KR20210081915A

KR20210081915A - 포도당 검출을 위한 바이오센서의 전극 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210081915A
Application number: KR1020190174334A
Authority: KR
Inventors: 박태정; 백승훈; 박찬영; 노지혁
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: KR102337896B1

Abstract

본 발명은 체액 내 포도당 농도를 전기화학적으로 측정가능한 바이오센서에 사용되는 전극 및 이의 제조방법, 상기 전극을 포함하는 포도당 검출 센서에 관한 것으로, 상기 포도당 검출용 전극은 전기 전도성이 우수한 나노섬유 상에 포도당 검출에 필요한 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체가 위치함으로써 선택성 및 민감도가 높아, 체액 내 미량의 포도당을 검출하는 포도당 검출 센서에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포도당 검출을 위한 바이오센서의 전극 및 이의 제조방법{Electrode of Biosensor for Glucose Detection and Method thereof}

본 발명은 체액 내 포도당 농도를 전기화학적으로 측정가능한 바이오센서에 사용되는 전극 및 이의 제조방법, 상기 전극을 포함하는 포도당 검출 센서에 관한 것이다.

포도당(glucose)은 ATP(adenosine triphosphate)를 생산하는 인간의 수많은 대사 경로에서 필수적인 역할을 한다. 그러나, 체액 내 비정상적으로 높은 포도당 수치는 실명, 심장병, 고혈압, 신부전과 같은 여러 심각한 합병증을 유발한다. 그러므로, 체액 내 포도당 수치를 모니터링하는 것은 당뇨병을 예방하고 제어하기 위한 의생명(biomedical) 연구의 중요성을 보여준다. 포도당 산화효소(glucose oxidase)를 이용한 체액 내 포도당 수치의 모니터링은 선택성, 용이성 및 신속성과 같은 여러 이점 덕분에 많은 관심을 끌었다. 이러한 관점에서, 포도당 산화효소는 생물시료에서 포도당 검출을 위해 양자점 기반 형광(quantum dots-based fluorescence) 센서, 전기화학(electrochemical) 센서, 광학(optical) 센서, 화학발광(chemiluminescence) 센서, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 포함한 다양한 분석적 접근법의 개발에 사용되어 왔다. 이러한 기술들 중 전기화학 센서는 다양한 시료 매트릭스 내 포도당을 검출하기 위해 높은 감도, 신속성, 가성비(cost-effcitiveness), 선택성과 같은 놀라운 장점을 갖는다. 또한, 휴대용 전기화학 장치가 최소한의 시료(sample)로 숙련되지 않은 사람이 조작가능하도록 생물검정(bioassay)을 위해 제작되었다는 것을 나타낸다. 중요한 것은, 포도당 효소 반응에 기초한 전기화학 바이오센서가 개인 포도당측정기(glucometer)에서 포도당 수치를 지속적으로 모니터링하는데 큰 역할을 했다는 점이다.

효소적 전기화학 센서는 높은 감도, 양호한 선택성, 수용해성, 낮은 독성 덕분에 임상적으로 중요한 분자를 분석하는 유망 도구(promising tool)인 것으로 밝혀졌다. 전기촉매 활성 및 선택성을 향상시키기 위해, 많은 연구들에서는 복합 시료로부터 폭넓게 다양한 분자들을 검출하기 위한 효소 코팅 전기화학 센서를 사용하였다 [Adv. Funct. Mater. 18 (2008) 591-599]. 동시에, 자유로운 효소(free enzyme)는 pH, 온도와 같은 특정 조건에서 재현성이 떨어지고, 작동 안정성이 낮으며 신뢰성(responsibility)이 불안정한 전기화학 센서를 생산한다는 한계가 있다. 그러나, 이러한 한계는 고형 지지체에 효소를 고정시킴으로써 성공적으로 극복되는데, 높은 효소 대 기질(enzyme-to-substrate)의 비율, 큰 효소 안정성, 재사용성 및 양호한 진단과 같은 여러 장점을 제공하며, 현저하게 진단 시간을 줄이는 것 또한 가능하게 하였다. 최근, 다양한 나노구조 물질 (나노입자, 유기 또는 무기 합성물 및 3차원 물질)에서의 효소 고정화는 선택된 대상 분석체에 대한 선택성 및 효소 활성도를 향상시키기 때문에 전기화학 센서에서 상당한 주목을 받았다. 게다가, 단백질-무기 하이브리드 나노플라워(protein-inorganic hybrid nanoflower)은 다양한 분자의 민감한 분석을 위한 효율적인 전기화학 센서로 밝혀졌다 [ACS Appl. Mater. Interfaces 6 (2014) 10775-10782]. 나노플라워에서의 효소 고정화는 나노플라워의 넓은 표면 대 부피(surface-to-volume) 비율로 효소 활성도, 안정성, 내구성 및 재사용성 향상과 같은 이점을 두드러지게 나타낸다. 중요한 것은, 효소 고정 나노소재(enzyme-immobilized nanomaterial) 기반의 전기화학 센서가 순수 효소(pure enzyme) 기반의 전기화학 센서보다 더 나은 분석적 특성을 보였다는 점이다 [Nanoscale 6 (2014) 255-262; Nanoscale 9 (2017) 5658-5663]. 그러므로, 새로운 유기-무기 나노구조 물질과 전극의 통합은 상당한 분석적 특징을 갖는 바이오센서를 확립하는 가장 간단한 방법을 제공할 수 있다.

