CN117642184A - 具有刷状缘膜酶可裂解接头的叶酸受体靶向缀合物以及在癌症成像和治疗中的使用方法 - Google Patents

Abstract

式(I)FRTL‑BBMecL‑AA或(II)FRTL‑Alb‑BBMecL‑AA的缀合物，其中FRTL是叶酸受体靶向配体，BBMecL是刷状缘膜(BBM)酶可裂解接头，Alb是白蛋白粘合剂部分，AA是活性剂；包含该缀合物的组合物；以及肿瘤成像和/或治疗方法。

Description

具有刷状缘膜酶可裂解接头的叶酸受体靶向缀合物以及在癌 症成像和治疗中的使用方法

优先权

本专利申请与2021年5月14日提交的美国临时专利申请号63/188,910和2022年3月10日提交的美国临时专利申请号63/318,463有关，并要求其优先权权益。上述两份申请的内容均通过引用的方式整体并入本公开中。

技术领域

本公开涉及包含靶向受体的配体、酶可裂解接头和药剂的缀合物，其用于肿瘤或肿瘤相关巨噬细胞的成像或治疗性治疗。

背景技术

叶酸受体(FR)是人类多种肿瘤和活化巨噬细胞的公认靶点。FR以高亲和力与叶酸缀合物结合并迅速内化，这些都是受体介导的药物递送的理想特性。

叶酸配体靶向缀合物可用于成像和治疗(例如癌症的成像和治疗)。其使用的缺点是长期高肾脏滞留性。肾脏滞留性使基于叶酸的放射疗法无法使用，因为有损害对放射敏感的肾脏的风险。使用基于叶酸的缀合物对肾癌进行荧光或放射成像也是无效的。

这一问题目前正以各种方式得到解决。施用抗叶酸盐来阻断肾脏的吸收，修饰叶酸配体结构，或施用血浆扩容剂或利尿剂来增加排尿。在临床前研究中，已经采用了几种策略来改善叶酸靶向诊断治疗的临界肿瘤肾脏比。这些策略包括预处理抗叶酸盐(例如培美曲塞)和加入白蛋白粘合剂，但还需要进一步优化，才能将FR靶向放疗应用于人类患者，特别是肾癌的成像和治疗。

鉴于上述情况，本公开旨在提供一种叶酸配体靶向缀合物，该缀合物可用于解决肾脏滞留性，而无需进一步的结构修饰或施用其他药剂。该缀合物可用于肿瘤和肿瘤相关巨噬细胞的成像和治疗，同时提供改善的药代动力学。从本文提供的详细描述中，可以明显看出本目的以及其他目的和优点，以及其他创造性特征。

发明内容

提供了一种式I或式II的缀合物：

FRTL-BBMecL-AA(式I)或FRTL-Alb-BBMecL-AA(式II)，其中：

FRTL是叶酸受体靶向配体，

BBMecL是肾刷状缘膜(BBM)酶可裂解接头，

Alb是白蛋白粘合剂部分，以及

AA是活性剂。

FRTL的分子量可低于10,000。Alb可与血清白蛋白非共价结合。

FRTL可以具有以下结构：

其中：

T选自由S、O、NR^4b和-HC＝CH-组成的组，

U、V和W代表二价部分，各自独立地选自由-(R^6a)C＝、-N＝、-(R^6a)C(R^7a)-和-N(R^4a)-组成的组，其中R^6a和R^7a各自独立地选自由氢、卤素和C₁-C₁₂烷氧基组成的组；或R^6a和R^7a合在一起形成羰基，

X和Y各自独立地选自由卤素、R²、OR²、SR³和NR⁴R⁵组成的组，

Q是C或CH，

A¹和A²各自独立地选择由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R^4b)-、-C(Z)N(R^4b)-、-N(R^4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R^4b)-、-N(R^4b)C(Z)O-、-N(R^4b)C(Z)N(R^5b)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R^4b)S(O)₂-、-C(R^6b)(R^7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH₂C≡CH)-、C₁-C₁₂亚烷基和C₁-C₁₂亚烷氧基组成的组，其中Z是氧或硫，

R²、R³、R⁴、R^4a、R^4b、R⁵、R^5b、R^6b和R^7b各自独立地选自由氢、卤素、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷氧基、C₁-C₁₂烷酰基、C₁-C₁₂烯基、C₁-C₁₂炔基、(C₁-C₁₂烷氧基)羰基和(C₁-C₁₂烷基氨基)羰基组成的组，

A³是氨基酸，

R¹选自由氢、卤素、C₁-C₁₂杂烷基和C₁-C₁₂烷氧基组成的组，

R⁶和R⁷各自独立地选自由氢、卤素、C₁-C₁₂烷基和C₁-C₁₂烷氧基组成的组；或R⁶和R⁷合在一起形成羰基，

q是1到3的整数，

p、r、s和t各自独立地是0或1，以及*表示与BBMecL或Alb的连接点。

Q可以是CH。X可以是OH，Y可以是NH₂。W和U可以是-N(R^4a)-，Q可以是CH，V可以是CH₂，A¹可以是-N(R^4b)-，s可以是1，p可以是1，t可以是0。R^4a和R^4b可以独立地是烷基或杂烷基。R^4a和R^4b可以是甲基。

FRTL可以具有以下结构：

其中表示FRTL与Alb或BBMecL的连接点。

Alb可以具有以下结构：

其中R_12-19独立地是-H、-C₁-C₆烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-CHO、-B(OH)₂、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)₂芳基、-CO₂H、-SO₃H、-SO₂NH₂、-PO₃H₂或-SO₂F；并且

R₂₀和R₂₁独立地是-H、-C₁-C₆烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C_1-6烷基、-CN、-CHO、-B(OH)₂、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)₂芳基、-CO₂H、-SO₃H、-SO₂NH₂、-PO₃H₂、-SO₂F或CF₃；

ABD035、ABDCon、设计的锚蛋白(ankyrin)重复蛋白(DARPins)、dsFV CA645、纳米抗体(单链抗体(sdAb))或与抗人血清白蛋白结构域克隆E06融合的新抗原受体可变结构域(VNAR)。

BBMecL可以包括：

(i)Met-Val，

(ii)X-Lys或X-Arg，其中X＝Gly或Arg，或其组合，

(iii)Gly-Tyr，

(iv)Gly-Phe-(Lys)，

(v)Gly-Pro，

(vi)Ala-X或Leu-X，其中X是任意氨基酸，或其组合，

(vii)Asp-X或Glu-X，其中X是任意氨基酸，或其组合，

(viii)γ-Glu-X，其中X是任意氨基酸，和受体肽，

(ix)蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、帕拉金糖(palatinose)或上述两种或更多种的组合，

(x)碘胰岛素B链，

(xi)根皮甙(phlorizin)，

(xii)对硝基苯磷酸，或

(xiii)上述两种或更多种的组合。

AA可以是光学成像剂、放射性成像剂或放射性治疗剂。光学成像剂可以是荧光染料。荧光染料可以选自由S0456、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、LS288、七甲川菁染料(heptamethine cyanine dye,HMCD)、SS180、吖啶橙(AO)、IRDye800CW、IR783、IR825、ZW800-1或吲哚菁绿(ICG)组成的组。在AA是放射性成像剂或放射性治疗剂的情况下，AA可以包含选自由¹⁸F、⁴⁴Sc、⁴⁷Sc、⁵²Mn、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、^114mIn、^117mSn、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴⁹Tb、¹⁵³Sm、¹⁵²Tb、¹⁵⁵Tb、¹⁶¹Tb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁵Ab、²²⁵Ac和²²⁷Th组成的组的放射性同位素。

AA可以包含放射性标记的假体基团，该假体基团包含选自由⁶⁸Ga、¹⁸F、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²²⁵Ac、¹⁸P、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I和²¹¹At组成的组的放射性同位素。放射性标记的假体基团可以包括选自以下的结构：

其中R和R’独立地是氢或甲基，且n是选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的整数。放射性标记的假体基团可以包括选自以下的结构：

其中n是选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的整数。

缀合物的AA可以包含选自由以下组成的组的螯合剂：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、SarAr(1-N-(4-氨基苄基)-3,6,10,13,16,19-六氮杂双环[6.6.6]-二十烷-1,8-二胺、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NODAGA(2,2’-(7-(4-((2-氨基乙基)氨基)-1-羧基-4-氧代丁基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸)、HYNIC(6-肼基烟酸)、NETA(4-[2-(双羧基甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基)乙酸、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧乙基)膦酸)、HBED(N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸)、2,3-HOPO(3-羟基吡啶-2-酮)、PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]-十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、DFO(去铁胺)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、OCTAPA(N,N-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N-二乙酸)、H₂macropa(N,N’-双[(6-羧基-2-吡啶基甲基)-4,13-二氮杂-18-冠-6]、H₂dedpa(1,2-[[羧基]-吡啶-2-基]-甲基氨基]乙烷)、包含β-l-二氨基丙酸、天冬氨酸和半胱氨酸的EC20-头以及上述任一物质的衍生物。AA可以包含选自由以下组成的组的螯合剂：

缀合物可以具有以下结构：

(BBM1(MVKC))。

缀合物可以具有以下结构：

(BBM2(MVKGYGKC))。

缀合物可以具有以下结构：

(BBM3(MVK))。

缀合物可以具有以下结构：

BBM4(DOTA-MVK(EB-叶酸)-OH)。

缀合物可以具有以下结构：

BBM5(DOTA-MVK(IP-叶酸)-OH。

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

进一步提供了一种组合物，其包含缀合物和药学上可接受的载体。

还进一步提供了一种通过对肿瘤细胞、与肿瘤相关的巨噬细胞(例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM))或两者的靶向放射性，单独或进一步联合光学成像剂，对受试者的肿瘤进行成像、治疗或成像并治疗的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)缀合物或(ii)包含缀合物和药学上可接受的载体的组合物。该方法可以进一步包括对肿瘤进行成像。成像可以通过光学成像、正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。

