CN117603330A

CN117603330A - 订书肽、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117603330A
Application number: CN202311453511.4A
Authority: CN
Inventors: 丁艳娇; 卢志远; 李玉磊; 薛晶文; 付银雪; 杨路平; 窦春慧; 程瑞雪
Original assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Current assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date: 2023-04-23
Filing date: 2023-04-23
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2043-04-23
Also published as: CN116655766A; CN117567589A; CN117486994A; CN117567589B; CN117486994B; CN117486993B; CN117567590B; CN117567590A; CN117603330B; CN117486993A; CN116655766B

Abstract

本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种订书肽、其制备方法和应用。本发明以Rink amide MBHA氨基树脂作为固相载体，根据模板多肽SLP‑0:Ac‑LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR‑NH₂氨基酸序列进行修饰改造,其中氨基酸残基19L和23V被S₅替换并环合，得到目标订书肽。本发明的订书肽可显著提高对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌的抑制活性，在临床耐药菌感染等相关疾病治疗中具有潜在的应用价值。

Description

订书肽、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种可以在模板多肽的基础上提高抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌抗菌活性的订书肽及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素滥用导致耐药菌株的出现，由耐药菌株引起的感染疾病已成为全球公共卫生的严重威胁。临床上的耐药菌株，如金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌等能在自身表面形成一层生物被膜，生物膜包裹的细菌对常规抗生素的耐受性是其他细菌的10～1000倍，致使临床上可用的抗生素在对抗耐药菌方面存在一定的局限性。近年来，抗菌药物开发进展缓慢，且部分上市抗生素药物在较短时间就出现了耐药菌性。估计到2050年全球因耐药菌导致的死亡人数可达到1000万，造成的经济损失可达1005万亿美元，细菌感染已经成为紧随缺血性心脏病之后的人类第二大致死因素。为此，迫切需要寻找新型的治疗药物来应对耐药菌造成的感染性疾病。

抗菌肽(AMP)是一类宿主防御肽，可通过多种途径杀伤细菌，如菌膜裂解、氧化损伤、抑制生物被膜形成等，不涉及特定蛋白的结合，不易产生耐药性，可对抗传统抗生素无效的细菌感染，因此AMP具有作为治疗耐药菌感染性疾病的新一代抗生素的潜力。但大部分AMP为线性多肽，在体内易被蛋白酶降解，结构不稳定，极大地限制其临床应用。前人通过对AMP进行化学改造，如骨架改变、D型和非天然氨基酸替换等，提高了多肽的结构稳定性并取得了一定的进展。但在过去的几十年中，AMP的结构稳定性仍是阻碍该类药物进入临床应用的重要因素，因此亟需寻找更有效地策略对AMP进行改造，从而更好地解决耐药菌感染的问题。

LL-37是主要的人类AMP之一，在防御局部和全身感染方面发挥重要作用。2018年，Nibbering组基于人类LL-37改造的抗菌肽SAAP-148(SLP-0)，含有24个残基，具有α螺旋结构，相比模型肽LL-37，其在体内外表现出较高的抵抗耐药菌的能力。但作为直链多肽易被酶解，结构不稳定，抗耐药菌活性有限，对金黄色葡萄杆菌、铜绿假单胞菌及大肠杆菌的抑制均需要较高浓度才能实现，阻碍其药物开发。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提高抗耐药菌活性及稳定性的订书肽。

本发明的另一的目的是，提供所述订书肽的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供所述订书肽的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种订书肽，所述订书肽选自下列中的一种：

a)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基1L和5W被S₅替换并环合；

b)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基4V和8V被S₅替换并环合；

c)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基5W和9F被S₅替换并环合；

d)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基7R和11L被S₅替换并环合；

e)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基8V和12L被S₅替换并环合；

f)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基9F和13K被S₅替换并环合；

g)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基11L和15Y被S₅替换并环合；

h)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基12L和16W被S₅替换并环合；

i)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基14R和18Q被S₅替换并环合；

j)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基15Y和19L被S₅替换并环合；

k)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基16W和20K被S₅替换并环合；

l)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基18Q和22P被S₅替换并环合；

m)以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基19L和23V被S₅替换并环合。

本发明中模板多肽及改造的订书肽的序列如下表：

表1本发明中模板多肽及改造的订书肽的序列

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

上述的订书肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)以Rink amide MBHA氨基树脂为载体，其载样量为0.30mmol/g，在活化剂活化的DIC/Oxyme缩合剂的作用下分别使C端首个氨基酸与固相载体偶联；

