CN117629923A - 一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法及其应用。所述测试方法包括以下步骤：步骤1：制备皮质醇抗体板；步骤2：向所得皮质醇抗体板中依次加入样本溶液和生物素化皮质醇，使样本溶液中的皮质醇和生物素化皮质醇竞争结合所述皮质醇抗体；步骤3：加入CaHPO4‑AM‑HRP‑SA杂化纳米花，识别剩余的生物素化皮质醇，并输出检测信号；步骤4：检测输出的检测信号强度，对比检测信号标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别是涉及一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法及其应用。
背景技术
皮质醇(11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮)作为类固醇激素，是中枢应激反应系统的最终产物。它也被称为“压力激素”，在人体中发挥如能量调节、激活抗炎等重要作用。产生和释放到血液中的皮质醇动态平衡受到机体的高度调节。然而，一旦平衡被破坏，就会导致肥胖、心血管疾病、精神健康障碍和癌症等一系列问题。尤其是皮质醇在长时间的压力暴露下不断大量积累，会引起库欣综合征等一些标志性症状，严重时可进一步导致高血压、骨质流失和2-型糖尿病。压力和抑郁通常是相关的，如压力性生活事件会导致易感人群出现抑郁症，而虐待或忽视形式的童年压力会增加晚年患抑郁症的风险。更重要的是，皮质醇是抑郁症诊断和干预策略选择的关键指标。因此，皮质醇的定量分析可能是诊断包括抑郁症为首的多种疾病以及开发相关药物的重要环节。
目前，分析技术包括高效液相色谱(HPLC)，串联质谱(LC-MS/MS)和放射免疫分析(RIA)等已开发用于测定皮质醇。虽然这些技术具有超高的灵敏度和检测速率，但仍然存在如设备昂贵、对操作人员的资质要求高及分析时间长等弊端。因此，它们无法满足集成到即时设备中以快速检测皮质醇的要求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中无法快速检测皮质醇含量存在的技术缺陷，而提供一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法。
本发明的另一个目的，是提供上述多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法在生物样本中皮质醇含量检测中的应用。
本发明的另一个目的，是提供上述多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法在药物评价及药物筛选中的应用。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，包括以下步骤：
步骤1：制备皮质醇抗体包被板；
步骤2：向所得皮质醇抗体包被板中依次加入样本溶液和生物素化皮质醇，使样本溶液中的皮质醇和生物素化皮质醇竞争结合所述皮质醇抗体；
步骤3：加入CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花，识别未结合的生物素化皮质醇，并输出检测信号；
步骤4：检测输出的检测信号强度，对比检测信号标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量。
在上述技术方案中，步骤1中，皮质醇抗体包被板的制备方法包括以下步骤：
步骤a：抗体包被
配置皮质醇抗体包被液，过夜孵育；
步骤b：清洗
孵育完成后，将上清液移除，接着加入洗涤缓冲液清洗；
步骤c：封闭
清洗完成后，立即向容器内加入工作浓度的封闭液，然后孵育；
步骤d：清洗
按照步骤b中的方法清洗，得到皮质醇抗体板，待用。
在上述技术方案中，步骤a中，孵育温度为0-8℃；步骤c中，孵育温度为25-37℃，孵育时间为0.5-2h。
在上述技术方案中，步骤1中，所述皮质醇抗体包被板中包含的皮质醇抗体含量为0.1-10μg；
步骤2中，生物素化皮质醇的加入量为0.01-1μg。
在上述技术方案中，步骤3中，所述CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花的加入量为4-20μg。
在上述技术方案中，所述检测信号为光信号和葡萄糖含量信号。
在上述技术方案中，通过紫外-可见光谱检测光信号的吸收峰强度，对比吸收峰标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量m1；所述吸收峰标准曲线中，线性检测范围为0.33-100ng mL-1，检测限为98.50pg mL-1；
和/或，
通过手机拍照色调识别检测光信号的色调识别，对比色调标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量m2；所述色调标准曲线中，线性检测范围为0.33-100ng mL-1，检测限为98.50pg mL-1；
和/或，
通过BGM检测葡萄糖含量，对比葡萄糖含量信号标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量m3；所述葡萄糖含量信号标准曲线中，线性检测范围为1-1000ng mL-1，检测限位287.41pg mL-1。
