CN117625639A - 一种水稻thion22基因及其在调控水稻花粉管生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，具体公开了一种水稻THION22基因及其在调控水稻花粉管生长中的应用。本发明实验表明THION22基因能够调控水稻的花粉管在雌蕊中的生长情况，从而影响水稻的结实率，最终影响水稻产量，对水稻花粉管生长调控的研究具有重要的意义，这对水稻育种工作具有应用价值。
Description
技术领域
本发明属于属于植物生物技术领域，具体是调控水稻花粉管生长的基因。
背景技术
被子植物需要通过双受精形成种子，完成世代繁殖，而双受精过程涉及到一系列复杂且连续的雌雄蕊互作。与动物不同，植物的精细胞不能自主游动，需要依靠花粉管将其输送到胚囊即雌配子体中。雄蕊中的花粉首先通过特定媒介落到雌蕊的柱头上，经水合与相互识别后萌发产生花粉管，花粉管在柱头乳突细胞的细胞间生长并穿过柱头和花柱，最终到达指定的胚囊完成精细胞的输送。在花粉管穿越多层细胞结构最终完成双受精的过程中，花粉管接受很多来自雌蕊和胚囊分泌的信号分子，前人的研究表明这些信号的吸引对被子植物完成双受精而言是必须的。花粉管只有不断接受雌蕊及胚囊分泌的信号分子，才能在雌蕊组织中进行准确的导向性生长，最终进入胚囊完成双受精。
过去二十年中，国内外研究人员以模式植物拟南芥及蓝猪耳草等为材料，研究受精过程中雌-雄相互作用的分子机制，在花粉管导向研究领域取得了一系列重大突破。大量实验数据证实，雌性组织及雌配子体各细胞分泌的信号分子和花粉管中的受体相互作用，精确调控花粉管导向。雌蕊来源的分泌信号包括小肽、糖蛋白及激素等，其中分泌小肽与其位于花粉管上的类受体蛋白激酶形成的信号转导通路被发现在花粉管导向的多个过程中发挥关键的调控作用。尽管近些年来在植物双受精过程中雌雄蕊互作的研究取得了较大的进展，一些关键的信号分子及其调控机制被揭示，但这些研究主要集中在双子叶模式植物拟南芥中，对于重要的单子叶粮食作物如水稻中花粉管导向机理的研究极少。水稻雌蕊组织会分泌哪些可促进花粉管生长或吸引花粉管生长的信号，这些科学问题均亟待解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控水稻花粉管生长的基因THION22及其应用，该基因的功能对水稻雌雄蕊相互作用的研究具有重要应用价值。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种水稻THION22基因，该基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，其主要在调控水稻花粉管生长中的应用。
本发明采用CRISPR/Cas 9载体的构建方法对THION22基因进行编辑，获得不同的THION22突变体株系。具体方法为：将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，在靠近双元载体RB的位置上装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I，其sgRNA表达盒元件安装在中间质粒载体上，通过酶切连接和PCR方法将其拼接起来，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法组装到双元载体上，实现对THION22基因编辑。
本发明水稻THION22基因回补株系的载体构建，具体方法为：
(1)以野生型水稻ZH11的基因组DNA作为模板，利用THION22-Pro-F/R引物将THION22基因起始密码子ATG上游2500bp的启动子用PCR扩增出来；
(2)以成熟时期水稻小穗组织的cDNA为模板，利用THION22-CDS-F/R引物将THION22基因完成的CDS序列扩增出来，具体见；
(3)将(1)和(2)中的两个PCR片段同时作为模板，利用两端的引物将连个片段扩增在一起，经凝胶电泳检测后进行片段回收；
(4)将(3)中PCR片段连接到pENTRTM/D-TOPO载体并通过测序验证，然后通过LR反应重组到目的载体pGWB504中，并通过根癌农杆菌转化方法转化到thion22突变体中即可获得水稻回补株系。
本发明水稻成熟稻穗结实率的观察与统计，将不同品系的水稻种植温室环境中，条件设置为：温度26℃～28℃，空气湿度50％，光照14h，黑暗10h；待水稻生长成熟，将穗子剪下进行结实率统计。每个品种至少统计30株水稻，且每株统计1～2个主茎上的穗子。
本发明的THION22基因调控花粉管在雌蕊中的生长观察，具体操作方法：