(2)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；

(3)使用缩合剂进行氨基酸的缩合；

(4)重复进行保护基的脱除-氨基酸缩合的操作，按照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以S₅来取代i和i+4位氨基酸；

(5)最后一个氨基酸使用脱Fmoc保护基后，然后进行乙酰化；

(6)在环合剂的作用下使i和i+4位S₅氨基酸发生烯烃复分解反应，合成订书肽；

(7)使用切割试剂将肽链从载体上切割下来，通过反相高效制备液相纯化得相应订书肽。

其中，作为本发明的另一优选例，步骤(7)中所述反相高效制备液相的色谱条件如下：色谱柱：UltimateXB-C18柱；流动相：流动相A为0.1％TFA/乙腈，流动相B为0.1％TFA/水；梯度洗脱程序：90％B洗脱0～3min，90％B～50％B洗脱40min；流速为8ml/min，进样体积为3ml，检测波长214nm和254nm。

作为本发明的另一优选例，步骤(1)中所述的缩合剂为DIC-Oxyme缩合体系，缩合体系的活化剂为DIC，以DMF为溶剂。

作为本发明的另一优选例，步骤(2)中所述脱保护试剂为哌啶和DMF的混合溶液，所述哌啶和DMF的体积比为1:4。

作为本发明的另一优选例，骤(5)中所述乙酰化步骤的乙酰化试剂为Ac₂O,DIEA,DMF的混合液，所述Ac₂O,DIEA,DMF的体积比为1:1:8。

作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合剂为GrubbsⅠ试剂的1,2-二氯乙烷的溶液，所述GrubbsⅠ试剂与1,2-二氯乙烷的用量比为60:7，单位为mg/ml。

作为本发明的另一优选例，步骤(7)中，所述切割试剂为TFA、H₂O、苯酚和TIPS的混合溶液，所述TFA、H₂O、苯酚和TIPS的体积比为88.75:0.5:0.5:0.25；所述切割试剂与所述载体用量比为1:20，单位为mL/mg。

作为本发明的另一优选例，步骤(1)中固相合成时，固相树脂的载样量为0.30mmol/g。

作为本发明的另一优选例，步骤(1)中偶联反应的温度为50～60℃，优选反应温度为60℃；偶联反应的时间为20-30min，优选反应时间为30min。

作为本发明的另一优选例，步骤(2)中，脱Fmoc保护是采用保护试剂反5min后，再次反应5min；脱除Fmoc基团的反应温度为20～40℃，更优选为37℃。

作为本发明的另一优选例，S₅后所接的第一个氨基酸反应时间为1h并按相同条件重复反应一次再进行下一步操作。

作为本发明的另一优选例，步骤(5)所述乙酰化是树脂在乙酰化试剂中反应15min，然后再次反应15min；反应温度为20～40℃，优选温度为37℃。

作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合剂为GrubbsⅠ试剂的1,2-二氯乙烷的溶液，投料比为固相树脂载样量:GrubbsⅠ:1,2-二氯乙烷＝0.35:60:7(mmol/mg/ml)。

作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合是树脂在环合试剂中于恒温振荡器中反应两次，每次2h；反应温度为20～40℃，优选温度为37℃。