전기방사(electrospinning)는 다양한 폴리머(polymer)로부터 나노미터에서 마이크로미터의 범위를 갖는 섬유성 나노구조 물질을 제작하기 위한 간단하고 새로운 기술이다 [Anal. Methods 2 (2010) 202-211]. 특별한 바이오응용(bioapplication)을 위해 형태 및 표면적을 변화시켜 수율을 산출하는 무기 나노소재를 형성하는 간단한 과정이다. 최근 몇 년 새, 나노섬유(nanofiber; NF)는 긴 저장 안정성, 유연성 및 넓은 표면적을 갖기 때문에 다양한 대상 분석체의 정성적, 정량적 분석을 위해 형광, 전기화학 장치, UV 가시 분광분석(UV-visible spectrometry) 및 약물전달/추적과 같은 다양한 분석 기법과 통합 가능한 유망 소재로 주목받았다. 많은 폴리머 중에서, 폴리비닐알코올(poly(vinyl alcohol); PVA)은 수용성 폴리머로, 히드록시기(hydroxyl group)에 의해 나타나는 비독성, 저비용, 친환경성, 화학 저항성 및 생물학적 호환성으로 인해 다양한 산업 분야에서 널리 사용되고 있다. PVA를 이용한 NF를 제작하기 위해, 조사(irradiation), 가열 및 화학 처리를 포함하는 다양한 가교(crosslinking) 방법이 불용성 NF를 제조하는데 사용되었다. 그러나, 이들은 전기 전도성이 낮기 때문에, 전기화학 센서를 개발하는데 사용하는 것이 어려울 수 있다. 최근, PVA는 키토산 및 그래핀 산화물(graphene oxide)과 결합되어, ATDC5 세포에 대한 생체적합성이 연구된 바 있었다 [Sci. Eng. C 79 (2017) 697-701].

이에, 본 발명자들은 전기방사를 이용하여 지지체로 전도성 물질과 폴리머로 이루어진 나노섬유를 형성하고, 그 위에 금속 나노입자 및 포도당 측정에 필요한 효소로 이루어진 효소 나노입자 복합체를 위치시킴으로써 포도당 검출용 전극을 개발하였다. 이러한 포도당 검출용 전극이 포도당과 포도당 산화효소 및 페록시다아제에 의해 발생된 전류의 변화를 높은 민감도로 감지하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양상은 금속칩, 나노섬유, 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체가 순차적으로 적층된 포도당 검출용 전극을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 포도당 검출용 전극을 포함하는 포도당 검출 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 일 양상은 a) 금속칩 상에 전기방사를 이용하여 나노섬유를 형성하는 단계; b) 상기 나노섬유 상에 금속 나노입자를 코팅하는 단계; 및 c) 상기 금속 나노입자 상에 효소 나노입자 복합체를 점적하는 단계를 포함하는 포도당 검출용 전극의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

<포도당 검출용 전극>

일 구체예에 따르면, 본 발명은 도 1을 참조하여, 금속칩(10), 나노섬유(20), 금속 나노입자(30) 및 효소 나노입자 복합체(40)가 순차적으로 적층된 포도당 검출용 전극(100)을 제공한다.

상기 금속칩은 내구성이 우수한 금속으로 이루어질 수 있으며, 일례로 백금(platinum; Pt), 금(gold; Au), 은(silver; Ag), 팔라듐(palladium; Pd) 등의 귀금속일 수 있다.

상기 나노섬유는 금속칩 상에 위치하며, 포도당 검출에 사용되는 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체를 고정시키는 지지체 역할을 한다. 이러한 나노섬유는 우수한 전기 전도성을 갖는 전도성 물질과 폴리머가 가교결합된 불용성 나노섬유이다. 이때, 나노섬유의 우수한 전기 전도성을 나타내기 위해, 전도성 물질 및 폴리머를 1:1 ~ 30의 중량비로 포함할 수 있다. 상기 전도성 물질은 그래핀 산화물, 이온성 물질 등일 수 있으며, 상기 폴리머는 폴리염화비닐(polyvinyl chloride), 폴리비닐알코올, 폴리에테르이미드(polyether imide), 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol) 등일 수 있다.

