CN117603349A - 一种用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域；该单克隆抗体通过以下方法制备而成：(1)TN完全抗原的制备；(2)动物免疫；(3)抗血清采集与效价测定；(4)细胞融合；(5)杂交瘤细胞亚克隆；(6)单克隆抗体亚型鉴定；(7)腹水制备与单克隆抗体纯化；本发明运用杂交瘤技术制备TN的单克隆抗体，筛选出亲和力和特异性最高的抗体应用于TN的免疫诊断研究中，建立一种高灵敏度、低成本、可用于临床使用的快速败血症免疫检测方法。

Description

一种用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
败血症(脓毒症)是指由微生物感染引起的全身性炎症反应综合征，其死亡率高于25-30％；如果出现休克，死亡率甚至高达40-50％。目前尚无有效的特异性抗脓毒症治疗方法，因此对败血症患者的治疗主要依赖于早期识别，以便迅速采取正确的治疗措施，包括使用适当的抗生素，必要时采取源头控制措施、或使用静脉输液和血管活性药物进行复苏。目前临床上主要根据体温变化和血常规结果辅助诊断，或晚期血培养检测病原体等方法进行诊断。然而，血培养检测病原微生物至少需要72h才能出诊断结果，甚至有时连续培养两次未果仍无法判断病因，这对于败血症这种急性炎症疾病的确诊非常不利并延误了疾病的治疗。最新的研究发现，败血症或感染性休克患者的血浆中四连接素TN(Tetranectin)与发病相关，其含量与正常人相比特异性地显著下降。因此如果能以此为败血症的免疫检测靶标可以实现临床上对败血症的快速诊断。
中国专利公开号为CN215866719U的专利公开了一种多指标快速检测新生儿败血症的荧光免疫层析试纸条，该实用新型专利涉及体外诊断技术领域,具体涉及多指标快速检测新生儿败血症的荧光免疫层析试纸条。该实用新型专利采用的生物靶标是PCT(降钙素原)、IL-6(一种促炎细胞因子)、IL-8(一种趋化因子)，对新生儿败血症的早期诊断提供了方法。荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相,测试液为流动相,荧光标记抗体或抗原固定于结合垫,通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。但该专利的关键问题是PCT、IL-6、IL-8都是体内广谱炎症因子水平的标志物，特异性不强，不能作为败血症病因的根本靶标，所以检测的准确度尚有待于评估。
发明内容
败血症的死亡原因主要是由于患者肺部组织分泌的TN蛋白可与其肝脏组织分泌的HMGB1(高迁移率族蛋白B1)结合成复合物，被巨噬细胞吞噬后可触发后者产生细胞焦亡，从而导致机体免疫抑制，无法清除病原微生物。同时，患者血浆中的TN浓度与败血症的进程密切相关。研究统计发现，由于蛋白TN和HMGB1之间的相互作用，败血症或败血症休克患者的血浆TN浓度降低了62-67％，与败血症的发生密切相关。本发明以此为生物靶标运用杂交瘤技术制备TN的单克隆抗体，筛选出亲和力特异性最高的抗体应用于TN的免疫诊断研究中，建立一种高灵敏度低成本的可用于临床使用的快速败血症免疫检测方法。
相关技术术语的名词解释：
TN:Tetranectin四连接素
P5-5：TN抗原肽
为实现本发明的目的，提供一下技术方案：
一种用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，具体如下：
(1)TN完全抗原的制备
将载体蛋白BSA或OVA溶解在偶联缓冲溶液中，同时将P5-5抗原肽(TN的关键抗原表位NDALYEYLRQ)溶解在偶联缓冲液中，在磁力搅拌下缓慢滴加EDC溶液并置于25℃磁力搅拌反应后透析去除未偶联的多肽和EDC试剂；
(2)动物免疫
用BCA蛋白测定试剂盒测定TN完全抗原的浓度后，取适量的抗原与弗氏佐剂混匀乳化完全后进行皮下注射6～7周龄的Balb/c雌性小鼠，进行多次免疫；
(3)抗血清采集与效价测定
从第四次免疫结束后，采用间接ELISA方法测定小鼠的抗血清效价；
(4)细胞融合
