CN117625482A - 一株植物乳植杆菌及其发酵获得的抗真菌肽 - Google Patents
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Abstract
一株植物乳植杆菌及其发酵获得的抗真菌肽。本发明从浆水菜中分离得到一株植物乳植杆菌，对植物乳植杆菌进行培养后得到发酵上清液，对上清液分离纯化后制得一种新的六肽。本发明提供的方法所得发酵上清液经浓缩可以直接用于抑菌，经过对发酵上清液进一步分离纯化后可以最强效抑菌组分F，当F作用于指示菌细胞时，对细胞造成不同程度损伤。同时六肽也可在1/2 MIC浓度下造成黄曲霉结构的变化。这些发现新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳植杆菌及其发酵获得的抗真菌肽，属于生物技术领域，特别涉及一种由植物乳植杆菌及由植物乳植杆菌发酵获得的抑制黄曲霉生长的抗真菌肽。
背景技术
真菌污染的发生和真菌毒素的产生涉及食物链的各个环节，对食品质量和保质期产生不可逆影响，造成大量收入损失，并对人类健康构成严重威胁。使用物理方法进行真菌抑制减少污染可能会对产品质量产生负面影响，同时面临投入设备成本高，效率有限等问题。而有些化学杀菌剂的使用会对食品质量和环境产生不利因素，有些甚至会对人类产生危及生命的副作用。因此，迫切需要开发有效、安全、环保的控制真菌和真菌毒素污染的方法。
植物乳植杆菌，为乳植杆菌属革兰氏阳性菌，是一种兼性异型发酵乳酸菌。同时，植物乳植杆菌也是分布最广、数量最多的乳酸菌之一，在抑制真菌生长和去除霉菌毒素方面发挥着重要作用。在其及代谢产物，包括有机酸、蛋白质类物质和挥发性有机化合物的作用下，通过分解细胞结构来抑制真菌的生长。由于其已获得欧洲食品安全局(EFSA)的合格安全推定(QPS)地位和美国食品和药物管理局(USFDA)的公认安全(GRAS)地位，因此分离并利用定义明确的微生物或其活性代谢物去抑制真菌生长和抗真菌毒性作用，是解决真菌污染问题的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一株植物乳植杆菌及其发酵获得的抗真菌肽。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株植物乳植杆菌，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH，所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年11月9日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 20232169。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种具有抑制黄曲霉菌生长活性的抗真菌肽，所述抗真菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗真菌肽由植物乳植杆菌发酵液分离获得，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH，所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)WYH，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年11月9日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 20232169。
优选的技术方案为：所述植物乳植杆菌培养条件为：培养温度为28～37℃，初始pH5.2～5.6，接种量1％～1.5％，装液量800～850mL；培养基具体为MRS肉汤培养基。
优选的技术方案为：植物乳植杆菌发酵液，以黄曲霉菌为指示真菌，经过离心，超滤，尺寸凝胶排阻色谱，结合蛋白纯化设备利用多肽在280nm的紫外吸收峰进行逐级分离纯化，得到抗真菌肽。
优选的技术方案为：所述抗真菌肽的分子量为512.61Da，等电点为5.52。
优选的技术方案为：所述抗真菌肽对于黄曲霉菌的最小抑菌浓度为15.63mg/mL。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明首次从植物乳植杆菌无细胞上清发酵液中分离并纯化一种抑制黄曲霉生长的抗菌六肽，所述抗菌肽对于Aspergillus flavus JXZS-118具备有较强的抑制效果，同时体外无细胞毒性，具有显著优势且应用前景广阔。