상기 금속 나노입자(nanoparticle; NP)는 물질을 산화시키는 반응을 촉매하는 것으로, 포도당의 산화물인 글루콘산(gluconic acid)을 산화시켜 과산화수소로 분해하는 역할을 한다. 이때, 금속 나노입자는 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu) 등일 수 있다. 이러한 금속 나노입자는 정전기적 인력 또는 공유결합을 통해 나노섬유 표면에 결합될 수 있는 것으로, 나노섬유의 전도성 및 포도당 검출의 민감도가 향상될 수 있다. 따라서, 금속 나노입자가 도포된 나노섬유는 열저항, 기계적 강도 및 전기적 특성이 향상되어, 바이오센서에 적용 가능하다.

상기 효소 나노입자 복합체는 금속 나노입자가 도포된 나노섬유 상에 점적 형태로 균일하게 위치하며, 포도당을 검출하는데 필요한 효소를 포함하는 나노입자이다. 이러한 효소 나노입자 복합체는 포도당을 산화시켜 글루콘산을 생성하는 포도당 산화효소(glucose oxidase), 과산화수소를 이용해 기질을 탈수소화시키는 페록시다아제(peroxidase) 등의 효소를 포함할 수 있으며, 구리 등의 금속을 핵으로 하여 효소가 결합된 꽃 형상일 수 있다.

이와 같은 포도당 검출용 전극은 금속칩, 나노섬유 및 금속 나노입자가 순차적으로 적층되며, 상기 금속 나노입자 상에 효소 나노입자 복합체가 균일하게 분포된 상태로 존재하는 구조를 갖으며, 이때 금속칩과 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체가 도포된 나노섬유는 결합제를 이용하여 화학적으로 결합될 수 있다.

<포도당 검출 센서>

다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 포도당 검출용 전극을 포함하는 포도당 검출 센서를 제공한다.

상기 포도당 검출 센서는 도 2를 참조하여, Au 칩 상에 효소 나노입자 복합체 및 금 나노입자가 도포된 그래핀 산화물 나노섬유가 형성된 포도당 검출용 전극(구리-나노플라워@AuNPs-GO NFs)을 포함할 수 있다. 포도당 검출 센서에 포도당이 주입되면, 포도당 검출용 전극에서 산소(O₂)와 반응하여 효소 촉매 반응을 통해 과산화수소(H₂O₂)가 생성되고, 전기 흐름이 증가하게 된다. 결과적으로, 포도당 검출용 전극은 포도당 농도에 대한 전기화학 반응을 나타내므로, 이를 포함하는 포도당 검출 센서는 선택성 및 민감도가 높으며, 체액 내 포도당을 전기화학적으로 검출할 수 있다.

<포도당 검출용 전극의 제조방법>

다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 도 3을 참조하여, a) 금속칩 상에 전기방사를 이용하여 나노섬유를 형성하는 단계; b) 상기 나노섬유 상에 금속 나노입자를 코팅하는 단계; 및 c) 상기 금속 나노입자 상에 효소 나노입자 복합체를 점적하는 단계를 포함하는 포도당 검출용 전극의 제조방법을 제공한다.

상기 a) 내지 c) 단계를 구체적으로 설명하면, 다음과 같다.

상기 a) 단계는 금속칩 상에 전기방사를 이용하여 지지체인 나노섬유를 형성하는 과정이다.

상기 금속칩은 내구성이 우수한 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd) 등의 귀금속으로 이루어진 것일 수 있다.

상기 나노섬유는 나노섬유의 골격을 형성하는 폴리머와 나노섬유의 전도성을 향상시킬 수 있는 전도성 물질을 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 전도성 물질은 그래핀 산화물, 이온성 물질 등일 수 있으며, 바람직하게는 그래핀 산화물일 수 있다. 상기 폴리머는 폴리염화비닐, 폴리비닐알코올, 폴리에테르이미드, 폴리에틸렌글라이콜 등일 수 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알코올일 수 있다. 이러한 폴리머 또는 전도성 물질은 용매에 용해되어 전기방사될 수 있다. 이때, 전도성 물질 및 폴리머의 혼합 비율은 1:1 ~ 30의 중량비, 바람직하게는 1:5 ~ 15의 중량비일 수 있다.

