CN116686847A - 萎缩芽孢杆菌lb6-2的代谢产物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种萎缩芽孢杆菌LB6‑2的代谢产物在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用，所述萎缩芽孢杆菌LB6‑2的代谢产物包含3‑丙‑2‑基‑2,3,6,7,8,8a‑六氢吡咯[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮、(3R,8AS)‑六氢‑3‑异丁基吡咯并[1,2‑A]吡嗪‑1,4‑二酮和(3R,8AS)‑六氢‑3‑(苯基甲基)‑吡咯并[1,2‑A]吡嗪‑1,4‑二酮；所述萎缩芽孢杆菌LB6‑2于2023年03月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo.63275。本发明涉及的萎缩芽孢杆菌LB6‑2的代谢产物，通过从萎缩芽孢杆菌LB6‑2中提取获得出抑制立枯丝核菌的代谢产物，确定了萎缩芽孢杆菌LB6‑2代谢产物中的有效成分，得到天然活性物质，为防治立枯丝核菌引起的病害提供了一个新的路径。
Description
技术领域
本发明涉及应用农业微生物与生物防治技术领域，具体涉及一种萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物及其应用。
背景技术
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是一种寄主范围极广，在自然界普遍存在的土壤习居真菌。立枯丝核菌可侵染大量经济作物如水稻、棉花、小麦、玉米、甜菜、大豆和番茄等，主要引起植物的烂种、苗期猝倒、立枯病、纹枯病及马铃薯黑痣病等。该病菌由于具有发病快、易传播、一旦侵染难以防治等特点，被认为是最具破坏力的土传病原菌之一。目前应用于防治立枯丝核菌的生防因子有很多，主要有真菌、细菌以及放线菌。
但是目前生物防治的效果远不及化学药剂防治，而且生物因子防治效果不稳定，可能的原因包括生防菌的退化、立枯丝核菌的变异、环境条件的变化等因素。因此在今后的研究中需要将遗传学、分子生物学、生态学等方法进行综合使用，最终达到高效、安全地防治立枯丝核菌。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物及其防治立枯丝核菌引起的病害中的应用，为防治立枯丝核菌提供了一个新的路径。
本发明所采用的技术方案如下：
根据本申请的一个方面，提供了一种萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用，所述萎缩芽孢杆菌LB6-2的包含3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮；
所述萎缩芽孢杆菌LB6-2于2023年03月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo.63275。
具体的，所述萎缩芽孢杆菌LB6-2的获得方法包括以下步骤：
(1)将萎缩芽孢杆菌LB6-2进行发酵，得到发酵液；
(2)使用大孔树脂对发酵液进行吸附，溶解，减压蒸馏后，得到浸膏；
(3)将所述浸膏溶解进行层析柱分离，得到所述萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物。
具体的，步骤(1)中，将萎缩芽孢杆菌LB6-2在NB培养中进行发酵，所述发酵的条件包括：温度为25℃～30℃，转速150～200r·min-1下振荡培养20～30h。
具体的，步骤(2)中，使用甲醇溶解后，进行减压蒸馏，得到粗提物浸膏；然后甲醇水溶液将粗提物浸膏再次溶解，用二氯甲烷萃取，收集有机相，真空浓缩，得到浸膏。
具体的，步骤(3)中，所述层析柱分离时，使用甲醇洗脱，控制流速在1.5～2.5mL/min，得到萎缩芽孢杆菌LB6-2的。
具体的，步骤(3)中，所述经高效液相色谱分离得到活性成分，所述活性成分为3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮。
具体的，步骤(4)中，将所述活性成分使用质谱与核磁共振波谱进行分析。
根据本申请的另一个方面，3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用。
根据本申请的另一个方面，(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用。
根据本申请的又一个方面，(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用。
生物材料保藏信息：
萎缩芽孢杆菌LB6-2已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址：中国广州市先烈中路100号，广东省微生物所，邮编：510070，保藏日期为2023年03月14日，保藏号为GDMCC No：63275；建议的分类学名称为Bacillusatrophaeus。
本发明的有益效果包括但不限于：
(1)本发明涉及的萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物，通过从萎缩芽孢杆菌LB6-2中提取获得出抑制立枯丝核菌的代谢产物，确定了萎缩芽孢杆菌LB6-2中的有效成分，得到天然活性物质，为防治立枯丝核菌引起的病害提供了一个新的路径。