2、本发明还提供了所述抗黄曲霉六肽在制备抑制微生物的产品种的应用，制备得到的产品可以显著抑制黄曲霉菌生长，减少黄曲霉菌产生孢子数量，增加了抗真菌肽的应用前途。
附图说明
图1为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH的革兰氏染色图片和与其他同源菌株的系统发育进化树。
图2为抗真菌有效组分分离筛选过程。A、蛋白纯化吸收峰图；B、峰组分抑菌图；C、各组分抑菌率图。
图3为活性峰F的色谱图。
图4为抗真菌肽高效液相色谱图。
图5为抗真菌肽的质谱图。
图6为抗真菌肽对Caco-2的细胞毒性。
图7为抗真菌肽作用与黄曲霉菌的SEM图。
图8为抗真菌肽抗黄曲霉作用在花生仁上应用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-8。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
菌种保藏：植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年11月9日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M20232169。保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。
下面结合实例，对本发明技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：一株植物乳植杆菌及其发酵获得的抗真菌肽
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH菌株分离自甘肃省兰州市家庭自制发酵蔬菜浆水菜中，具体方法如下：
用无菌取样袋将浆水菜样品与无菌水按照(v/m＝1:10)混匀后，用移液器吸取适量，将其稀释成不同梯度后涂布于乳酸菌选择性培养基MRS培养基上，37℃培养36h，挑取平板上单菌落，将得到的菌落多次划线纯化培养，得到纯的单菌落。首先分辨属于细菌的菌株。同时利用革兰氏染色后显微镜观察其为革兰氏阳性菌，同时菌落呈白色圆形、中央凸起，菌落表面细密而光滑。
而后，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT)进行分子鉴定后，对分离得到的菌株进行测序。将得到的序列16S rDNA sequence(SEQ ID No：1)
在NCBI的Genome数据库进行BLAST比对，结果表明，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH菌株与已知的植物乳植杆菌16S rDNA序列的同源性>99％；并与同源菌株进行进化分析，确认植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)WYH菌株是同种不同株的植物乳植杆菌(图1)。
L.plantarum的16s rDNA序列SEQ NO.1：
TGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGG AACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAAC。
抗黄曲霉菌肽的制备方法如下：
以MRS肉汤培养基培养植物乳植杆菌30h，接种量为1.5％，培养温度37℃。后收集培养液，4000rpm/min离心20min后获得无细胞上清液。将滤过液经切向流过滤系统(TFF)(P/N：S02-E003-05-N，Media/Rating：mPES/3KDa，比表面积：790cm2)进行超滤得到分子量≤3KDa的粗肽溶液，-80℃冰箱冷冻凝固后置于冷冻干燥机中冻干浓缩。将浓缩后粗多肽溶液使用粒径排除色谱(Sephadex G-25)进一步分离含有低于3KDa的肽的部分。将100mg冻干馏分溶解于5mL蒸馏水中，并将其装入柱种。洗脱液为超纯水，根据重力调节流速为0.6mL/min。采用波长为280nm的紫外灯测定峰，用于检测蛋白质多肽类化合物。所得部分的肽浓度用OPA法测定并统一，以黄曲霉JXZS-118作为指示菌，采用琼脂平板法测量菌落直径，以此计算分离峰的抑制率，测定分离峰的抑菌活性。结果如图所示，峰F测出最强抑菌活性，计算出抑菌率为39.06±1.33％。(图2)
