一套疫苗，这种方法有几个假设。这些假设之一是基本上每个人都将以同一免疫学方式通过发展保护性水平的抗体或细胞介导的免疫性来反应，其中相关副作用的发生率几乎不存在。这种方法的主要缺点是它忽略了疾病风险免疫应答的个体差异和反应原性的任何遗传倾向，以及产生免疫性所需剂量的差异。同时，免疫学、遗传学、分子生物学和生物信息学的进展已经证明了治疗药物选择和给药的个性化方法的价值。

此外，基因组学和蛋白质组学的最新进展集中于患者中与疾病相关的突变。例如，肿瘤突变组已经揭示了每个肿瘤具有一组独特的“驱动”突变和“乘客”突变。这些观察为个性化治疗提供了独特的机会。表达突变蛋白诸如新抗原的肿瘤细胞在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下递呈这些新表位。与肿瘤相关抗原(其表达在健康细胞和肿瘤细胞中共享)相反，新抗原由肿瘤中的突变产生，因此完全受限于肿瘤细胞。因此，利用丰富的基因组学和蛋白质组学数据来开发基于与疾病相关的突变的个性化策略的免疫疗法使得能够高度特异性地靶向参与疾病的细胞，而不会危及健康组织并且不会受到免疫耐受机制的限制。

非病毒基因递送为基于病毒载体的疫苗的局限性提供了潜在的解决方案，如在过去几十年开发的优化的基于DNA的基因递送系统的报道所例证的。经由肌内、皮内或静脉内途径在小鼠中直接注射裸DNA质粒使得能够分别将目的基因转染到肌肉、皮肤和肝组织中，但是裸DNA的体内转染效率受到其化学不稳定性、对核酸酶攻击的易感性、快速清除和向局部淋巴结的无效递送的限制。阳离子脂质已经广泛用于与DNA形成脂质体复合物以增加转染，并且新递送系统诸如透皮贴剂可增强DNA质粒向皮肤固有树突细胞的靶向递送。特别是对于基于mRNA的疫苗，mRNA的化学不稳定性和低转染效力仍然是治疗效力的主要障碍，并且裸mRNA的体内递送仍然具有挑战性。

发明内容

为了解决DNA、RNA、肽或其疫苗的不稳定性问题，在一个方面，本公开提供了一种制造针对受试者个性化的封装疫苗的方法，该方法包括合成包含DNA、RNA或肽的疫苗，以及将该疫苗封装在药筒中，该药筒被配置为被装载到注射器。

在另一个方面，本公开还提供了一种向受试者施用个性化疫苗的方法，该方法包括根据本文所公开的方法制造针对受试者个性化的封装疫苗，将药筒装载到注射器，以及从注射器向受试者注射个性化疫苗。

在另一个方面，本公开进一步提供了一种治疗或改善受试者与突变相关的疾病的方法，该方法包括根据本文所公开的方法向该受试者施用个性化疫苗。

在另一个方面，本公开还提供了一种注射器，该注射器包括点火器和可拆卸药筒。在一些实施方案中，可拆卸药筒被配置为容纳包含DNA、RNA或肽的疫苗。在另一个方面，本公开提供了注射器用于根据本文所述的方法向受试者施用个性化疫苗的用途。在另一个方面，本公开提供了注射器用于根据本文所述的方法治疗或改善受试者的肿瘤的用途。

附图说明

图1A和图1B是示出示例性注射压力转变的图。

图2是示出与粉末燃烧相关的燃烧压力、施加到密封的定量液体的压力、注射压力的相应转变的图。

图3描绘了通过本文所述的注射，基因表达增强对GFP编码的裸mRNA的影响。

图4描绘了通过本文所述的注射对Luc编码的裸mRNA的基因表达增强效果。

图5A和图5B是示出第一另选注射压力转变的图。

图6A和图6B是示出第二另选注射压力转变的图。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本公开的示例性实施方案。然而，本公开不限于以下公开的实施方案，但是可以各种形式实施。对以下实施方案进行描述是为了使所属领域的技术人员能够体现并实践本公开的实施方案。

定义

尽管术语第一、第二等可用于描述各种元素，但这些元素不受这些术语限制。这些术语仅用于将一个元素与另一个元素区分开来。例如，在不脱离示例性实施方案的范围的情况下，第一元素可被称为第二元素，并且类似地，第二元素可被称为第一元素。术语“和/或”包括相关联的列出的项目中的一者或多者的任何和所有组合。

本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制示例性实施方案。除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式。

以上所用的术语“含有”、“具有”、“包括”和/或“包含”指定所陈述的特征、整体、步骤、操作、元素、部件和/或其群组的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元素、部件和/或其群组的存在或添加。本文所用的所有术语(包括技术和科学术语)可具有与本发明技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非上下文另有明确指示，否则预定义的常用术语可具有与相关技术的上下文含义相同或类似的含义，并且不以理想或过于正式的意义来解释。

如本文所用，术语“约”意指修饰例如核苷酸序列的长度、误差程度、尺寸、组合物中成分的量、浓度、体积、处理温度、处理时间、产率、流速、压力等值以及它们的范围，是指例如通过用于制备化合物、组合物、浓缩物或使用制剂的典型测量和处理程序，通过这些过程中的疏忽错误，通过用于实施这些方法的起始物质或成分的制造、来源或纯度的差异，以及类似考虑可能发生的数值的变化。术语“约”还包括由于例如具有特定初始浓度或混合物的组合物、制剂或细胞培养物的老化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。无论是否用术语“约”修饰，所附权利要求书包括这些量的等同物。术语“约”还可指与所陈述参考值类似的值的范围。在某些实施方案中，术语“约”是指落入所陈述参考值的50％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值的范围。

概述

下文将参考附图详细描述本公开的示例性实施方案。为了帮助理解本公开，贯穿附图的描述，相同的数值指代相同的元素，并且将不重复对相同元素的描述。

在一个方面，本公开提供了一种制造针对受试者个性化的封装疫苗的方法，该方法包括合成包含DNA、RNA或肽的疫苗，以及将该疫苗封装在药筒中，该药筒被配置为被装载到注射器。

术语“疫苗”意指诱导或改善针对特定疾病的免疫性的生物制剂。通常，疫苗包含常规盐水或缓冲水溶液介质，本发明的组合物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组合物可方便地用于预防、改善或以其他方式治疗疾病或病症，诸如感染。在引入宿主后，疫苗能够激发免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或CD8+T细胞、抗原递呈细胞、CD4+T细胞、树突细胞的活化和/或其他细胞应答。

在某些实施方案中，封装疫苗可意指疫苗处于容器中，并且容器可以是密封的药筒，该药筒可随后连接至将疫苗注射到受试者的注射器。在某些实施方案中，“个性化”在本文中可意指疫苗针对特定受试者定制，并且药筒被标记或组织以使得药筒中的疫苗可递送至特定受试者。术语“药筒”意指被配置用于可拆卸地安装在注射器中的注射器的元素。在某些实施方案中，注射器的移动部件的机械移动在药筒之外(即外部)控制药筒的操作。在另外的实施方案中，药筒包括阀的线性布置，该阀与孔口相关联，注射器的另一个部分可通过用针刺穿药筒的膜分离元素或通过气密连接而附接到该孔口。阀可具有与注射器的对应可移动手柄配合的凸对凸部件连接。当药筒被附接到注射器时，手柄的外旋可控制阀的打开或闭合。