예를 들면, 폴리비닐알코올(PVA) 용액과 그래핀 산화물(GO) 용액을 1:1 ~ 30 (v/v)의 비율로 혼합하여 분사액을 제조한 후 10 ~ 30 kV의 압력, 0.5 ~ 3.0 mL/h의 주사기 펌프 유량으로 Au 칩 상에 전기방사하고 150 ~ 200℃의 건조 오븐에서 소성함으로써 Au 칩 상에 불용성의 그래핀 산화물 나노섬유(GO NFs)를 제조할 수 있다.

상기 b) 단계는 나노섬유가 형성된 금속칩 상에 금속 나노입자를 코팅하는 과정이다.

상기 금속 나노입자는 물질을 산화시키는 반응의 촉매 역할을 하며, 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu) 등의 나노입자일 수 있다.

예를 들면, 금 나노입자(AuNPs) 용액을 그래핀 산화물 나노섬유 상에 점적(drop)하고 건조시켜 금 나노입자가 도포된 그래핀 산화물 나노섬유(AuNP-GO NFs)를 제조할 수 있다. 이때, 금 나노입자는 그래핀 산화물 나노섬유 표면에 정전기적 결합으로 부착될 수 있다.

상기 c) 단계는 포도당 검출에 사용되는 효소 나노입자 복합체를 코팅하는 과정이다.

상기 효소 나노입자 복합체는 포도당 산화효소, 페록시다아제 등의 효소를 포함하는 나노입자로, 넓은 표면적이 갖기 때문에 포도당과 효소들 간의 반응을 향상시킬 수 있다. 이러한 효소 나노입자 복합체를 금속 나노입자 표면에 점적 형태로 균일하게 위치시킬 수 있다.

예를 들면, 포도당 산화효소 용액, 페록시다아제 용액 및 구리 함유 용액을 혼합하여 반응시켜 꽃 형상을 갖는 효소 나노입자 복합체(구리-나노플라워)를 형성한 후 이를 금 나노입자가 도포된 그래핀 산화물 나노섬유 상에 점적하여 건조시킬 수 있다. 이때, 효소 나노입자 복합체는 금 나노입자 표면에 위치할 수 있다.

또한, 상기 c) 단계 이후, 화학적 결합제를 사용하여 금속칩과 그 표면에 형성된 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체가 도포된 나노섬유를 서로 고정시킬 수 있다.

본 발명에 따른 포도당 검출용 전극은 전기 전도성이 우수한 나노섬유 상에 포도당 검출에 필요한 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체가 위치함으로써 선택성 및 민감도가 높아, 체액 내 미량의 포도당을 검출하는 포도당 검출 센서에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 전기화학 포도당 검출용 전극의 측면도이다; 10: 금속칩, 20: 나노섬유, 30: 금속 나노입자, 40: 효소 나노입자 복합체, 100: 바이오센서 전극.
도 2는 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF 기반으로 하는 전기화학 센서를 이용한 체액 내 포도당 검출 방법이다.
도 3은 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF 기반으로 하는 전기화학 포도당 검출용 전극의 제조 흐름도이다.
도 4는 GO NF의 특성분석에 대한 그래프 및 이미지이다; (a)는 다양한 GO 농도 (0 ~ 2.0 mg/mL)에 대한 PVA NF의 전기화학 임피던스 값이다. (b)는 GO NFs 및 PVA NFs의 FT-IR 분광분석 결과이다. 소성된 GO NFs 의 특성으로, 소성 (c) 전/(d) 후의 FE-SEM 이미지이다.
도 5는 다양한 반응 시간에 대한 AuNPs-GO NF의 FE-SEM 이미지이다; 반응 시간은 (a) 10분, (b) 30분, (c) 60분, (d) 90분, (e) 120분 및 (f) 150분이다.
도 6은 다양한 GOx 농도에서 구리-나노플라워의 최적 조건을 확인한 이미지이다; GOx 농도는 (a) 0.3 mg/mL, (b) 0.5 mg/mL, (c) 0.7 mg/mL 및 (d) 1.0 mg/mL이다. 각 나노플라워는 GOx 농도를 제외하고는, 동일한 조건에서 합성되었다 (Cu²⁺ 이온 및 HRP의 농도는 각각 120 mM 및 0.05 mg/mL임).
도 7은 구리-나노플라워@AuNPs-GO NFs의 포도당 검출 조건을 확인한 그래프이다; (a)는 20 mV/s의 검출 속도, 30 μM 의 포도당 조건에서 측정된 GO NFs, Cu-나노플라워, Cu-나노플라워@GO NF 및 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF 전극에 대한 순환 전압 전류 곡선이다. 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF에 대한 작동 전극의 최적화 결과로, (b) 구리-나노플라워의 다양한 농도 (0 ~ 60 μg/mL) 또는 (c) 다양한 pH (pH 5 ~ 9) 환경에서 50 μM의 포도당 내 효소 전극의 전류를 측정하였다.
도 8은 구리-나노플라워@AuNPs-GO NFs의 포도당 검출 성능을 확인한 그래프이다; (a)는 다양한 포도당 농도 (0 ~ 0.1 mM)에서의 CV 전류 측정값이고, (b)는 검정 곡선(calibration curve)이다. (c) 50 μM의 포도당 및 다양한 방해제(interference)에 대한 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF의 의존적 전류 반응이다. (d)는 안정성 시험을 위해 20일 동안 측정된 상대적 활성 값이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

