CN117603883A - 一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株及其应用 - Google Patents

一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产转糖苷活性β‑半乳糖苷酶的片球菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述片球菌菌株为片球菌Y1，所述片球菌Y1分类命名为Pediococcus sp.Y1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232025。本发明所述片球菌Y1在发酵培养基中培养可获得含产转糖苷活性β‑半乳糖苷酶的粗酶液，经该粗酶液催化乳糖可制备出特定结构组成的低聚半乳糖，该低聚半乳糖含有较高比例的转移三糖。

Description

一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株及其应用。
背景技术
低聚半乳糖(galactOoligosaccharides，GOS)是以葡萄糖或半乳糖为还原性末端，通过β-(1,3)、β-(1,4)、β-(1,6)等糖苷键连接2-10个半乳糖单元组成的一种功能性低聚糖。GOS最早在动物乳汁中被发现，是一种天然的益生低聚糖。GOS能够促进肠道双歧杆菌和乳杆菌等益生菌在肠道内的定殖，在婴儿配方奶粉中的功能特性已得到广泛的认可。GOS还具有抑制致病菌在结肠上皮的附着，降低血清胆固醇和血压，预防结肠癌和增强免疫力等益生特性。此外，GOS的甜度仅为蔗糖的0.3～0.6倍，具有较好的水溶性和适口性，在高温和低pH条件下具有较高的稳定性，因而在食品工业中有着重要的应用价值。
目前，GOS因其特殊的复杂结构获取途径还十分有限，不同糖苷键类型及聚合度的低聚半乳糖，其益生特性也存在差异。食品中天然存在的GOS含量一般很少，现主要通过酶法来合成。主要利用具有转糖苷活性的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)催化乳糖反应制得。β-半乳糖苷酶可以以乳糖为底物转移半乳糖残基合成不同聚合度和糖苷键类型的GOS。GOS的得率，聚合度以及产物的β-糖苷键类型主要依赖于β-半乳糖苷酶的来源以及其在反应过程中使用的转苷条件(初始乳糖浓度，加酶量，反应温度，反应时间，pH等)。因此，筛选不同微生物来源的高转糖苷活性β-半乳糖苷酶对于高效合成具有特定聚合度和糖苷键的GOS具有重要意义。
目前商业化的β-半乳糖苷酶主要来源于菌株有很多，比如米曲霉、环状芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、片球菌等。对乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)不同菌株的比较基因组学研究表明，乳酸片球菌在菌株水平的代谢特点与其生活环境密切相关，特别是一些碳水化合物水解酶(CAZy)基因在乳酸片球菌不同种菌株之间存在较大的差异，推测不同片球菌属菌株所产β-半乳糖苷酶的酶学特性存在较大差异，进而对β-半乳糖苷酶合成的GOS的得率和组成也存在较大的差异。目前对于不同菌株来源的β-半乳糖苷酶合成GOS的得率和组成研究并未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于丰富转糖苷活性β-半乳糖苷酶产酶菌株的来源并为进一步开发应用该菌株所产β-半乳糖苷酶高效合成GOS奠定基础。本发明提供了一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株及其应用，所述片球菌(Pediococcus sp.)Y1制备的β-半乳糖苷酶能以乳糖为底物催化合成以转移二糖、转移三糖为主的低聚半乳糖产物。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株，所述片球菌菌株为片球菌Y1，所述片球菌Y1分类命名为Pediococcus sp.Y1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232025，保藏日期为2023年10月25日。
本发明提供了所述片球菌Y1在制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶中的应用。
本发明提供了所述片球菌Y1在制备低聚半乳糖中的应用。
本发明还提供了利用所述的片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法，包括如下步骤：将片球菌Y1接种至种子培养基中活化培养，将活化的片球菌Y1接种至发酵培养基中发酵得发酵液，将发酵液离心收集湿菌体，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液，超声破碎，离心收集上清液，即为含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的粗酶液。