在细胞融合之前准备好骨髓瘤细胞SP2/0和饲养细胞，并在超净工作台中制备好步骤(3)中达到融合需求抗血清效价的小鼠脾细胞悬液，将准备好的脾细胞悬液与SP2/0细胞悬液混在一起，倒出上清液；用移液枪把剩余的细胞沉淀搅拌混匀，并晃动离心管，待细胞完全散开后，将离心管置于37℃水浴中，在1min之内按照先慢后快的顺序滴加缓慢加入已预热的PEG1450融合剂，一边滴加一边不断晃动离心管，滴加结束后静置；紧接着在1min内缓慢地加入1mL提前预热的1640不完全培养基，第2min加入3mL1640不完全培养基，第3min加入5mL1640不完全培养基，第4min加入10mL1640不完全培养基，直至终体积为50mL时终止细胞融合；随后将离心管放入细胞培养箱静置10min，室温离心，倒出上清液；往有细胞沉淀的离心管中加入事先配置的含有2％HAT的完全培养基，吹散混匀后把离心管置于细胞培养箱；然后把离心管取出来，融合后的细胞按照每孔100μL加入之前已经铺入饲养细胞的96孔板，最后放入细胞培养箱培养；
(5)杂交瘤细胞亚克隆
采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，取阳性孔的细胞吹散混匀，用移液枪吸取10μL加入到每孔含有300μL2％HAT单抗专用培养基的96孔培养板中，不断进行纵向和横向梯度稀释，直到最后一列和最后一行在显微镜下观察到每孔中只剩一个细胞为止；然后将细胞培养板转移至培养箱中培养，待单细胞集落孔长满培养板孔径的60％～80％时取出100μL杂交瘤细胞培养上清做ELISA检测，若OD450nm大于0.8则为阳性，取阳性孔只有单一集落的杂交瘤细胞继续吹散克隆化筛选；
(6)单克隆抗体亚型鉴定
TN抗原包被封闭洗板后，每孔加入杂交瘤细胞培养上清，37℃反应1h，洗净甩干，然后加入相应的抗体亚型试剂，37℃反应1h，洗净甩干，每孔加入TMB显色液37℃反应30min，最后加入2MH2SO4终止反应，用酶标仪检测OD450nm的吸光值；
(7)腹水制备与单克隆抗体纯化
选取10～11周龄的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射腹水专用佐剂致敏；致敏后两周，选取6孔细胞培养板中的生长状态良好的杂交瘤细胞进行细胞计数后注射到致敏的小鼠腹腔；10～12d后即可采用无菌针头扎入小鼠的下部腹腔收集腹水，腹水收集完毕后离心10min；离心后的腹水取中间相进行单克隆抗体层纯化。
进一步地，所述步骤(1)中，将两种溶液混合后载体蛋白与多肽的摩尔比为1:10。
进一步地，所述步骤(2)中，免疫时选择小鼠的腹部或者背部进行皮下多点注射，每次免疫的时间为15d，待5～6次免疫后即可开始测定抗血清的效价。
进一步地，所述步骤(3)中，采用尾尖静脉采血的方式采血后收集于EP管中离心后可得抗血清，抗血清效价的测定采用间接ELISA方法检测，具体方法如下：
①包被：用碳酸盐缓冲溶液稀释TN完全抗原加入96孔酶标板中，4℃过夜；
②封闭：将酶标孔内包被溶液全部去除，每孔加入含有5％脱脂牛奶的1×PBS溶液，37℃反应2h；
③洗板：将酶标孔内封闭溶液全部去除，每孔300μL1×PBS溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复洗3次，拍干后备用；
④加入抗血清：将抗血清用PBSM梯度稀释，把按照比例稀释后的抗血清加入封闭好的酶标孔内，37℃反应1h；
⑤洗涤：将酶标孔内反应溶液全部去除，然后每孔加入300μL1×PBST(PBS+0.05％Tween-20)溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复清洗3次，然后每孔继续加入300μL1×PBS溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复清洗3次，拍干待用；
⑥加入二抗：将标记辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠二抗用PBSM按照1:5000稀释；把稀释为工作浓度的二抗加入之前洗涤好的酶标孔内，37℃反应1h；
⑦洗涤同步骤⑤；
⑧显色：把ELISA显色液A和显色液B按照等比例混匀，然后加入拍干的酶标孔内，37℃反应15～30min；