(2)本发明涉及的抑制立枯丝核菌的活性物质的提取方法，首次提取得到化合物LBN4-2，LBN4-4和LBN4-5，为这三种天然化合物的开发研究提供了一个新的思路。
(3)本发明涉及到的应用，首次公开了化合物抑制立枯丝核菌的作用，可以将这三种化合物直接用于抑制立枯丝核菌，可有效防治立枯丝核菌引起的病害。
附图说明
图1为本发明萎缩芽孢杆菌LB6-2对立枯丝核菌的拮抗效果；A1:平板对峙，B1:对照，A2:菌丝生长速率法，B2:对照，A3:菌核萌发抑制法，B3:对照；
图2为本发明萎缩芽孢杆菌LB6-2的16S rDNA序列系统发育树；
图3为本发明化合物LBN4-2的正离子源质谱数据图；
图4为本发明化合物LBN4-2氢谱图(1H NMR)；
图5为本发明化合物LBN4-2碳谱图(13C NMR)；
图6为化合物LBN4-2质荷比；
图7为本发明化合物LBN4-4的正离子源质谱数据图；
图8为本发明化合物LBN4-4氢谱图(1H NMR)；
图9为本发明化合物LBN4-4碳谱图(13C NMR)；
图10为化合物LBN4-4质荷比；
图11为本发明化合物LBN4-5的正离子源质谱数据图；
图12为本发明化合物LBN4-5氢谱图(1H NMR)；
图13为本发明化合物LBN4-5碳谱图(13C NMR)；
图14为化合物LBN4-5质荷比；
图15为本发明萎缩芽孢杆菌LB6-2代谢产物对立枯丝核菌菌核的拮抗效果；其中A1，B1:对照；A2:LBN4-21mm；A3:LBN4-41mm；A4:LBN4-51mm；B2:LBN4-22mm；B3:LBN4-42mm；B4:LBN4-52mm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。
本发明中，如未指定，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
供试立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)从市场购得，生防萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)LB6-2由新疆农业科学院植物保护研究所蔬菜病虫害绿色防控创新团队分离保存。
实施例1生防菌株的分离筛选
采用平板对峙法、菌丝生长速率法和菌核萌发抑制法筛选对立枯丝核菌有防治效果的生防菌株。平板对峙法：选取活化的立枯丝核菌菌饼置于PDA平板中央，在菌饼两侧划线供试菌株，28℃恒温黑暗培养72h，观测抑菌直径，同时接种只含有病原菌的作为对照。菌丝生长速率法：将纯化菌饼接种N培养基中，28℃，130r·min-1振荡培养24h作为种子培养液。取种子培养液5mL转入装有100mLNA液体培养基的三角瓶中，28℃，130r·min-1条件下振荡培养120h，8000r·min-1离心10min，取上清液过滤得无菌发酵滤液。将1mL的无菌发酵滤液与9mL PDA培养基混匀制成带菌平板，在带菌平板上放置立枯丝核菌饼，以无菌水为对照，3次重复，28℃恒温黑暗培养72h后测量抑菌直径。菌核萌发抑制法：选择大小基本一致的立枯丝核菌菌核放入无菌发酵滤液中浸泡30min，将处理后的菌核放在PDA平板上，以在无菌水中浸泡的菌核为对照。每皿4个菌核，每个处理3次重复；28℃恒温黑暗培养，48h后观测菌核萌发的菌落直径，计算抑制率。
菌落生长直径(mm)＝测量直径(mm)-菌饼直径(mm)
本申请以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为靶标，对已分离出的330株菌采用平板对峙法、菌丝生长速率法和菌核萌发抑制法，综合获得效果好的菌株LB6-2。结果表明，在对峙培养中，LB6-2平板对峙的抑菌直径为32.33mm；菌丝生长抑制率为71.76％；菌核萌发抑制率为100.00％(见表1、图1)。
表1生防菌株对立枯丝核菌的效果
注：数据为3次重复的平均值±标准差；显著性分析采用最小极差法(LSD,P＜0.05)(下同)。
实施例2LB6-2的鉴定
形态学鉴定：生防细菌的形态特征和生理生化特性试验参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》进行鉴定。
分子生物学鉴定：采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，使用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R对提取的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix12.5μL，F和R引物(10μmol/L)各1μL，模板DNA1μL，加ddH2O至总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃复性2min，重复31个循环，最后72℃下延伸10min。PCR产物由上海生物工程股份有限公司进行序列测定，测得的序列经NCBI进行BLAST比对后，用MEGA 5软件进行序列分析，采用邻接法构建系统发育树。
生物学鉴定：菌株LB6-2在NA培养基上前期成乳白色，后期呈乳黄色逐渐产生黑色素，菌落不透明，边缘不规则，呈波状，菌落表面不平滑，微微凸起。革兰氏染色呈阳性，细胞杆状，两端钝圆。菌株可利用D-葡萄糖和D-甘露醇为碳源，在过氧化氢酶和淀粉水解反应、V-P试验、硝酸盐还原、牛奶凝固与胨化中呈阳性，在明胶液化和M.R.测定都呈阴性，在5％的NaCl浓度下正常生长(表2)。
表2生理生化特性测定
注：+.阳性；-.阴性。Note:+.Positive；-.Negativ.