1. 재료 및 방법

1-1. 물질

폴리비닐알코올[(-CH₃CHOH-)n, MW 22,000], D(+)-포도당 (98%) 및 수크로스 (C₁₂H₂₂O₁₁)를 준세이(Junsei) (일본)에서 구매하였다. 황산구리 5수화물(copper (II) sulfate pentahydrate; CuSO_4·5H₂O, 99.9%), 염화칼슘(CaC_l2, anhydrous, 96.0%), L(+)-아스코르브산, D(+)-수크로스 (사카로스), 요소 및 과산화수소(H₂O₂)를 삼천 (한국)으로부터 입수하였다. 염화칼륨(KCl) 및 염화나트륨(NaCl)를 덕산 (한국)으로부터 입수하였다. HRP(horseradish peroxidase), 염화금 3수화물(gold (III) chloride trihydrate; HAuC_l4·3H₂O), 과망간산염(KMnO₄), 과황화칼륨(K₂S₂O₈), 오산화인(P₂O₅), 진한 황산(Conc. H₂SO₄), 시스테아민 염산염(cysteamine hydrochloride) 및 검정곰팡이(Aspergillus niger) 유래 포도당 산화효소(glucose oxidase)를 Sigma-Aldrich (미국)에서 구매하여 추가 정제 없이 사용하였다. 수소화 붕소나트륨(NaBH₄)을 대정화금 (한국)에서 구매하였다. 소 혈청 알부민(BSA)를 GenDEPOT (미국)에서, 소 태아 혈청(FBS)을 Gibco (미국)에서 구매하였다. 흑연(graphite) 파우더를 칸토 화학(Kanto Chemical) (일본)에서 구매하였다.

1-2. AuNPs-GO NF의 제조

25 wt% 폴리비닐알코올(PVA) 용액을 만들기 위해, PVA (25 g)를 초순수정제수(DI water) (100 mL)에서 80℃로 6시간 동안 계속 저어 용해하였다. 그래핀 산화물(GO) (1 mg)를 정제수 (1 mL)에 넣고 GO 용액을 균일화하기 위해 30분 동안 초음파 처리하였다. 이후, 1:10 (v/v)의 비율로 1.0 mg/mL의 GO 용액을 25 wt% 의 PVA 용액에 넣고, 실온에서 3시간 동안 저었다. Au 칩 상에 적재하기 위해, 고압 (15 kV) 조건에서 1.0 mL/h로 주사기 펌프 유량을 사용하여 전기방사를 통해 PVA/GO 용액을 22-G 바늘로 분사하였다. 이때, 바늘 끝과 집전기(needle tip-to-collector)의 거리를 15 cm로 하여 10 분 동안 Au 칩 상에 GO NF를 전기방사하였다. 전기방사 후, 그래핀 산화물 나노섬유(GO NF)를 180℃의 건조 오븐에서 1시간 동안 소성하여 NF를 불용성 상태로 만들었다. 이후, 200 μL의 시스테아민-AuNP 용액 (9 nM)을 GO NF의 표면 위에 떨어뜨려 1시간 동안 실온에 놔두었다. 제조된 AuNPs-GO NF를 정제수로 3회 세척하여 부착되지 않은 AuNP를 제거하고, 60℃에서 건조하였다.

1-3. 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF(Cu-nanoflower@AuNPs-GO NFs)의 제조

구리-나노플라워는 다음과 같은 절차에 따라 합성되었다. 간략하게는, 1.0 mg/mL의 포도당 산화효소(GOx)와 0.05 mg/mL의 HRP를 PBS(phosphate-buffered saline)에 첨가하였다. 여기에 120 mM의 CuSO₄ 용액 (20 μL)을 첨가하고서 실온에서 3시간 동안 저어 주었다. 이후, 용액을 실온에서 72시간 동안 반응시켜서 PBS로 5회 세척하였다. 합성된 구리-나노플라워를 다음에 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다.