在某些实施方案中，本文的封装疫苗可仅在施用时密封和打开。在一些实施方案中，疫苗从合成直接封装在药筒中。在一些实施方案中，药筒是真空的。

在某些实施方案中，本文所述的疫苗中的DNA、RNA或肽是DNA。在某些实施方案中，本文所述的疫苗不包含DNA，并且疫苗不是DNA溶液。

DNA是脱氧核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧-腺苷-单磷酸酯、脱氧-胸苷-单磷酸酯、脱氧-鸟苷-单磷酸酯和脱氧-胞苷-单磷酸酯单体，它们本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸酯部分组成，并且聚合形成特征性的主链结构。主链结构通常由第一相邻单体的核苷酸的糖部分(即脱氧核糖)和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序，即与糖/磷酸酯主链连接的碱基的顺序，被称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对。

在某些实施方案中，本文所述的DNA、RNA或肽是RNA。RNA可选自小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及它们的混合物。

在某些实施方案中，本文所述的DNA、RNA或肽是肽。肽或多肽通常是通过肽键连接的氨基酸单体的聚合物。它通常含有少于50个单体单元。然而，术语肽不排除具有多于50个单体单元的分子。长肽也被称为多肽，通常具有50至600个单体单元。

在某些实施方案中，本文所述的DNA、RNA或肽是RNA。RNA是核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是沿所谓的主链彼此连接的腺苷-一磷酸、尿苷-一磷酸、鸟苷-一磷酸和胞苷-一磷酸单体。主链由第一相邻单体的糖(即核糖)和第二相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定序列被称为RNA序列。通常，RNA可通过DNA序列的转录获得，例如在细胞内部。在真核细胞中，转录通常在核或线粒体内进行。在体内，DNA的转录通常产生所谓的未成熟RNA，其必须被加工成所谓的信使RNA，通常缩写为mRNA。未成熟RNA的加工，例如在真核生物中，包括多种不同的转录后修饰，诸如剪接、5'-加帽、多腺苷酸化、从细胞核或线粒体输出等。这些过程的总和也被称为RNA的成熟。成熟信使RNA通常提供可被翻译成特定肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。通常，成熟mRNA包含5'-帽、5'-UTR、开放阅读框、3'-UTR和聚(A)序列。除了信使RNA之外，还存在几种非编码类型的RNA，其可能参与转录和/或翻译的调节。

在某些实施方案中，本文所述的DNA、RNA或肽是mRNA。mRNA可编码任何目的肽，包括任何天然或非天然存在的或以其他方式经修饰的肽。由mRNA编码的肽可以是任何大小，并且可具有任何二级结构或活性。在另外的实施方案中，由mRNA编码的肽当在细胞中表达时可具有治疗效果。本文所述的RNA或mRNA可包括编码目的肽的连接的核苷的第一区(例如，编码区)、位于第一区的5'末端的第一侧翼区(例如，5'-UTR)、位于第一区的3'末端的第二侧翼区(例如，3'-UTR)、至少一个5'-帽区和3'-稳定区。在某些实施方案中，RNA或mRNA进一步包括聚-A区或Kozak序列(例如，在5'-UTR中)。在某些实施方案中，RNA或mRNA可包括5'帽结构、链终止核苷酸、茎环、聚A序列和/或多腺苷酸化信号。RNA或mRNA的区中的任一个区可包括一种或多种另选组分(例如，另选核苷)。例如，3'-稳定区可含有另选核苷，诸如L-核苷、反向胸苷或2'-O-甲基核苷，并且/或者编码区、5'-UTR、3'-UTR或帽区可包括另选核苷，诸如5-取代的尿苷(例如5-甲氧基尿嘧啶苷)、1-取代的假尿苷(例如1-甲基-假尿苷或1-乙基-假尿苷)和/或5-取代的胞苷(例如5-甲基-胞苷)。

在一些实施方案中，本文所述的DNA、RNA或肽是裸核酸分子。“裸”核酸分子是指不与蛋白质、脂质或任何其他有助于保护它的分子缔合的核酸分子。裸核酸分子可在实验室中产生以用于遗传工程或作为遗传工程的结果。在一些实施方案中，本文所述的DNA、RNA或肽是裸mRNA。在一些实施方案中，药筒中的裸mRNA的量为至少约0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg或60μg。在另外的实施方案中，药筒中的裸mRNA的量为约200μg、190μg、180μg、170μg、160μg、150μg、140μg、130μg、120μg、110μg、100μg、90μg、80μg、70μg、60μg、50μg、40μg、30μg、20μg、10μg、9μg、8μg、7μg、6μg、5μg、4μg、3μg、2μg、1μg或更少。在进一步的实施方案中，药筒中的裸mRNA的量为约0.2μg至150μg、50μg至100μg、10μg至150μg、30μg至100μg或20μg至110μg。

尽管疫苗递送系统的最新取得进展，但疫苗的体内递送仍然具有挑战性。例如，在mRNA疫苗的情况下，不同于DNA中的脱氧核糖糖主链，RNA的核糖糖主链易于水解，这降低了循环中RNA分子的稳定性。哺乳动物mRNA平均长约2,000个核苷酸，并且沿mRNA主链的单个水解事件可阻止其翻译。此外，体内普遍存在的核糖核酸酶降低了RNA的稳定性并降低了其治疗功效。然而，通过使用本文所述的药筒，个性化疫苗可保持存活而无需对DNA、RNA或肽或对疫苗组合物进行修饰。在一些实施方案中，疫苗不包含纳米颗粒。在一些实施方案中，疫苗不包含阳离子脂质。在一些实施方案中，疫苗不包含PEG脂质。在一些实施方案中，疫苗不包含磷脂。在一些实施方案中，疫苗不包含脂质。在一些实施方案中，疫苗包括助剂。在一些实施方案中，疫苗不包括助剂。在某些实施方案中，助剂可以是聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(I:C))。在一些实施方案中，疫苗不包含DNA编码的免疫刺激基因。在一些实施方案中，疫苗不包含脂质体。在一些实施方案中，疫苗是非病毒的。在一些实施方案中，疫苗由DNA、RNA或肽和缓冲液组成。在另外的实施方案中，缓冲液可以是盐水。

在某些实施方案中，受试者患有与突变相关的疾病。本文中的疾病可包括由遗传突变引起的病症。在另外的实施方案中，并且本文所述的DNA、RNA或肽包含突变。

本文所述的疫苗可以是包含抗原DNA、RNA或肽的治疗性疫苗。在某些实施方案中，本文所述的抗原DNA或RNA表达抗原。在本发明的上下文中，“抗原”通常是指可被免疫系统、优选地被适应性免疫系统识别并且能够例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分来触发抗原特异性免疫应答的物质。通常，抗原可以是或可包含肽或蛋白质，其可由MHC递呈给T细胞。在本发明的意义上，抗原可以是本文所定义的提供的核酸分子的翻译产物。在本上下文中，包含至少一个表位的肽和蛋白质的片段、变体和衍生物也被理解为抗原。在某些实施方案中，本文所述的裸核酸分子表达选自以下的抗原：病原性抗原、肿瘤抗原、变应性抗原和自身免疫抗原。抗原可来源于与感染性疾病相关联的病原体。抗原可选自细菌、病毒、真菌和原生动物病原体。疫苗可根据例如WO2022112498A、WO2022049093A或US15/304701中公开的方法制备，这些公开的内容以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，受试者患有肿瘤。在另外的实施方案中，DNA、RNA或肽包含肿瘤特异性突变。