还提供了用于对受试者的肿瘤进行成像、治疗或成像和治疗的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含在第一容器中的至少一个剂量单位的缀合物或组合物，和至少一个剂量的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物。在某些实施方案中，至少一个剂量单位的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物容纳在第一容器中。替代地，至少一个剂量单位的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物容纳在第二容器中。试剂盒还可以包含用于施用缀合物或组合物的装置(例如注射器、支架、套管、套管针等)。

附图说明

图1A显示了叶酸靶向OTL38的流式细胞术验证结果。

图1B显示了叶酸靶向BBM1的流式细胞术验证结果。

图1C显示了叶酸靶向BBM2的流式细胞术验证结果。

图2A显示了OTL38的叶酸缀合物结合曲线(K_d＝6.7nM)。

图2B显示了BBM1的叶酸缀合物结合曲线(K_d＝12.3nM)。

图2C显示了BBM2的叶酸缀合物结合曲线(K_d＝29.6nM)。

图2D显示了BBM3的叶酸缀合物结合曲线(K_d＝16.0nM)。

图3A和3B显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38、BBM1或BBM2，并在24小时后处死的小鼠的器官荧光扫描结果，图3A显示了短时间暴露的结果，图3B显示了高暴露的结果(图3A中所示的高荧光由白圈进一步标识)。

图4A和4B显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38、BBM1或BBM2，并在1小时后处死的小鼠的器官荧光扫描结果(高荧光由白色矩形进一步标识)。

图5A和5B显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38、BBM1或BBM2，并在3小时后处死的小鼠的器官荧光扫描结果(高荧光由白色矩形进一步标识)。

图6A和6B显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38、BBM1或BBM2，并在6小时后处死的小鼠的器官荧光扫描结果(高荧光由白色矩形进一步标识)。

图7显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38或BBM3，并在注射后1小时(1h p.i.)或3小时(3h p.i.)进行荧光扫描的小鼠的荧光扫描结果(荧光由白色圆圈进一步标识)。

图8A显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38或BBM3，并在3小时后处死的小鼠的器官荧光扫描结果(最高荧光由黑色矩形进一步标识)。

图8B显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射1nmol的OTL38、BBM1或BBM2，并在3小时后处死的小鼠的器官荧光扫描结果(最高荧光由白色矩形进一步标识)。

图9A显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射5nmol的OTL38或BBM3，并在注射后1小时(1h p.i.)或3小时(3h p.i.)进行荧光扫描的小鼠的扫描结果(最高荧光由黑色圆圈进一步标识)。

图9B显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射5nmol的OTL38或BBM3，并在注射后6小时(6h p.i.)或24小时(24h p.i.)进行荧光扫描的小鼠的扫描结果(最高荧光由黑色圆圈进一步标识)。

图10显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射5nmol OTL38或BBM3，并在24小时后处死的小鼠的器官扫描结果(最高荧光由黑色矩形进一步标识)。

图11显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射5nmol的OTL38、BBM1或BBM2，并在24小时后处死的无胸腺裸鼠的器官扫描结果。

图12显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，注射5nmol的OTL38或BBM3(1-2只小鼠/缀合物)，并在注射后1小时(1小时p.i.)、3小时(3小时p.i.)、6小时(6小时p.i.)和24小时(24小时p.i.)对肿瘤(MDA-MD-231)和肾脏进行荧光扫描的无胸腺裸鼠的扫描结果(荧光由黑色圆圈进一步标识)。

图13显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，尾静脉注射5nmol的OTL38或BBM3(1-2只小鼠/缀合物)，并在注射后1小时(1小时p.i.)、3小时(3小时p.i.)、6小时(6小时p.i.)和24小时(24小时p.i.)对肿瘤(MDA-MB-231)和肾脏进行荧光扫描的无胸腺裸鼠的扫描结果(荧光由黑色圆圈进一步标识)。

图14显示了以叶酸缺乏饮食饲养3周以上，尾静脉注射5nmol的OTL38或BBM3(1-2只小鼠/缀合物)，注射后24小时对肿瘤、心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏进行荧光扫描的无胸腺裸鼠的器官扫描结果。

图15是¹¹¹In-BBM4的放射色谱图。

图16是¹¹¹In-BBM5的放射色谱图。

图17A是浓度(nM)与CPM的关系的图，显示了铟-111放射性标记的BBM4缀合物在KB细胞中的结合。

图17B是浓度(nM)与CPM的关系的图，显示了铟-111放射性标记的BBM5缀合物在KB细胞中的结合。

图18显示了铟-111放射性标记的BBM4缀合物在健康小鼠体内的SPECT/CT图像。1nmol注射放射性标记约250uCi的In-111。黄色箭头表示肾脏。

图19显示了铟-111放射性标记的BBM5缀合物在健康小鼠体内的SPECT/CT图像。1nmol注射放射性标记约250uCi的In-111。黄色箭头表示肾脏。

图20显示了铟-111放射性标记的BBM4缀合物在健康小鼠体内的SPECT/CT图像。5nmol注射放射性标记约250uCi的In-111。黄色箭头表示肾脏。

图21是¹⁷⁷Lu-BBM4的放射色谱图。

图22是¹⁷⁷Lu-BBM5的放射色谱图。

图23A是天数与肿瘤体积(mm³)的关系的图，显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM缀合物治疗的小鼠中KB肿瘤的总体积。

图23B是天数与相对肿瘤大小的关系的图，显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM缀合物治疗的小鼠中KB肿瘤的相对大小。

图23C是天数与相对体重(％)的关系的图，显示了具有KB肿瘤并用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM缀合物治疗的的小鼠的相对体重。

图24显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记BBM4缀合物治疗的小鼠的SPECT/CT图像。5nmol注射放射性标记约500uCi的Lu-177。白色箭头表示肿瘤，黄色箭头表示肾脏。

图25显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM5缀合物治疗的小鼠的SPECT/CT图像。5nmol注射放射性标记约500uCi的Lu-177。白色箭头表示肿瘤，黄色箭头表示肾脏。

具体实施方式

为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考附图中说明的实施方案，并使用具体的语言对其进行描述。但应理解的是，对这些实施方案的描述无意限制其范围。相反，本公开旨在涵盖本公开的精神和范围内可能包括的替代、修改和等同物。

本公开至少部分基于以下发现：使用肾刷状缘膜(BBM)酶底物将叶酸受体靶向配体与用于成像或放疗的药剂连接，可使缀合物快速从肾脏清除。快速清除使肾癌成像成为可能，并最大限度地减少了多发性肿瘤放疗对肾脏的毒性。除了能从肾脏快速清除外，缀合物还能实现特异性靶向、高肿瘤穿透性以及从受体阴性组织中快速清除。此外，由于叶酸在许多实体瘤的癌症相关巨噬细胞上表达，缀合物可用于治疗多种类型癌症的基质。

提供了式I或式II的缀合物：

FRTL-BBMecL-AA(式I)或FRTL-Alb-BBMecL-AA(式II)，其中：

FRTL是叶酸受体靶向配体，

BBMecL是肾刷状缘膜(BBM)酶可裂解接头，

Alb是白蛋白粘合剂部分，以及

AA是活性剂。

在某些实施方案中，FRTL的分子量低于10,000。Alb可与血清白蛋白非共价结合。

FRTL可以具有以下结构：

其中：

T选自由S、O、NR^4b和-HC＝CH-组成的组，

U、V和W代表二价部分，各自独立地选自由-(R^6a)C＝、-N＝、-(R^6a)C(R^7a)-和-N(R^4a)-组成的组，其中R^6a和R^7a各自独立地选自由氢、卤素和C₁-C₁₂烷氧基组成的组；或R^6a和R^7a合在一起形成羰基，

X和Y各自独立地选自由卤素、R²、OR²、SR³和NR⁴R⁵组成的组，

Q是C或CH，

A¹和A²各自独立地选择由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R^4b)-、-C(Z)N(R^4b)-、-N(R^4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R^4b)-、-N(R^4b)C(Z)O-、-N(R^4b)C(Z)N(R^5b)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R^4b)S(O)₂-、-C(R^6b)(R^7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH₂C≡CH)-、C₁-C₁₂亚烷基和C₁-C₁₂亚烷氧基组成的组，其中Z是氧或硫，

R²、R³、R⁴、R^4a、R^4b、R⁵、R^5b、R^6b和R^7b各自独立地选自由氢、卤素、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷氧基、C₁-C₁₂烷酰基、C₁-C₁₂烯基、C₁-C₁₂炔基、(C₁-C₁₂烷氧基)羰基和(C₁-C₁₂烷基氨基)羰基组成的组，

A³是氨基酸，

R¹选自由氢、卤素、C₁-C₁₂杂烷基和C₁-C₁₂烷氧基组成的组，

R⁶和R⁷各自独立地选自由氢、卤素、C₁-C₁₂烷基和C₁-C₁₂烷氧基组成的组；或R⁶和R⁷合在一起形成羰基，

q是1到3的整数，

p、r、s和t各自独立地是0或1，以及

*表示与BBMecL或Alb的连接点。

“C₁-C₁₂烷基”是指含有1至12个碳原子的直链、支链或环状烃链。根据本发明的教导，C₁-C₁₂烷基的代表性实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、环丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、环己基、异己基、新己基、庚基、环庚基、异庚基、新庚基、辛基、环辛基、异辛基、新辛基、壬基、环壬基、异壬基、新壬基、癸基、环癸基、异癸基、新癸基、十一烷基、环十一烷基、异十一烷基、新十一烷基、十二烷基、环十二烷基、异十二烷基和新十二烷基。