本发明还提供了利用所述的片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法，包括如下步骤：将片球菌Y1接种至种子培养基中活化培养，将活化的片球菌Y1接种至发酵培养基中发酵得发酵液，将发酵液离心收集湿菌体，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液，加入溶菌酶孵育，超声破碎，离心收集上清液，即为含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的粗酶液。
优选的，所述种子培养基和发酵培养基均为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO45 g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，吐温-80 1mL/L，MnSO40.25 g/L，pH(6.2～6.4)，121℃灭菌15min。
本发明还提供利用所述片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法获得的粗酶液生产低聚半乳糖的方法，包括如下步骤：将得到的β-半乳糖苷酶粗酶液添加至乳糖溶液中催化转糖苷反应，即得到含有低聚半乳糖的酶反应液。
优选的，所述乳糖溶液为pH7.0磷酸盐缓冲液配制的质量浓度为75～525mg/mL的乳糖溶液。
优选的，所述反应的条件包括：150μL乳糖溶液中加酶量3～5U/mL，反应温度为40～65℃，反应时间为2～48h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开的片球菌(Pediococcus sp.)Y1菌株来源于奶酪，具有安全性好(GRAS，QPS)，增殖率高、遗传稳定性好，易培养，成本低等特点。在以乳糖为碳源，酵母浸粉、蛋白胨及牛肉浸粉等氮源及无机盐等组成的发酵培养基，发酵生产β-半乳糖苷酶，发酵后经酶活检测，发酵液中酶活可达14.52U/mL。将制备的β-半乳糖苷酶粗酶液加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液中，50℃条件下催化反应28h，GOS得率最高可达38.4％(w/w)，乳糖水解率达到约69.1％(w/w)，其中，转移二糖和转移三糖分别为15.6％(w/w)和18.3％(w/w)。目前，对于Pediococcus属来源β-半乳糖苷酶以乳糖为底物合成GOS的得率以及组成尚未见报道。因此，本发明公开的从奶酪样品中分离筛得的片球菌(Pediococcus sp.)Y1因其较高的转糖苷活性而具有明显的优势。
附图说明
图1为产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌Y1的系统进化分析。
图2为TLC分析初始乳糖质量浓度对合成GOS的影响。其中：S为标准糖(乳糖、半乳糖、葡萄糖混合物)，1-8：依次对应初始乳糖质量浓度为75、150、225、300、337、375、450、525mg/mL反应12h的转糖苷反应产物。
图3为TLC分析反应温度对合成GOS的影响。其中：S为标准糖(乳糖、半乳糖、葡萄糖混合物)，1-6：依次对应在反应温度40，45，50，55，60，65℃反应12h的转糖苷反应产物。
图4为TLC分析反应时间对合成GOS的影响。其中：S为标准糖(乳糖、半乳糖、葡萄糖混合物)，1-12：依次对应在反应时间2，4，6，8，12，16，20，24，28，32，40，48h转糖苷反应产物。
图5为片球菌Y1所产转糖苷活性β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的HPLC分析。
生物保藏说明
片球菌Y1，分类命名为Pediococcus sp.Y1，拉丁名为Pediococcus sp.Y1，于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232025。
具体实施方式
本发明提供了一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株，所述片球菌菌株为片球菌Y1，所述片球菌Y1分类命名为Pediococcus sp.Y1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232025，保藏日期为2023年10月25日。本发明所述片球菌Y1从新疆伊犁少数民族传统手工奶酪中分离得到。本发明所述片球菌Y1具有如下生物学特征：革兰氏阳性球菌、不形成芽孢、在MRS培养基上形成1～2mm的圆形菌落、边缘整齐、表面呈乳白色；能够发酵乳糖、半乳糖、葡萄糖，不能发酵蔗糖、麦芽糖、木糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇；淀粉水解试验、明胶水解试验、接触酶试验、硫化氢产生试验均为阴性。
