CN117599257A - 一种用于预防神经瘤的端帽及其制备方法 - Google Patents

一种用于预防神经瘤的端帽及其制备方法 Download PDF

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王秀梅
罗小斌
潘勇卫
赵勇刚
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Abstract

本发明提供了一种用于预防神经瘤的端帽，由纳米纤维成膜后压制而成；所述纳米纤维由聚己内酯和矿化胶原的混合溶液制备得到。本发明在制备端帽的原料中添加了矿化胶原，可以大幅度提高端帽的力学性能，同时可以提高细胞在端帽内表面的粘附性，更好的预防创伤性痛性神经瘤的产生。而且神经端帽通过加压工艺制备从而具备良好的机械力学性能，并且其制备工艺流程化，操作简单，有望实现量产化，具有良好的工业应用前景。

Description

一种用于预防神经瘤的端帽及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种用于预防神经瘤的端帽及其制备方法。
背景技术
由自然灾害、交通事故及医源性神经损伤等因素引起的周围神经损伤(Peripheral nerve injury，PNI)会导致严重的感觉障碍和运动功能受损。而创伤性痛性神经瘤(Traumatic painful neuroma，TPN)则是周围神经损伤后常见的一种并发症，它常发生于外伤性断指，车祸或糖尿病晚期等因素最终截肢的患者，被截肢后的神经不仅无法发挥支配远端的功能，还会带来长期又剧烈的疼痛。因为在残端肢体中，末端神经的自我生长还在继续。因缺乏有序的引导和胶原纤维的不断再生阻碍神经再生，末端神经最后生长成了创伤性痛性神经瘤，诱发残端肢体的痛觉异常(即触摸痛)，给患者的生活带来无尽的痛苦。
目前常见的防治方法为套管法，用于损伤神经的修复。现有的神经端帽有天然聚合物端帽，如壳聚糖、胶原蛋白等，发现其存在力学性能不佳，在体内容易塌陷的缺点，无法稳定地为受损神经提供再生所需的支撑屏障环境。还有人工合成聚合物，如聚乳酸、丙交酯等，但这些材料的细胞粘附方面的生物相容性较差，会出现令受损神经在套管内无法稳定取向性生长，继而导致神经组织结构出现紊乱，易诱发疼痛的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于预防神经瘤的端帽及其制备方法，有助于提高细胞在端帽内表面的粘附性，可以更好的预防神经瘤的产生。
本发明提供了一种用于预防神经瘤的端帽，由纳米纤维成膜后压制而成；
所述纳米纤维由聚己内酯和矿化胶原的混合溶液制备得到。
具体的，所述纳米纤维由聚己内酯和矿化胶原的混合溶液通过纺丝制备得到。
优选的，所述聚己内酯和矿化胶原的质量比为2：(0.56～1)。
本发明在制备端帽的原料中添加了矿化胶原，可以大幅度提高端帽的力学性能，同时可以提高细胞在端帽内表面的粘附性，更好的预防创伤性痛性神经瘤的产生。
优选的，所述矿化胶原中含有针状羟基磷灰石晶体。
所述针状羟基磷灰石晶体在混合溶液中的含量优选为12wt％～26wt％。
所述针状羟基磷灰石晶体的添加具有提高材质力学性能的作用。
本发明优选的，所述矿化胶原通过胶原蛋白、磷酸溶液、氢氧化钙进行沉淀反应制备得到。
本发明中，所述端帽可以为圆台状或圆柱状，且两端开口。
本发明中的圆台形状指用一个平行于圆锥底面的平面去截圆锥，底面与截面之间的部分。
上述两端开口指的是圆台的底面，以及与底面平行的一面均为开口设置。
上述两端开口的设置使神经端帽前后端都与外界连通，有利于末端神经血流及内分泌物质的流出，创造预防局部炎症产生的微环境。
优选的，所述圆台两个截面的直径比为0.5～1.5：2。
在本发明的一些具体实施例中，所述圆台两个截面的直径比例为0.5mm:2mm、1mm:2mm或1.5mm:2mm。
本发明通过改变端帽形状，采用前后两端不同直径比例，可以随着末端神经的生长引入不同的限制神经生长的机械力，形成定向取向结构，为末端神经组织的自我生长及愈合都提供了有利的微轨道，相较于中空圆柱结构能够更快、更稳定地限制末端神经的生长，从而抑制周围神经瘤的形成，更好的减轻患者的疼痛。