作为本发明的另一优选例，步骤(7)中，切割的温度为20～40℃，更优选为37℃；切割的时间为3h。

上述的订书肽在制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌药物中的应用。

本发明中，涉及的缩略词解释如下：

Fmoc：芴甲氧羰基；DCM：二氯甲烷

DCE：1,2-二氯乙烷

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

Oxyme：Ethyl Cyanoglyoxylate-2-Oxime

DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺

S₅：2-amino-2-methylhept-6-enoic acid

TFA：三氟乙酸

TIPS：三异丙基硅烷

GrubbsⅠ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌

MS：质谱

HR-Q-TOF-MS：高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。

本发明优点在于：

1、本发明提供了系列新的订书肽，通过对SAAP-148(SLP-0)进行结构改造得到新的订书肽，使其具有更高的抗耐药菌活性，药理实验表明，本发明的订书肽可显著提高对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌的抑制活性，在临床耐药菌感染等相关疾病治疗中具有潜在的应用价值。

2、本发明以Rink amide MBHA氨基树脂作为固相载体，根据模板多肽SLP-0:Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂氨基酸序列进行修饰改造,在DIC-Oxyme的缩合体系中，通过Fmoc固相合成法，合成得到肽链，在保留关键氨基酸残基的基础上，在i,i+4氨基酸位置用S₅代替原有氨基酸，直链肽在固相上合成完毕后，GrubbsⅠ混合溶液加入到固相载体上，进行烯烃复分解反应环合，通过TFA混合溶液将目标订书肽切割下来，所得化合物通过反相高效液相进行纯化，采用HPLC及MS等光谱进行表征分析。该方法简便易行，所得订书肽纯度大于95％，产率高。

3、为提高多肽的稳定性和抗耐药菌活性，本专利通过对SLP-0进行订书化改造，在保留关键残基的基础上，以i,i+4方式进行设计，在肽链的非关键残基位置以S₅分别替代i和i+4位氨基酸，环合后得到结构稳定的订书肽。共合成了13条订书肽(SLP-1—SLP-13)，筛选得到的多肽提高了抗菌活性，能够对有害耐药细菌产生抑制性的正向调控。其中，SLP-9对金黄色葡萄杆菌的抑菌效果得到显著提升，SLP-12及SLP-13对铜绿假单胞菌和大肠杆菌两个菌种的抑制效果有明显的增强。

附图说明

为了更清楚说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例和对比例中所需要的附图说明简单介绍，应当理解，以下表示了本发明的实施例和对比例的结果对比和方法验证呈现。图1为本发明订书肽的合成路线图。

图2为SLP-0氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-0通过HPLC纯化(纯化条件：10％-55％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)。其中，A为SLP-0的氨基酸序列，B为SLP-0的HPLC图谱，分析柱：Welch C18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-0的质谱图。

图3为SLP-1氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-1通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-1，分离率为24.4％。其中，A为SLP-1的氨基酸序列，B为SLP-1的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-1的质谱图。

图4为SLP-2氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-2通过HPLC纯化(纯化条件：10％-55％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-2，分离率为14.7％。其中，A为SLP-2的氨基酸序列，B为SLP-2的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-2的质谱图。

图5为SLP-3氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-3通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-3，分离率为14.6％。其中，A为SLP-3的氨基酸序列，B为SLP-3的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-3的质谱图。

图6为SLP-4氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-4通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-4，分离率为19.6％。其中，A为SLP-4的氨基酸序列，B为SLP-4的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-4的质谱图。

图7为SLP-5氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-5通过HPLC纯化(纯化条件：10％-55％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)。得到SLP-5。其中，A为SLP-5的氨基酸序列，B为SLP-5的HPLC图谱，分析柱：Welch C18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-5的质谱图。

图8为SLP-6氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-6通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-6，分离率为15.6％。其中，A为SLP-6的氨基酸序列，B为SLP-6的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-6的质谱图。

图9为SLP-7氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-7通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，在Welch C18色谱柱上经过55分钟)，得到SLP-7，分离率为6.7％。其中，A为SLP-7的氨基酸序列，B为SLP-7的HPLC图谱，分析柱：Welch C18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-7的质谱图。

图10为SLP-8氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-8通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-8，分离率为19.8％。其中，A为SLP-8的氨基酸序列，B为SLP-8的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-8的质谱图。