在某些实施方案中，抗原DNA、RNA或肽可以是新抗原DNA、RNA或肽。肿瘤细胞的遗传不稳定性可导致突变的发生，并且非同义突变的表达可产生称为新抗原的肿瘤特异性抗原。新抗原是高度免疫原性的，因为它们在正常组织中不表达。它们可活化CD4+和CD8+T细胞以产生免疫应答，并且具有成为肿瘤免疫疗法的新靶标的潜力。生物信息学技术的发展加速了新抗原的鉴定，并且已经鉴定了多种新抗原。Castle,J.C.等人，Exploiting theMutanome for Tumor Vaccination，Cancer Res.，第72卷：第1081-1091页，2012年；Yadav,M.等人，Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometryand exome sequencing，Nature，第515卷：第572-576页，2014年；Gubin,M.M.等人，Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutantantigens，Nature，第515卷：第577-581页，2014年；Kreiter,S.等人，Mutant MHC class IIepitopes drive therapeutic immune responses to cancer，Nature，第520卷：第692-696页，2015年；Ott,P.A.等人，An immunogenic personal neoantigen vaccine forpatients with melanoma，Nature，第547卷：第217-221页，2017年；Sahin,U.等人，Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeuticimmunity against cancer，Nature，第547卷：第222-226页，2017年；Keskin,D.B.等人，Neoantigen vaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ibglioblastoma trial，Nature，第565卷：第234-239页，2019年；Hilf,N.等人，Activelypersonalized vaccination trial for newly diagnosed glioblastoma，Nature，第565卷：第240-245页，2019年。在一些实施方案中，抗原DNA、mRNA或肽可以是新抗原mRNA。

在某些实施方案中，抗原DNA、RNA或肽可以是新抗原DNA、RNA或肽，并且药筒可进一步含有另外的疫苗，包括源自患者的树突细胞(DC)或合成的长肽(SLP)。在一些实施方案中，抗原DNA、RNA或肽可以是新抗原mRNA。可将基于负载有肿瘤相关抗原(TAA)的源自患者的DC(例如，获自外周血单核细胞的离体分化)的细胞疗法输注回患者体内以增强T细胞活化和肿瘤细胞杀伤。在一些实施方案中，药筒进一步包含对免疫检查点蛋白质具体特异性的阻断抗体。在一些实施方案中，免疫检查点蛋白质包含细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和/或程序性细胞死亡受体-1(PD-1)。被设计用于从由CTLA-4和PD-1途径介导的免疫抑制释放T细胞的这些抗体可促进有效和持久的T细胞应答，这可消除肿瘤并导致癌症缓解。

在一些实施方案中，制造针对本文所述的受试者个性化的封装疫苗的方法进一步包括从收集自受试者的样本检测突变。在另外的实施方案中，检测可包括对受试者基因组进行全外显子组DNA和/或RNA测序。在进一步的实施方案中，检测可包括将受试者的基因组序列与参考体基因组序列进行比较。在更进一步的实施方案中，检测可包括对受试者的肿瘤进行全外显子组DNA和/或RNA测序。在更进一步的实施方案中，检测可包括将受试者的肿瘤的基因组序列与参考体基因组序列进行比较。在一些实施方案中，样本是肿瘤活检样本。

在一些实施方案中，制造针对本文所述的受试者个性化的封装疫苗的方法进一步包括基于从收集自受试者的样本检测到的突变鉴定与疾病相关的DNA、RNA或肽。在另外的实施方案中，鉴定包括预测蛋白酶体加工。在另外的实施方案中，鉴定包括预测MHC I类和II类结合亲和力。在进一步的实施方案中，鉴定包括免疫沉淀肽的质谱分析。在一些实施方案中，样本是肿瘤活检样本。

示例性检测和鉴定方法描述于Ott,P.A.等人，An immunogenic personalneoantigen vaccine for patients with melanoma，Nature，第547卷：第217-221页，2017年中；以及本文引用的其他参考文献中。

在某些实施方案中，受试者需要针对感染性疾病的疫苗。在一些实施方案中，疫苗触发针对冠状病毒(包括但不限于Sars-CoV2)的抗原特异性免疫应答。在某些实施方案中，疫苗是巨细胞病毒(CMV)疫苗，例如包括但不限于John,S.等人，Multi-antigenic humancytomegalovirus mRNA vaccines that elicit potent humoral and cell-mediatedimmunity，Vaccine，第36卷第12期：第1689-1699页，2018年描述的mRNA。

在某些实施方案中，封装疫苗在室温下储存。在另外的实施方案中，封装疫苗储存在介于2℃至8℃之间的温度下。在进一步的实施方案中，封装疫苗储存在-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或更低的温度下。在某些实施方案中，封装疫苗可在储存之前或之后在施用给受试者之前稀释。

在一个方面，本公开提供了一种向受试者施用个性化疫苗的方法，该方法包括根据本文所公开的方法制造针对受试者个性化的封装疫苗，将药筒装载到注射器，以及从注射器向受试者注射个性化疫苗。

在一些实施方案中，本文所述的注射器可包括药筒和点火器，其中当点火器点火时，药筒的内容物被注射到目标中。

在一些实施方案中，注射器是无针的。在某些实施方案中，注射器可以是无针注射器，该无针注射器包括：本文所述的药筒、点火器和喷嘴单元，该点火器包括点火器粉末，该点火器粉末具有这样的压力特性：在紧接点火之后的燃烧期间产生等离子体，然后当温度变为常温并且燃烧产物由于燃烧产物中不含气体组分或燃烧产物中包含的任何气体组分而冷凝时，产生的压力降低，并且与冷凝之前相比其量减少；该喷嘴单元具有排出口，通过点火器中的点火器粉末的燃烧而加压的疫苗流过该排出口，使得疫苗被排出到注射目标区域。在另外的实施方案中，在用于排出疫苗的加压过程期间，在由于点火器粉末的燃烧而施加到疫苗的压力达到初始峰值排出力之后，在加压期间提供的燃烧产物的温度在20毫秒内变化到常温附近。在另外的实施方案中，在由于点火器粉末的燃烧而施加到DNA溶液的压力达到初始峰值排出力之后，在加压期间提供的燃烧产物的温度在10毫秒内变化到常温附近。在某些实施方案中，注射器可以是在给定结构被插入到注射目标中的状态下将疫苗从注射器主体注射到注射目标中而不执行通过给定结构的注射的注射器。在另外的实施方案中，注射器包括药筒和喷嘴单元，该喷嘴单元包括注射口，含有生物分子的溶液流过该注射口并被注射到注射目标中，该溶液通过点火器中的点火药的燃烧而被加压。在另外的实施方案中，在含有生物分子的溶液的注射开始时间和0.20ms的时间之间的含有生物分子的溶液的最大注射速度为75m/s至150m/s，并且75m/s至150m/s的含有生物分子的溶液的注射速度持续0.11ms或更长。

在某些实施方案中，示例性注射器和使用注射器的方法可以是在美国专利申请公开号2018/0168789、2018/0369484和/或2021/0023302中描述的那些，所有这些公开以引用方式并入本文。