“C₁-C₁₂烷氧基”是与氧单键键合的C₁-C₁₂烷基。

“C₁-C₁₂烷酰基”是与羰基单键键合的C₁-C₁₂烷基。

“C₁-C₁₂烯基”是包含C＝C的C₁-C₁₂烷基。

“C₁-C₁₂炔基”是包含C≡C的C₁-C₁₂烷基。

“(C₁-C₁₂烷氧基)羰基”是与羰基键合的C₁-C₁₂烷氧基。

“(C₁-C₁₂烷基氨基)羰基”是与羰基键合的C₁-C₁₂烷基氨基(即与氨基键合的C₁-C₁₂烷基)。

“C₁-C₁₂杂烷基”是包含至少一个杂原子(即碳或氢以外的原子)的C₁-C₁₂烷基。

“卤素”和“卤代”是指氟、氯、碘或溴。

在某些实施方案中，Q是CH。在某些实施方案中，X是OH，Y是NH₂。在某些实施方案中，W和U是-N(R^4a)-，Q是CH，V是CH₂，A¹是-N(R^4b)-，s是1，p是1，t是0(例如，A¹直接连接到杂环上)。在某些实施方案中，R^4a和R^4b各自独立地是烷基或杂烷基。在某些实施方案中，R^4a和R^4b各自是甲基。

FRTL可以具有以下结构：

其中表示FRTL与Alb或BBMecL的连接点。

Alb可以具有以下结构：

其中表示Alb与FRTL的连接点，

R_12-19独立地是-H、-C₁-C₆烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-CHO、-B(OH)₂、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)₂芳基、-CO₂H、-SO₃H、-SO₂NH₂、-PO₃H₂或-SO₂F；并且R₂₀和R₂₁独立地是-H、-C₁-C₆烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C_1-6烷基、-CN、-CHO、-B(OH)₂、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)₂芳基、-CO₂H、-SO₃H、-SO₂NH₂、-PO₃H₂、-SO₂F或CF₃；

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ABD035(Jonsson et al.,Protein Eng.Des.Sel.21,515–527.doi:10.1093/protein/gzn028(2008))、ABDCon(Jacobs et al.,Protein Eng Des Sel 28(10):385-393(Oct 2015)、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、dsFV CA645(Zorzi et al.,Med ChemComm 10:1068-1081(2019))、纳米抗体(单域抗体(sdAb))或与抗人血清白蛋白结构域克隆E06融合的新抗原受体(VNAR)可变结构域(Barelle et al.,Antibodies 4(3):240-258(2015))。

缀合物的BBMecL可以是任何合适的BBM酶可裂解底物(例如接头)。实例包括表1所示的那些；然而，可以理解的是，BBMecL可以包括现在已知的或此后开发的任何合适的BBM酶可裂解底物。

表1：刷状缘膜酶可切割底物

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在某些实施方案中，缀合物的BBMecL包括：

(i)甲硫氨酸-缬氨酸(Met-Val)，

(ii)X-赖氨酸(X-Lys)或X-精氨酸(X-Arg)或其组合，其中X是甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)，

(iii)甘氨酸-酪氨酸(Gly-Tyr)，

(iv)甘氨酸-苯丙氨酸-(赖氨酸)(Gly-Phe-(Lys))，

(v)甘氨酸-脯氨酸(Gly-Pro)，

(vi)丙氨酸-X(Ala-X)或亮氨酸-X(Leu-X)或其组合，其中X是任意氨基酸，

(vii)天冬氨酸-X(Asp-X)或谷氨酸-X(Glu-X)或其组合，其中X是任意氨基酸、

(viii)γ-谷氨酸-X(γ-Glu-X)，其中X是任意氨基酸，和受体肽，

(ix)蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、帕拉金糖或上述两种或更多种的组合，

(x)碘胰岛素B链，

(xi)根皮甙(phlorizin)，

(xii)对硝基苯磷酸，或

(xiii)上述两种或更多种的组合。

在某些实施方案中，缀合物的BBMecL包括肾BBM可裂解底物/接头。在某些实施方案中，BBMecL的BBM可裂解接头至少连接到缀合物的AA和FRTL(例如，式I的缀合物)。在某些实施方案中，BBMecL的BBM可裂解接头至少连接到缀合物的AA和Alb(例如，式II的缀合物)。当这种缀合物的实施方案被施用于受试者(例如，全身地)时，BBM接头可以裂解并从缀合物的其余部分(例如，FRTL和/或Alb)释放AA。因此，即使缀合物的一部分能与刷状缘膜上的叶酸受体(例如FRα)结合—例如受试者肾脏的刷状缘膜上的叶酸受体—缀合物的其余部分也会被释放，因此不会被器官(例如肾脏)吸收或保留在器官内。

在某些实施方案中，BBM接头可以包括一种或多种非天然氨基酸(UAA)，包括但不限于D-氨基酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、正亮氨酸、3-硝基酪氨酸、硝基精氨酸、萘丙氨酸、氨基丁酸(Abu)、2,4-二氨基丁酸(DAB)、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜等中的一种或多种。

可以理解的是，导致BBM可裂解接头断裂的这些生理条件包括例如在生理pH下发生的标准化学水解反应，或由于分隔到细胞器(例如pH低于细胞溶质pH的核内体)中而发生的标准化学水解反应。举例来说，本文所述的BBM可裂解接头可在其他生理或代谢条件下发生裂解。

AA可以是光学成像剂、放射性成像剂或放射性治疗剂。

在某些实施方案中，AA是光学成像剂。光学成像剂可以是任何能发出可检测信号(例如电磁信号(如无线电信号、荧光信号、伽马射线)或物质)的化合物(或其自由基)。光学成像剂的实例包括但不限于放射成像剂(例如正电子发射断层扫描(PET)成像剂或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像剂)、荧光成像剂(例如荧光染料)等。成像剂可以是磁共振(MR)剂。在一些实施方案中，AA包括适用于PET成像、SPECT成像、其他放射成像技术、磁共振成像或放疗的放射性标记的官能团(例如，其自由基)。AA可以包括放射成像、放疗或磁共振同位素的自由基。

在某些实施方案中，光学成像剂是包含荧光染料的光学成像剂。荧光染料可以选自由S0456、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、LS288、七甲川菁染料(HMCD)、SS180、吖啶橙(AO)、IRDye800CW、IR783、IR825、ZW800-1或吲哚菁绿(ICG)组成的组。

在某些实施方案中，AA是放射性成像剂或放射性治疗剂，其包含选自由¹⁸F、⁴⁴Sc、⁴⁷Sc、⁵²Mn、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、^114mIn、^117mSn、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴⁹Tb、¹⁵³Sm、¹⁵²Tb、¹⁵⁵Tb、¹⁶¹Tb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁵Ab、²²⁵Ac和²²⁷Th组成的组的放射性同位素。

在某些实施方案中，AA包含放射性标记的假体基团，该假体基团包含选自由⁶⁸Ga、¹⁸F、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²²⁵Ac、¹⁸P、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I和²¹¹At组成的组的放射性同位素。放射性标记的假体基团可以包括选自以下的结构：

其中R和R’独立地是氢或甲基，n是选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的整数。放射性标记的假体基团可以包括选自以下的结构：

其中n是选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的整数。

AA可以是螯合基团(例如，螯合剂(或其自由基))。“螯合基团”是指多齿化学基团，它可以通过使用螯合基团上的两个或更多个结合位点，以多重结合相互作用与中心金属原子结合。螯合基团和金属原子的组合就是螯合物。螯合基团与金属原子的结合可以通过非共价相互作用或键合；在一些实施方案中，螯合基团与金属原子的结合通过多个配位键。

AA可以包括选自由以下组成的组的螯合基团或螯合剂：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、SarAr(1-N-(4-氨基苄基)-3,6,10,13,16,19-六氮杂双环[6.6.6]-二十烷-1,8-二胺、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NODAGA(2,2’-(7-(4-((2-氨基乙基)氨基)-1-羧基-4-氧代丁基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸)、HYNIC(6-肼基烟酸)、NETA(4-[2-(双羧基甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基)乙酸、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧乙基)膦酸)、HBED(N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸)、2,3-HOPO(3-羟基吡啶-2-酮)、PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]-十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、DFO(去铁胺)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、OCTAPA(N,N-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N-二乙酸)、H₂macropa(N,N’-双[(6-羧基-2-吡啶基甲基)-4,13-二氮杂-18-冠-6]、H₂dedpa(1,2-[[羧基]-吡啶-2-基]-甲基氨基]乙烷)、包含β-l-二氨基丙酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)和半胱氨酸的EC20-头以及上述任一物质的衍生物。在某些实施方案中，AA可以包括前述任何螯合剂的自由基。

在某些实施方案中，AA可以是或包括与适用于放射成像、放疗或磁共振成像的同位素(或金属)共价结合的基团的自由基。

代表性的螯合基团包括但不限于(包括其游离碱，例如其中一个或多个CO₂H(COOH)的质子(H+)被去除以形成COO-)：

/>

在某些实施方案中，每种螯合剂都可以任选地与适用于放射成像、放疗或磁共振成像的同位素(或金属)结合。

缀合物/化合物

在一些实施方案中，缀合物(例如化合物)具有以下结构：

(BBM1(MVKC))。

在一些实施方案中，缀合物具有以下结构：

(BBM2(MVKGYGKC))。

在一些实施方案中，缀合物可以具有以下结构：

(BBM3(MVK))。

缀合物可以具有以下结构：

/>

BBM4(DOTA-MVK(EB-叶酸)-OH)。

缀合物可以具有以下结构：

BBM5(DOTA-MVK(IP-叶酸)-OH。

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以具有以下结构：

缀合物可以包含一个或多个手性中心，或者可以以多种立体异构体的形式存在，如对映体、非对映体以及对映体或非对映体富集的混合物。除非另有说明，否则应考虑化合物的所有立体异构体形式。当缀合物含有烯烃双键时，除非另有说明，否则应包括E和Z两种几何异构体(例如顺式或反式)。同样，还包括所有可能的异构体以及其外消旋和光学纯形式，以及所有互变异构形式。