(1)配好FAA固定液：50％乙醇、冰乙酸、甲醛按照体积比为89:6:5进行配置，10mol/L的NaOH溶液备用；
(2)取自然开花或者人工授粉(需要提前人工去雄)1.5-2小时后的颖花用FAA固定液固定；
(3)固定24小时后，再先后放在70％，50％，30％的系列酒精中脱水，每个步骤10-12分钟，最后在蒸馏水中复水，冲洗2-3遍；
(4)然后放入预先准备好的10mol/L NaOH溶液中，在56℃水浴锅中浸泡5-8分钟，再用蒸馏水冲洗数次后用0.1％苯胺蓝染色10～12h；
(5)最后在激光共聚焦显微镜下观察花粉在柱头上附着和萌发及花粉管伸长情况。
本发明的有益效果：本发明的水稻THION22基因能够调控水稻的花粉管在雌蕊中的生长，从而影响水稻的结实率，最终影响产量，对水稻花粉管生长调控的研究具有重要的意义，这对水稻育种工作具有一定的应用价值。
附图说明
图1为本发明调控水稻花粉管生长THION22基因结构及基因编辑鉴定的结果。如图所示展示了三种编辑方式的纯合突变体，命名为thion22-9、thion22-14、thion22-16。
图2为不同品系水稻成熟期穗子的结实观察和结实率统计图。其A图为野生型中花11(ZH11)、thion22突变体(thion22-9和thion22-14)及回补株系(Com#)穗子中的种子发育情况图；B图为ZH11、thion22突变体(thion22-9和thion22-14)及Com#的种子结实率统计图。
图3为不同品系的水稻花粉管在雌蕊中的生长情况图。图A、B、C分别为自花授粉2小时后ZH11、thion22突变体(thion22-14)及回补株系的雌蕊苯胺蓝染色结果情况图；图D为授粉2小时后花粉管在雌蕊中能否正常生长到达胚珠底部的概率统计图。
具体实施方式
本发明用下列实施例进行说明，但不是对本发明的使用范围的限制。
实施例
一、载体的构建
1、CRISPR/Cas 9载体的构建：
本研究中使用的基因编辑体系是华南农业大学刘耀光课题组2015年研究改造的CRISPR/Cas9体系，本套体系利用双元系统，将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，在靠近双元载体RB的位置上装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I，其sgRNA表达盒元件安装在中间质粒载体上，可以通过酶切连接和PCR方法将其拼接起来，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法组装到双元载体上，最终实现对THION22基因进行基因编辑。具体操作为：
(1)靶位点的选择和引物设计：选择合适的靶位点是至关重要的，在CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)在线网站上输入THION22基因的locusID，点击设计靶位点会自动输出候选靶位点，在输出的结果中挑选两个脱靶概率低且GC含量合适的靶位点，序列分别为Target1(TGTCCAGGATCTGCAGATGC)和Target2
(AGTTGGGCAAGCATTCGTG)。
(2)通过PCR将目的基因的两条引物进行互补配对：正反引物各加2μL，再加46μL的水至50ul体系，PCR反应程序为：95℃，5min；25℃，20min；利用限制性内切酶BsaI和T4DNALigase，通过边切边连的连接方式，将靶位点片段安装在sgRNA载体上。
(3)利用特异的接头引物U-F/gR-R和pps-GGL/pps-GGR(见表1)，通过两轮巢式PCR扩增出sgRNA表达盒的盒片段，并且将其带上了BsaI酶切位点的接头，用1％琼脂糖凝胶电泳检测两轮巢式聚合酶链反应的产物，在750bp内获得正确的目的条带，回收PCR反应产物。
(4)将第(3)步得到的PCR回收产物，利用限制性内切酶BsaI和T4DNALigase，通过边切边连的连接方式，将包含靶位点与sgRNA的PCR片段连接到Cas9载体上，验证正确后，再提取质粒，通过电击转化法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。
(5)利用农杆菌介导的水稻遗传转化体系，将构建好的crispr重组质粒转入到野生型中花11(ZH11)成熟种子诱导的愈伤组织中，经过筛选、分化以及PCR鉴定等过程得到基因编辑阳性苗。