在某些实施方案中，本文所述的受试者是人。在某些实施方案中，本文所述的受试者是非人。在某些实施方案中，本文所述的受试者是啮齿动物。在某些实施方案中，本文所述的受试者是哺乳动物、鸟、爬行动物、鱼、两栖动物或无脊椎动物。

如本文所述，疫苗的不稳定性是在受试者中表达疫苗的DNA或RNA的挑战。注射疫苗的方法可在注射到受试者后增加DNA或RNA的表达。在一些实施方案中，本文所述的注射表现出双相注射曲线。“双相注射曲线”在本文中意指在注射时，随时间测量注射压力的至少两相。“双相注射曲线的第一相”是指测量的第一相，并且“双相注射曲线的第二相”是指在第一相之后立即测量的第二相。

例如，双相注射曲线可通过不同的压力源来实现，并且示例性双相注射曲线如图1A和图1B所示。

图1A和图1B是示出可应用于本文所述的疫苗的压力(下文简称为“注射压力”)的示例性转变的注射曲线。在图1A和图1B中，横坐标表示以毫秒(“msec”)计的经过时间，并且纵坐标表示以MPa计的注射压力。此外，可使用常规技术测量注射压力。例如，以与日本专利申请公开号2005-21640中描述的测量方法类似的方式，可通过这样的方法来测量注射力，该方法包括以分布方式将注射的力施加到布置在喷嘴下游侧的负荷传感器的隔膜，经由检测放大器用数据采样装置采样来自该负荷传感器的输出，以及将所采样的输出存储为每单位时间的注射力(N)。通过将以这种方式测量的注射力除以注射器的注射口的面积来计算注射压力。

在某些实施方案中，可通过在点火器中采用不同的点火药材料来修改注射压力的转变以及由此修改注射曲线。例如，点火药材料可包括含有锆和高氯酸钾的火药(ZPP)、含有氢化钛和高氯酸钾的火药(THPP)、含有钛和高氯酸钾的火药(TiPP)、含有铝和高氯酸钾的火药(APP)、含有铝和氧化铋的火药(ABO)、含有铝和氧化钼的火药(AMO)、含有铝和氧化铜的火药(ACO)，以及含有铝和氧化铁的火药(AFO)，以及由多种这些火药的组合组成的火药。这些火药可表现出如下特性：当在点火之后立即在燃烧期间产生高温和高压等离子体时，一旦燃烧产物达到正常温度则所产生的压力突然下降，并且由于燃烧产物不具有气体成分而冷凝。作为点火药材料，只要能够进行适当的施用，也可使用上述以外的火药。

在某些实施方案中，可通过采用不同的气体发生剂来修改注射压力的转变以及由此修改注射曲线，该气体发生剂将被来自点火器的燃烧产物燃烧以产生气体。气体发生剂可暴露于来自点火器的燃烧产物。如WO 2001/031282和日本专利申请公开号2003-25950中所公开的，布置在点火器内部的气体发生剂已经是众所周知的。另外，气体发生剂的示例包括由98质量％的硝化纤维素、0.8质量％的二苯胺和1.2质量％的硫酸钾组成的单基无烟粉末。此外，也可使用在气囊气体发生器或安全带预紧器气体发生器中使用的各种气体发生剂。当布置气体发生剂时，通过调整气体发生剂的尺寸或大小、形状，并且特别是表面轮廓，可改变气体发生剂的燃烧完成时间，并且因此可调整施加到定量液体的压力转变，并且可实现定量液体的期望注射压力转变。

本文所述的双相注射曲线不限于通过点火产生的注射压力曲线。本文所述的双相注射曲线可通过其他方法实现，例如通过控制应用于疫苗的气体体积和/或速度。

例如，图1A和图2B中所示的注射曲线描绘了基于点火药材料的初始点火的第一相，以及具有基于如上所述的气体发生剂的一个峰值的第二相。该示例中的第一相包括四个振动元素(即，S1至S4)，每个振动元素在振动峰值之前和之后具有两个局部最小值。一个振动元素在振动峰值之后在稍后的局部最小值处结束。

在一些实施方案中，双相注射曲线在距注射约15毫秒、14毫秒、13毫秒、12毫秒、11毫秒、10毫秒、9毫秒、8毫秒、7毫秒、6毫秒、5毫秒、4.5毫秒、4毫秒、3.5毫秒、3毫秒、2.5毫秒、2毫秒、1.5毫秒、1毫秒或0.5毫秒内具有至少两个峰值。本文中的术语“距注射”可意指从开始向疫苗施加压力的时间和/或检测到疫苗上的压力增加的时间开始。在某些实施方案中，双相注射曲线在距注射约5毫秒、4毫秒、3毫秒、2毫秒、1毫秒、0.9毫秒、0.8毫秒、0.7毫秒、0.6毫秒、0.5毫秒、0.4毫秒、0.3毫秒、0.2毫秒或0.1毫秒内具有第一峰值。

在一些实施方案中，本文所述的双相注射曲线可包括第一相，该第一相包括多个振动元素，每个振动元素具有振动峰值以及在振动峰值之前和之后的两个局部最小值。在一些实施方案中，振动元素的总振幅随时间减小。在一些实施方案中，上述至少两个峰值是振动峰值。在一些实施方案中，上述双相注射曲线的第一峰值是振动峰值。

图1A表示示例性注射曲线，该示例性注射曲线示出了从燃烧开始到按压注射器上的启动按钮的时间点的大约40毫秒的时段期间的注射压力的转变，并且图1B示出了图1A所示的压力转变中的初始时段(距原点大约10毫秒)中的注射压力转变的放大。另外，注射压力的上升不是在开始时发生，而是在5毫秒附近发生，因为点火药材料的燃烧需要一定的时间量，被加压的疫苗像活塞一样被点火药的燃烧能量推动。在图1A和图1B中所示的示例性注射压力转变中，多个压力振动元素S1至S4存在于从上升时刻T0到其后大约2毫秒的规时刻间段Δt内，并且一旦规时刻间段Δt过去，压力振动就大致收敛。另外，在本实施方案中，将其中注射压力的压力振动的上升和下降的一个周期作为一个压力振动元素来处理。

在某些实施方案中，双相注射曲线在约15毫秒、14毫秒、13毫秒、12毫秒、11毫秒、10毫秒、9毫秒、8毫秒、7毫秒、6毫秒、5毫秒、4毫秒、3毫秒、2毫秒、1.9毫秒、1.8毫秒、1.7毫秒、1.6毫秒、1.5毫秒、1.4毫秒、1.3毫秒、1.2毫秒、1.1毫秒、1.0毫秒、0.9毫秒、0.8毫秒、0.7毫秒、0.6毫秒、0.5毫秒、0.4毫秒、0.3毫秒、0.2毫秒或0.1毫秒内完成第一相(例如，在最后振动元素的稍后局部最小值处和/或在第二相开始处完成第一相)。