在本发明的一些具体实施例中，所述圆柱形的两个截面的直径比例为2mm:2mm或3mm:3mm。
优选的，所述端帽的厚度为0.5mm～1.0mm。所述厚度指圆台的管壁厚度。
优选的，所述端帽的长度为6～10mm。所述长度指端帽两个平面，即两个端口的垂直距离。
本发明提供了上述用于预防神经瘤的端帽的制备方法，包括以下步骤：
S1)将聚己内酯和矿化胶原的混合溶液纺丝成膜；
S2)将得到的膜材料叠加或对叠，压合得到厚膜；
S3)将得到的厚膜与圆台状或圆柱状模具贴合，形状固定后得到用于预防神经瘤的端帽。
所述聚己内酯和矿化胶原可以为一般市售。
本发明优选的，将胶原蛋白溶解于磷酸溶液中，并加入氢氧化钙、Tris-HCL缓冲溶液，沉淀得到矿化胶原。
冻干得到矿化胶原冻干粉末。
然后将聚己内酯溶液与矿化胶原冻干粉末混合得到聚己内酯和矿化胶原的混合溶液。
所述聚己内酯溶液的溶剂优选为六氟异丙醇。
对上述聚己内酯和矿化胶原的混合溶液进行纺丝得到膜材料。
所述纺丝优选为静电纺丝机纺丝成膜。
本发明对所述静电纺丝的方法并无特殊限定，可以为本领域常规的静电纺丝。
然后将得到的膜材料对叠，优选对叠1～3次，分别得到2层、4层、8层不同厚度的膜，压合后形成厚膜。
或者将得到的膜材料叠加，优选叠加至4～8层，得到厚膜。
所述压合优选为用压片机进行压合。
所述压合的压力优选为100N～200N，温度优选为25～60℃，时间优选为10～30分钟。
在本发明的一些具体实施例中，在0.1MPa、60℃条件下进行等压恒温压制10min。
最后将得到的厚膜与圆台状或圆柱状模具贴合，形状固定后得到用于预防神经瘤的端帽。
本发明中，上述厚膜与圆台状或圆柱状模具贴合后，根据厚度要求，可以缠绕1～3层。
本发明对上述形状固定的方法并无特点限定，在一些实施方案中，可以在缠绕后的厚膜边缘用少量粘合剂，包括但不限于六氟异丙醇，进行粘连以达到形状固定的效果。
本发明可根据周围神经直径的大小，选择合适直径大小的模具，进而制备尺寸合适的神经端帽。
本方法可以根据周围神经所在部位，选择合适管壁厚度的神经端帽。根据需要调整叠加不同层数的厚膜或者调整缠绕层数即可。
本发明对端帽的长度并无特殊限定，可以根据需求调节模具长度。在一些实施方案中，根据不同部位的周围神经损伤情况的需要，调整端帽的总长度为6mm-10mm。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于预防神经瘤的端帽，由纳米纤维成膜后压制而成；所述纳米纤维由聚己内酯和矿化胶原的混合溶液制备得到。
本发明提供的神经端帽通过加压工艺制备从而具备良好的机械力学性能，并且其制备工艺流程化，操作简单，有望实现量产化，具有良好的工业应用前景。更进一步的，本发明提供的神经端帽结构新颖，能够让神经随着周围生长环境的变窄，受到相对的机械应力的作用，从而更快更稳定地预防神经瘤的形成，且采用的材料都具备良好的生物相容性，能够显著预防神经瘤的形成，并且具有良好的抗压力学性能，对抗体内周围肌肉挤压，保护末端神经。
附图说明
图1为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜取向性结构扫描电镜图；
图2为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜内部结构的透射电镜图；
图3为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜的能谱分析图；
图4为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜的局部能谱分析图；
图5为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜的热重分析图；
图6为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜的红外光谱图；
图7为0.1MPa、60℃条件下物理压合后的聚己内酯复合矿化胶原纤维膜图片；
图8为电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜的杨氏模量测定图；