在本发明中，本发明涉及的产转糖苷活性β-半乳糖苷酶菌株Y1的16SrRNA的核苷酸序列长度为1572bp，通过NCBI-blast进行同源性比对分析，筛选菌株Y1与乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)归为一支，因此菌株Y1暂定为片球菌(Pediococcus sp.)Y1。
本发明提供所述片球菌Y1在制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶中的应用。利用本发明所述片球菌Y1发酵获得的产转糖苷活性β-半乳糖苷酶活性高达14.52U/mL。
本发明提供了所述片球菌Y1在制备低聚半乳糖中的应用。利用本发明所述片球菌Y1发酵获得的含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶粗酶液催化乳糖，可获得具有特定结构的低聚半乳糖，所述低聚半乳糖组成以转移二糖和转移三糖为主，分别为15.6％(w/w)和18.3％(w/w)，转移三糖以上的低聚半乳糖质量分数为4.5％(w/w)。
作为一种可实施方式，本发明提供了所述片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法，包括如下步骤：将片球菌Y1接种至种子培养基中活化培养，将活化的片球菌Y1接种至发酵培养基中发酵得发酵液，将发酵液离心收集湿菌体，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液，超声破碎，离心收集上清液，即为含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的粗酶液。
作为另一种可实施方式，本发明提供所述片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法，其包括如下步骤：将片球菌Y1接种至种子培养基中活化培养，将活化的片球菌Y1接种至发酵培养基中发酵得发酵液，将发酵液离心收集湿菌体，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液，加入溶菌酶孵育，超声破碎，离心收集上清液，即为含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的粗酶液。本发明加入溶菌酶孵育可使细菌在破碎的时候更加彻底，β-半乳糖苷酶的释放量增加，从而酶活力得到提高。
在本发明中，所述种子培养基和发酵培养基均为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO45 g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O0.58g/L，吐温-80 1mL/L，MnSO40.25 g/L，pH(6.2～6.4)，121℃灭菌15min。
在本发明中，涉及的种子培养条件为：将片球菌(Pediococcus sp.)Y1于30～38℃、100～250rpm的转速震荡培养12～24h活化该菌株；涉及的发酵条件为：将活化的片球菌(Pediococcus sp.)Y1接种在发酵培养基，接种量为发酵培养基的1％～10％，在30～38℃、震荡转速100～300rpm发酵培养12～24h，得发酵液。
在本发明中，对得到的发酵液经过冷冻离心收集湿菌体，用pH 7.0的0.1M磷酸盐缓冲液制成菌悬液，然后于0～4℃冰浴破碎，破碎采用超声破碎，破碎后所得的悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
本发明提供利用所述片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法获得的粗酶液生产低聚半乳糖的方法包括如下步骤：将得到的β-半乳糖苷酶粗酶液添加至乳糖溶液中催化转糖苷反应，即得到含有低聚半乳糖的酶反应液。本发明所述乳糖溶液为pH7.0磷酸盐缓冲液配制的质量浓度为75～525mg/mL乳糖溶液，优选为100～400mg/mL乳糖溶液。本发明所述反应条件包括：150μL乳糖溶液中加酶量3～5U/mL，反应温度为40～65℃，反应时间2～48h。
在本发明中，若无特殊说明，所有的组分或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1片球菌(Pediococcus sp.)Y1的分离和筛选
(1)在超净工作台内取出保存好的新疆伊犁少数民族传统手工奶酪样品适样，置于45mL已经灭过菌的生理盐水中，混合均匀以后使用无菌生理盐水试管进行梯度稀释至10-5，移取100μL稀释液均匀涂布于含有X-gal的以乳糖为碳源的MRS固体培养基中，放置于37℃恒温培养24～48h。挑取能够水解X-gal且单菌落呈蓝色的单菌落，在相同的条件下进行划线，反复划线3次，得到纯培养物后采用斜面与甘油进行保藏。
其中，MRS培养基(平板)：琼脂粉20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO45 g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，吐温-80 1mL/L，MnSO40.25 g/L，pH(6.2～6.4)，121℃灭菌15min。