在图1A和图1B中，在从上升时刻T0起的规定时间段Δt内，可最初产生压力振动元素S1(在下文中，称为“第一振动元素S1”)。第一振动元素S1是从上升时刻T0的注射压力(在该示例中为大约0MPa)开始直到下一个局部最小值到达的、包括峰值Px1(在该示例中为大约45MPa)的期间的注射压力转变。另外，第一振动元素S1的总振幅在该示例中为大约45MPa。第一振动元素S1之后进一步跟随有第二振动元素S2、第三振动元素S3和第四振动元素S4。从振动元素的上升时刻T0到最后一个局部最小值(例如，最后一个振动元素的结束处的稍后局部最小值)到达被称为“第一相”。第二振动元素S2是从第一振动元素S1结束的时刻起直到下一个局部最小值到达的、包括峰值Px2(在该示例中为大约37MPa)的期间的注射压力转变。从第一振动元素的结束处的局部最小值的结束到下一个局部最小值到达、包括峰值Px2被称为“第二振动元素”。另外，第二振动元素S2的从最低局部最小值到第二元素的峰值的总振幅在该示例中为大约10MPa。关于第三振动元素S3和第四振动元素S4，限定每个振动元素的周期和每个振动元素的总振幅与第二振动元素S2的周期和总振幅类似，并且尽管将省略其详细描述，但是第三振动元素S3的总振幅和第四振动元素S4的总振幅随时间的流逝而减小。即，在规定时间Δt内，压力转变随时间的经过而成为阻尼振动，并且在经过规定时间段Δt后，压力转变进入其中振动或多或少收敛的状态。

在一些实施方案中，双相注射曲线的至少一个相的振动元素的总振幅随时间减小。在一些实施方案中，双相注射曲线的第一相的振动元素的总振幅随时间减小。

在一些实施方案中，本文所述的双相注射曲线的第一峰值为至少约0.5MPa、1MPa、2MPa、3MPa、4MPa、5MPa、6MPa、7MPa、8MPa、9MPa、10MPa、11MPa、12MPa、13MPa、14MPa、15MPa或16MPa。在一些实施方案中，本文所述的双相注射曲线的第一峰值低于约50MPa、49MPa、48MPa、47MPa、46MPa、45MPa、44MPa、43MPa、42MPa、41MPa、40MPa、39MPa、38MPa、37MPa、36MPa或35MPa。

双相注射曲线的第一峰值可以是双相注射的第一相的最高峰值。例如，如图1A和图1B中所示，双相注射曲线的第一峰值可以是双相注射曲线的第一相的最高振动峰值，并且第一相的稍后振动元素可具有较低高度的峰值。第一相的最高峰值的高度和/或双相曲线的第一峰值的高度可根据施用疫苗的受试者组织来预先确定或调整。对于直接施用给器官和易损损伤，例如，双相注射曲线可具有至少约0.5MPa、1MPa、2MPa、3MPa、4MPa或5MPa的第一相的最高峰值和/或第一峰值。在另外的实施方案中，双相注射曲线具有低于约20MPa、19MPa、18MPa、17MPa、16MPa、15MPa、14MPa、13MPa、12MPa、11MPa、10MPa、9MPa、8MPa、7MPa、6MPa或5MPa的第一相的最高峰值以及/或者第一峰值。在另外的实施方案中，双相注射曲线的第一相的最高峰值以及/或者第一峰值为0.5MPa至20MPa、0.5MPa至15MPa或0.5MPa至5MPa。对于透皮注射，例如，双相注射曲线具有至少约15MPa、16MPa、17MPa、18MPa、19MPa、20MPa、21MPa、22MPa、23MPa、24MPa、25MPa、26MPa、27MPa、28MPa、29MPa、30MPa、31MPa、32MPa、33MPa、34MPa、35MPa、36MPa、37MPa、38MPa、39MPa、40MPa、41MPa、42MPa、43MPa、44MPa或45MPa的最高峰值和/或第一峰值。在另外的实施方案中，双相注射曲线具有低于约50MPa、49MPa、48MPa、47MPa、46MPa、45MPa、44MPa、43MPa、42MPa、41MPa、40MPa、39MPa、38MPa、37MPa、36MPa或35MPa的第一相的最高峰值以及/或者第一峰值。在另外的实施方案中，双相注射曲线的第一相的最高峰值以及/或者第一峰值为15MPa至50MPa、30MPa至36MPa或20MPa至36MPa。

另选地，如图5A、图5B、图6A和图6B中所示，双相注射曲线中的最高峰值可在双相注射的第二相中。双相曲线的第一相和第二相的最高峰值的高度可根据施用疫苗的受试者组织来预先确定或调整。例如，双相注射曲线可具有至少约0.5MPa、1MPa、2MPa、3MPa、4MPa、5MPa、6MPa、7MPa、8MPa、9MPa、10MPa、11MPa、12MPa、12MPa、14MPa或15MPa的第一相的最高峰值。此外，第一相的最高峰值可小于50MPa、45MPa、40MPa、39MPa、38MPa、37MPa、36MPa或35MPa。此外，双相注射曲线可具有至少约10MPa、12MPa、14MPa、16MPa、20MPa、21MPa、22MPa、23MPa、24MPa、25MPa、26MPa或27MPa的第二相的最高峰值。此外，第一相的最高峰值可小于80MPa、75MPa、70MPa、68MPa、66MPa、65MPa、64MPa、63MPa、62MPa、61MPa或60MPa。

在某些实施方案中，从第一振动元素S1的峰值到第二振动元素S2的峰值计算的周期在约1毫秒、0.9毫秒、0.8毫秒、0.7毫秒、0.6毫秒、0.5毫秒、0.4毫秒或0.3毫秒内。在某些实施方案中，从第二振动元素S2的峰值到第三振动元素S3的峰值计算的周期在约1.1毫秒、1毫秒、0.9毫秒、0.8毫秒、0.7毫秒、0.6毫秒、0.5毫秒、0.4毫秒或0.3毫秒内。虽然在即将达到收敛状态之前的时段可略微更短，但是注射压力的转变可在规定时间段Δt中以大致恒定的时段发生。在某些实施方案中，在规定时间段Δt内的注射压力转变可以是频率为大约2200Hz、2100Hz、2000Hz、1900Hz、1800Hz或1700Hz或更小的压力振动。在某些实施方案中，压力振动的频率可为大约1500Hz、1600Hz、1700Hz、1800Hz、1900Hz或2000Hz或更高。当双相注射曲线的第二相高于第一相时，在双相曲线的第一相期间可能不必具有注射压力的振动。例如，当第二相的最高峰值处的压力比第一相的最高峰值处的压力大2、3、4、5、6或7倍时，第一相的振动对于疫苗的注射不是必需的。同样，当第一相具有比第二相更高的峰值时，在双相注射曲线的第一相期间注射压力可以不必具有振动。

