CN117625522A - 一种基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨及其制备方法，以及在修复关节缺损中的应用。本发明通过抽取患者骨髓液，体外分离、扩增患者自体骨髓间充质干细胞，将体外分离培养的骨髓间充质干细胞接种于脱钙骨支架，体外构建了组织工程软骨。所述组织工程软骨可被移植至关节缺损部位，实现关节缺损的有效修复及功能重建。

Description

一种基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程领域，具体地，涉及一种基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨和其制备方法，及其在修复关节缺损中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的退行性关节疾病，在中老年人群中发病率极高，累及人群巨大；患者发病时受累关节疼痛剧烈、活动受限、劳动能力基本丧失，严重影响日常生活和工作质量，给诸多家庭造成严重负担，已成为影响中老年人生存质量的重大社会问题。因此，骨关节炎防治研究价值巨大，其有效防治可显著提高患者生存质量，减轻社会负担，同时带来巨大的社会效益和经济效益。目前，临床上针对OA软骨退变程度不同，治疗措施也大不相同。对于轻度退变的早期患者，常用激素抗炎、透明质酸润滑、富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)等保守治疗，这些方法能缓解局部症状，但无法阻止关节软骨的持续退变。对于有局限性软骨缺损的中度退变患者，主要采用微骨折术和自体骨软骨移植术，前者主要依靠软骨下骨涌出的骨髓间充质干细胞再生少量的纤维样软骨，但仅限极小范围的软骨缺损，且长期效果不理想；后者会对供区造成极大创伤，且供体来源有限，移植软骨与周围正常软骨整合欠佳(马塞克现象)。对于关节软骨广泛破坏的重度退变患者，主要采用人工关节置换术实现关节结构和功能替代，但目前常用的基于金属、陶瓷等人工关节费用昂贵、无生物学功能，易引发感染和异物排斥，存在远期磨损和假体松动等弊端，常需二次甚至多次翻修。总体上讲，上述治疗方法都存在各自局限性，均无法实现生理性永久性关节功能重建。如何实现真正符合生理结构的生物关节再生和永久性功能重建仍是难以攻克的国际难题。
近年来，随着组织工程学的进步，人们逐渐开始研究使用组织工程所构建的支架或组织来尝试修复关节缺损。有研究证实，对于轻度退变的早期患者，应用自体干细胞结合抗炎、免疫调节等措施能有效阻止OA病情进展，甚至部分逆转软骨退变。对于有局限性软骨缺损的中度退变或软骨损伤，自体软骨细胞移植或复合胶原、明胶等可降解支架联合移植也能实现一定程度的软骨再生，临床症状明显改善。但该技术仅限于局限性软骨缺损修复，对于复合骨缺损的骨相修复和软骨-骨界面整合效果欠佳；同时，该技术需行开放性手术移植，使得手术时间较长，患者术后恢复缓慢；此外，获取软骨细胞对病损关节的创伤、细胞-材料复合物移植后软骨再生成功率以及其有限的力学性能也极大地限制了其临床推广应用。因此，现阶段关节缺损仍缺乏一种有效的治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨和其制备方法，及其在修复关节缺损中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种组织工程软骨，所述组织工程软骨包括：
(a)载体支架，所述载体支架包括脱钙骨支架；和
(b)接种于或负载于所述载体的骨髓间充质干细胞。
在另一优选例中，所述组织工程软骨包括将所述骨髓间充质干细胞接种于所述载体，并经成软骨培养后所形成的复合物，在所述复合物中，骨髓间充质干细胞负载于载体并与载体形成更为紧密的一体结构。
在另一优选例中，所述骨髓间充质干细胞来自人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述骨髓间充质干细胞分离自受试者自体的骨髓液。
在另一优选例中，所述受试者为人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述受试者患有关节缺损或其他类型硬组织缺损或畸形。
在另一优选例中，所述关节缺损为包括软骨缺损、硬骨缺损或其组合。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
在另一优选例中，所述其他类型硬组织缺损或畸形包括，但不限于胫骨缺损、股骨缺损、肱骨缺损、下颌骨畸形、颧骨畸形。
在另一优选例中，所述骨髓间充质干细胞是经体外培养至P2至P5代，优选P3代的骨髓间充质干细胞。
在另一优选例中，所述骨髓间充质干细胞接种于所述载体上的接种密度为20-100×106细胞/cm3，较佳地，40-80×106细胞/cm3。
在另一优选例中，所述脱钙骨支架包括同种异体脱钙骨支架、异种脱钙骨支架及以脱钙骨为主体结构构建的复合支架。