(2)挑取蓝色单菌落于MRS培养基中37℃，200rpm培养18h。之后在4℃下冷冻离心(8000rpm，10min)发酵液，使用pH 7.0，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶在37℃孵育2.5h，冰浴条件下超声破碎(工作3s停6s、功率125W、时间15min)，12000rpm冷冻离心20min，上清液即为粗酶液。
(3)取20μL粗酶液与80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)配制的ONPG溶液于37℃反应10min，反应结束后加入100μL 1mol/L的碳酸钠溶液终止反应，使用酶标仪测其420nm波长处的吸光度，计算酶活力，筛选出高产β-半乳糖苷酶活力的菌株。对照组采用20μL已灭活的粗酶液在相同条件下参与反应。酶活单位定义为：在一定的条件下，1min催化水解ONPG生成1μmol邻硝基苯酚(o-nitrophenyl，ONP)的酶量为1个酶活单位(U)。
(4)基于步骤(3)筛选出的高产β-半乳糖苷酶活力的菌株，取对应菌株的步骤(2)的粗酶液50μL与150μL300 mg/mL的乳糖溶液反应，于40℃反应12h，100℃处理10min终止反应。分别对不同菌株的反应产物进行薄层层析(TLC)。用无水乙醇将样品稀释至1％，毛细管将稀释的样品点样至加热活化过的薄层硅胶板，以正丁醇-乙醇-水(5:3:2，V/V)为展开剂进行展开，将显色剂(3,5二羟基甲苯0.5％(w/v)溶解在20％的硫酸中)喷雾于TLC板后于烘箱中110℃烘烤10min显色。根据TLC板上对应低聚糖产物斑点的大小，筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株C1、C3、Y1、Y2、F1和F2。
实施例2产转糖苷活性β-半乳糖苷酶菌株的鉴定
对上述实施例1筛选得到的菌株Y1进行鉴定。
(1)形态学观察和生理生化试验
将Y1菌株接种于MRS固体培养基上37℃培养24h-48h，菌株Y1在MRS培养基上形成圆形菌落，边缘整齐，表面光滑，呈乳白色；菌体为球状，革兰氏染色为阳性。菌株Y1的生理生化实验说明，该菌株能够发酵乳糖、半乳糖、葡萄糖，不能发酵蔗糖、麦芽糖、木糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇。淀粉水解试验、明胶水解试验、接触酶试验、硫化氢产生试验均为阴性。
(2)16S rRNA的克隆及其序列分析
提取菌株Y1基因组DNA，用细菌16S rRNA基因的通用引物27f和1492r进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行通用引物27f和1492r的双向测序，16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。将测序结果从NCBI-blast进行同源性比对分析。比对结果显示，菌株Y1的16S rRNA基因序列与多株Pediococcus属菌株的16S rRNA基因序列相似性均达到99％。依据数据库中相关种属序列，建立系统发育树。进化距离的计算采用邻接法(Neighbor-joining method)，在MEGA 7.0软件中用p-距离(p-distances)和Kimura-2参数(Kimura-2parameter)双参数法构建，选用Bootstrap法评价进化树分支聚类的稳定性，重复1000次，得到产酶菌株的种属分类情况，结果如图1所示，筛选菌株Y1与乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)归为一支。因此，菌株Y1暂定为片球菌(Pediococcus sp.)Y1。
实施例3利用产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的菌株片球菌(Pediococcussp.)Y1发酵生产β-半乳糖苷酶的方法
具体步骤如下：
(1)种子培养
种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO45 g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，吐温-80 1mL/L，MnSO40.25 g/L，pH(6.2～6.4)，121℃灭菌15min。
种子培养条件：将片球菌(Pediococcus sp.)Y1于37℃、200rpm的转速震荡培养15h活化该菌株；
(2)发酵培养
发酵培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO45 g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，吐温-80 1mL/L，MnSO40.25 g/L，pH(6.2～6.4)，121℃灭菌15min。