在某些实施方案中，规定时间段Δt内的压力波动可归因于本文所述的点火器的点火药材料的燃烧。另外，也可在经过规定时间段Δt的时刻附近，通过点火药材料的燃烧产物开始注射器内的气体发生剂的燃烧，并且其燃烧能量开始进一步作用于疫苗。因此，在图1A所示的示例中，在经过规定时间段Δt之后，注射压力再次上升，并且被称为“第二相的最高峰值”的峰值Pv在大约18毫秒的时刻到达。此外，随后，注射压力随时间流逝而逐渐下降。由于气体发生剂的燃烧速率可低于点火药材料的燃烧速率，所以由于气体发生剂的燃烧而引起的注射压力的增加速率也可变得相对较低。在某些实施方案中，气体发生剂的燃烧可在从注入起约8毫秒、7.5毫秒、7毫秒、6.5毫秒、6毫秒、5.5毫秒、5毫秒、4.5毫秒、3毫秒、3.5毫秒、3毫秒、2.5毫秒、2毫秒、1.5毫秒或1毫秒之前开始。在某些实施方案中，气体发生剂燃烧的峰值Py或第二相的最高峰值可在距注射约30毫秒、29毫秒、28毫秒、27毫秒、26毫秒、25毫秒、24毫秒、23毫秒、22毫秒、21毫秒、20毫秒、19毫秒、18毫秒、17毫秒、16毫秒、15毫秒、14毫秒、13毫秒、12毫秒、11毫秒或10毫秒之前出现。在某些实施方案中，气体发生剂燃烧的峰值Py或第二相的最高峰值可在距注射约7毫秒、8毫秒、9毫秒、10毫秒、11毫秒、12毫秒、13毫秒、14毫秒、15毫秒、16毫秒、17毫秒、18毫秒、19毫秒或20毫秒之后出现。在某些实施方案中，双相注射曲线在距注射约30毫秒、29毫秒、28毫秒、27毫秒、26毫秒、25毫秒、24毫秒、23毫秒、22毫秒、21毫秒、20毫秒、19毫秒、18毫秒、17毫秒、16毫秒、15毫秒、14毫秒、13毫秒、12毫秒、11毫秒、10毫秒、9毫秒、8毫秒、7毫秒、6毫秒、5毫秒或4毫秒之前具有第二相的至少一个峰值。在某些实施方案中，在距注射约7毫秒、8毫秒、9毫秒、10毫秒、11毫秒、12毫秒、13毫秒、14毫秒、15毫秒、16毫秒、17毫秒、18毫秒、19毫秒或20毫秒之后双相注射曲线具有第二相的至少一个峰值。

在一些实施方案中，双相注射曲线可包括仅具有一个峰值的第二相。

双相曲线的第二相的最高峰值的高度可根据施用疫苗的受试者组织来预先确定或调整。在某些实施方案中，对于直接施用给器官和易损损伤，双相注射曲线的第二相的最高峰值为至少约0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、0.5MPa、0.6MPa、0.7MPa、0.8MPa、0.9MPa、1MPa、2MPa、3MPa、4MPa、5MPa、6MPa、7MPa、8MPa、9MPa或10MPa。在另外的实施方案中，双相注射曲线的第二相的最高峰值低于约15MPa、14MPa、13MPa、12MPa、11MPa、10MPa、9MPa、8MPa、7MPa、6MPa、5MPa、4MPa、3MPa、2MPa或1MPa。在另外的实施方案中，双相注射曲线具有约0.1MPa至15MPa、1MPa至10MPa或3MPa至6MPa的第二峰值。在某些实施方案中，对于透皮注射，双相注射曲线的第二相的最高峰值为至少约20MPa、21MPa、22MPa、23MPa、24MPa、25MPa、26MPa、27MPa、28MPa、29MPa、30MPa、31MPa、32MPa、33MPa、34MPa或35MPa。在另外的实施方案中，双相注射曲线的第二相的最高峰值低于约45MPa、44MPa、43MPa、42MPa、41MPa、40MPa、39MPa、38MPa、37MPa、36MPa、35MPa、34MPa、33MPa、32MPa、31MPa、30MPa或29MPa。在另外的实施方案中，双相注射曲线的第二相的最高峰值为30MPa至40MPa、30MPa至36MPa或20MPa至36MPa。在另一个实施方案中，第一相的最高峰值可为10.0MPa至38.0MPa，并且第二相的最高峰值可为25.0MPa至64.0MPa。

在一些实施方案中，双相曲线的第二相的最高峰值低于双相曲线的第一相的最高峰值。在某些实施方案中，双相曲线的第二相的最高峰值低于双相曲线的第一相的第一峰值。在一些实施方案中，双相曲线的第一相的最高峰值低于双相曲线的第二相的最高峰值。在某些实施方案中，双相曲线的第二相的最高峰值高于双相曲线的第一相的第一峰值。

在某些实施方案中，注射在距注射约400毫秒、450毫秒、300毫秒、250毫秒、200毫秒、150毫秒或100毫秒内完成。

在一些实施方案中，注射是透皮注射。在一些实施方案中，注射不包括透皮注射。

在一些实施方案中，注射是肌内注射。在一些实施方案中，所述注射是皮下注射。在一些实施方案中，所述注射是皮内注射。在一些实施方案中，注射是病灶内的。在某些实施方案中，可将疫苗注射到目的特定器官，例如在手术期间。在一些实施方案中，注射是肿瘤内的。在一些实施方案中，注射是结内注射。在一些实施方案中，不包括结内注射。在一些实施方案中，注射是淋巴内的。

在一些实施方案中，注射给受试者的个性化疫苗中的mRNA的量为至少约0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg或60μg。在另外的实施方案中，注射给受试者的个性化疫苗中的mRNA的量为约200μg、190μg、180μg、170μg、160μg、150μg、140μg、130μg、120μg、110μg、100μg、90μg、80μg、70μg、60μg、50μg、40μg、30μg、20μg、10μg、9μg、8μg、7μg、6μg、5μg、4μg、3μg、2μg、1μg或更少。在进一步的实施方案中，注射给受试者的个性化疫苗中的mRNA的量为约0.2μg至150μg、50μg至100μg、10μg至150μg、30μg至100μg或20μg至110μg。

在一个方面，本公开进一步提供了一种治疗或改善受试者与突变相关的疾病的方法，该方法包括根据本文所公开的方法向该受试者施用个性化疫苗。在一些实施方案中，疾病是肿瘤癌症。

在一个方面，本公开还提供了一种注射器，该注射器包括点火器和可拆卸药筒。注射器可以是上述的注射器。在一些实施方案中，可拆卸药筒被配置为容纳本文所述的疫苗或者DNA、RNA或肽。在一些实施方案中，注射器不包括针。在一些实施方案中，注射器不包括弹簧。在一些实施方案中，注射器被配置用于细胞内递送。

在另一个方面，本公开提供了该注射器用于根据本文所述的方法向受试者施用个性化疫苗的用途。在另一个方面，本公开提供了注射器用于根据本文所述的方法治疗或改善受试者的肿瘤的用途。

实施例

材料

杜氏磷酸缓冲水溶液(Nacalai Tesque制造，D-PBS)

TE缓冲液pH 8.0(Nacalai Tesque制造)

PBS-片剂(Takara Bio株式会社制造)

水(Nacalai Tesque制造)

裸mRNA GFP(TriLink制造的EGFP mRNA)

裸mRNA_Luc(TriLink，FLuc mRNA)

裸mRNA_U修饰_Luc(TriLink，FLuc mRNA(5moU))

被动裂解缓冲液5×(Promega制造)

荧光素酶测定(Promega，荧光素酶测定系统)

C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠购自Claire Japan。

所用的装置

冷却离心机(Tomy制造的MDX-300)

高压釜(Tomy制造，LSX-700)

8mm活检穿孔器(KAI industry，8mm活检穿孔器)

光度计(KIKKOMAN，C-100N)