⑨酶标仪读吸光值：向每孔加入100μL2MH2SO4终止反应，用酶标仪测量在450nm下的酶标孔的吸光值。
进一步地，所述步骤(7)中，单克隆抗体的纯化采用ProteinG Resin亲和层析进行纯化即可得到高纯度的单克隆抗体。
本发明另外一个目的是一种单克隆抗体，其采用上述方法制备。
本发明另外一个目的是公开了一种单克隆抗体的应用，所述的单克隆抗体能够应用于检测血浆中TN含量的检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备一种针对TN新靶点P5-5的高亲和力和特异性的单抗。
(2)以该单抗建立一种ELISA免疫检测方法，可用于血浆或血清样本检测，样本取材方便。
(3)该TN单抗后续可以研发胶体金，纳米花等免疫测流层析检测卡，该方法检测时间更短，操作方便，室温反应5～10min，无需仪器设备，肉眼即可得到观察结果。
附图说明
图1是完全抗原交联制备，载体蛋白BSA或OVA与TN抗原肽P5-5交联后对比图。
图2是以BSA-P5-5为免疫原免疫小鼠后用OVA-P5-5检测原检测小鼠图内抗血清效价。
图3是细胞融合后杂交瘤生长情况，杂交瘤生长情况×40。
图4是亚克隆杂交瘤细胞株抗体亚型鉴定与单抗纯化。
图5a是单克隆抗体特异性分析。
图5b是单克隆抗体亲和力分析。
图6是单克隆抗体对TN的竞争曲线以及P5-5抗原线性检测范围312ng/mL-4.8ng/mL，最低检测限2.4ng/mL。
具体实施方案
下面结合部分具体实施例对本发明进行详述，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，实施例中的制备方案仅为优选方案，但本发明并不局限于实施例。
(1)TN完全抗原的制备
将载体蛋白BSA或OVA溶解在偶联缓冲溶液(0.1M MES，pH4.7)，终浓度10mg/mL。同时将P5-5抗原肽(NDALYEYLRQ)溶解在偶联缓冲液中，将两种溶液混合后载体蛋白与多肽的摩尔比为1:10，在磁力搅拌下缓慢滴加EDC溶液并置于25℃磁力搅拌反应后透析去除未偶联的多肽和EDC试剂。
(2)动物免疫
根据BCA蛋白测定试剂盒测定TN完全抗原的浓度后，取适量的抗原与弗氏佐剂混匀后乳化完全后进行皮下注射6～7周龄的Balb/c雌性小鼠。免疫时选择小鼠的腹部或者背部进行皮下多点注射，每次免疫的时间为15d，待5～6次免疫后可以开始测定抗血清的效价。
(3)抗血清采集与效价测定
从第四次免疫结束后，开始测定小鼠的抗血清效价。采用尾尖静脉采血的方式采血后收集于EP管中离心后可得抗血清。抗血清效价的测定采用间接ELISA检测，具体方法如下：
①包被：用碳酸盐缓冲溶液稀释TN完全抗原加入96孔酶标板中，每孔加入100μL，4℃过夜。
②封闭：将酶标孔内包被溶液全部去除，每孔加入含有5％脱脂牛奶的1×PBS溶液(PBSM)，每孔加入300μL，37℃反应2h。
③洗板：将酶标孔内封闭溶液全部去除，每孔300μL 1×PBS溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复洗3次，拍干后备用。
④加入抗血清：将抗血清用PBSM梯度稀释，把按照比例稀释后的抗血清加入封闭好的酶标孔内，每孔100μL，37℃反应1h。
⑤洗涤：将酶标孔内反应溶液全部去除，然后每孔加入300μL 1×PBST(PBS+0.05％
Tween-20)溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复清洗3次，然后每孔继续加入300μ
L 1×PBS溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复清洗3次，拍干待用。
⑥加入二抗：将标记辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠二抗用PBSM按照1:5000稀释。把稀释为工作浓度的二抗加入之前洗涤好的酶标孔内，每孔加入100μL，37℃反应1h。
⑦洗涤同步骤⑤。
⑧显色：把ELISA显色液A和显色液B按照等比例混匀，然后加入拍干的酶标孔内，每孔加入100μL，37℃反应15～30min。