缀合物可以作为几何异构体存在。术语“几何异构体”是指烯烃双键的E或Z几何异构体(例如顺式或反式)。本领域普通技术人员会进一步了解到，这些化合物可以“氚化”，即一个或多个氢原子可以被氘取代。

缀合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。一般来说，溶剂化形式等同于非溶剂化形式。缀合物可以以多种结晶或无定形形式存在。一般来说，所有的物理形式对于所考虑的用途都是等效的。制剂包括药学上可接受的盐(例如酸加成盐和碱盐)、水合物和/或溶剂化物。

组合物、施用途径和给药

在某些实施方案中，药物组合物包含多种缀合物和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种兼容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质，其适用于向人或其他脊椎动物施用。术语“载体”是指一种天然或合成的有机或无机成分，将活性成分与之结合以方便施用。载体可以是赋形剂。载体的选择取决于多种因素，如特定的施用方式、载体对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质。适用于递送本文所述的缀合物的药物组合物及其制备方法可参见，例如Remington:The Science&Practice of Pharmacy,21st edition(Lippincott Williams&Wilkins,2005)。

组合物中的各组分还可以与化合物混合，也可以相互混合，混合的方式应确保不会产生严重影响预期药效的相互作用。

组合物可以通过将一种或多种缀合物与药学上可接受的载体以及任选的一种或多种另外的成分结合来制备。制剂可以在药学上可接受的溶液中施用，这些溶液通常可含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体、佐剂以及任选的其他治疗成分。

缀合物和任选的一种或多种其他治疗剂可以本身(纯)或以药学上可接受的盐的形式施用。当用于药物时，盐应是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐也可方便地用于制备其药学上可接受的盐。这些盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，这些盐还可以制备为碱金属盐或碱土盐，如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。

合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。说明性实例包括但不限于：乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐(camsylate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐(hibenzate)、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐(isethionate)、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐(nicotionate)、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、帕莫酸盐(pamoate)、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

本文所述的缀合物的合适碱盐由形成无毒盐的碱形成。说明性实例包括但不限于精氨酸盐、苄星青霉素盐(benzathine)、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐(diolamine)、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐(meglumine)、乙醇胺盐、钾盐、氨丁三醇钠盐(sodiumtromethamine)和锌盐。也可形成酸和碱的半盐，如半硫酸盐和半钙盐。

可以用纯度为至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的缀合物制备用于施用的组合物和/或剂型。可以用纯度为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的缀合物制备用于施用的组合物和/或剂型。

药学上可接受的载体可以包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，以及它们的组合。载体可以适用于肠外施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体，以及用于即刻制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。此类载体(或赋形剂)的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物(例如聚乙二醇)。一种或多种其他活性剂也可以掺入组合物中。

组合物可以配制成液体，例如悬浮液或溶液。液体制剂可以包含水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油，以及一种或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂可以通过对固体进行重构来制备。

药物制剂(例如用于肠外施用)包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性缀合物/化合物的悬浮液可制备成合适的油性注射悬浮液。水性悬浮液可包含单独或与一种或多种其他活性剂进一步结合的缀合物，并与合适的赋形剂混合。赋形剂包括悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、刺黄芪胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂，如卵磷脂；环氧亚烷基与脂肪酸的缩合产物，如聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，如十七亚乙基氧杂环丁醇(heptadecaethyleneoxcycetanol)；环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，如抗坏血酸或乙基、正丙基或对羟基苯甲酸酯，以及一种或多种着色剂。在某些实施方案中，水性悬浮液可以进一步包含合适的亲脂溶剂或载体，包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加缀合物溶解度的试剂，以便制备高浓度溶液。

替代地，组合物可以是粉末形式，在使用前与合适的载体(例如无菌无热原水)混合。适用于通过加水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒可以与悬浮剂、分散剂或润湿剂以及一种或多种防腐剂混合来提供活性成分。此外，还可以存在另外的赋形剂，例如着色剂。

合适的乳化剂包括天然存在的胶，如阿拉伯胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，如大豆卵磷脂；和酯类，包括由脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯，如山梨糖醇酐单油酸酯，以及部分酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。等渗剂，如糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠，也可包含在组合物中。通过在组合物中包含一种或多种延缓吸收的试剂，如单硬脂酸盐和明胶，可延长注射组合物的吸收。

在疗法或治疗中使用时，可以通过任何将化合物递送到所需表面的方式向受试者施用有效量的缀合物或组合物。组合物的施用可以通过熟练技术人员已知的任何方式完成。施用途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、膀胱内(膀胱)、口服、皮下、直接注射(例如注入肿瘤或脓肿)、粘膜(例如眼部局部)、吸入和局部。

对于口服施用，可以通过将缀合物与本领域熟知的药学上可接受的载体结合来容易地配制缀合物。此类载体可将缀合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，供待治疗的受试者口服摄入。口服使用的药物制剂可以以固体赋形剂的形式获得，任选地可以将得到的混合物进行研磨，并在加入合适的辅助剂(如果需要)后，对颗粒混合物进行加工，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，还可以添加崩解剂，如交联PVP、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。任选地，口服制剂也可以在盐水或缓冲液中配制，如用于中和体内酸性条件的EDTA，也可以在不使用任何载体的情况下施用。

还考虑了化合物的口服剂型。可以对缀合物进行化学修饰，使衍生物的口服递送具有疗效。一般来说，考虑的化学修饰是将至少一个部分连接到化合物本身，其中该部分允许(a)抑制酸水解；以及(b)从胃或肠摄入血流。此外或替代地，可以对缀合物进行修饰，以增加其整体稳定性和在体内的循环时间。可用于增加稳定性和/或循环时间的部分的实例包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、PVP和聚脯氨酸。参见，例如，Abuchowski and Davis,“Soluble Polymer-Enzyme Adducts,”In:Enzymesas Drugs,Hocenberg and Roberts,eds.,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,pp.367-383(1981)；Newmark et al.,J Appl Biochem 4:185-189(1982)。其他可使用的聚合物还有聚-1,3-二氧戊环(poly-1,3-dioxolane)和聚-1,3,6-三氧戊环(poly-1,3,6-tioxocane)。如上所述，对于制药用途，聚乙二醇部分是合适的。

可以包含着色剂和/或调味剂。例如，可以配制该化合物(例如通过脂质体或微球封装)，然后进一步将其包含在可食用产品中，如含有着色剂和调味剂的冷藏饮料。

用于口服施用的说明性形式包括但不限于片剂、胶囊、酏剂、糖浆等。

在某些实施方案中，缀合物可直接施用进入血流、肌肉或内脏。这种肠外施用的合适途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜外、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、瘤内、肌内、鼻内和皮下。用于肠外施用的合适方式包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。在希望全身递送缀合物和/或组合物的实施方案中，可将缀合物和/或组合物配制成通过注射，例如通过大剂量注射或连续输注用于肠外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，如在安瓿或多剂量容器中，并添加防腐剂。组合物可采用油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液等形式，并可含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等制剂。

肠外制剂通常为水溶液，可含有载体或赋形剂，如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3-9)，但对于一些应用，它们可能更合适地被配制成无菌非水溶液或干燥形式，该干燥形式与合适的载体如无菌无热原水一起使用。

液体制剂可用于缀合物的肠外施用。在无菌条件下制备肠外制剂，例如通过在无菌条件下冻干，可容易地使用本领域技术人员熟知的标准制药技术完成。缀合物的溶解度可通过使用合适的配制技术(例如掺入溶解度增强剂)来提高。

用于肠外施用的制剂可以配制成用于立即释放和/或经修饰释放。缀合物可以在缓释制剂中施用，例如在包括缓释聚合物的组合物中施用。缀合物可与保护其免于快速释放的危害的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)、聚乳酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PGLA)。制备此类制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。

通过将所需量的缀合物单独或与一种或多种其它活性剂进一步结合，按所需与上述一种或多种成分的组合掺入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常情况下，通过将缀合物掺入含有分散介质和上述任何其他成分的无菌载体中来制备分散体。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从先前经过无菌过滤的溶液中得到活性成分加任何其他所需成分的粉末，或者将这些成分一起进行无菌过滤。

组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂来保持适当的流动性。

在合适的情况下，缀合物或包含缀合物的组合物可以连续施用。

试剂盒

还进一步提供了一种试剂盒。如果要施用一种以上的缀合物，或者如果要将缀合物与一种或多种其他活性剂同时或依次(任一顺序)施用，则可将缀合物和活性剂(或包含它们的组合物)组合在试剂盒中。在至少一个实施方案中，试剂盒包含至少一个剂量单位的缀合物或包含缀合物的组合物。在至少一个实施方案中，试剂盒包含至少一个剂量单位的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物。“剂量单位”是指通过一次递送操作一次性施用的组合物或缀合物。例如，在组合物配制成通过鼻腔递送用于经粘膜施用的实施方案中，剂量单位是通过一次递送操作施用的组合物的体积或活性剂的量。

缀合物和活性剂可以以固体或液体形式存在于同一或单独的容器中，例如小瓶、分隔瓶、分隔箔包等。试剂盒还可以包含使用说明。这些说明可以印在纸上、以电子可读介质的形式提供或可以在互联网上访问，如通过电子邮件、文本、社交媒体、网站等。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含在治疗过程中施用缀合物和/或活性剂的装置。这种用于施用的装置可以例如包括注射器、止血带、支架、套管和/或套管针。

成像和/或治疗方法

还进一步提供了一种通过将放射性单独或进一步与光学成像剂结合，靶向肿瘤细胞、与肿瘤相关的巨噬细胞(肿瘤相关巨噬细胞(TAM))或两者，对受试者肿瘤(例如癌症)进行成像、治疗或成像并治疗的方法。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的缀合物或包含缀合物和药学上可接受的载体的组合物。该方法可以进一步包括对肿瘤进行成像。成像可以是光学成像、PET或SPECT。