分子生物学鉴定：菌株LB6-2(OK639005.1)用16S rDNA进行PCR扩增测得的序列在NCBI上进行BLAST比对，生防细菌菌株LB6-2与Bacillus atrophaeus(MH488964.1和MK721038.1)的相似度最高，达到99％，采用MEGA 5软件构建系统发育树(图2)，结合形态学和生理生化测定结果，将其鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
实施例3生防菌代谢产物的提取与检测
挑取纯化后的生防菌株LB6-2单菌落接种于装有5mLNB培养液的试管中，28℃、180r·min-1下振荡培养24h，得到一级种子发酵液。将一级种子发酵液转接到50mL/250mL的NB培养液中，28℃、180r·min-1下振荡培养24h，得到二级种子发酵液。以5％的接种量接种于装有9g XAD-16大孔树脂及200mLNB培养液的1L三角瓶中，并在相同培养条件下培养5d，共计液体发酵6L。
摒弃发酵液，留下大孔树脂并用蒸馏水反复清洗直至干净，28℃下烘干。烘干后的树脂用甲醇浸泡得到甲醇浸提液，反复浸泡3次。收集浸提液进行旋转蒸发减压蒸馏，得到浸膏。用质量分数为50％的甲醇水溶液将浸膏再次溶解，用一倍体积的二氯甲烷萃取4次，收集有机相，真空浓缩，得到二氯甲烷相浸膏5.35g用于后续化合物分离。
取少量浸膏复溶于1mL甲醇中进行液相色谱HPLC检测，HPLC流动相为0.1％甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)。HPLC分析柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm、4.6×150mm)，梯度洗脱条件为：0-2min，B相10％；2-20min，B相10％-100％；20-30min，B相100％；30-30.5min，B相100％-10％；30.5-34.5min，B相10％。流速为1.0mL/min，柱温25℃，进样量1μL，检测波长为254、210、280和230nm。
采用湿法上样用3mL甲醇溶解浸膏，Sephadex LH-20层析柱(柱长50cm，直径2.0cm)进一步分离纯化，用甲醇洗脱，控制流速在2mL/min，当色谱带层析到玻璃柱下端5cm时等体积收集馏分，每样品瓶接25mL直到色谱带全部层析完毕，共接馏分14瓶，命名为LBN1～14。
采用菌丝生长速率法分别在平板中加入100μL收集液，对馏分LBN1～14进行活性检测，结果表明馏分LBN4对立枯丝核菌有较好的抑制活性，抑制率达73.71％(表3)
表3不同馏分对立枯丝核菌的生防效果
注：数据为3次重复的平均值±标准差；显著性分析采用最小极差法(LSD,P＜0.05)。
实施例4生防菌代谢产物的分离纯化和结构鉴定
利用半制备型高效液相色谱对活性较好的馏分LBN4进行分离制备，馏分LBN4色谱图中共有6个明显峰值，分别命名为LBN4-1～6，并对其进行制备分离。HPLC样品制备条件：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈。采用Kromasil 100-5-C18柱(10μm、10×250mm)进行分离制备。洗脱条件为：0-50min，B相18％；50.0-50.5min，B相18％。流速为2.0mL/min，柱温25℃，进样量3μL，检测波长为254、210、280和230nm。经同等条件制备液相分离、浓缩后，其中LBN4-1、LBN4-3和LBN4-6获得化合物质量较少，不足以进行后续试验，最终从馏分LBN4中获得3个单体化合物，分别为LBN4-2(3.12mg，tR 11.421～11.834min)、LBN4-4(2.67mg，tR24.852～25.810min)和LBN4-5(5.87mg，tR 27.610～29.015min)。使用超高效液相-四级杆飞行时间质谱检测样品的高分辨质谱对其测定，充分干燥的3个样品分别溶解于600μL氘代丙酮，进行核磁共振波谱(NMR)分析(由中科院微生物所代为测定)。
化合物LBN4-2为无色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。化合物LBN4-2的[M+H]+分子离子峰为197.0，推断其分子式为C10H16N2O2，确定其结构式如式1所示，通过其核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据图(见表4、图3～6)，与已知化合物Cyclo(Pro-Val)(CAS：5654-87-5)进行对比分析，鉴定其为Cyclo(Pro-Val)，常用名：环(脯氨酸-缬氨酸)，中文名：3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
表4化合物LBN4-2的碳谱、氢谱NMR数据(methanol-d4)
Note:a 1H and 13C NMR spectra were recorded at 600and 150MHz,respectively.