在上述技术方案中，所述CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花通过以下步骤制备：
将淀粉酶α-AM的水溶液、辣根过氧化物酶SA的水溶液以及链霉亲和素HRP的水溶液，加入到PBS缓冲液中，轻微震动摇匀，然后加入CaCl2水溶液，再次轻微震荡混匀后，静置孵育，生成白色絮状沉淀物，离心后，对沉淀物进行洗涤得到所述的三蛋白绿色杂化纳米花，记作CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花。
本发明的另一方面，上述多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法在生物样本中皮质醇含量检测中的应用。线性检测范围为0.33-1000ng mL-1，检测限为98.50pgmL-1。
本发明的另一方面，上述多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法在药物评价及药物筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，具有较宽的线性检测范围，以及较低的检测限，具有优异的检测范围和多种复杂样本中的检测能力。
2.本发明提供的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，可成功用于复杂体系中皮质醇的测定。此外，通过回收率试验表明，该方法不受人尿液及唾液中复杂样本基质影响。
3.本发明提供的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，可以在药物评价或药物筛选过程中提供数据支撑，有着较为广阔的应用前景。
附图说明
图1所示为实施例2中构建的标准曲线；
其中，a为不同浓度皮质醇下的紫外可见光光谱图，0.33、1、3.3、10、33.3、100ngmL-1：b为吸光度与皮质醇浓度对数之间的线性关系；c为色调与皮质醇浓度对数的线性关系；d为BGM读数值与皮质醇浓度对数之间的线性关系。
图2所示为市售商业ELISA试剂盒对皮质醇的检测结果；
其中，a为不同浓度皮质醇下的紫外可见光光谱图：1、3.3、10、33.3、100、333.3ngmL-1；b为标准曲线。
图3所示为实施例3中，实际样本检测结果；
其中，a为健康个体24小时尿液中皮质醇总量；b为健康个体唾液中皮质醇含量。
图4所示为实施例4中检测对照组(Con)，模型组(UCMS)，氟西汀组(Flu)和不同剂量的BZYQW组大鼠血清中的皮质醇含量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种三蛋白绿色杂化纳米花(CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花)，通过以下方法制备：
将一定浓度的α-AM(10μL，不同浓度)，SA(10μL，1mg mL-1)和HRP(5μL，10mg mL-1)加入到的3mL的PBS(3mM，pH7.4)中，轻微震动摇匀，后加入60μL CaCl2(200mM)水溶液，再次轻微震荡混匀后，置于25℃水浴锅中，静置孵育12h。生成肉眼可见的白色絮状沉淀物即为Ca纳米花。通过离心(10,000rpm min-1)收集制备的纳米花沉淀物，并用超纯水洗涤3次待用，记作CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花。
制备的CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花包括淀粉酶、辣根过氧化物酶和链霉亲和素构成的三蛋白体系以及以所述淀粉酶、辣根过氧化物酶和链霉亲和素作为结点均匀生长其上的呈花瓣状的磷酸氢钙晶体。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上介绍其检测方法。
一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，具体包括以下步骤：
步骤1：抗体包被
首先将皮质醇抗体使用碳酸盐包被缓冲液(Ph＝9.6)以1:200的比例稀释到工作溶液浓度(6.67μg mL-1)；然后将配置好的皮质醇抗体包被液加入至96孔板中，每孔的加入量为100μL；在4℃过夜孵育，使得皮质醇抗体可以沉淀吸附到96孔板底部；
步骤2：清洗
孵育完成后，将96孔板中的上清液使用移液枪移除，接着向每孔加入350μL的洗涤缓冲液(PBST，PH＝7.4)，静置1-2min，立即移除孔内上清液，在吸水纸上甩干残余上清液；
步骤3：封闭
清洗完成后，立即向96孔板内加入工作浓度的封闭液(1％BSA/PBS缓冲液)10％BSA溶液，每孔的加入量为200μL；然后将96孔板于37℃温箱孵育1.5h；
步骤4：清洗
按照步骤2中的方法清洗2次，得到分布在96孔内的皮质醇抗体包被板，置于-20℃待用；
步骤5：抗原抗体反应
首先将96个孔划分为标准品孔、实际样本孔和空白孔；向每一标准品孔中加入不同浓度的标准品溶液50μL；向每一实际样本孔中加入样本溶液50μL；向每一空白孔中加入稀释液(PBST-PVP，PH＝7.4)50μL；然后向所有孔内加入50μL浓度为0.5μg mL-1的生物素化皮质醇与样本溶液或者标准品溶液中的皮质醇进行竞争，轻轻震荡混匀后，盖上覆膜，于37℃孵育1h；孵育完成后，重复清洗3次；