在某些实施方案中，对受试者肿瘤(例如癌症)进行成像、治疗或成像并治疗的方法包括将肿瘤细胞(例如癌症患者的肿瘤细胞)与本文提供的任一式的化合物(例如缀合物)接触。

因此，提供了一种用于对患有癌症的受试者中的癌症(例如肿瘤)进行成像的方法。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的缀合物(例如，作为药物组合物的一部分或其他)。在某些实施方案中，该方法进一步包括对受试者进行成像。在某些实施方案中，该方法进一步包括生成受试者的癌症(例如肿瘤)的图像(例如，在施用缀合物之后或与施用缀合物同时)。

还提供了光学成像的方法。在某些实施方案中，对受试者进行光学成像的方法包括向受试者施用有效量的任何缀合物(例如，作为药物组合物的一部分或其他)。例如，该方法可用于荧光引导手术。该方法可用于放射成像。该方法可用于MRI。

该方法可与一种或多种另外的疗法和/或活性剂结合使用。这些另外的疗法包括但不限于免疫疗法、施用DNA损伤反应途径抑制剂、化疗和/或手术。

“有效量”是指在受试者(即组织、器官或生物体，如脊椎动物，如哺乳动物，如人类)中引起研究人员、兽医、医生或其他诊治者所寻求的所需的生物或药物反应的缀合物或包含缀合物的组合物的量，所述反应包括但不限于正在治疗的疾病或病症的体征和/或症状的成像和/或缓解。在一个方面，有效量是活性剂的量，可以以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比治疗或减轻疾病的体征和/或症状。前药的有效量是非活性前药的量，在通过正常代谢过程转化时，产生的活性药物的量能在受试者中引起所寻求的所需的生物或药物反应。在治疗中使用的“有效量”是指制剂中化合物的量，当作为所需的剂量方案的一部分施用(例如，向哺乳动物，如人)时，根据临床上可接受的待治疗疾病或状况或美容目的的标准，例如，以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比，减轻症状、改善状况或减缓疾病的发生。

结合本文所提供的教导，通过在各种活性剂中进行选择，并权衡诸如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和施用方式等因素，可以规划出一种有效的预防性或治疗性治疗方案，该方案不会引起大量不希望的毒性，但却能有效治疗特定受试者。

根据癌症类型、施用途径和/或缀合物是局部施用还是全身施用，本文考虑了广泛的允许剂量，包括落入约1μg/kg至约1g/kg的范围中的剂量。根据患者的病况、所治疗的癌症、施用途径、组织分布以及联合使用其他治疗性治疗(例如放疗或联合疗法中的其他药物)的可能性，单位日剂量可能会有很大的不同。向患者施用的有效量取决于体表面积、质量以及医生对患者病况的评估。治疗有效剂量(在本文中也称为“治疗有效量”或“有效量”)的范围可为约0.5至20.0mg/m²。

对于任何缀合物，可根据动物模型初步确定有效量。对于已在人体中进行过测试的化合物以及已知具有类似药理活性的缀合物/化合物(例如其他相关活性剂)，也可根据人体数据确定有效剂量。肠外施用可能需要更大的剂量。任何特定应用的有效量都可能因治疗的疾病或病况、施用的特定缀合物、受试者的体型或疾病或病况的严重程度等此类因素而异。本领域普通技术人员可以根据经验确定特定化合物和/或其他治疗剂的有效量，而不必进行不必要的实验。可以使用最大剂量，即根据一些医学判断的最高安全剂量。每天可使用多个剂量，以达到合适的化合物全身水平。例如，可通过测量患者中药物的峰值或持续血浆水平来确定合适的全身水平。“剂量”和“用量”在本文中可互换使用。

根据所述方法和本领域熟知的其他方法调整剂量以达到最大疗效完全在普通熟练技术人员的能力范围内。可根据施用方式适当调整剂量，以达到所需的局部或全身药物水平。例如，用于静脉施用的剂量可以从每天低一个数量级到低几个数量级不等。如果在这种剂量下受试者的反应不充分，可以在受试者耐受性允许的范围内使用更大的剂量(或通过不同的、更局部的递送途径使用有效的更大剂量)。可以考虑每天多个剂量，以达到合适的化合物全身水平。

可以使用用于施用缀合物的任何有效的方案。剂量可以是单次或分次的，并且可以按照多种方案施用，包括q.d.、b.i.d.、t.i.d.，甚至隔天一次、一周两次(b.i.w.)、一周一次、一月一次、一季度一次等。在上述每种情况下，可以理解的是，本文所述的有效量与施用实例相对应，或者与由给药方案确定的每日、每周、每月或每季度的总剂量相对应。

例如，缀合物可以以单剂量施用，或者可以作为每日多剂量方案分次施用。此外，还可采用交错方案，例如每周一至五天，作为每日治疗的替代方案。这种间歇或交错的每日方案被认为等同于每日治疗。患者可以通过多次注射缀合物来治疗癌症。患者可以多次(例如约2-50次)注射缀合物，例如间隔12-72小时或间隔48-72小时。可以在首次注射后间隔数天或数月对患者进行缀合物的额外注射，额外注射可以防止癌症复发。

替代地，可以选择单独的剂量以及剂量方案，例如，一个月内施用的总剂量为约15mg。可以在每个4周周期的第1、第2和第3周，以每周5天、每天一次的剂量施用缀合物，第4周不施用。在另一个替代实例中，可以在每个4周周期的第1周和第3周，以每周3天、每天一次的剂量施用缀合物，第2周和第4周不施用。在另一个替代实例中，可以在第1周和第2周，一周两次施用缀合物(即3周周期的第1、4、8和11天)。作为另一个替代实例，可在第1周和第2周(即3周周期的第1天和第8天)每周施用一次。

“受试者”可以是人类患者、实验动物，如啮齿动物(如小鼠、大鼠或仓鼠)、兔子、猴子、黑猩猩、家畜(如狗、猫或兔子)、农业动物(如奶牛、马、猪、绵羊或山羊)或圈养的野生动物(如熊、熊猫、狮子、老虎、豹、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚或鲸鱼)。

癌症可以是致瘤的癌细胞群，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，也可以是非致瘤的癌细胞群。癌症可以通过种系突变或体细胞突变自发产生，或者癌症可以通过化学、病毒或放射诱导产生。癌症包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌和骨髓瘤。癌症可以是肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌症、颈部癌症、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、平滑肌肉瘤、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、胆管癌、Hurthle细胞甲状腺癌或胃食管交界处腺癌。

其他定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均与化学和生物领域的技术人员通常理解的含义相同。此外，如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非内容另有明确规定。因此，举例来说，当化合物/组合物被“一个”烷基或芳基取代时，该化合物/组合物任选地被至少一个烷基和/或至少一个芳基取代。

“Oxo”是指＝O自由基。

“烷基”通常是指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链自由基，例如具有1至15个碳原子(例如C₁-C₁₅烷基)。除非另有说明，否则本文对“烷基”的公开旨在包括对饱和“烷基”的独立记载。烷基可包含一至十三个碳原子(例如C₁-C₁₃烷基)。烷基可包含一至八个碳原子(例如C₁-C₈烷基)。烷基可包含一至五个碳原子(例如C₁-C₅烷基)。烷基可包含一至四个碳原子(例如C₁-C₄烷基)。烷基可包含一至三个碳原子(例如C₁-C₃烷基)。烷基可包含一至二个碳原子(例如C₁-C₂烷基)。烷基可包含一个碳原子(例如C₁烷基)。烷基可包含五至十五个碳原子(例如C₅-C₁₅烷基)。烷基可包含五至八个碳原子(例如C₅-C₈烷基)。烷基可包含二至五个碳原子(例如C₂-C₅烷基)。烷基可包含三至五个碳原子(例如C₃-C₅烷基)。在其他实施方案中，烷基选自甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、1-甲基乙基(异丙基)、1-丁基(正丁基)、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-戊基(正戊基)。烷基通过单键与分子的其余部分相连。

“烷氧基”是指通过式-O-烷基的氧原子键合的自由基，其中烷基是如上文所定义的烷基链。

“亚烷基”或“亚烷基链”通常是指将分子的其余部分与自由基相连的直链或支链二价烷基，例如具有1至12个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、正亚丁基等。

“芳基”是指通过从环状碳原子上去除氢原子而由芳香族单环或多环烃环体系衍生的自由基。芳香族单环或多环烃环体系只含有氢和碳，为5至18个碳原子，其中环体系中的至少一个环是完全不饱和的，即根据Hückel理论，它含有环状的、离域化的(4n+2)π电子系统。衍生芳基的环体系包括但不限于苯、芴、茚满、茚、萘满和萘等基团。

“芳烷基”或“芳基-烷基”是指式-R^c-芳基的自由基，其中R^c是如上文所定义的亚烷基链，例如亚甲基、亚乙基等。芳烷基自由基的亚烷基链部分任选地被取代，如上文对亚烷基链所述。

“约”可允许数值或范围有一定程度的可变性，例如，在所述数值或范围的所述极限的10％、5％或1％以内。

术语“包括”(以及相关术语，如“包含”或“含有”或“具有”)无意排除可能“由所述特征组成”或“由所述特征组成”的任何化合物、组合物、方法、过程等的实施方案。本文中说明性描述的本发明可在没有任何本文未具体公开的元素或限制的情况下适当地实施。

术语“杂烷基”是指如上文所定义的烷基，其中烷基的一个或多个骨架碳原子被杂原子取代(具有合适数目的取代基或化合价—例如，-CH2-可被-NH-或-O-取代)。例如，每个被取代的碳原子独立地被杂原子取代，例如其中碳被氮、氧、硒或其他合适的杂原子取代。在一些情况下，每个被取代的碳原子独立地被氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-或具有本文考虑的其他取代基)或硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)₂-)取代。杂烷基在杂烷基的碳原子上与分子的其余部分相连。杂烷基在杂烷基的杂原子上与分子的其余部分相连。杂烷基是C₁-C₁₈杂烷基。杂烷基是C₁-C₁₂杂烷基。杂烷基是C₁-C₆杂烷基。杂烷基是C₁-C₄杂烷基。杂烷基可包括如本文所定义的烷氧基、烷氧基烷基、烷基氨基、烷基氨基烷基、氨基烷基、杂环烷基、杂环烷基和杂环烷基烷基。