(6)在THION22基因的靶位点前后约250bp设计引物(THION22T1-YZ-F/R，THION22T2-YZ-F/R)，通过PCR将含有靶位点的片段扩增出来，并进行测序。经过比对分析，靶位点Target1得到两种纯合突变体株系(thion-9和thion-14)，靶位点Target2得到一种纯合突变体株系(thion-16)，三种纯合突变体株系均发生了移码突变导致翻译的提前终止，如图1所示。通过仔细分析发现其中thion-14和thion-16突变后的蛋白序列差异较小，因此后续选择了thion-9和thion-14两个株系进行实验分析。
表1本发明中使用的引物
2、回补株系的载体构建
(1)以野生型ZH11的基因组DNA作为模板，利用表1中的THION22-Pro-F/R引物将THION22基因起始密码子ATG上游2500bp的启动子用PCR扩增出来；
(2)以成熟时期小穗组织的cDNA为模板，利用表1中的THION22-CDS-F/R引物将THION22基因完成的CDS序列扩增出来，具体见SEQ ID No.1；
(3)将(1)和(2)中的两个PCR片段同时作为模板，利用两端的引物将连个片段扩增在一起，经凝胶电泳检测后进行片段回收；
(4)将(3)中PCR片段连接到pENTRTM/D-TOPO载体(Invitrogen)并通过测序验证，然后通过LR反应重组到目的载体pGWB504中，并通过根癌农杆菌转化方法转化到thion22突变体中，获得回补株系(Com#)。
SEQ ID No.1：水稻THION22基因的CDS序列
ATGGAGGTGAAGAAGGTGGCCATGGTTGCTGTCTGCTGCATGTTCATACTGCTGTTTCCAGGCCAGCAGCAGCAGGTGGCTGCCATGTCCAGGATCTGCAGATGCTACCACGAATGCTTGCCCAACTGCGGCCTGCGCAATTCTCGCTCCTTCTGCAAGGTGTTCTGCGGCAGCTGCTGCGTCTTCAATCCAGTTCACAATTGCACTAGCACCGATGCGGCGGCCGCGGCGCCAGCGATCGCCGGAGACGACTGCAGAATGATCTGCCTGAACTCCTTCTGCGGCGAGGCAGCTACAGGCTACTCGGGGCGAAACGATGCTGATGCTGCAGCTTGTCTCGATGGCTGCAGCAAAGGATGA
二、表型的观察与统计
1、结实率的观察与统计：
将野生型ZH11、thion22突变体(thion22-9和thion22-14)及回补株系(Com#)水稻种植在条件可控制的智能温室中，条件设置为：温度26℃～28℃，空气湿度50％，光照14h，黑暗10h。待水稻生长成熟，将穗子剪下进行结实率统计(如图2所示)，每个品种至少统计30株水稻，且每株只统计1～2个主茎上的穗子。
由图2可知，thion22突变体水稻成熟期的穗子相比于野生型ZH11水稻的结实量少，且成熟慢，大部分呈现青色，未完全转色。thion22-9的结实率为42％(n＝35)，thion22-14的结实率为45％((n＝34)，与野生型ZH11 90％(n＝30)的结实率相比存在显著的下降。通过将pTHION22::THION22回补到突变体后(回补株系Com#)能正常结实，成熟期的形态、颜色也与野生型没有差异，结实率能够恢复正常，达到88％(n＝45)。
2、花粉管在雌蕊中的生长观察
水稻花粉着落在柱头上到形成花粉管伸长到达胚珠大约需要45分钟就可以完成。所以需要严格观察材料的开花时间并做好标记。
(1)配好FAA固定液：(V50％乙醇:V冰乙酸:V甲醛＝89:6:5)，10mol/L NaOH溶液备用；
(2)分别取野生型ZH11、thion22突变体(thion22-14)及回补株系(Com#)水稻自然开花大约2小时后的颖花用FAA固定液固定；
(3)固定24小时后，再放在70％，50％，30％的系列酒精中脱水，每个步骤约10分钟，最后在蒸馏水中复水，冲洗2-3遍；
(4)然后放入提前准备好的10mol/L NaOH溶液中，在56℃水浴锅中浸泡5-8分钟，再用蒸馏水冲洗数次后用0.1％苯胺蓝染色10-12h(可以过夜)；
(5)最后在激光共聚焦显微镜下(Leica SP2)观察花粉在柱头上附着和萌发及花粉管伸长情况并拍照如图3所示，并计算花粉管在雌蕊中能否正常生长到达胚珠底部的概率。
图3展示的是在授粉2小时候后野生型ZH11，thion22突变体和回补株系Com#雌蕊中花粉管的生长情况(白色箭头指示花粉管的生长位置)。结果显示在野生型中花11的雌蕊中观察到91％(n＝104)花粉管从柱头萌发后生长到达胚珠(图A和图D)，thion22突变体中只有63％(n＝138)的花粉管能够生长至胚珠，存在37％(n＝138)的花粉管生长停滞在花柱的位置导致突变体的结实率下降(图B和图D)。当pTHION22::THION22回补到thion22突变体后，结果显示85％花粉管能够生长至胚珠，显著提高了thion22突变体中花粉管正常生长的比例(图C和图D)。实验结果表明THION22基因的缺失会影响水稻花粉管的伸长，将pTHION22::THION22回补到突变体后(回补株系Com#)后花粉管能恢复正常生长。