步骤6：生物素链霉亲和素反应
清洗完毕后，生物素化皮质醇被皮质醇抗体捕获，此时每孔加入100μL浓度为100μg mL-1的CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花，轻轻震荡混匀后，盖上覆膜，于37℃孵育30min；孵育完成后，重复清洗2次；CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花识别未结合的生物素化皮质醇，并输出检测信号；
步骤7：采用以下三种方法进行数值测定：
1)HRP-H2O2-TMB显色反应
每孔加入90μL的H2O2-TMB溶液，轻轻震荡混匀后，盖上覆膜，于37℃避光孵育15min；孵育完成后，直接加入终止液(1mM H2SO4)50μL终止反应；反应终止后立即将96孔板置于多功能酶标仪中，分别在450nm吸光度处进行数值读取；其中标准品孔加入的标准品溶液浓度分别为0.33、1、3.3、10、33.3、100ng mL-1，对应的数值用于绘制标准曲线，如图1a、b所示；实际样本孔对应的数值对应标准曲线推算样本溶液中皮质醇的浓度；
2)使用手机识别色调；其中标准品孔对应的数值用于绘制标准曲线，如图1c所示；实际样本孔对应的数值对应标准曲线推算样本溶液中皮质醇的浓度；
3)α-AM分解淀粉BGM读数
每孔加入100μL的100mg mL-1的淀粉，体系为MES缓冲液，在55℃水浴条件下，加热反应45min。使用BGM进行葡萄糖含量的读取；其中标准品孔对应的数值用于绘制标准曲线，如图1d所示；实际样本孔对应的数值对应标准曲线推算样本溶液中皮质醇的浓度。
从图1可以看出，随着皮质醇浓度的增加，450nm处的吸收峰有明显降低，而使用RGB color读取的色调则明显升高。同时，随着皮质醇浓度的升高，BGM读数值逐步降低。
此外，通过比较在不同浓度的皮质醇存在下在450nm处的吸光度进行定量分析，吸光度(Absorbance，a.u.)与皮质醇浓度的lg值在0.33-100ng mL-1范围内呈良好的线性关系Y＝-0.09181*lg[cortisol]+0.2960(R2＝0.9897)，检测限(LOD)为98.50pg mL-1(图1b)。使用手机识别的色调(Hue)与皮质醇浓度的lg值在0.33-100ng mL-1范围内呈线性关系Y＝10.66*lg[cortisol]+187.9(R2＝0.9770)，检测限(LOD)为105pg mL-1(图1c)。使用BGM读数与皮质醇浓度的lg值在1-1000ng mL-1范围内呈线性关系Y＝-2.058*lg[cortisol]+11.61(R2＝0.9770)，检测限(LOD)为287.41pg mL-1(图1d)。
下表所示为本申请以及文献报道的皮质醇检测方法的比较。
备注：
[1]Weng X,Fu Z,Zhang C,et al.A Portable 3D Microfluidic OrigamiBiosensor for Cortisol Detection in Human Sweat[J].Analytical Chemistry,2022,94(8):3526-3534.
[2]Safarian S M,Kusov P A,Kosolobov S S,et al.Surface-specificwashing-free immunosensor for time-resolved cortisol monitoring[J].Talanta,2021,225.
[3]Suda N,Sunayama H,Kitayama Y,et al.Oriented,molecularly imprintedcavities with dual binding sites for highly sensitive and selectiverecognition of cortisol[J].Royal Society Open Science,2017,4(8).
[4]Apilux A,Rengpipat S,Suwanjang W,et al.Paper-based immunosensorwith competitive assay for cortisol detection[J].Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis,2020,178.
[5]Dalirirad S,Han D,Steckl A J.Aptamer-Based Lateral Flow Biosensorfor Rapid Detection of Salivary Cortisol[J].Acs Omega,2020,5(51):32890-32898.
[6]Dalirirad S,Steckl AJ.Aptamer-based lateral flow assay for pointof care cortisol detection in sweat[J].Sensors and Actuators B-Chemical,2019,283:79-86.