⑨酶标仪读吸光值：向每孔加入100μL 2M H2SO4终止反应，用酶标仪测量在450nm下的酶标孔的吸光值(即OD450值)。
(4)细胞融合
在细胞融合之前准备好骨髓瘤细胞SP2/0和饲养细胞，并在超净工作台中制备好免疫
小鼠脾细胞悬液。将准备好的脾细胞悬液与SP 2/0细胞悬液混在一起，于1000r/min离心7min，小心地把上清倒出来。用移液枪把剩余的细胞沉淀搅拌混匀，并用手指轻轻地晃动离心管。待细胞完全散开后，将离心管置于37℃水浴中，缓慢加入已预热的PEG1450。融合剂在1min之内按照先慢后快的顺序滴加，一边滴加一边用手不断晃动离心管，滴加结束后静置一会。紧接着在1min内缓慢地加入1mL提前预热的1640不完全培养基，第2min加入3mL 1640不完全培养基，第3min加入5mL 1640不完全培养基，第4min加入10mL 1640不完全培养基，直到加入1640不完全培养基至终体积为50mL以终止细胞融合。随后将离心管放入细胞培养箱静置10min，于1000r/min室温离心，小心将上清倒掉。往有细胞沉淀的离心管中加入事先配置的含有2％ HAT完全培养基，轻轻吹散混匀后把离心管置于细胞培养箱。然后把离心管取出来，融合后的细胞按照每孔100μL加入之前已经铺入饲养细胞的96孔板，最后放入细胞培养箱培养。
(5)杂交瘤细胞亚克隆
采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，取阳性孔的细胞继续吹散混匀，用移液枪继续吸取10μL加入到含有300μL 2％ HAT单抗专用培养基的96孔培养板中，不断进行纵向和横向梯度稀释，直到最后一列和最后一行在显微镜下观察到每孔中只剩一个细胞为止。然后将细胞培养板转移至培养箱中培养，待单集落孔长满培养板的60％～80％时取出100μL杂交瘤细胞培养上清做ELISA检测，若OD450 nm大于0.8则为阳性，取阳性孔只有单一集落的杂交瘤细胞继续吹散克隆化筛选。
(6)单克隆抗体亚型鉴定
采用博奥龙间接ELISA检测试剂盒测定抗体的亚型。TN抗原包被封闭洗板后每孔加入100μL杂交瘤细胞培养上清，37℃反应1h，洗净甩干，然后加入相应的抗体亚型试剂(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM)，37℃反应1h，洗净甩干，每孔加入100μL TMB显色液37℃反应30min，最后加入2MH2SO4终止反应，用酶标仪检测OD450nm的吸光值。
(7)腹水制备与单克隆抗体纯化
选取10～11周龄的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500μL腹水专用佐剂致敏。致敏后两周，选取6孔细胞培养板中的生长状态良好的杂交瘤细胞进行细胞计数后(约106个)注射到致敏的小鼠腹腔。大约10～12d，即可采用无菌针头扎入小鼠的下部腹腔收集腹水，腹水收集完毕后于3000r/min 4℃离心10min。离心后的腹水取中间相为单克隆抗体层是纯化。单克隆抗体的纯化采用Protein G Resin亲和层析进行纯化即可得到高纯度的单克隆抗体。
(8)抗体性质鉴定
对获得的抗TN的单克隆抗体的亲和力，特异性进行鉴定。抗体亲和力代表了抗体与抗原之间的结合能力，亲和力越高，抗体与相应的抗原之间结合强度越高。本研究采用间接ELISA法通过测试不同浓度抗原和抗体的反应值来计算该抗体的亲和力常数Kaff。计算出每一个抗原浓度在EC50对应的抗体浓度，按照下面公式可以计算出该抗体亲和力常数。
式中：[Ab]表示抗原浓度[Ag]时，在IC50处的抗体度；
[Ab]t表示抗原浓度[Ag]t时，在IC50处的抗体浓度；
n＝[Ag]/[Ag]t
特异性是抗原抗体反应的另一个重要特性，因为单克隆抗体的互补决定区只与对应抗原的表位相互紧密结合。本研究通过测试TN单克隆抗体是否只与TN发生反应而不与其他蛋白结合。
(9)TN单克隆抗体竞争曲线及模拟样品检测