化合物LBN4-4为无色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。化合物LBN4-4的[M+H]+分子离子峰为210.2，推断其分子式为C11H18N2O2，确定其结构式如式2所示。通过其核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR))数据图(见表5、图7～10)，与已知化合物Cyclo(Pro-Ile)(CAS：36238-67-2)进行对比分析，鉴定其为Cyclo(D-Leu-L-Pro)，常用名：环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽，中文名：(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮。
表5化合物LBN4-4的碳谱、氢谱NMR数据(methanol-d4)
化合物LBN4-5为无色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。化合物LBN4-5的[M+H]+分子离子峰为244.1，推断其分子式为C14H16N2O2，确定其结构式如式3所示。通过其核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR))数据图(见表6、图11～14)，与已知化合物Cyclo(D-Phe-L-Pro)(CAS：26488-24-4)进行对比分析，鉴定其为Cyclo(L-prolyl-D-phenylalanyl)，常用名：环(D-苯丙氨酸-L-脯氨酸)，中文名：(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮。
表6化合物LBN4-5的碳谱、氢谱NMR数据(methanol-d4)
Note:a 1H and 13C NMR spectra(methanol-d4)were recorded at 600and150MHz,respectively.
Note:a 1H and 13C NMR spectra(methanol-d4)were recorded at 600and150MHz,respectively.
实施例5单体化合物对立枯丝核菌菌核的抑制
溶液配制：将核磁管内化合物溶液进行氮吹，吹干后测得LBN4-2、LBN4-4和LBN4-5的质量分别为3.12mg、2.67mg和7.00mg。加入100μL甲醇进行溶解，再分别加入无菌水配成8mM母液，再将其稀释成4mM、2mM和1mM进行活性测定。
菌核萌发抑制法：选择大小基本一致的立枯丝核菌菌核放入不同浓度的稀释液中浸泡30min，将处理后的菌核放在PDA平板上，以在无菌水中浸泡的菌核为对照。每皿4个菌核，每个处理3次重复。28℃恒温黑暗培养，48h后观察菌核萌发的菌落直径，计算抑制率。
由图15，表7的结果可知，化合物LBN4-2、LBN4-4和LBN4-5对立枯丝核菌菌核的生长均有显著的抑制效果，且浓度越高，对菌核的抑制作用越好。LBN4-2、LBN4-4和LBN4-5的浓度在2mM以上时，对立枯丝核菌菌核的抑制率为100％。
表7不同浓度化合物对立枯丝核菌菌核的抑制效果
注：数据为3次重复的平均值±标准差；显著性分析采用最小极差法(LSD,P＜0.05)。
以上对本发明所提供的萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和优化，这些改进和优化也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物包含3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮；
所述萎缩芽孢杆菌LB6-2于2023年03月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo.63275。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物的获得方法包括以下步骤：
(1)将萎缩芽孢杆菌LB6-2进行发酵，得到发酵液；
(2)使用大孔树脂对发酵液进行吸附，溶解，减压蒸馏后，得到浸膏；
(3)将所述浸膏溶解进行层析柱分离，得到所述萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，将萎缩芽孢杆菌LB6-2在NB培养中进行发酵，所述发酵的条件包括：温度为25℃～30℃，转速150～200r·min-1下振荡培养20～30h。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，使用甲醇溶解后，进行减压蒸馏，得到粗提物浸膏；然后甲醇水溶液将粗提物浸膏再次溶解，用二氯甲烷萃取，收集有机相，真空浓缩，得到浸膏。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述层析柱分离时，使用甲醇洗脱，控制流速在1.5～2.5mL/min，得到萎缩芽孢杆菌LB6-2的代谢产物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述代谢产物经高效液相色谱分离得到活性成分，所述活性成分为3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，将所述活性成分使用质谱与核磁共振波谱进行分析。
8.3-丙-2-基-2,3,6,7,8,8a-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用。
9.(3R,8AS)-六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用。
10.(3R,8AS)-六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮在防治立枯丝核菌引起的病害中的应用。
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