从表中可以看出，本申请中的皮质醇含量测定方法具有较宽的线性检测范围，以及较低的检测限，具有优异的检测范围和多种复杂样本中的检测能力。
本实施例还将本申请中的皮质醇含量测定方法与市售传统的商业ELISA试剂盒测试方法进行了对比，其结果如图2所示，传统的商业ELISA试剂盒的检测范围为1-333.3ngmL-1，在范围内的线性关系为Y＝-0.1101*lg[cortisol]+0.6793(R2＝0.9594)，检测限为323.58pg mL-1。结合上文中皮质醇含量测定方法的线性检测范围和检测限，可以得出结论，本申请中的皮质醇含量测定方法比商业ELISA试剂盒具有更低的检测限，检测更加灵敏。
实施例3
本实施例是基于实施例1和实施例2，介绍皮质醇含量测定方法在生物样本中皮质醇含量检测中的应用。
为了评估本申请皮质醇含量测定方法针对复杂生物基质中皮质醇的测定，本实施例进行了基于实施例1制备的皮质醇含量测定方法的检测试验，以检测人尿液及唾液中皮质醇的含量。
样本收集及处理：
实际样本测试的唾液及尿液提供者为6人，三男三女，年龄22-28岁。采集已征得供试者知晓且同意。唾液样本于上午10:30集中取样。唾液样本采集时要求所有供试者在采集前1小时禁食禁水，清水漱口保证口腔无异物。供试者在保持安静后进行唾液自然分泌，收集于无菌唾液采集器。收集的样本使用离心机处理(3000rpm 20min)，分离转移上清，置于-20℃冰箱中保存待用。
尿液收集为24小时全尿混合，检测为测试24小时尿中总皮质醇含量。使用无菌烧杯收集所有尿液，记录体积，并用离心管按照比例取一定体积，将24小时收集的尿液按照体积比例配制，总量收集10-15mL。后经离心处理机处理(3000rpm 20min)后，分离转移上清，置于-20℃冰箱中保存待用。
利用实施例2中介绍的检测方法，检测健康个体24小时尿液中皮质醇总量以及健康个体唾液中皮质醇含量结果如图3所示(每一结果，采用HRP-H2O2-TMB显色反应和BGM读数方法，分别读取三个数值)。图中可以看出，测得24小时尿液总皮质醇含量在26815.39-160783.80ng。唾液中皮质醇含量在3.32-12.85ng mL-1，表明本申请皮质醇含量测定方法可成功用于复杂体系中皮质醇的测定。
为进一步证明该方法不受人尿液及唾液中复杂样本基质影响，采用健康人尿液及唾液作为模型基质，采用加样回收试验法进行回收率试验。在6份唾液及尿液样本中，分别加入10ng mL-1和50ng mL-1的皮质醇进行回收率验证。结果如下表所示，回收率在97.55％和112.74％之间，相对标准偏差值从7.93％到29.23％不等。因此，该CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米的ELISA适用于实际样品中皮质醇的测定。
表1本文构建传感器对于健康个体尿液与血清中皮质醇含量测定。
实施例4
本实施例是基于实施例1和实施例2，介绍皮质醇含量测定方法在药物评价及药物筛选中的应用。
动物的饲喂，组别设置及抑郁症模型建立：
将36只八周大雄性SD大鼠(SPF级，许可证号：SCXK(京)2017-0005)适应性喂养一周后，随机分成对照组(Con)，模型组(UCMS)，氟西汀组(Flu)，补中益气丸低中高三组(BZYQ2.5，5，10pills/kg)。
对照组进行常规饲养，食水充足，光照黑暗交替各12小时。
模型组，氟西汀组，补中益气丸低中高三组进行抑郁症模型处理。
抑郁症模型处理方式包括：1、食物与水不足(24小时)；2、45°笼倾斜(24小时)；3、鼠笼拥挤过夜(24小时)，每个笼子20只大鼠；4、限制在一个空水瓶(娃哈哈，中国)(4小时)；5、潮湿垫料24小时笼中注入500mL水；6、尾夹，距离尾尖1cm(1分钟)；7、强迫游泳(10分钟)；8、昼夜颠倒(12h/12h)。为了确保过程不可预测，以上这些方案都是随机安排的，让大鼠每天都接受其中一种方案。
阳性药及补中益气丸在UCMS实施一周后进行，之后的2-4周，在实施UCMS的同时连续给药。对照组与模型组进行生理盐水灌胃，氟西汀组进行氟西汀(2mg/kg)灌胃，补中益气丸组分为低剂量组(2.5丸/kg)，中剂量组(5丸/kg)以及高剂量组(10丸/kg)灌胃。
四周结束后，进行大鼠血液及组织的制备。首先选取腹主动脉取血方式，用10％的水合氯醛腹腔注射进行麻醉处理，当大鼠失去直觉(手掐大鼠脚趾判断有无直觉)后进行腹主动脉取血。将取出的血液在4℃下静置过夜，后采用4℃下3500rpm离心10min，分离血清血细胞，血清置于-80℃备用。血细胞与细胞裂解液在冰上裂解30min，离心取上清，离心条件同上。
将收集的大鼠血清样本，使用先前构建的皮质醇含量测定方法，进行了血清皮质醇含量的测定测试结果如图4所示，UCMS大鼠的皮质醇含量显著高于对照组(Con)(P<0.01)，氟西汀组(Flu)的治疗可以显著降低UCMS大鼠的皮质醇含量(P<0.01)。此外，补中益气丸作用于UCMS抑郁症大鼠，其高剂量(10pills/kg)组也有显著的降低皮质醇含量的作用(P<0.05)，虽然中剂量(5pills/kg)与低剂量(2.5pills/kg)相较于模型组，皮质醇含量降低无显著性差异，但不可否认的是其均值都有所降低。由此证明，补中益气丸同时可通过降低UCMS大鼠血清皮质醇的含量，发挥其抗抑郁的作用。