从上述水稻结实率的观察实验和花粉管在雌蕊中的生长观察实验可知，THION22基因对水稻花粉管生长具有调控作用，会影响到水稻的结实率，可以依据实验要求对THION22基因进行编辑，调控水稻花粉管生长，从而获得生产、实验研究需要的水稻品系。
Claims (10)
1.一种水稻THION22基因，其特征在于，该基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种如权利要求1所述的THION22基因的应用，其特征在于，其在调控水稻花粉管生长中的应用。
3.权利要求2所述的THION22基因的应用，其特征在于，采用RISPR/Cas 9载体的构建方法对THION22基因进行编辑，获得不同的THION22突变体株系。
4.权利要求3所述的THION22基因的应用，其特征在于，RISPR/Cas 9载体的构建具体方法为：将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，在靠近双元载体RB的位置上装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I，其sgRNA表达盒元件安装在中间质粒载体上，通过酶切连接和PCR方法将其拼接起来，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法组装到双元载体上，实现对THION22基因编辑。
5.权利要求2所述的THION22基因的应用，其特征在于，水稻THION22基因回补株系的载体构建，具体方法为：
(1)以野生型水稻ZH11的基因组DNA作为模板，利用THION22-Pro-F/R引物将THION22基因起始密码子ATG上游2500bp的启动子用PCR扩增出来；
(2)以成熟时期水稻小穗组织的cDNA为模板，利用THION22-CDS-F/R引物将THION22基因完成的CDS序列扩增出来；
(3)将(1)和(2)中的两个PCR片段同时作为模板，利用两端的引物将连个片段扩增在一起，经凝胶电泳检测后进行片段回收；
(4)将(3)中PCR片段连接到pENTRTM/D-TOPO载体并通过测序验证，然后通过LR反应重组到目的载体pGWB504中，并通过根癌农杆菌转化方法转化到thion22突变体中即可获得水稻回补株系。
6.权利要求5所述的THION22基因的应用，其特征在于，所述THION22-Pro-F引物为GGCCGCCCCCTTCACCGCGCAGTGATGCTTACAGAT；
所述THION22-Pro-R引物为CTTCTTCACCTCCATTGATGCGATTCTTCT。
7.权利要求5所述的THION22基因的应用，其特征在于，所述THION22-CDS-F引物为AGAAGAATCGCATCAATGGAGGTGAAGAAG；
所述THION22-CDS-R引物CGGCGCGCCCACCCTTCCTTTGCTGCAGCCATCGAGAC。
8.权利要求5所述的THION22基因的应用，其特征在于，水稻成熟稻穗结实率的观察与统计，将不同品系的水稻种植温室环境中，条件设置为：温度26℃～28℃，空气湿度50％，光照14h，黑暗10h；待水稻生长成熟，将穗子剪下进行结实率统计。
9.权利要求5所述的THION22基因的应用，其特征在于，所述每个品种至少统计30株水稻，且每株统计1～2个主茎上的穗子。
10.权利要求5所述的THION22基因的应用，其特征在于，THION22基因调控花粉管在雌蕊中的生长观察，具体操作方法：
(1)配好FAA固定液：50％乙醇、冰乙酸、甲醛按照体积比为89:6:5进行配置，10mol/L的NaOH溶液备用；
(2)取自然开花或者人工授粉1.5-2小时后的颖花用FAA固定液固定；
(3)固定24小时后，再先后放在70％，50％，30％的系列酒精中脱水，每个步骤10-12分钟，最后在蒸馏水中复水，冲洗2-3遍；
(4)然后放入预先准备好的10mol/L NaOH溶液中，在56℃水浴锅中浸泡5-8分钟，再用蒸馏水冲洗数次后用0.1％苯胺蓝染色10～12h；
(5)最后在激光共聚焦显微镜下观察花粉在柱头上附着和萌发及花粉管伸长情况。
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