在另一优选例中，所述脱钙骨支架的形状包括圆柱体、长方体或其他特定形状。
在另一优选例中，所述脱钙骨支架为圆柱体，其直径为4-8mm，高度为6-10mm。
在另一优选例中，所述脱钙骨支架的孔隙的孔径为200-400μm，孔隙率为80％～90％。
在另一优选例中，所述载体支架还可以负载有明胶、胶原、丝素、水凝胶或其组合。
在另一优选例中，所述成软骨培养是使用成软骨诱导液进行的体外培养。
在另一优选例中，所述成软骨诱导液包含以下组分：高糖DMEM培养基，1％1×ITSpremix((ITS通用型培养混合剂，含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐),40μg/ml脯氨酸，10ng/ml TGF-β1，100ng/ml IGF-1,40ng/ml地塞米松和50μg/ml维生素C。
在另一优选例中，所述成软骨培养的时间为2-10周，较佳地4-8周，最佳地6周。
在另一优选例中，所述组织工程软骨可用于修复关节缺损和/或其他类型硬组织缺损。
本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的组织工程软骨的方法，包括以下步骤：将骨髓间充质干细胞群接种于所述载体支架，经体外成软骨培养，从而获得所述的组织工程软骨。
在另一优选例中，所述骨髓间充质干细胞群采用直接填充的方式接种于载体支架上。
在另一优选例中，所述骨髓间充质干细胞群以骨髓间充质干细胞悬液的形式接种于载体支架上，所述骨髓间充质干细胞悬液的浓度为40-80×106细胞/mL。
在另一优选例中，所述方法包括以下具体步骤：
(1)无菌抽取患者骨髓液，体外分离、扩增培养骨髓间充质干细胞至P2-P5代，优选P3代；
(2)将骨髓间充质干细胞收集、重悬，并以40-80×106细胞/cm3的密度接种至脱钙骨支架中，孵育2-4小时；
(3)加入成软骨诱导液，体外成软骨培养2-10周，较佳地4-8周，最佳地6周，从而获得所述组织工程软骨。
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的组织工程软骨的用途，用于制备修复关节缺损或其他类型硬组织缺损或畸形的医用产品。
在另一优选例中，所述关节缺损为包括软骨缺损、硬骨缺损或其组合。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
在另一优选例中，所述其他类型硬组织缺损或畸形包括，但不限于胫骨缺损、股骨缺损、肱骨缺损、下颌骨畸形、颧骨畸形。
本发明的第四方面，提供了一种修复关节缺损或其他类型硬组织缺损或畸形的方法，包括使用如本发明第一方面所述的组织工程软骨，移植入待修复患者的组织缺损或畸形处。
在另一优选例中，所述关节缺损为包括软骨缺损、硬骨缺损或其组合。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
在另一优选例中，所述其他类型硬组织缺损或畸形包括，但不限于胫骨缺损、股骨缺损、肱骨缺损、下颌骨畸形、颧骨畸形。
在另一优选例中，所述移植为微创移植，包括关节镜或其他微创植入手段。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的组织工程软骨大体观及组织学染色；A1-A3：大体观，组织工程软骨呈象牙白样软骨外观；B1-B3：苏木素-伊红(HE)染色，染色结果显示体外构建的组织工程软骨具有典型的软骨陷窝样结构；C1-C3：番红(SO)染色，染色结果显示体外构建的组织工程软骨含有大量软骨特异性细胞外基质。
图2显示了本发明的组织工程软骨移植的手术操作；A：筛选大小形状合适的组织工程软骨；B：镜下观察股骨软骨损伤区；C：清理损伤面后将筛选出的软骨放入打好的孔道内；D：按一定密度重复植入后。
图3显示了组织工程软骨移植手术前后MRI检查结果；A(A1、A2)为术前MRI情况，可见关节内侧间室退行性病变，股骨内侧软骨及软骨下骨损伤明显，伴有囊变；B(B1、B2)为术后半年MRI情况，术前水肿情况明显减轻，移植物在位良好，见连续性软骨下骨及软骨信号，提示关节软骨及骨再生情况良好。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现并开发了一种基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨。本发明使用脱钙骨基质这一天然来源且具有良好力学强度的天然材料作为支架，接种患者自体骨髓间充质干细胞体外构建组织工程软骨后通过关节镜微创移植至缺损部位，从而实现患者关节缺损的有效修复及功能重建。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“组织工程软骨”可以互换使用“基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨”，均指如本文所述的经体外成软骨培养或未经体外成软骨培养的骨髓间充质干细胞-脱钙骨支架复合物。