如本文所用，术语“自由基”是指分子的片段，其中该片段具有可形成键的开放化合价。单价自由基具有一个开放化合价，因此它可以与另一个化学基团形成一个键。除非另有说明，否则分子的自由基是通过从该分子中移除一个氢原子而产生的，在移除氢原子的位置产生具有一个开放化合价的单价自由基。在合适的情况下，自由基可以是二价、三价等，其中两个、三个或更多个氢原子或其他基团被移除，从而产生可以与两个、三个或更多个化学基团键合的自由基。在合适的情况下，可通过除去氢原子以外的原子(例如卤素)或除去两个或更多个原子(例如羟基)来产生自由基开放化合价，只要除去的原子只占形成自由基的分子中总原子的一小部分(原子数的20％或更少)即可。

“基本上”可允许数值或范围有一定程度的可变性，例如，在所述数值或范围的所述极限的90％、95％或99％以内。

虽然本公开的概念在本文的附图和描述中进行了详细说明和描述，但附图中的结果及其描述应被视为示例性的，而非限制性的；可以理解的是，仅示出和描述了说明性的实施方案，并且希望保护符合本公开精神的所有变化和修改。事实上，列出所提供的大量具体细节是为了提供对本公开的全面理解。特定的实例例可以在没有部分或全部这些具体细节的情况下实施，并且应当理解的是，本公开并不局限于特定的生物系统、特定的癌症或特定的器官或组织，这些当然可以有所不同，但鉴于本文提供的数据仍然适用。

本文引用的各个和每篇专利文献、非专利文献和参考文献的全部内容均通过引用的方式并入本文，但如果与本说明书的公开内容或定义有任何不一致，则以本文的公开内容或定义为准。

本公开的各种技术和机制有时会描述两个组件之间的连接或链接。附接、相连、偶联、连接等词及其词形变化的类似术语可互换使用，除非在上下文中指出了区别或以其他方式明确了区别。这些词和表达方式不一定表示直接连接，也包括通过中介组件的连接。需要注意的是，两个组件之间的连接并不一定表示直接、无障碍的连接，因为在这两个组件之间还可能存在其他各种组件。因此，除非另有说明，否则连接并不一定表示直接、无障碍的连接。

标题和子标题的使用仅仅是为了便于参考，并不旨在将给定标题或子标题下的本公开的范围限制在该标题或子标题下所阐述的主题上。相反，任何标题或子标题下的公开内容均适用于本文的所有主题，除非另有明确说明或与上下文相矛盾。

实施例

以下实施例用于说明本公开，但不旨在以任何方式限制其范围。

实施例1

具有刷状缘膜(BBM)接头M-V-K-C的叶酸配体的合成

2-氯三苯甲基树脂在10mL DCM/g树脂中溶胀，然后过滤。将2.0当量的第一氨基酸和4.0当量的DIPEA溶解在10mL DCM/g树脂中，然后加入到树脂中。将混合物搅拌2小时，然后每克树脂加入0.8mL MeOH封端30分钟。依次用DMF、DCM和MeOH洗涤树脂两次。

其他氨基酸和模拟肽分子与肽如下缀合。首先，通过将树脂在20％的哌啶/DMF溶液(v/v)中悬浮3次，每次悬浮20分钟，并在每次悬浮之间依次用DMF、DCM和DMF洗涤5次，对Fmoc进行脱保护。然后，将2当量的适当氨基酸与2当量的HATU和4当量的DIPEA溶解在20mLDMF/g树脂中。将溶液孵育5分钟，然后加入到树脂中并用惰性气体鼓泡2-3小时。

在进行下一个氨基酸之前，在相同条件下重复偶联步骤。3当量的DOTA-三(t-Bu酯)、HATU和6当量的DIPEA用于偶联。在惰性气体下，通过将1当量的刚用MeOH漂洗过的Pd(PPh₃)₄和20当量的苯基硅烷当量加入到DCM中浓度为约0.05M的树脂中1小时，对Alloc进行脱保护。用DMF、N,N-二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.03M，DMF中)和DCM洗涤树脂三次。用40％NH₄OH/DMF溶液(v/v)对用COCF₃保护的蝶酸(pteoric acid)进行脱保护，持续6小时。通过将含有5mM TCEP的95％TFA/2.5％TIPS/2.5％H₂O溶液与树脂孵育1小时来裂解最终的肽缀合物。裂解产物在冰冷的二乙醚中沉淀，并与含马来酰亚胺的染料偶联，无需进一步纯化。

使用RP-HPLC(Agilent Technologies；Santa Clara,CA；C18 10μm；19mm×250mm)对最终产物进行纯化。

实施例2

S0456-马来酰亚胺的合成并偶联至叶酸-M-V-K-C-SH的BBM接头(BBM1(MVKC))

按照先前公开的方案合成S0456马来酰亚胺和Evans Blue马来酰亚胺(国际公开号WO/2019/165200)。使用RP-HPLC(Agilent Technologies；Santa Clara,CA；C18 10μm；19mm×250mm)纯化最终产品。

实施例3

BBM3(MVK)的合成

实施例4

叶酸缀合物结合曲线

KB细胞在4℃下与染色缓冲液中浓度不断增加的OTL38、BBM1、BBM2或BBM3孵育1小时，用染色缓冲液洗涤三次，然后通过流式细胞术进行分析。

如Mahalingam et al.,Evaluation ofNovel Tumor-Targeted Near-InfraredProbe for Fluorescence-Guided Surgery of Cancer,Journal of MedicinalChemistry 2018 61(21),9637-9646中所述合成OTL38。根据本文所述方案合成BBM2，它是一种序列为M-V-K-G-Y-G-K-C的肽。

实施例5

叶酸BBM放射性配体缀合前体的合成

用于白蛋白-粘合剂偶联的叶酸-BBM-DOTA前体的合成：试剂和条件：a)2-氯三苯甲基树脂，DIPEA，DCM，室温(rt)，2小时；b)i.20％哌啶DMF，Ar，20分钟(x3)；ii.Fmoc-Met-OH，HATU，DIPEA，DMF，Ar，3小时(x2)；c)i.20％哌啶DMF，Ar，20分钟(x3)；ii.DOTA-三(t-Bu酯)，HATU，DIPEA，DMF，Ar，3小时；d)Pd(PPh₃)₄，苯基硅烷，DCM，Ar，1小时；e)i.Fmoc-Cys-OH，HATU，DIPEA，DMF，Ar，3小时(x2)；ii.20％哌啶DMF，Ar，20分钟(x3)；iii.Fmoc-Glu-OtBu，HATU，DIPEA，DMF，Ar，3小时；f)i.20％哌啶DMF，Ar，20分钟(x3)；ii.N10-TFA-蝶酸，HATU，DIPEA，DMF；g)i.50％NH₄OH DMF，Ar；ii.TCEP，95/2.5/2.5TFA/TIPS/H₂O，1小时。

实施例6

BBM4的合成

DOTA-MVK(EB-叶酸)-OH的合成。试剂和条件：a)联甲苯胺(Tolidine)，HATU，DIPEA，DMF，过夜；b)i.HCl，NaNO₂，ACN，H₂O，0℃，30分钟；ii.1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸，NaHCO₃，H₂O，0℃-rt，1.5小时；c)DOTA-MVK(Cys-叶酸)-OH，DMSO，Ar，室温，4小时。

实施例7

BBM5的合成

DOTA-MVK(IP-叶酸)-OH的合成。试剂和条件：a)4-iodopheyl-丁酸，HATU，DIPEA，DMF，室温，3小时；b)DOTA-MVK(Cys-叶酸)-OH，DMSO，Ar，室温，4小时。

实施例8

通过流式细胞术验证叶酸靶向性

将OTL38、BBM1和BBM2中的每一种与之前在叶酸缺乏培养基中培养的KB细胞在没有或有100倍过量叶酸葡糖胺的情况下在4℃下孵育1小时。细胞被洗涤三次，然后通过流式细胞术进行分析。结果如图1A-1C所示。

实施例9

叶酸缀合物结合曲线

KB细胞在4℃下与染色缓冲液中浓度不断增加的OTL38、BBM1、BBM2或BBM3孵育1小时，用染色缓冲液洗涤三次，并悬浮在磷酸盐缓冲盐水中，然后通过流式细胞术进行分析。结果如图2A-2D所示。所有缀合物的浓度都通过荧光归一化。在50nM下，所有缀合物都显示出与叶酸-葡糖胺的竞争。

实施例10

小鼠体内研究

以叶酸缺乏饮食饲养瑞士韦伯斯特(Swiss Webster)小鼠3周以上。然后向小鼠尾静脉注射1nmol的OTL38、BBM1或BBM2(1-2只小鼠/缀合物)，并在注射后24小时、1小时、3小时或6小时处死小鼠。解剖小鼠，扫描其心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的荧光。结果分别如图3A和3B、4A和4B、5A和5B以及6A和6B所示。

另外，以叶酸缺乏饮食饲养其他瑞士韦伯斯特小鼠3周以上，尾静脉注射1nmol的OTL38、BBM1、BBM2或BBM3(1只小鼠/缀合物)。注射后1小时(1h p.i.)和3小时(3h p.i.)，扫描小鼠的荧光。OTL38和BBM3的结果如图7所示。注射后3小时解剖小鼠，扫描其心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的荧光。OTL38、BBM1、BBM2和BBM3的结果如图8A和8B所示。