收集抑菌活性最高的分离峰，使用真空冷冻干燥设备进行干燥后，称取20mg，用200μL裂解液完全溶解后，加入800μL甲醇，冰水浴超声5分钟。40℃静置1h后，4℃条件下12000rpm离心10分钟，收集480μL上清液，真空冷冻干燥备用。使用用400μL 0.1％FA，2％乙腈溶液(buffer A)溶解样品。然后使用400μL 0.1％FA，80％乙腈(buffer B)，1000rpm离心1分钟活化除盐柱。接着使用400μL的0.1％FA，2％乙腈溶液(buffer A)，1000rpm离1分钟平衡除盐柱。将样品加入除盐柱内，1000rpm离心1分钟，多肽被除盐柱捕集。再加400μL0.1％FA，2％乙腈溶液(buffer A)1000rpm离心1分钟，清洗除盐柱。随后将除盐柱放到新的EP管中，加200μL0.1％FA，80％乙腈溶液(buffer B)，1000rpm离心1分钟，洗脱获得待测多肽。洗脱液真空干燥后，加入100μLbuffer A复溶样品，取20μL上机检测。经nanoUPLC液相系统EASYnLC1200进行分离后联用配备纳升离子源的质谱仪(Q-Exactive HFX)进行数据采集。色谱分离采用100μm ID×15cm反相色谱柱(Reprosil-Pur 120C18AQ，1.9μm，Dr.Maisch)进行。流动相采用乙腈水甲酸体系，其中流动相A为0.1％甲酸98％水溶液(乙腈为2％)，B相为0.1％甲酸和80％乙腈溶液(水为20％)。色谱柱以100％的A相平衡后，样品由自动进样器直接上样到色谱柱，再经色谱柱梯度分离，流速300nL/min，梯度时长60min。流动相B比例为25％，持续2min，5～22％持续34min，22～45％持续20min，45～95％持续2min，95％持续2min。
质谱分析使用数据依赖性采集(DDA)模式，总分析时长为60min，采取正离子检测模式。一级扫描(Full scan)范围3501600m/z，分辨率为120k(@200m/z)，AGC为1E6，最大离子注入时间(max IT)为50ms；一级扫描中强度最高的20个离子(top 20)经四极杆筛选后使用HCD裂解后进行碎片离子扫描。四极杆隔离窗口(isolation window)为1.2m/z，标准化碰撞能(NCE)为30％，AGC为1E5，max IT为100ms。二级扫描分辨率15k。根据色谱峰峰宽，动态排除时间设为30s；单电荷及>6价的离子不进行二级扫描。最终原始数据文件使用ProteomeDiscoverer软件(PD)(version 2.4.0.305,Thermo Fisher Scientific)及内置的SequestHT搜索引擎进行搜库分析得到目标多肽序列。
通过筛选，得到最优性能抗真菌肽为6个氨基酸组成的小肽，序列SEQ ID NO.2为Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Ala。使用ExPasy中的ProtParam软件，对该抗真菌六肽进行分析。得知该抗真菌肽的分子式为C23H40N6O7，分子量为512.61Da,等电点为5.52，脂溶性指数为130.00，亲水性的总体平均值(GRAVY)是1.233，见表1。使用NCBI、APD数据库进行同源性分析，发现与该抗真菌肽的同源性较低，最高仅为40％，见表2。由此推断，该六肽为一种新型的抑制黄曲霉生长的抗真菌肽。
表1抗真菌肽6667理化性质预测
| 序列 | 长度 | 静电荷数 | GRAVY | 平均亲水性 | 等电点 |
| LPGVGA | 6 | 0 | 1.23 | -0.6 | 5.52 |
表2抗真菌肽6667与APD数据库中抗菌肽对比
色谱纯化到纯度大于98％，并通过质谱进行对多肽的氨基酸序列进行鉴定，得到其分子量为512.61。
色谱条件为：色谱柱为：Kromasil 100-5C18，4.6×250mm 5micron；液相色谱条件：流动相：A泵：体积百分比0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，B泵：体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液。流速1.0mL/min；进样量10μL；检测波长：220nm；洗脱时间：20min；洗脱方式为梯度洗脱：0min进样量为15％A+85％B，20min进样量为40％A+60％B，20.1min100％A+0％B停止。抗菌肽6667的高效液相色谱图见图3。
质谱条件为：离子源：ESI；毛细管电压(V)：2500-3000；脱溶气体流速(L/小时)：800脱溶温度：450℃锥形电压(V)：15-30运行时间：1分钟。抗菌肽液相色谱质谱图见图4。
测定六肽的最小抑菌浓度。