如本文所用，术语“接种”意指将从患者骨髓液中分离的骨髓间充质干细胞接种于细胞培养皿中，也可意指将经体外扩增培养至P4-P5代的骨髓间充质干细胞接种于脱钙骨支架中并使其均匀分布，本领域技术人员根据上下文可以理解所用“接种”的含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
骨髓间充质干细胞及其制备
本发明所使用的骨髓间充质干细胞由患者自体骨髓液中分离扩增而来。
具体地，从患者髂前上棘经穿刺取骨髓3～5ml，置于PercoII分离液上(密度1.073g/L)行梯度密度离心，骨髓与分离液比例为1:2。2550r/min离心30分钟，吸取中间云雾状细胞层，磷酸缓冲液(PBS)洗1次。1550r/min离心后弃上清获取有核细胞，以2×107细胞/cm2接种培养皿，进行体外细胞扩增。
原代细胞接种后48小时换液，细胞达80％～90％融合后，采用0.25％胰酶消化，2×103细胞/cm2传代培养，置于37℃，5％CO2培养箱培养至P2-P5代，收集细胞并计数，从而得到可用于接种的骨髓间充质干细胞悬液。
脱钙骨支架
在本发明的一个优选实施例中，载体支架为脱钙骨支架(也称为脱钙骨基质)，其厚度为0.3～0.8cm，较佳地0.4～0.6cm，最佳地0.5cm。所述脱钙骨基质的脱钙量为30％～50％，脱钙程度合适，支持作用佳，并易于修整裁剪为合适的形状和大小。所述的脱钙骨基质的孔隙的孔径为200-400μm，易于接种骨髓间充质干细胞。
脱钙骨基质(DBM)是由同种异体骨或异种骨经脱钙处理，免疫原性较低的组织再生材料。具有良好的生物学特性、及生物降解性，促进组织再生，可以单独或与自体骨、其它生物材料、生长因子联合有效修复各类硬组织损伤，是比较理想的组织工程支架材料。但脱钙骨基质本身无主动组织再生能力，单纯应用会降解、吸收，导致修复效果无法长久维持。本发明使用骨髓间充质干细胞接种于脱钙骨支架构建组织工程软骨，可实现在关节缺损部位的稳定组织再生、缺损修复与功能重建。
本发明所用的培养基
骨髓间充质干细胞培养基：用于骨髓间充质干细胞的培养基每升液体含低糖DMEM培养基10g，L-谷氨酰胺300mg，维生素C 50mg，碳酸氢钠3.7g。优选地，加入2-5ng/mL的碱性成纤维生长因子(bFGF)。
成软骨诱导液：高糖DMEM培养基，1％1×ITS premix((ITS通用型培养混合剂，含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐)，40μg/ml脯氨酸，10ng/ml TGF-β1，100ng/ml IGF-1，40ng/ml地塞米松和50μg/ml维生素C。
HE染色和Saf-O染色
HE染色：苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
Saf-O染色：又称番红O染色，是一种常用的软骨染色方法。Saf-O染色的原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色；番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖阴离子基团(硫酸软骨素或硫酸角质素)结合。
本发明的组织工程软骨
在本发明的一个方面，提供了一种组织工程软骨，所述组织工程软骨是将体外分离扩增的骨髓间充质干细胞接种于载体支架上，然后经体外成软骨培养后所形成的骨髓间充质干细胞-脱钙骨支架复合物。在本发明的一个优选例中，所述骨髓间充质干细胞是分离自患者自体骨髓液，经体外扩增培养至P2-P5代的骨髓间充质干细胞，且所述载体支架为脱钙骨支架；所述骨髓间充质干细胞以细胞悬液的形式直接填充接种于脱钙骨支架上，接种密度为20-100×106细胞/cm3，较佳地，40-80×106细胞/cm3；负载有骨髓间充质干细胞的脱钙骨支架在成软骨诱导液中经体外成软骨培养后，最终形成更为紧密的骨髓间充质干细胞-脱钙骨支架复合物一体结构。本发明的组织工程软骨呈象牙白样软骨外观，且组织染色显示不仅具有典型的软骨陷窝样结构，还含有大量软骨特异性细胞外基质。由于骨髓间充质干细胞具有软骨、骨双向分化潜能，因此本发明的组织工程软骨植入患处可用于修复关节缺损或其他类型硬组织缺损或畸形，实现软骨-骨缺损一体化修复与功能重建。
本发明的有益效果
本发明提出了一种使用基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨微创修复关节缺损的方法，其有益效果包括：
(1)现有的组织工程技术构建的关节缺损修复软骨移植物力学强度极其有限，无法在缺损部位实现即时力学支撑；而脱钙骨支架力学强度优异，基于该类支架体外构建的组织工程软骨具备良好的力学性能，可在缺损部位实现即时力学支撑。
(2)脱钙骨基质作为可降解的天然材料，可在体内降解，相较于人工合成高分子支架材料而言具有较低的免疫原性。