在另一项实验中，以叶酸缺乏饮食饲养瑞士韦伯斯特小鼠3周以上，尾静脉注射5nmol的OTL38或BBM3(1只小鼠/缀合物)。在注射后1小时(1h p.i.)、3小时(h p.i.)、6小时(6h p.i.)和24小时(24h p.i.)，扫描小鼠的荧光。结果如图9A和9B所示。注射后24小时解剖小鼠，扫描其心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的荧光。结果如图10所示。

在另一项实验中，以叶酸缺乏饮食饲养3周以上的无胸腺裸鼠尾静脉注射5nmol的OTL38、BBM1或BBM2(1只小鼠/缀合物)。注射后24小时，解剖小鼠并扫描其肿瘤(KB)、心脏、肺脏、肝脏和肾脏的荧光。结果如图11所示。

以叶酸缺乏饮食饲养3周以上的无胸腺裸鼠尾静脉注射5nmol的OTL38或BBM3(1-2只小鼠/缀合物)。注射后1小时(1小时p.i.)、3小时(3小时p.i.)、6小时(6小时p.i.)和24小时(24小时p.i.)，扫描小鼠肿瘤(MDA-MB-231)与肾脏的荧光。结果如图12所示。

以叶酸缺乏饮食饲养无胸腺裸鼠3周以上，尾静脉注射5nmol的OTL38或BBM3(1-2只小鼠/缀合物)。注射后1小时(1小时p.i.)、3小时(3小时p.i.)、6小时(6小时p.i.)和24小时(24小时p.i.)，扫描小鼠肿瘤(MDA-MB-231)与肾脏的荧光。结果如图13所示。

以叶酸缺乏饮食饲养无胸腺裸鼠3周以上，尾静脉注射5nmol的OTL38或BBM3(1-2只小鼠/缀合物)。注射后24小时，解剖小鼠并扫描其肿瘤(MDA-MB-231)、心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的荧光。结果如图14所示。

实施例11

用¹¹¹In对BBM4和BBM5进行放射性标记

叶酸-DOTA缀合物用乙酸铵(0.5M，pH 8.0)稀释至最终缀合物浓度为0.5mM。加入铟-111(¹¹¹InCl₃)以获得1MBq/nmol的比活性，然后加热至90℃持续10分钟。加入二亚乙基三胺五乙酸钠溶液(5mM，pH 7.0)以络合任何未反应的痕量放射性同位素。放射化学纯度通过放射性-HPLC进行分析，使用Agilent 1260Infinity II，配有从LabLogic Systems Ltd.(Brandon,FL)购买的Flow-RAM检测器和反相XBridge Shield RP18柱(3.0×50mm,3.5μm)。流动相由20mM乙酸铵水性缓冲液(pH 7)(A)和乙腈(B)组成，线性梯度为5％B-95％B，历时15分钟。¹¹¹In放射性标记的叶酸-DOTA缀合物的放射化学纯度≥95％。图15是¹¹¹In-BBM4的放射色谱图。图16是¹¹¹In-BBM5的放射色谱图。

实施例12

¹¹¹In-BBM4和¹¹¹In-BBM5在KB细胞中的结合

将KB细胞(200,000个)接种到24孔胺涂覆的板中，并使其粘附过夜。细胞达到汇合后，在室温下与浓度不断增加的¹¹¹In-BBM4或¹¹¹In-BBM5(在没有或有100倍过量叶酸-葡糖胺的情况下)孵育一小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次以去除未结合的放射性，并将细胞溶解在1.0M NaOH中。将样品转移到管中，使用Packard Cobra伽马计数器测量细胞结合的放射性。使用单位点特异性非线性拟合计算特异性结合常数。图17A是浓度(nM)与CPM的关系的图，显示了铟-111放射性标记的BBM4缀合物在KB细胞中的结合。图17B是浓度(nM)与CPM的关系的图，显示了铟-111放射性标记的BBM5缀合物在KB细胞中的结合。

实施例13

¹¹¹In-BBM4和¹¹¹In-BBM5在体内的结合

使用普杜大学Bindley生物科学中心的VECTor/CT系统进行放射性扫描，该系统带有簇式多针孔高能准直器(MILabs B.V.,Utrecht,The Netherlands)。12周龄的雌性ND4瑞士韦伯斯特小鼠和12周龄的雌性无胸腺nu/nu小鼠购自Envigo(Indianapolis,IN)。所有小鼠均可自由摄入叶酸缺乏的饮食和水。小鼠按标准的12小时光-暗周期饲养。在进行SPECT/CT扫描之前，通过在小鼠肩部接种5×10⁶个MDA-MB-231细胞，使MDA-MB-231肿瘤长到约1cm³。每只小鼠经尾静脉静脉注射多达5nmol ¹¹¹In-BBM4或¹¹¹In-BBM5。小鼠(每组n＝1)在氧气中使用3％异氟醚麻醉，并在多个时间点进行全身扫描。发射扫描进行15-60分钟。CT扫描是在60kV和615μA的X射线源设置下获得的。使用U-SPECT II软件和171和241keV的¹¹¹Inγ能量窗对SPECT图像进行重建。使用POS-EM算法，在0.8mm的体素网格上有16个子集和4次迭代。使用NRecon软件对CT图像进行重建。使用PMOD软件(3.2版)对数据集进行融合和过滤。

图18显示了健康小鼠体内铟-111放射性标记的BBM4缀合物(¹¹¹In-BBM4)的SPECT/CT图像。1nmol注射放射性标记约250uCi的In-111。黄色箭头表示肾脏。图19显示了健康小鼠体内铟-111放射性标记的BBM5缀合物(¹¹¹In-BBM5)的SPECT/CT图像。1nmol注射放射性标记约250uCi的In-111。黄色箭头表示肾脏。图20显示了健康小鼠体内铟-111放射性标记的BBM4缀合物(¹¹¹In-BBM4)的SPECT/CT图像。5nmol注射放射性标记约250uCi的In-111。黄色箭头表示肾脏。

实施例14

用¹⁷⁷Lu对BBM4和BBM5进行放射性标记

叶酸-DOTA缀合物用乙酸铵(0.5M，pH 8.0)稀释达到最终缀合物浓度为0.5mM。加入镥-177(¹⁷⁷LuCl₃)以获得4MBq/nmol的比活性，然后加热至90℃持续10分钟。加入二亚乙基三胺五乙酸钠溶液(5mM，pH 7.0)以络合任何未反应的痕量放射性同位素。放射化学纯度通过放射性-HPLC进行分析，使用Agilent 1260Infinity II，配有从LabLogic(Brandon,FL)购买的Flow-RAM检测器和反相XBridge Shield RP18柱(3.0×50mm,3.5μm)。流动相由20mM乙酸铵水性缓冲液(pH 7)(A)和乙腈(B)组成，线性梯度为5％B至95％B，历时15分钟。¹⁷⁷Lu放射性标记的叶酸-DOTA缀合物的放射化学纯度≥95％。图21是¹⁷⁷Lu-BBM4的放射色谱图。图22是¹⁷⁷Lu-BBM5的放射色谱图。

实施例15

¹⁷⁷Lu-BBM4和¹⁷⁷Lu-BBM5在体内的结合

12周龄的雌性无胸腺nu/nu小鼠购自Envigo，可自由摄入叶酸缺乏的饮食和水。小鼠按标准的12小时光-暗周期饲养。通过在小鼠肩部接种5×10⁶个KB细胞，使KB肿瘤长到约300mm³。在治疗研究开始前，将小鼠随机分为对照组和治疗组。小鼠在第0天通过尾静脉接受单次静脉剂量的无菌生理盐水或5nmol经18MBq的镥-177放射性标记的BBM4或BBM5。治疗期间每隔一天在两个垂直方向测量肿瘤，肿瘤体积按0.5×L×W²计算，其中L为最长轴(单位为毫米)，W为垂直于L的轴(单位为毫米)。人道终点标准定义为体重下降超过初始体重的20％、肿瘤体积超过1,800mm³或出现开放性溃疡。小鼠在达到预定义终点标准之一时被安乐死。

图23A是天数与肿瘤体积(mm³)的关系的图，显示了用177Lu放射性标记的BBM缀合物治疗的小鼠中KB肿瘤的总体积。图23B是天数与相对肿瘤大小的关系的图，显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM缀合物治疗的小鼠中KB肿瘤的相对大小。图23C是天数与相对体重(％)的关系的图，显示了具有KB肿瘤并用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM缀合物治疗的小鼠的相对体重。

使用普杜大学Bindley生物科学中心的VECTor/CT系统进行放射性扫描，该系统带有簇式多针孔高能准直器(MILabs B.V.,Utrecht,The Netherlands)。扫描的小鼠选自图23A-23C中的放疗组。小鼠(每组n＝1)在氧气中使用3％异氟醚进行麻醉，并在多个时间点进行全身扫描。发射扫描进行15-60分钟。CT扫描是在60kV和615μA的X射线源设置下获得的。使用U-SPECT II软件和208kV的177Luγ能量窗口对SPECT图像进行重建。采用POS-EM算法，在0.8毫米的体素网格上有16个子集和4次迭代。使用NRecon软件对CT图像进行重建。使用PMOD软件(3.2版)对数据集进行融合和过滤。图24显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM4缀合物治疗的小鼠的SPECT/CT图像。5nmol注射放射性标记约500uCi的Lu-177。上箭头表示肿瘤，下箭头表示肾脏。图25显示了用¹⁷⁷Lu放射性标记的BBM5缀合物治疗的小鼠的SPECT/CT图像。5nmol注射放射性标记约500uCi的Lu-177。上箭头表示肿瘤，下箭头表示肾脏。

实施例16

具有BBM酶不稳定接头的叶酸染料缀合物结构

实施例17

具有BBM酶不稳定接头的叶酸放射性缀合物结构

其他参考文献

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23.Vaidyanathan,G.；Kang,C.M.；McDougald,D.；Minn,I.；Brummet,M.；Pomper,M.G.；Zalutsky,M.R.,Brush border enzyme-cleavable linkers:Evaluation forreducing renal uptake of radiolabeled prostate-specific membrane antigeninhibitors.Nuclear Medicine and Biology 2018,62-63,18-30.