图11为SLP-9氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-9通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-9，分离率为15.1％。其中，A为SLP-9的氨基酸序列，B为SLP-9的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-9的质谱图。

图12为SLP-10氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-10通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到SLP-10，分离率为9.3％。其中，A为SLP-10的氨基酸序列，B为SLP-10的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-10的质谱图。

图13为SLP-11氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-11通过HPLC纯化(纯化条件：10％-65％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)。其中，A为SLP-11的氨基酸序列，B为SLP-11的HPLC图谱，分析柱：Welch C18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-11的质谱图。

图14为SLP-12氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-12通过HPLC纯化(纯化条件：10％-65％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)。其中，A为SLP-12的氨基酸序列，B为SLP-12的HPLC图谱，分析柱：Welch C18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-12的质谱图。

图15为SLP-13氨基酸序列示意图及其表征图谱，SLP-13通过HPLC纯化(纯化条件：10％-60％CH₃CN(0.1％TFA)在H₂O(0.1％TFA)中，在Welch C18柱上经过55分钟)，得到肽13，分离率为2.4％。其中，A为SLP-13的氨基酸序列，B为SLP-13的HPLC图谱，分析柱：WelchC18，梯度：10％-90％ CH₃CN(0.1％ TFA)在H₂O(0.1％ TFA)中，25分钟(λ＝214nm)。C为SLP-13的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本申请作进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本申请，但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，即所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明一部分实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明范围，而是仅仅是本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明按照模板多肽SLP-0:Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQL KKPVR-NH₂氨基酸序列设计并合成13条订书肽。订书肽的结构和分子量如图1所示。

本发明实施例中涉及的实验材料来源如下：

Fmoc-氨基酸、Rink amide MBHA氨基树脂购自南开合成有限公司；NMP、DIC、Oxyme、TFA、乙腈(色谱纯)购自探索平台；DMF、无水乙醚、DCM、DCE、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂上海有限公司

实施例1基于SAAP-148(SLP-0)的订书肽的制备

1、订书肽的合成

如图2所示：

(1)化合物1的制备

取氨基树脂400mg(载样量为0.30mmol·g^-1)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡30min使树脂充分溶胀，抽干待用。

加7ml 20％哌啶-DMF溶液至树脂中，35℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc保护基团，依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂各3次。

(2)化合物2的制备

将序列中首个氨基酸(1mmol)、Oxyme(142mg,1mmol)和DIC(200μL)混溶于7ml DMF中，加入到树脂中60℃下振荡20min(S₅后的一个氨基酸反应1h，并重复反应1次)，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂3次。

(3)化合物3的制备

重复(1)、(2)步骤的做法，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸(1mmol)、Oxyme(142mg)和DIC(200μl)溶解于7ml DMF中，然后加入到树脂上，于60℃下振荡反应30min，重复脱除Fmoc保护→缩合→脱Fmoc保护的过程，直至所有氨基酸缩合完成。最后一个氨基酸脱Fmoc保护基团后，加入乙酸酐:DIEA:DMF(1:1:8)混合液7ml，并在37℃下震荡15min，抽干，再次加入乙酰化试剂，反应15min,依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂各3次后，通过油泵抽真空干燥树脂。

(4)化合物4的制备

待树脂完全干燥后，加入GrubbsⅠ(58mg)试剂的1,2-二氯乙烷溶液(7ml)，37℃下震荡反应两次，每次2h，反应完成后依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂各3次，油泵抽真空干燥树脂。

(5)目标化合物的制备

首先将树脂洗净抽干，加入TFA:苯酚:H₂O:TIPS＝88.75:0.5:0.5:0.25(V/V/V/V)20mL，37℃下振荡3h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，收集滤液。氩气鼓泡吹走多余TFA，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，重复上述步骤，冰乙醚沉淀洗涤离心三次，置于通风橱下自然挥干，得粗多肽样品。