最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)的测定：选择黄曲霉菌作为指示菌。将真菌接种在PDA培养基上，置于25℃的恒温培养箱中培养7天，待孢子成熟后用已灭过菌的生理盐水将孢子洗下，于4℃冰箱保存备用。采用二倍稀释法测定抗真菌肽的最小抑菌浓度值(MIC)。具体操作如下所述：①在平板的每个孔中加入100μL的PDB培养基，然后在三排的第一孔中加入配好母液的100μL，接着用移液枪充分吹打使其混匀，再吸取其中的100μL加入到第二孔中，按照以上步骤重复至最后一孔，吸取100μL后弃去。使得孔内浓度为(0.98～500mg/mL)②在每一孔中加入稀释好的孢子悬液2μL(浓度为105个/mL)，这样就形成了测定每种抑菌剂MIC值的三次重复实验(1/2/3三排样品)。④于同一块平板上做对照实验，分别为阴性对照即仅添加培养基而没有孢子悬液和阳性对照实验即孢子悬液中不添加抑菌剂。将平板置于恒温培养箱(25℃)中培养40h，以不出现肉眼可见菌落的最低抑菌剂浓度定义为MIC。实验重复3次。最终得出MIC为15.63mg/mL。
表3抗真菌肽MIC
对抗真菌肽6667的细胞毒性进行测定
采用CCK-8法测定抗菌肽6667的细胞毒性，具体步骤如下：
铺板：使用0.25％胰酶消化对数期Caco-2细胞，以PBS缓冲液(0.01M，pH 7.2)冲洗、离心(2000r/min，离心3min)后收集细胞，制成细胞悬液，采用细胞计数法将其浓度调整至1×105个/ml；吸取细胞悬液至96孔板中(100μL/孔)，置于细胞培养箱在温度37℃、CO2浓度5％条件下培养24h。加样：把预先准备好的96孔板从培养箱中取出，吸出旧细胞培养基，加入90μL新鲜的细胞培养基。第1列加入100μL的PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)作为空白对照。将抗真菌肽样品用PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)稀释，使得孔内终浓度为32、16、8、4mg/ml，每孔样品加入量为10μL，每个浓度设置4组平行。接着将96孔板放入培养箱中继续培养24h。加入CCK-8：在每个孔中避光加入10μL浓度为5mg/mL的CCK-8，放入培养箱中继续培养4h。终止培养，最后在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值。结果如图6所示。
扫描电镜观察抗黄曲霉六肽处理后真菌表面形态变化。
在96孔板中加入100μL PDA培养基中加入不同量的抗真菌肽6667，使其的终浓度分别为0.5和1MIC。然后将黄曲曲霉的孢子悬浮液接种在培养基中，浓度为106个/mL，以纯水为对照。在28℃下进行培养24h。后斜插入直径为3mm的细胞爬片继续培养。取下每组爬片，用PBS缓冲液冲洗3次。将菌丝体置于4％的戊二醛溶液中在4℃条件下过夜固定。将样品用0.1M PBS(pH 7.4)缓冲液漂洗3～4次(每次约8～10min)，然后在1％的四氧化锇溶液中固定2h。将固定好的样品通过梯度乙醇系列脱水后置于CO2临界点进行喷金镀膜处理等待观察。
观察六肽在花生仁上的实际应用。健康的花生种子经过70％乙醇处理1.5分钟，用3.5％次氯酸鈉洗涤2分钟,然后用无菌蒸馏水彻底冲洗5次。超净台内置于培养皿中，皿上放置9mm滤纸。表面风干后，分别均匀喷洒等体积无菌水，0.5和1MIC抗真菌肽溶液。平板置于恒温培养箱(25℃)中培养5天。并收集花生上的菌体，过滤菌丝体和杂质，得到并计数分生孢子。
实施例2：一株植物乳植杆菌及其发酵获得的抗真菌肽
本实施例的目的是为传统化学杀菌剂和物理方法杀灭黄曲霉菌，探索新型生物控制方法，提供一种植物乳植杆菌产抑黄曲霉菌多肽的方法。其发酵上清液经浓缩后可以直接用于抑制黄曲霉生长，经过分离纯化后还可以得到一种新的六肽，具有抑菌作用，可作为生物制剂防控黄曲霉污染。
本发明第一个目的提供了一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WYH菌株，其特征在于，其从甘肃兰州家庭自制发酵蔬菜浆水菜中分离得到，所述植物乳植杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 20232169；所述植物乳植杆菌WYH的16S rDNA全序列SEQ ID No:1所示。
一种六肽，其由植物乳植杆菌发酵无细胞上清液分离纯化产生，具有抑制黄曲霉菌生长的活性。其氨基酸序列SEQ ID NO.2为：Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Ala，用单字母表示为LPGVGA.