전기화학 바이오센서인 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF를 제조하기 위해, 40 μg/mL의 나노플라워 용액 (10 μL)을 AuNP-GO NFs 위에 떨어뜨리고 실온에서 건조하였다. 2-프로판올 내 1%의 내피온(nafion) (3 μL)을 결합제로 사용하여 포도당 감지를 위한 작동 전극으로 사용되는 구리-나노플라워@AuNPs-GO NFs과 Au 칩을 결합하였다.

1-4. 구리-나노플라워@AuNPs-GO NFs를 이용한 전기화학적 포도당 검출

구리-나노플라워@AuNPs-GO NF 기반 전기화학 바이오센서는 다음과 같은 절차에 따라 확인되었다. 소량 (보통 50 μL)의 포도당 용액 (0.001 ~ 0.1 mM)을 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF Au-칩 전극 및 작동 전해질로서 0.1 M의 PBS (pH 5.0)를 포함하는 전기화학 셀(cell) 5 mL에 주입하고, 통상적인 3-전극 셀을 이용한 CHI 750E 장비 (CH Instruments, Austin, TX) (미국)를 통해 전기화학 측정을 수행하였다. 기준전극(reference electrode)은 Ag/AgCl이며, 대전극(counter electrode)은 백금(Pt)이였다. 시간대전류법(chronoamperometry) 및 CV 유속 측정(current measurement)을 0.1 M의 PBS 용액 (pH 5.0)에서 수행하였다. CV는 스윕 속도(sweep speed) 0.02 V/s에서, -0.8 V ~ +0.6 V로 기록되었다. 시간대전류법 측정은 적용 전위 -0.25 V (vs. Ag/AgCl)에서 기록되었다. 추가로, 다양한 농도의 포도당을 지속적으로 주입하여 중복(redundancy) 측정 및 교정(calibration)을 수행하였으며, 총 추가량은 전해질 조성 내 큰 변화를 피하기 위해 500 μL를 초과하지 않았다.

1-5. 특성분석(characterization)

UV-가시 흡광 분광분석은 JASCO 670 분광광도계 (일본)로 측정하였다. FE-SEM(field emission scanning electron microscope) 이미지는 SIGMA 장비 (Carl Zeiss) (영국) 또는 JEM-F200 (JEOL) (일본)를 사용하여 획득하였다. FT-IR(fourier transform infrared) 분광분석은 JASCO 6660FV (일본)으로 기록하였다. 시료의 XRD(X-ray diffraction) 패턴은 실온에서 Cu Kα를 조사하는 (40 kV, 40 mA) D8-Advance 장비 (Bruker AXS) (독일)로 측정하였다. 라만 분광분석(Raman spectra)은 Kaiser optical system (Raman Rxn 1) (미국)으로 수행하였다. 전기방사 처리는 전기방사 시스템 (NNC-ESDR) (한국)으로 수행하였다.

2. 결과

2-1. GO NF의 최적화 및 특성분석

GO의 농도에 따른 GO NF의 임피던스(impedance) 값을 확인하였다. 그 결과, GO 농도를 최대 1.0 mg/mL까지 증가시키면 임피던스 값이 감소되어 안정기(plateau)에 접어들며, GO가 PVA 기반 NF의 전기 전도도(electric conductivity)를 크게 향상시킨 것을 알 수 있었다 (도 4a). 따라서, GO NF를 제조하는데 GO의 최적 농도로 1.0 mg/mL를 선택하였다.

PVA NF과 GO NF에 대해 FT-IR 분광분석을 수행하였다. 그 결과, PVA NF에서는 피크가 나타나지 않은 반면, GO NF에서는 히드록시, 카르복시 및 에폭시드와 같은 기능기에 대한 피크가 나타났으며, 이를 통해 GO NF의 형성을 확인할 수 있었다 (도 4b).

PVA는 수용성 폴리머이기 때문에, 내수성(water stable)을 갖는 GO NF 기반 전기화학 센서를 개발하기 위해서는 전기방사 가교 과정이 필요하다. 내수성 GO NF를 제조하기 위해, GO NFs를 180℃에서 1시간 동안 소성하였다(calcinated). 그 결과, 소성 후 PVA 체인이 재배열되어 PVA의 결정도(crystallinity)가 증가하였다. 소성된 PVA는 화학적으로 가교된 PVA에 비해 건조 및 습식 상태에서 양호한 기계적 특성을 갖는다. 결과적으로, 형태적 변화 없이 불수용성 GO NF를 얻었다 (도 4c, d).

2-2. AuNP를 갖는 GO NF의 구조

포도당 감지를 위한 민감도를 증가시키기 위해, GO NF의 표면 위에 AuNP를 점적하였다. GO NF는 음전하를, AuNP는 양전하를 나타내므로, 강한 정전기력이 발생하여 GO NF의 표면에 AuNP가 위치하게 된다.