发酵条件：将步骤(1)活化的片球菌(Pediococcus sp.)Y1接种在发酵培养基，接种量为发酵培养基的2％(体积百分比)，在37℃、震荡转速200rpm发酵培养18h生产β-半乳糖苷酶。
(3)发酵后处理
将步骤(2)得到的发酵液经过冷冻离心收集湿菌体，用pH 7.0的0.1M磷酸盐缓冲液制成菌悬液，冰浴条件下超声破碎(工作3s停6s、功率125W、时间15min)，12000rpm冷冻离心20min，上清液即为粗酶液。取20μL粗酶液与80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)配制的邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)溶液于37℃反应10min，反应结束后加入100μL 1mol/L的碳酸钠溶液终止反应，使用酶标仪测其420nm波长处的吸光值，通过ONPG标准曲线法计算酶活。经检测酶活达到：6.95U/mL。
实施例4利用产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的菌株片球菌(Pediococcussp.)Y1发酵生产β-半乳糖苷酶的方法
具体步骤如下：
(1)种子培养
种子培养基同实施例3。
种子培养条件：将片球菌(Pediococcus sp.)Y1于37℃、200rpm的转速震荡培养15h活化该菌株；
(2)发酵培养
发酵培养基同实施例3。
发酵条件：将步骤(1)活化的片球菌(Pediococcus sp.)Y1接种在发酵培养基，接种量为发酵培养基的2％，在37℃、震荡转速200rpm发酵培养18h生产β-半乳糖苷酶。
(3)发酵后处理
将步骤(2)得到的发酵液经过冷冻离心收集湿菌体，用pH 7.0的0.1M磷酸盐缓冲液制成菌悬液，加入终浓度1mg/mL的溶菌酶在37℃条件孵育2.5h，冰浴条件下超声破碎(工作3s停6s、功率125W、时间15min)，12000rpm冷冻离心20min，上清液即为粗酶液。
取20μL粗酶液与80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)配制的ONPG溶液于37℃反应10min，反应结束后加入100μL 1mol/L的碳酸钠溶液终止反应，使用酶标仪测其420nm波长处的吸光值，通过ONPG标准曲线法计算酶活。经检测酶活达到：14.52U/mL。
实施例5利用片球菌(Pediococcus sp.)Y1发酵生产的β-半乳糖苷酶粗酶液生产低聚半乳糖的方法
1、β-半乳糖苷酶粗酶液对不同浓度初始乳糖催化反应的影响
具体步骤包括：
(1)将实施例4所得的粗酶液以加酶量4.54U/mL(75、150、225、300、337、375、450、525mg/mL，pH 7)不同初始乳糖浓度溶液中，40℃孵育12h。
(2)用无水乙醇将将步骤(1)得到含有低聚半乳糖的酶反应液稀释至1％，毛细管将稀释的样品点样至加热活化过的薄层硅胶板，以正丁醇-乙醇-水(5:3:2，V/V)为展开剂进行展开，将显色剂(3,5二羟基甲苯0.5％(w/v)溶解在20％的硫酸中)喷雾于TLC板后于烘箱中110℃烘烤10min显色。各种糖即显出不同颜色，与标准糖比较，结果见图2，随着初始乳糖浓度的增加，GOS的得率呈先增加后减少的趋势，当初始乳糖浓度为300mg/mL时，GOS得率最高。
2、β-半乳糖苷酶粗酶液在不同温度下对乳糖催化反应的影响
(1)将实施例4所得的粗酶液以加酶量4.54U/mL加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液配制的300mg/mL乳糖溶液中进行催化反应。在不同的反应温度(40，45，50，55，60，65℃)下孵育12h，得到含有低聚半乳糖的酶反应液。
(2)得到含有低聚半乳糖的酶反应液的检测步骤同本实施例步骤1(2)，结果见图3，随着反应温度升高，GOS得率呈先升高后降低的趋势，在50℃的反应温度下，GOS的得率最高。
3、β-半乳糖苷酶粗酶液在不同反应时间下对乳糖催化反应的影响
(1)将实施例4所得的粗酶液以加酶量4.54U/mL加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液配制的300mg/mL乳糖溶液中，50℃条件下进行催化反应。在不同反应时间(2，4，6，8，12，16，20，24，28，32，40，48h)下孵育，得到含有低聚半乳糖的酶反应液。
(2)得到含有低聚半乳糖的酶反应液的检测步骤同本实施例步骤1(2)，结果见图4，在反应初始2h内，就有GOS的合成，随着反应时间的延长，GOS得率逐渐增加并在28h，GOS得率达到最高。
实施例6利用片球菌(Pediococcus sp.)Y1发酵生产的β-半乳糖苷酶合成GOS的得率和组成测定