2、订书肽样品的纯化

将粗多肽，用乙腈和水的混合溶剂溶解，通过反相制备RP-HPLC纯化，得到纯化后的订书肽纯品产物。分离条件如下：

仪器：岛津LC-20A反相高效液相色谱仪；

色谱柱：UltimateXB-C18，21.2×250mm,5μm；

流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的水溶液；

步骤与参数：90％B洗脱3min，90％B～50％B洗脱40min；流速为8ml/min，进样量为3ml，检测波长214nm和254nm。

实施例2产物的鉴别与结构分析

将实施例1的步骤2所得产物通过反相HPLC进行鉴别，并通过HR-Q-TOF-MS进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相A为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的水溶液，梯度洗脱(0～2min，流动相B：90％；3-25min，流动相B：90％～10％)；流速1.0mL·min^-1；检测波长214nm和254nm，进样体积为24μl。经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备订书肽纯度>95％，质谱分析结果如图3-15所示。经过解析，得到的订书肽结构见表1。

表1本发明中模板多肽及改造的订书肽的序列

实施例3本发明订书肽抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌实验

体外抗耐药菌试验：配制固体LB培养基，高压灭菌后铺板并配制LB液体培养基，4℃冰箱备用。将菌液涂布在固体LB培养基上，37℃培养箱中倒置培养过夜；取单克隆，加入3mL液体LB培养基中，37℃，220rpm，恒温摇床中培养6h，使细菌生长至对数期；取1mL菌液，4000rpm离心5min，弃上清，加入PBS，通过OD值调整细菌菌液浓度为2×106CFU/mL。将不同浓度的抗菌肽加入96孔板中，同时将菌液加入96孔板中，37℃培养8h，酶标仪采用595nm检测，重复三次，统计分析MIC值。

结果见表2。

表2本发明订书肽抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌实验结果

表2结果表明，本发明的订书肽可以提高模板多肽的抗耐药菌活性，其中SLP-12、SLP-13抗耐药菌效果最为突出。

以上实施例表明，本发明成功制备得到基于SAAP-148(SLP-0)的改造订书肽，通过体外抑菌实验，证明合成的订书肽可以显著抑制致病耐药细菌的生长及繁殖，具有发展成新型抗菌药物的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种订书肽，其特征在于，所述订书肽为：

以Ac-LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR-NH₂为肽链模板，其中氨基酸残基19L和23V被S₅替换并环合。

2.权利要求1所述的订书肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的Fmoc保护基；

(3)使用缩合剂进行氨基酸的缩合；

(5)最后一个氨基酸使用脱Fmoc保护基后，然后进行乙酰化；

3.根据权利要求2所述的订书肽的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述反相高效制备液相的色谱条件如下：色谱柱：UltimateXB-C18柱；流动相：流动相A为0.1％TFA/乙腈，流动相B为0.1％TFA/水；梯度洗脱程序：90％B洗脱0～3min，90％B～50％B洗脱40min；流速为8ml/min，进样体积为3ml，检测波长214nm和254nm。

4.根据权利要求2所述的订书肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的缩合剂为DIC-Oxyme缩合体系，缩合体系的活化剂为DIC，以DMF为溶剂。

5.根据权利要求2所述的订书肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述脱保护试剂为哌啶和DMF的混合溶液，所述哌啶和DMF的体积比为1:4。

6.根据权利要求2所述的订书肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述乙酰化步骤的乙酰化试剂为Ac₂O,DIEA,DMF的混合液，所述Ac₂O,DIEA,DMF的体积比为1:1:8。

7.根据权利要求2所述的订书肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述环合剂为GrubbsⅠ试剂的1,2-二氯乙烷的溶液，所述GrubbsⅠ试剂与1,2-二氯乙烷的用量比为60:7，单位为mg/ml。

8.根据权利要求2所述的订书肽的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述切割试剂为TFA、H₂O、苯酚和TIPS的混合溶液，所述TFA、H₂O、苯酚和TIPS的体积比为88.75:0.5:0.5:0.25；所述切割试剂与所述载体用量比为1:20，单位为mL/mg。

9.权利要求1所述的订书肽在制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌药物中的应用。