AuNP의 도핑은 다양한 시간 간격 (10, 30, 60, 90, 120, 150 분)으로 GO NF 표면에 시스테아민-AuNP 용액을 떨어뜨려 수행되었다. GO NF 위에 AuNP를 도핑하는데 최적의 시간을 찾기 위해, FE-SEM을 수행하였다. 그 결과, 시스테아민-AuNP은 정전기력을 통해 GO NF의 표면 위에 잘 도핑되었다 (도 5).

2-3. 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF의 제조

구리-나노플라워의 형성 기전은 핵 성장 과정을 따른다. 초기 단계에서, Cu²⁺ 이온은 PBS 용액에서 인산염 음이온과 상호작용하여 구리 인산염(copper phosphate) 결정을 형성하고, 단백질 (GOx 및 HRP) 내 아미드 골격(amide backbone)은 구리 인산염 결정과 조직화되어 구리-단백질 복합체를 형성한다. 복합체는 나노플라워의 씨앗 역할을 하며, 이를 핵으로 하여 반응 시간에 따라 자라나 나노플라워의 꽃잎을 형성한다. 이러한 순차적인 반응에 따라, 나노플라워의 다층 구조가 형성될 수 있다.

FE-SEM을 통해 GOx 농도에 따른 구리-나노플라워의 형성을 관찰하였다. 그 결과, GOx가 1.0 mg/mL일 때, 균일한 크기로 구리-나노플라워가 제조되는 것을 알 수 있었다 (도 6).

2-4. 구리-나노플라워@AuNPs-GO NFs를 이용한 전기화학적 포도당 검출

제조된 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF가 구리-나노플라워에 비해 더 나은 성능을 나타내는지 확인하기 위해, 30 μM의 포도당 존재 하에서 순환 전압 전류 기법(cyclic voltammetry technique)을 통해 각 전극을 분석하였다. 그 결과, 모든 전극에 대한 전압 전류 곡선(voltammogram)은 Au 산화환원과 관련된 레독스 피크(peak I/peak II)가 -0.26/-0.028 V인 것으로 나타났다. 반면, 초기 함수성 금 산화물(hydrous gold oxides) [Au⁺(H₂O)n]_ads로 이루어진 예비단층의 형성과 Au 흡착원자(adatom)에 대한 Au(I) 함수성 산화물의 감소에 관련이 있는 피크(peak I'/peak II")는 포도당 산화효소의 부재로 인해 AuNPs-GO NF를 제외하고 나타났다 (도 7a). 구리-나노플라워는 포도당에 반응하여 소량의 레독스 피크를 나타내지만, AuNPs-GO NF는 포도당에 대해 명확한 반응을 나타내지 않았다. 구리-나노플라워@GO NF의 합성에 있어서, GO NF가 Au 칩 및 구리-나노플라워와 결합하여 구리-나노플라워의 신호를 더욱 강화할 수 있었다. 게다가, 구리-나노플라워@GO NF를 갖는 AuNP는 페록시다아제에 의한 활성을 통해 구리-나노플라워@GO NF의 레독스 피크를 향상시킨다. 구리-나노플라워는 GO NF와 결합한 포도당에 반응하여 AuNP는 더 많은 상승효과를 나타낸다. 또한, 지지체인 GO NF에 의해 안정성이 강화되었다. 3D 구조인 AuNP의 표면적을 확장시켜, 내재성 페록시다아제와 같은 활성은 전기화학 활성을 강화하도록 HRP를 도울 수 있다. 레독스 피크가 나타내 전극들 중 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF은 동일한 양의 포도당에서 다른 시료들에 비해 가장 높은 음극 전류를 나타냈다.

포도당에 대한 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF의 전기화학 성능을 측정하기 전에, 다음과 같은 실험 조건을 확인하였다. 먼저, 고정된 양의 포도당 (50 μM)을 사용하여 AuNPs-GO NF 내 구리-나노플라워의 농도에 의한 영향을 확인하였다. 그 결과, 구리-나노플라워의 농도가 최대 40 μg/mL까지 증가함에 따라 점차 전류가 증가한 후 절연 효과로 인해 감소되었다. 비록 구리-나노플라워가 포도당을 인식하는 핵심 소재이지만, 절연체(insulator)로 작용하는 생물소재(biomaterial)를 포함하기 때문에 구리-나노플라워의 농도를 40 μg/mL로 선택하였다 (도 7b).