根据前期ELISA实验确定最佳的TN包被浓度和单克隆抗体的使用浓度，建立TN间接竞争ELISA标准曲线，具体实验方法如下：用pH值为9.6的包被缓冲溶液稀释TN完全抗原至终浓度为5μg/mL包被，96孔板封闭洗涤后待用。用抗体稀释液倍比稀释TN标准品从40μg/mL开始稀释，紧接着20μg/mL 10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，625ng/mL，312.5ng/mL，156.25ng/mL，78.125ng/mL，39.0625ng/mL，19ng/mL，9.7ng/mL，4.85ng/mL，一直到2.425ng/mL。然后将稀释后的TN与1:8000倍稀释的TN单克隆抗体1:1等体积充分混匀后，于37℃恒温培养箱反应1h后，然后每孔取100μL加入96孔酶标孔内继续反应1h。与此同时做一个反应孔内没有加TN抗原，只有TN单克隆抗体的孔作为阳性孔；以及一个没有包被TN抗原的孔为阴性对照。其余步骤按照间接ELISA测定抗血清效价进行。以TN标准品的实际浓度取LOG对数值后作为图像的横坐标，B/B0值为纵坐标，在Origin 8.0软件中做出检测标准曲线，并根据标准曲线计算出TN的ELISA线性检测范围等。
(10)TN单克隆抗体对实际败血症病人血浆样品的检测
在医院抽取实际败血症患者的血液作为实际样品检测的对象，将全血放入抗凝管3000r/min离心10min后取上层透明血浆加热处理后与1:8000倍稀释的TN单克隆抗体1:1等体积充分混匀后，然后每孔取100μL加入96孔酶标孔内反应1h进行间接竞争ELISA测试，待反应结束再加入酶标二抗，反应时间2h。同时为了进一步缩短败血症检测时间，可将热处理的血浆样品直接与HRP酶标TN单克隆抗体进行反应(直接竞争ELISA)，反应时间只需1h。反应过程取正常人的血浆作为对照。实际血浆样品检测结果显示正常人的血浆中TN含量分别为11μg/mL和8.9μg/mL，败血症患者体内的TN含量与正常相比出现了明显的降低，这与文献报道一致，因此可用于败血症患者的诊断和愈后。
其中，图4出示了亚克隆杂交瘤细胞株抗体亚型鉴定与单抗纯化。该杂交瘤分泌的抗体亚型为IgG1，纯化的单抗结构H链和L链完整。图5出示了单克隆抗体特异性和亲和力分析(经测试抗体特异性强，亲和力高亲和力常数Kaff＝1.38×109L/mol)。
表1TN-P5-5模拟样品检测结果，待测样本中添加已知浓度抗原后经ELISA测试样品回收率和变异系数。
表2间接竞争ELISA试剂血浆样品检测结果
表3直接竞争ELISA试剂血浆样品检测结果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体如下：
(1)TN完全抗原的制备
将载体蛋白BSA或OVA溶解在偶联缓冲溶液中，同时将P5-5抗原肽溶解在偶联缓冲液中，在磁力搅拌下缓慢滴加EDC溶液并置于25℃磁力搅拌反应后透析去除未偶联的多肽和EDC试剂；
(2)动物免疫
用BCA蛋白测定试剂盒测定TN完全抗原的浓度后，取适量的抗原与弗氏佐剂混匀乳化完全后进行皮下注射6～7周龄的Balb/c雌性小鼠，进行多次免疫；
(3)抗血清采集与效价测定
从第四次免疫结束后，采用间接ELISA方法测定小鼠的抗血清效价；
(4)细胞融合
在细胞融合之前准备好骨髓瘤细胞SP2/0和饲养细胞，并在超净工作台中制备好步骤(3)中达到融合需求抗血清效价的小鼠脾细胞悬液，将准备好的脾细胞悬液与SP2/0细胞悬液混在一起，倒出上清液；用移液枪把剩余的细胞沉淀搅拌混匀，并晃动离心管，待细胞完全散开后，将离心管置于37℃水浴中，在1min之内按照先慢后快的顺序滴加缓慢加入已预热的PEG1450融合剂，一边滴加一边不断晃动离心管，滴加结束后静置；紧接着在1min内缓慢地加入1mL提前预热的1640不完全培养基，第2min加入3mL1640不完全培养基，第3min加入5mL1640不完全培养基，第4min加入10mL1640不完全培养基，直至终体积为50mL时终止细胞融合；随后将离心管放入细胞培养箱静置10min，室温离心，倒出上清液；往有细胞沉淀的离心管中加入事先配置的含有2％HAT的完全培养基，吹散混匀后把离心管置于细胞培养箱；然后把离心管取出来，融合后的细胞按照每孔100μL加入之前已经铺入饲养细胞的96孔板，最后放入细胞培养箱培养；