通过上述实验，皮质醇生物传感器可以在药物评价或药物筛选过程中提供数据支撑，有着较为广阔的应用前景。
依照本发明内容进行工艺参数调整，均可实现多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试，并表现出与实施例2基本一致的性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：制备皮质醇抗体包被板；
步骤2：向所得皮质醇抗体包被板中依次加入样本溶液和生物素化皮质醇，使样本溶液中的皮质醇和生物素化皮质醇竞争结合所述皮质醇抗体；
步骤3：加入CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花，识别未结合的生物素化皮质醇，并输出检测信号；
步骤4：检测输出的检测信号强度，对比检测信号标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量。
2.如权利要求1所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：步骤1中，皮质醇抗体包被板的制备方法包括以下步骤：
步骤a：抗体包被
配置皮质醇抗体包被液，过夜孵育；
步骤b：清洗
孵育完成后，将上清液移除，接着加入洗涤缓冲液清洗；
步骤3：封闭
清洗完成后，立即向容器内加入工作浓度的封闭液，然后孵育；
步骤4：清洗
按照步骤b中的方法清洗，得到皮质醇抗体板，待用。
3.如权利要求2所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：步骤a中，孵育温度为0-8℃；步骤c中，孵育温度为25-37℃，孵育时间为0.5-2h。
4.如权利要求1所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：步骤1中，所述皮质醇抗体包被板中包含的皮质醇抗体含量为0.1-10μg；
步骤2中，生物素化皮质醇的加入量为0.01-1μg。
5.如权利要求1所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：步骤3中，所述CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花的加入量为4-20μg。
6.如权利要求5所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：所述检测信号为光信号和葡萄糖含量信号。
7.如权利要求6所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：
通过紫外-可见光谱检测光信号的吸收峰强度，对比吸收峰标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量m1；所述吸收峰标准曲线中，线性检测范围为0.33-100ng mL-1，检测限为98.50pg mL-1；
和/或，
通过手机拍照色调识别检测光信号的色调识别，对比色调标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量m2；所述色调标准曲线中，线性检测范围为0.33-100ng mL-1，检测限为98.50pgmL-1；
和/或，
通过BGM检测葡萄糖含量，对比葡萄糖含量信号标准曲线获得样品溶液中皮质醇含量m3；所述葡萄糖含量信号标准曲线中，线性检测范围为1-1000ng mL-1，检测限位287.41pgmL-1。
8.如权利要求1-7任一项所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法，其特征在于：所述CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花通过以下步骤制备：
将淀粉酶α-AM的水溶液、辣根过氧化物酶SA的水溶液以及链霉亲和素HRP的水溶液，加入到PBS缓冲液中，轻微震动摇匀，然后加入CaCl2水溶液，再次轻微震荡混匀后，静置孵育，生成白色絮状沉淀物，离心后，对沉淀物进行洗涤得到所述的三蛋白绿色杂化纳米花，记作CaHPO4-AM-HRP-SA杂化纳米花。
9.如权利要求1-7任一项所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法在皮质醇含量测定中的应用，其特征在于，线性检测范围为0.33-1000ng mL-1，检测限为98.50pgmL-1。
10.如权利要求1-8任一项所述的多信号输出的压力及抑郁症标志物定量测试方法在药物评价及药物筛选中的应用。
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