使用三蒸水对反应28h的转糖苷反应产物稀释至糖终质量浓度1g/100mL，0.22μm滤膜过滤后上样分析。转移二糖的测定使用Aps-2HYPERSIL(4.6mm×250mm)色谱柱和RID-10A示差检测器进行分析，流动相为70％(v/v)乙腈/水溶液，流速和柱温分别设置为1mL/min和40℃，进样量10μL。采用糖分析柱Hi-PlexNa(300mm×7.7mm)色谱柱和RID-10A示差检测器分析不同GOS组分，流动相为三蒸水，流速和柱温分别设置为0.2mL/min和80℃，进样量20μL。结合Aps-2HYPERSIL与Hi-PlexNa色谱柱的分析结果，可确定以片球菌(Pediococcussp.)Y1所产β-半乳糖苷酶催化乳糖合成GOS的得率为38.4％(w/w)，GOS成分以转移二糖和转移三糖为主，分别为15.6％(w/w)和18.3％(w/w)，转移三糖以上的GOS质量分数为4.5％(w/w)。结果见图5，图5中，保留时间14.423min以及15.182min为溶剂峰。保留时间44.556min的峰为半乳糖，保留时间41.382min的峰为葡萄糖，34.745min为二糖(乳糖和转移二糖未分离)，29.536min为低聚半乳三糖，9.200～27.274min为三糖以上的低聚半乳糖成分。
综上实验可知，本发明所述片球菌(Pediococcus sp.)Y1菌株可发酵生产β-半乳糖苷酶，且制备的β-半乳糖苷酶粗酶液加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液配制的300mg/mL乳糖溶液中，可获得低聚半乳糖。且在进行转糖苷实验过程中，加酶量仅为3～5U/mL，相较于其他菌株来源的β-半乳糖苷酶其加酶量偏少，基于目前β-半乳糖苷酶因其价格昂贵、工业应用比较困难，本发明使用较少的加酶量使得它的工业应用价值更高。同时本发明制备低聚半乳糖中三糖的产率得到提升，相较于益生效果不明的二糖、三糖，经本发明所述片球菌(Pediococcus sp.)Y1菌株制备低聚半乳糖具有更加显著的益生效果，尤其是在以不同组成GOS为目的产品时，本发明所述片球菌(Pediococcus sp.)Y1菌株是富集三糖产品的最佳选择。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的片球菌菌株，其特征在于，所述片球菌菌株为片球菌Y1，所述片球菌Y1分类命名为Pediococcus sp.Y1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232025，保藏日期为2023年10月25日。
2.如权利要求1所述的片球菌Y1在制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶中的应用。
3.如权利要求1所述的片球菌Y1在制备低聚半乳糖中的应用。
4.利用权利要求1～3任意一项中所述的片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将片球菌Y1接种至种子培养基中活化培养，将活化的片球菌Y1接种至发酵培养基中发酵得发酵液，将发酵液离心收集湿菌体，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液，超声破碎，离心收集上清液，即为含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的粗酶液。
5.利用权利要求1～3任意一项中所述的片球菌Y1制备产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将片球菌Y1接种至种子培养基中活化培养，将活化的片球菌Y1接种至发酵培养基中发酵得发酵液，将发酵液离心收集湿菌体，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液，加入溶菌酶孵育，超声破碎，离心收集上清液，即为含产转糖苷活性β-半乳糖苷酶的粗酶液。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基和发酵培养基均为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO45 g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，吐温-80 1mL/L，MnSO40.25 g/L，pH(6.2～6.4)，121℃灭菌15min。
7.利用权利要求4～6任意一项所述的方法获得的粗酶液生产低聚半乳糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求4～6任意一项所述方法得到的β-半乳糖苷酶粗酶液添加至乳糖溶液中催化转糖苷反应，即得到含有低聚半乳糖的酶反应液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳糖溶液为pH7.0磷酸盐缓冲液配制质量浓度为75～525mg/mL的乳糖溶液。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应的条件包括：150μL乳糖溶液中加酶量3～5U/mL，反应温度为40～65℃，反应时间为2～48h。
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