(5)杂交瘤细胞亚克隆
采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，取阳性孔的细胞吹散混匀，用移液枪吸取10μL加入到每孔含有300μL2％HAT单抗专用培养基的96孔培养板中，不断进行纵向和横向梯度稀释，直到最后一列和最后一行在显微镜下观察到每孔中只剩一个细胞为止；然后将细胞培养板转移至培养箱中培养，待单细胞集落孔长满培养板孔径的60％～80％时取出100μL杂交瘤细胞培养上清做ELISA检测，若OD450nm大于0.8则为阳性，取阳性孔只有单一集落的杂交瘤细胞继续吹散克隆化筛选；
(6)单克隆抗体亚型鉴定
TN抗原包被封闭洗板后，每孔加入杂交瘤细胞培养上清，37℃反应1h，洗净甩干，然后加入相应的抗体亚型试剂，37℃反应1h，洗净甩干，每孔加入TMB显色液37℃反应30min，最后加入2MH2SO4终止反应，用酶标仪检测OD450nm的吸光值；
(7)腹水制备与单克隆抗体纯化
选取10～11周龄的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射腹水专用佐剂致敏；致敏后两周，选取6孔细胞培养板中的生长状态良好的杂交瘤细胞进行细胞计数后注射到致敏的小鼠腹腔；10～12d后即可采用无菌针头扎入小鼠的下部腹腔收集腹水，腹水收集完毕后离心10min；离心后的腹水取中间相进行单克隆抗体层纯化。
2.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将两种溶液混合后载体蛋白与多肽的摩尔比为1:10。
3.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，免疫时选择小鼠的腹部或者背部进行皮下多点注射，每次免疫的时间为15d，待5～6次免疫后即可开始测定抗血清的效价。
4.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用尾尖静脉采血的方式采血后收集于EP管中离心后可得抗血清，抗血清效价的测定采用间接ELISA方法检测，具体方法如下：
①包被：用碳酸盐缓冲溶液稀释TN完全抗原加入96孔酶标板中，4℃过夜；
②封闭：将酶标孔内包被溶液全部去除，每孔加入含有5％脱脂牛奶的1×PBS溶液，37℃反应2h；
③洗板：将酶标孔内封闭溶液全部去除，每孔300μL1×PBS溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复洗3次，拍干后备用；
④加入抗血清：将抗血清用PBSM梯度稀释，把按照比例稀释后的抗血清加入封闭好的酶标孔内，37℃反应1h；
⑤洗涤：将酶标孔内反应溶液全部去除，然后每孔加入300μL1×PBST(PBS+0.05％Tween-20)溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复清洗3次，然后每孔继续加入300μL1×PBS溶液，每次清洗2～3min，去除干净，重复清洗3次，拍干待用；
⑥加入二抗：将标记辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠二抗用PBSM按照1:5000稀释；把稀释为工作浓度的二抗加入之前洗涤好的酶标孔内，37℃反应1h；
⑦洗涤同步骤⑤；
⑧显色：把ELISA显色液A和显色液B按照等比例混匀，然后加入拍干的酶标孔内，37℃反应15～30min；
⑨酶标仪读吸光值：向每孔加入100μL2MH2SO4终止反应，用酶标仪测量在450nm下的酶标孔的吸光值。
5.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，单克隆抗体的纯化采用ProteinG Resin亲和层析进行纯化即可得到高纯度的单克隆抗体。
6.一种单克隆抗体，其特征在于，其采用权利要求1-5中任一项所述方法制备。
7.一种单克隆抗体的应用，其特征在于，权利要求6所述的单克隆抗体能够应用于检测血浆中TN含量的检测。
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