优选的，所述抗菌六肽的分子量为512.61Da，等电点为5.52。
对植物乳植杆菌进行培养，得到无细胞发酵上清液。
所述的植物乳植杆菌的培养条件为培养温度35-37℃，初始pH 5.5-5.9，接种量1.0％-1.5％，装液量为800-850mL。所述培养基为MRS肉汤培养基，具体为：酪蛋白酶消化物10.0g/L,牛肉膏粉10.0g/L,酵母膏粉4.0g/L,柠檬酸三铵2.0g/L,乙酸钠5.0g/L,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L,硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.05g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,葡萄糖20.0g/L,吐温-80 1.0g/L。
植物乳植杆菌产生并纯化抗黄曲霉菌活性物质的方法，对所得发酵上清液以黄曲霉菌为指示菌，具体为Aspergillus flavus JXZS-118。首先通过超滤截留有效组分，后使用AKTA蛋白纯化设备利用尺寸排阻色谱，得到抗黄曲霉活性多肽，对纯化产物进行LC-MS分析。
将分离纯化后得到的抑菌物质作用于黄曲霉JXZS-118，而后通过扫描电镜观察抗真菌肽对于黄曲霉菌丝体的结构变化。
通过对无细胞上清液的分离纯化和抑菌活性的筛选，最终获得最有效活性六肽，经液相质谱分析有效抑菌组分F中含有一种6个氨基酸组成的新型抗真菌肽。
本发明提供所述抗菌肽在制备防治黄曲霉菌中的应用。
优选的，所述多肽对于黄曲霉菌的最小抑菌浓度为15.63mg/mL。并在玉米粒上可以显著抑制黄曲霉生长，减少分生孢子产量。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (6)
1.一株植物乳植杆菌，其特征在于：所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）WYH，所述植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）WYH，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期为2023年11月9日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 20232169。
2.一种具有抑制黄曲霉菌生长活性的抗真菌肽，其特征在于：所述抗真菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗真菌肽由植物乳植杆菌发酵液分离获得，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）WYH，所述植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）WYH，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期为2023年11月9日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 20232169。
3.根据权利要求2所述的具有抑制黄曲霉菌生长活性的抗真菌肽，其特征在于：所述植物乳植杆菌培养条件为：培养温度为28~37℃，初始pH 5.2~5.6，接种量1%~1.5%，装液量800~850 mL；培养基具体为MRS肉汤培养基。
4.根据权利要求2所述的具有抑制黄曲霉菌生长活性的抗真菌肽，其特征在于：植物乳植杆菌发酵液，以黄曲霉菌为指示真菌，经过离心，超滤，尺寸凝胶排阻色谱，结合蛋白纯化设备利用多肽在280nm的紫外吸收峰进行逐级分离纯化，得到抗真菌肽。
5.根据权利要求2所述的具有抑制黄曲霉菌生长活性的抗真菌肽，其特征在于：所述抗真菌肽的分子量为512.61Da，等电点为5.52。
6.根据权利要求2所述的具有抑制黄曲霉菌生长活性的抗真菌肽，其特征在于：所述抗真菌肽对于黄曲霉菌的最小抑菌浓度为15.63 mg/mL。
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