효소는 관측 환경에 따라 활성도의 영향을 많이 받으므로, 우선 다양한 pH 조건에서의 전류값을 관측했다. 그 결과, GOx는 약산성 조건 (~ pH 5.0)에서 최상의 성능을 나타내며, HRP에 의해 전자를 생성하는 과산화수소는 기본 조건에서 탈양자(deprotonation)가 발생하기 때문에 낮은 PH에서 더 안정적으로 유지되고, 이를 통해 낮은 pH에서 전류가 증가한 것을 알 수 있었다 (도 7c). 따라서, 전기화학 센서로 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF를 사용할 때, 포도당의 전기화학 감지를 위한 최적으로 pH로 pH 5.0가 선택되었다.

최적 조건 하에서, 분석 성능을 판단하기 위해 전기화학 분석으로 제조된 포도당 센서를 평가하였다. 그 결과, 음극 전류는 Cu-나노플라워@AuNPs-GO NF와 포도당 간의 반응에 의해 생성되는 전자의 양과 관련이 있기 때문에, 전기 화학적 신호 (피크 II) 강도는 포도당의 양이 증가함에 따라 점차 증가하였다 (도 8a). 저농도 범위 (0 ~ 0.01 mM)의 선형 회귀식(linear regression equation)은 μA = 3656.4933x + 0.6867으로, 상관계수가 0.9618 (n=3)이며, 고농도 범위 (0.03 ~ 0.1 mM)의 선형회귀식은 μA = 636.3007x + 19.9981으로, 상관계수가 0.9903 (n=3)이다. 검출 한계는 3σ-rule에 의해 계산된 0.018 μM 이었다 (도 8b).

제조된 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF 기반 포도당 센서의 선택성을 검증하기 위해, 상호간의 대상 및 센서의 상호작용을 방해할 수 있는 다양한 성분 조건에서 시간대전류법 분석을 수행하였다. 그 결과, 아스코르브산, 사카로스, 요소, NaCl, KCl 및 BSA와 같은 다른 간섭 물질을 첨가하더라도 전류가 변하지 않은 것을 알 수 있었다 (도 8c). 반면, 전류는 포도당을 주입한 경우에만 현저하게 증가한 것으로, 구리-나노플라워@AuNPs-GO NF가 미량의 포도당에 대해 선택적인 포도당 센서로 작용했다는 것을 나타낸다.

구리-나노플라워@AuNPs-GO NF 전극의 시간 의존적 안정성을 평가하기 위해, 20일 동안 30 μM의 포도당 용액을 분석하였다. 그 결과, 첫째날과 비교하여, 전류 값은 16일까지 95%를 유지하였으며, 20일 후에도 91% 이상을 나타냈다 (도 8d).

10: 금속칩
20: 나노섬유
30: 금속 나노입자
40: 효소 나노입자 복합체
100: 바이오센서 전극

Claims

금속칩, 나노섬유, 금속 나노입자 및 효소 나노입자 복합체가 순차적으로 적층된 포도당 검출용 전극.
청구항 1에 있어서,
상기 금속칩은 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 및 팔라듐(Pd)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 전극.
청구항 1에 있어서,
상기 나노섬유는 전도성 물질 및 폴리머를 1:1 ~ 30의 중량비로 포함하는 것인, 전극.
청구항 3에 있어서,
상기 전도성 물질은 그래핀 산화물 및/또는 이온성 물질인 것인, 전극.
청구항 3에 있어서,
상기 폴리머는 폴리염화비닐, 폴리비닐알코올, 폴리에테르이미드 및 폴리에틸렌글라이콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 전극.
청구항 1에 있어서,
상기 금속 나노입자는 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 및 구리(Cu)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 전극.
청구항 1에 있어서,
상기 금속 나노입자는 나노섬유 표면에 정전기적 인력 또는 공유결합으로 결합되는 것인, 전극.
청구항 1에 있어서,
상기 효소 나노입자 복합체는 포도당 산화효소 및/또는 페록시다아제를 포함하는 것인, 전극.
청구항 1의 포도당 검출용 전극을 포함하는 포도당 검출 센서.
a) 금속칩 상에 전기방사를 이용하여 나노섬유를 형성하는 단계;
b) 상기 나노섬유 상에 금속 나노입자를 코팅하는 단계; 및
c) 상기 금속 나노입자 상에 효소 나노입자 복합체를 점적하는 단계
를 포함하는 포도당 검출용 전극의 제조방법.
청구항 10에 있어서,
상기 a) 단계의 금속칩은 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 및 팔라듐(Pd)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 a) 단계의 나노섬유는 전도성 물질 및 폴리머의 혼합 비율이 1:1 ~ 30의 중량비인 것인, 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 c) 단계의 효소 나노입자 복합체는 포도당 산화효소 및/또는 페록시다아제를 포함하는 것인, 방법.