首先，在编码GFP的mRNA(裸mRNA GFP)中评价通过使用该装置将mRNA施用给活体是否增强了所施用的mRNA的基因表达。施用时使用10周龄的雄性BALB/c小鼠，并且在施用之后六小时进行安乐死和数据收集。用于施用的装置是具有0.1mm喷嘴直径、30mg ZPP点火材料和30mg GG气体生成材料的容器。每次施用的剂量为20μL，并且mRNA为0.01mg/mL至0.5mg/mL(0.2μg/次至10μg/次)。为了基因表达，将施用部位的皮肤贴在松浪玻璃底皿上，并用KEYENCE制造的荧光显微镜BZ-X710进行观察。

因此，当使用30G针施用时，在任何量的mRNA下仅获得少量的基因表达。另一方面，当使用该装置施用时，确认了在0.01mg/mL至0.5mg/mL的任何mRNA量下在施用的皮肤中的基因表达(图3)。对应于基因表达水平的荧光强度取决于所用mRNA的量而增加，并且证实所施用的mRNA是基因表达的。由于即使在仅0.01mg/mL的少量下也确认了通过该装置的裸mRNA的基因表达，因此获得了使用该装置的有效mRNA胞质溶胶递送和随后的基因表达。

当在30G针和装置之间比较GFP的荧光强度时，使用该装置的一个在0.01mg/mL至0.5mg/mL的任何mRNA量下明显具有强荧光(图3)。根据这些结果，证实了该装置比针更可能诱导裸mRNA的基因表达，并且证实了使用该装置的基因表达增强效果。

(2)装置基因表达增强对编码Luc的mRNA的效果

对编码为不同蛋白质的Luc的mRNA(裸mRNA Luc)评价该装置的基因表达增强效果。施用时使用10周龄的雄性BALB/c小鼠，并且在施用之后六小时进行安乐死和数据收集。用于施用的装置是具有0.1mm喷嘴直径、30mg ZPP点火材料和30mg GG气体生成材料的容器。每次施用的剂量为20μL，并且mRNA为0.01mg/mL至0.1mg/mL(0.2μg/次至2μg/次)。对于基因表达，使用8mm活检穿孔器对施用部位的皮肤进行取样，并且使用5倍稀释的被动裂解缓冲液5×制备裂解物。然后，使用Promega制造的荧光素酶测定系统和Kikkoman制造的光度计C-100N，测定10秒内释放的荧光素酶的量，评价其基因表达。

因此，与GFP的情况一样，当使用30G针施用时，在任何mRNA量下仅获得少量基因表达。另一方面，在使用该装置施用的那些中证实了高基因表达(图4)。为了评价该装置的基因表达增强效果，当在30G针和该装置之间比较基因表达水平时，该装置对于0.01mg/mLmRNA高约2,300倍，并且对于0.1mg/mL mRNA高约300倍(图4)。在编码Luc的mRNA中也证实了通过使用该装置的基因表达增强效果。

因此，由于在多种报告蛋白诸如GFP和Luc中证实了该装置的基因表达增强效果，因此阐明了该装置的基因表达不依赖于由mRNA编码的基因序列。由此，认为利用编码任何基因的mRNA可获得该装置的基因表达增强效果。

(3)注射器的另选注射压力曲线—实施例1

在喷嘴值径为0.5mm的注射器中填充150μL的水，并评价从通过点火药的燃烧进行水的加压直到注射之后的注射器内的注射压力。关于炸药，使用含有锆和高氯酸钾的炸药(ZPP)55mg，并且关于气体发生剂，使用单基无烟炸药(以下有时称为“GG”)40mg。

对于注射压力的测量，类似于日本专利申请公开号2005-21640中的测量方法，其中将注射力分配并施加到布置在喷嘴下游的负荷传感器的隔膜上，将来自该负荷传感器的输出经由检测放大器收集在数据收集显示装置中，以及显示和存储为每次的注射力(N)用于测量，并且通过将注射力(N)除以喷嘴口的面积来计算注射压力。使用来自okyoMeasuring Instruments Laboratory有限公司的CLS-2NA获得测量结果。总共进行了30次测量。

在30次测量中，在图5A和图5B中示出了其中检测到双相曲线的第二相的最高峰值和最低峰值的两次测量。第二相的峰值在所有30次测量中都较高，其中第一相和第二相的平均峰值压力分别为4.574MPa和9.598MPa。平均而言，在点火之后5.230毫秒和24.150毫秒检测到第一相和第二相的峰值。

(3)注射器的另选注射压力曲线—实施例2

重复上述实施例1中使用的相同条件，不同之处在于ZPP和GG的量均从55mg增加到65mg。总共进行30次测量，并且在图6A和图6B中示出了其中检测到双相曲线的第二相的最高峰值和最低峰值的两次测量。第二相的峰值在所有30次测量中都较高，其中第一相和第二相的平均峰值压力分别为6.102MPa和12.562MPa。平均而言，在点火之后5.243毫秒和21.957毫秒检测到第一相和第二相的峰值。

以下是本公开的一些示例性实施方案。

实施方案1.一种制造针对受试者个性化的封装疫苗的方法，所述方法包括合成包含DNA、mRNA或肽的疫苗，以及将所述疫苗封装在药筒中，所述药筒被配置为被装载到注射器。

实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤，并且所述DNA、mRNA或肽包含肿瘤特异性突变。

实施方案3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤，并且所述DNA、mRNA或肽是新抗原DNA、mRNA或肽。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括从收集自所述受试者的样本检测突变。

实施方案5.根据实施方案4所述的方法，所述检测包括对所述受试者的基因组进行全外显子组DNA和/或RNA测序。

实施方案6.根据实施方案4或5所述的方法，其中所述检测包括将所述受试者的基因组序列与参考体基因组序列进行比较。

实施方案7.根据实施方案4至6中任一项所述的方法，其中所述检测包括对所述受试者的肿瘤进行全外显子组DNA和/或RNA测序。

实施方案8.根据实施方案4至7中任一项所述的方法，其中所述检测包括将所述受试者的肿瘤的基因组序列与参考体基因组序列进行比较。

实施方案9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于从收集自所述受试者的样本检测到的突变鉴定与疾病相关的所述DNA、mRNA或肽。

实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中所述鉴定包括预测蛋白酶体加工以及MHC I类和II类结合亲和力。

实施方案11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述鉴定包括免疫沉淀肽的质谱分析。

实施方案12.根据实施方案3至11中任一项所述的方法，其中所述样本是肿瘤活检样本。

实施方案13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗不包含纳米颗粒。

实施方案14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗不包括阳离子脂质。

实施方案15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗不包括脂质。

实施方案16.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗不包含助剂。

实施方案17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗不包含DNA编码的免疫刺激基因。

实施方案18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗不包含脂质体。

实施方案19.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗是非病毒的。

实施方案20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗由所述新抗原DNA、mRNA或肽和缓冲液组成。

实施方案21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述DNA、mRNA或肽是裸核酸分子。

实施方案22.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述DNA、mRNA或肽是裸mRNA。

实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中所述药筒中的所述裸mRNA的量为至少0.2μg。

实施方案24.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗从所述合成直接封装在所述药筒中。

实施方案25.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药筒是真空的。

实施方案26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述疫苗触发针对冠状病毒的抗原特异性免疫应答。

实施方案27.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药筒进一步包含对免疫检查点蛋白质具有特异性的阻断抗体。

实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白质包含细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和/或程序性细胞死亡受体-1(PD-1)。