(3)现有的组织工程修复关节缺损的方法多使用软骨细胞构建软骨移植物修复缺损，该类方法仅能修复软骨缺损，但多数关节缺损患者多伴有不同程度的软骨下骨损伤，因此现有技术无法实现关节软骨-骨一体化修复；本发明使用具有软骨、骨双向分化潜能患者自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞构建组织工程软骨修复缺损，可实现关节软骨-骨缺损一体化修复与功能重建。
(4)脱钙骨支架具有良好的可雕刻性，可根据患者缺损面积及形状个体化定制支架材料并构建具有特定形状的组织工程软骨。
(5)本发明使用患者自体骨髓间充质干细胞构建的组织工程软骨相较于传统干细胞-材料复合物而言，对于环境具有更好的耐受能力，适于长途运输，有利于本技术的推广应用。
(6)本发明构建的组织工程软骨所使用的种子细胞为患者自体骨髓间充质干细胞，具备骨化潜能，因此也可用于其它类型的硬组织缺损修复。
下面，通过具体的实施例对本发明做进一步说明。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1
基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨的制备
(1)从患者髂前上棘经穿刺取骨髓3～5ml，置于PercoII分离液上(密度1.073g/L)行梯度密度离心，骨髓与分离液比例为1:2。2550r/min离心30分钟，吸取中间云雾状细胞层，磷酸缓冲液(PBS)洗1次。1550r/min离心后弃上清获取有核细胞，以2×107细胞/cm2接种培养皿，进行体外细胞扩增。
(2)原代细胞接种后48小时换液，细胞达80％～90％融合后，采用0.25％胰酶消化，2×103细胞/cm2传代培养，置于37℃，5％CO2培养箱培养至P2至P5代，收集细胞并计数。
(3)将骨髓间充质干细胞收集、重悬制备浓度为40-80×106细胞/mL的细胞悬液并接种至圆柱状脱钙骨支架(直径4-8mm，高度6-10mm)中，孵育2-4小时后加入成软骨诱导液，体外成软骨诱导4-8周构建组织工程软骨。
本发明所制备的组织工程软骨具有典型的软骨组织象牙白样外观(图1，A1-A3)，组织学检测显示有大量软骨特异性细胞外基质成分分泌，是典型的软骨组织(图1，B1-B3，C1-C3)。
实施例2
使用基于脱钙骨支架构建的组织工程软骨微创修复关节缺损
患者行全身麻醉，仰卧位，采用标准膝关节前内、前外侧入路，使用关节镜微创清理损伤面至软骨下骨并将实施例1中制备的组织工程软骨移植至缺损部位(图2)。
患者术前MRI检查可见软骨及软骨下骨损伤明显，伴有囊变及水肿信号(图3，A)。移植后可见移植物在位良好，水肿范围明显减少，可见连续性软骨信号(图3，B)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种组织工程软骨，其特征在于，所述组织工程软骨包括：
(a)载体支架，所述载体支架包括脱钙骨支架；和
(b)接种于或负载于所述载体的骨髓间充质干细胞。
2.如权利要求1所述组织工程软骨，其特征在于，所述组织工程软骨包括将所述骨髓间充质干细胞接种于所述载体，并经成软骨培养后所形成的复合物，在所述复合物中，骨髓间充质干细胞负载于载体并与载体形成更为紧密的一体结构。
3.如权利要求1所述的组织工程软骨，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞是经体外培养至P2至P5代，优选P3代的骨髓间充质干细胞。
4.如权利要求2所述的组织工程软骨，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞接种于所述载体上的接种密度为20-100×106细胞/cm3，较佳地，40-80×106细胞/cm3。
5.如权利要求2所述的组织工程软骨，其特征在于，所述成软骨培养是使用成软骨诱导液进行的体外培养。
6.如权利要求6所述的组织工程软骨，其特征在于，所述成软骨诱导液包含以下组分：高糖DMEM培养基，1％1×ITS premix((ITS通用型培养混合剂，含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐),40μg/ml脯氨酸，10ng/ml TGF-β1，100ng/ml IGF-1,40ng/ml地塞米松和50μg/ml维生素C。
7.如权利要求2所述的组织工程软骨，其特征在于，所述成软骨培养的时间为2-10周，较佳地4-8周，最佳地6周。
8.一种制备如权利要求1所述的组织工程软骨的方法，包括以下步骤：将骨髓间充质干细胞群接种于所述载体支架，经体外成软骨培养，从而获得所述的组织工程软骨。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞以骨髓间充质干细胞悬液的形式接种于载体支架上，所述骨髓间充质干细胞悬液的浓度为40-80×106细胞/mL。
10.一种如权利要求1所述的组织工程软骨的用途，用于制备修复关节缺损或其他类型硬组织缺损或畸形的医用产品。
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