24.Radiopharmaceutical Agents(Chinese Patent Application PublicationNo.CN111065646A published April 24,2020).

25.Novel radiometal-binding compounds for diagnosis or treatment ofprostate specific membrane antigen-expressing cancer(Canadian PatentApplication Publication No.CA3079906A1 published April 25,2019).

26.Trifunctional constructs with tunable pharmacokinetics useful inimaging and anti-tumor therapies(US Patent Application Publication No.2019/0015531 A1 published September 18,2018).

27.Folate conjugates of albumin-binding entities(US Patent No.9295739B2 filed August 10,2012)。

Claims (46)

1.一种式I或式II的缀合物：

FRTL-BBMecL-AA(式I)或FRTL-Alb-BBMecL-AA (式II)，其中：

FRTL是叶酸受体靶向配体，

BBMecL是肾刷状缘膜(BBM)酶可裂解接头，

Alb是白蛋白粘合剂部分，以及

AA是活性剂。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中FRTL具有以下结构：

其中：

T选自由S、O、NR^4b和-HC＝CH-组成的组，

U、V和W代表二价部分，各自独立地选自由-(R^6a)C＝、-N＝、-(R^6a)C(R^7a)-和-N(R^4a)-组成的组，其中R^6a和R^7a各自独立地选自由氢、卤素和C₁-C₁₂烷氧基组成的组；或R^6a和R^7a合在一起形成羰基，

X和Y各自独立地选自由卤素、R²、OR²、SR³和NR⁴R⁵组成的组，

Q是C或CH，

A¹和A²各自独立地选择由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R^4b)-、-C(Z)N(R^4b)-、-N(R^4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R^4b)-、-N(R^4b)C(Z)O-、-N(R^4b)C(Z)N(R^5b)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R^4b)S(O)₂-、-C(R^6b)(R^7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH₂C≡CH)-、C₁-C₁₂亚烷基和C₁-C₁₂亚烷氧基组成的组，其中Z是氧或硫，

R²、R³、R⁴、R^4a、R^4b、R⁵、R^5b、R^6b和R^7b各自独立地选自由氢、卤素、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷氧基、C₁-C₁₂烷酰基、C₁-C₁₂烯基、C₁-C₁₂炔基、(C₁-C₁₂烷氧基)羰基和(C₁-C₁₂烷基氨基)羰基组成的组，

A³是氨基酸，

R¹选自由氢、卤素、C₁-C₁₂杂烷基和C₁-C₁₂烷氧基组成的组，

R⁶和R⁷各自独立地选自由氢、卤素、C₁-C₁₂烷基和C₁-C₁₂烷氧基组成的组；或R⁶和R⁷合在一起形成羰基，

q是1到3的整数，

p、r、s和t各自独立地是0或1，以及

*表示与BBMecL或Alb的连接点。

3.根据权利要求2所述的缀合物，其中Q是CH。

4.根据权利要求2所述的缀合物，其中X是OH，Y是NH₂。

5.根据权利要求2或3所述的缀合物，其中W和U是-N(R^4a)-；Q是CH；V是CH₂；A¹是-N(R^4b)-；s是1；p是1；t是0。

6.根据权利要求4所述的缀合物，其中W和U是-N(R^4a)-；Q是CH；V是CH₂；A¹是-N(R^4b)-；s是1；p是1；t是0。

7.根据权利要求2所述的缀合物，其中R^4a和R^4b独立地是烷基或杂烷基。

8.根据权利要求7所述的缀合物，其中R^4a和R^4b是甲基。

9.根据权利要求4所述的缀合物，其中R^4a和R^4b独立地是烷基或杂烷基。

10.根据权利要求9所述的缀合物，其中R^4a和R^4b是甲基。

11.根据权利要求5所述的缀合物，其中R^4a和R^4b独立地是烷基或杂烷基。

12.根据权利要求11所述的缀合物，其中R^4a和R^4b是甲基。

13.根据权利要求6所述的缀合物，其中R^4a和R^4b独立地是烷基或杂烷基。

14.根据权利要求13所述的缀合物，其中R^4a和R^4b是甲基。

15.根据权利要求2所述的缀合物，其中FRTL具有以下结构：

其中表示FRTL与Alb或BBMecL的连接点。

16.根据权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中Alb具有以下结构：

其中表示Alb与FRTL的连接点；

R_12-19独立地是-H、-C₁-C₆烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-CHO、-B(OH)₂、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)₂芳基、-CO₂H、-SO₃H、-SO₂NH₂、-PO₃H₂或-SO₂F；并且R₂₀和R₂₁独立地是-H、-C₁-C₆烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C_1-6烷基、-CN、-CHO、-B(OH)₂、-C＝C-C(O)芳基、-C＝C-S(O)₂芳基、-CO₂H、-SO₃H、-SO₂NH₂、-PO₃H₂、-SO₂F或CF₃；

ABD035、ABDCon、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、dsFV CA645、纳米抗体或与抗人血清白蛋白结构域克隆E06融合的新抗原受体可变结构域(VNAR)。

17.根据权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中BBMecL包括：

(i)Met-Val，

(ii)X-Lys或X-Arg，其中X＝Gly或Arg，或其组合，

(iii)Gly-Tyr，

(iv)Gly-Phe-(Lys)，

(v)Gly-Pro，

(vi)Ala-X或Leu-X，其中X是任意氨基酸，或其组合，

(vii)Asp-X或Glu-X，其中X是任意氨基酸，或其组合，

(viii)γ-Glu-X，其中X是任意氨基酸，和受体肽，

(ix)蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、帕拉金糖或上述两种或更多种的组合，

(x)碘胰岛素B链，

(xi)根皮甙，

(xii)对硝基苯磷酸，或

(xiii)上述两种或更多种的组合。

18.根据权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中AA是光学成像剂、放射性成像剂或放射性治疗剂。

19.根据权利要求1所述的缀合物，其中AA是包含荧光染料的光学成像剂。

20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述荧光染料选自由S0456、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、LS288、七甲川菁染料(HMCD)、SS180、吖啶橙(AO)、IRDye800CW、IR783、IR825、ZW800-1和吲哚菁绿(ICG)组成的组。

21.根据权利要求1所述的缀合物，其中AA是放射性成像剂或放射性治疗剂，所述放射性成像剂或放射性治疗剂包含选自由¹⁸F、⁴⁴Sc、⁴⁷Sc、⁵²Mn、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、^114mIn、^117mSn、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴⁹Tb、¹⁵³Sm、¹⁵²Tb、¹⁵⁵Tb、¹⁶¹Tb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁵Ab、²²⁵Ac和²²⁷Th组成的组的放射性同位素。

22.根据权利要求1所述的缀合物，其中AA包含放射性标记的假体基团，所述假体基团包含选自由⁶⁸Ga、¹⁸F、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²²⁵Ac、¹⁸P、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I和²¹¹At组成的组的放射性同位素。

23.根据权利要求22所述的缀合物，其中所述放射性标记的假体基团包括选自以下的结构：

其中R和R’独立地是氢或甲基，n是选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的整数。

24.根据权利要求23所述的缀合物，其中所述放射性标记的假体基团包括选自以下的结构：

其中n是选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的整数。

25.根据权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中AA包含选自由以下组成的组的螯合剂：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、SarAr(1-N-(4-氨基苄基)-3,6,10,13,16,19-六氮杂双环[6.6.6]-二十烷-1,8-二胺、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NODAGA(2,2’-(7-(4-((2-氨基乙基)氨基)-1-羧基-4-氧代丁基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸)、HYNIC(6-肼基烟酸)、NETA(4-[2-(双羧基甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基)乙酸、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧乙基)膦酸)、HBED(N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸)、2,3-HOPO(3-羟基吡啶-2-酮)、PCTA(3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]-十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、DFO(去铁胺)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、OCTAPA(N,N-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N-二乙酸)、H₂macropa(N,N’-双[(6-羧基-2-吡啶基甲基)-4,13-二氮杂-18-冠-6]、H₂dedpa(1,2-[[羧基]-吡啶-2-基]-甲基氨基]乙烷)、包含β-l-二氨基丙酸、天冬氨酸和半胱氨酸的EC20-头以及上述任一物质的衍生物。

26.根据权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中AA包含选自由以下组成的组的螯合剂：

27.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

28.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

29.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

30.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

31.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

32.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

33.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

34.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

35.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

36.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

37.根据权利要求1所述的缀合物，其具有以下结构：

38.一种组合物，其包含权利要求1-37中任一项的缀合物和药学上可接受的载体。

39.一种通过对肿瘤细胞、与肿瘤相关的巨噬细胞或两者的靶向放射性，单独或还联合光学成像剂，对受试者的癌症进行成像、治疗或成像并治疗的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1-37中任一项的缀合物或权利要求38的组合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中与肿瘤相关的巨噬细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。

41.根据权利要求39所述的方法，进一步包括对肿瘤成像。

42.根据权利要求41所述的方法，其中对肿瘤成像包括通过光学成像、正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)进行成像。

43.一种用于对受试者的肿瘤进行成像、治疗或成像和治疗的试剂盒，其包含：

在第一容器中的至少一个剂量单位的权利要求1-37中任一项的缀合物或权利要求38的组合物；和

至少一个剂量单位的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物。

44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述至少一个剂量单位的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物容纳在第一容器中。

45.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述至少一个剂量单位的第二活性剂或包含第二活性剂的组合物容纳在第二容器中。

46.根据权利要求43-45中任一项所述的试剂盒，进一步包含用于施用权利要求1-37中任一项的缀合物或权利要求38的组合物的装置。