实施方案29.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述注射器进一步包括点火器，其中当所述点火器点火时，使得所述药筒的内容物被注射到目标中。

实施方案30.一种向受试者施用个性化疫苗的方法，所述方法包括根据前述实施方案中任一项所述的方法制造针对所述受试者个性化的封装疫苗，将所述药筒装载到所述注射器，以及从所述注射器向所述受试者注射所述个性化疫苗。

实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述注射表现出包括第一相和第二相的双相注射曲线，所述第二相在所述第一相之后。

实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中所述双相注射曲线在距所述注射15毫秒内具有至少两个峰值。

实施方案33.根据实施方案31或32所述的方法，其中所述双相注射曲线在距所述注射1.5毫秒内具有至少两个峰值。

实施方案34.根据实施方案31至33中任一项所述的方法，其中所述双相注射曲线在5毫秒内具有第一峰值。

实施方案35.根据实施方案31至34中任一项所述的方法，其中所述第一相包括多个振动元素，每个振动元素具有振动峰值。

实施方案36.根据实施方案35所述的方法，其中所述至少两个峰值是所述振动元素的所述振动峰值。

实施方案37.根据实施方案35或36所述的方法，其中所述振动元素的总振幅随时间减小。

实施方案38.根据实施方案31至37中任一项所述的方法，其中所述第一峰值为至少2MPa。

实施方案39.根据实施方案31至38中任一项所述的方法，其中所述第一峰值为至少15MPa。

实施方案40.根据实施方案31至39中任一项所述的方法，其中所述双相注射曲线的所述第二相的最高峰值在距所述注射30毫秒内。

实施方案41.根据实施方案31至40中任一项所述的方法，其中所述双相注射曲线的所述第二相的最高峰值在距所述注射15毫秒内。

实施方案42.根据实施方案31至41中任一项所述的方法，其中所述双相注射曲线包括仅具有一个峰值的所述第二相。

实施方案43.根据实施方案31至42中任一项所述的方法，其中所述双相曲线的所述第二相的所述最高峰值为至少0.1MPa。

实施方案44.根据实施方案31至43中任一项所述的方法，其中所述双相曲线的所述第二相的所述最高峰值为至少10MPa。

实施方案45.根据实施方案31至44中任一项所述的方法，其中所述双相曲线的所述第二相的所述最高峰值低于所述双相曲线的第一相的最高峰值。

实施方案46.根据实施方案30至45中任一项所述的方法，所述注射是透皮注射。

实施方案47.根据实施方案30至45中任一项所述的方法，其中所述注射不包括透皮注射。

实施方案48.根据实施方案30至47中任一项所述的方法，所述注射是肌内、皮下或皮内的。

实施方案49.根据实施方案30至47中任一项所述的方法，所述注射是病灶内的。

实施方案50.根据实施方案30至47中任一项所述的方法，其中所述注射是肿瘤内的。

实施方案51.根据实施方案30至47中任一项所述的方法，其中所述注射是结内或淋巴内的。

实施方案52.根据实施方案30至50中任一项所述的方法，其中所述注射不包括结内注射。

实施方案53.根据实施方案30至52中任一项所述的方法，其中注射到所述受试者的所述个性化疫苗中的mRNA的量为至少0.2μg。

实施方案54.根据实施方案30至53中任一项所述的方法，其中所述注射器是无针的。

实施方案55.根据实施方案30至54所述的方法，其中所述注射器进一步包括点火器，其中当所述点火器点火时，使得所述药筒的内容物被注射到目标中。

实施方案56.一种治疗、改善或预防受试者与突变相关的疾病的方法，所述方法包括根据实施方案30至55中任一项所述的方法向所述受试者施用个性化疫苗。

实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中所述疾病是肿瘤癌症。

实施方案58.一种注射器，所述注射器包括点火器和可拆卸药筒，其中所述可拆卸药筒被配置为容纳包含DNA、mRNA或肽的疫苗。

实施方案59.根据实施方案58所述的注射器，其中所述注射器不包括针。

实施方案60.根据实施方案58或59所述的注射器，其中所述注射器不包括弹簧。

实施方案61.根据实施方案58至60中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含纳米颗粒。

实施方案62.根据实施方案58至61中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含阳离子脂质。

实施方案63.根据实施方案58至62中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含脂质。

实施方案64.根据实施方案58至63中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含助剂。

实施方案65.根据实施方案58至64中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含DNA编码的免疫刺激基因。

实施方案66.根据实施方案58至65中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含脂质体。

实施方案67.根据实施方案58至66中任一项所述的注射器，其中所述疫苗是非病毒的。

实施方案68.根据实施方案58至67中任一项所述的注射器，其中所述疫苗由所述新抗原DNA、mRNA或肽和缓冲液组成。

实施方案69.根据实施方案58至68中任一项所述的注射器，其中所述DNA、mRNA或肽是裸核酸分子。

实施方案70.根据实施方案58至69中任一项所述的注射器，其中所述DNA、mRNA或肽是裸mRNA。

实施方案71.根据实施方案70所述的注射器，其中所述药筒中的所述裸mRNA的量为至少0.2μg。

实施方案72.根据实施方案58至71中任一项所述的注射器，其中所述注射器被配置用于细胞内递送。

实施方案73.根据实施方案30至55中任一项所述的注射器用于根据实施方案30至45中任一项所述的方法向受试者施用个性化疫苗的用途。

实施方案74.根据实施方案55至57中任一项所述的注射器用于根据实施方案46或47所述的方法治疗或改善受试者的肿瘤的用途。

Claims

1.一种制造针对受试者个性化的封装疫苗的方法，所述方法包括

合成包含DNA、RNA或肽的疫苗，以及

将所述疫苗封装在药筒中，所述药筒被配置为被装载到注射器。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疫苗由新抗原DNA、RNA或肽和缓冲液组成。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA、RNA或肽是裸核酸分子。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA、RNA或肽是裸RNA。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗从所述合成直接封装在所述药筒中。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述注射器进一步包括点火器，其中当所述点火器点火时，使得所述药筒的内容物被注射到目标中。

7.一种向受试者施用个性化疫苗的方法，所述方法包括根据前述权利要求中任一项所述的方法制造针对所述受试者个性化的封装疫苗，将所述药筒装载到所述注射器，以及从所述注射器向所述受试者注射所述个性化疫苗。

8.根据权利要求7所述的方法，其中注射器是无针的。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述注射器进一步包括点火器，其中当所述点火器点火时，使得所述药筒的内容物被注射到目标中。

10.一种治疗、改善或预防受试者与突变相关的疾病的方法，所述方法包括根据权利要求7至9中任一项所述的方法向所述受试者施用个性化疫苗。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是肿瘤癌症。

12.一种注射器，所述注射器包括点火器和可拆卸药筒，其中所述可拆卸药筒被配置为容纳包含DNA、RNA或肽的疫苗。

13.根据权利要求12中任一项所述的注射器，其中所述疫苗不包含纳米颗粒、阳离子脂质、脂质、助剂、DNA编码的免疫刺激基因和脂质体。

14.根据权利要求12或13所述的注射器，其中所述DNA、RNA或肽是裸核酸分子。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的注射器，其中所述DNA、RNA或肽是裸RNA。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的注射器用于根据权利要求7至11中任一项所述的方法向受试者施用个性化疫苗的用途。