图9为电纺后的聚己内酯膜以及聚己内酯复合矿化胶原膜的细胞粘附电镜观察图；
图10为电纺后的聚己内酯膜以及聚己内酯复合矿化胶原膜的细胞粘附定量统计图；
图11为神经端帽实物图前端示意图；
图12为神经端帽实物图后端示意图；
图13为神经端帽俯视图；
图14为动物实验效果图；
图15为测痛分析图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于预防神经瘤的端帽及其制备方法进行详细描述。
实施例1
1.聚己内酯膜的制备方法：
一.聚己内酯的溶解方法
1、配制聚己内酯(山东岱钢)溶液：将聚己内酯溶解于六氟异丙醇(HFIP，99.5％)，浓度为10％(质量/体积)，搅拌器6小时以上。
二.神经端帽的制作方法(接上文)
2、用2个10mL注射器抽取1中的混合液共20mL，利用静电纺丝机纺丝成膜，厚度在220μm左右。
3、静电纺丝的膜取下来，对叠2次，即4层膜。
4、用压片机将3的4层膜在0.1MPa、60℃条件下进行等压恒温压制10min。得到厚度约0.33mm的厚膜。
5、将4的厚膜与长度恒定10mm、近端直径恒定2mm、远端不同直径(依次为0.5mm,1mm,1.5mm,2mm)的圆台状或圆柱状模具进行贴合，缠绕3层。边缘用少量六氟异丙醇进行粘连，得到厚度均一的神经端帽。
实施例2
1.聚己内酯复合矿化胶原膜的制备方法：
一、矿化胶原制备：
1、将胶原蛋白0.55g(来自牛尾皮的去端肽胶原，MW 300,000牛尾，河北考力森公司)以0.03％的浓度溶解在1600mL去离子水和6.4mL 85％纯度的磷酸液(H3PO4，分析纯，上海泰坦科技股份有限公司)混合溶液中，并锡纸包裹装有混合液的烧杯，以37摄氏度800rpm/分钟搅拌36小时以上，直至完全溶解。
2、将11.85g氢氧化钙(40mL磷酸液对应1mol钙离子)溶解于1600mL去离子水并搅拌1小时。
3、调节缓冲溶液：称取3.152g Tris-HCL(C4H11NO3·HCl，分析纯，北京百迪生物科技有限公司)加入100mL去离子水中，并于37℃加热搅拌台中搅拌，然后缓慢滴加少量氨水直到将pH调为8.5。
4、将1和2按照1:1的体积比(Ca/P按摩尔比＝1.67)缓慢滴入3中，搅拌16-20小时。
5、在4的基础上，静置一夜沉淀物析出，用50mL离心管加入少许蒸馏水将沉淀物以3000rpm/分钟的转速离心5分钟，洗涤1次。
6、在5的基础上，倒去上清液，加入新的去离子水摇匀，再以16000rpm/分钟离心10分钟，洗涤1次。
7、在6的基础上，将制备好的矿化胶原放在-80℃冰箱中冻存2小时。
8、在7的基础上，将冻存后的矿化胶原放在冻干机(德国Christ)内48小时，之后即可永久保存。
9、配制聚己内酯(山东岱钢)溶液：将聚己内酯溶解于六氟异丙醇(HFIP，99.5％)，浓度为10％(质量/体积)，搅拌器6小时以上。
10、将10％聚己内酯溶液与矿化胶原冻干粉末按照0.56g(或1g)矿化胶原:2g聚己内酯(即20mL 10％聚己内酯溶液)的比例混合，置于搅拌台上搅拌48小时。
11、用2个10mL注射器抽取10中的混合液共20mL，利用静电纺丝机纺丝成膜，厚度在220μm左右。
二.神经端帽的制作方法(接上文)
12、静电纺丝的膜取下来，对叠2次，即4层膜。
13、用压片机将12的4层膜在0.1MPa、60℃条件下进行等压恒温压制10min。得到厚度约0.33mm的厚膜。
14、将13的厚膜与长度恒定10mm、近端直径恒定2mm、远端不同直径(依次为0.5mm,1mm,1.5mm,2mm)的圆台状或圆柱状模具进行贴合，缠绕3层。边缘用少量六氟异丙醇进行粘连，得到厚度均一的神经端帽。
采用扫描电镜观察电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜取向性结构。结果如图1所示，图1中A为1500倍视野下的整体取向结构，B为5000倍视野下的局部放大后的取向结构，可以看出在1500倍视野下和5000倍视野下，纤维结构保留完好。
采用透射电镜观察与聚己内酯复合后的矿化胶原纤维的内部结构，结果如图2所示，图2中方框标注了矿化胶原单体。
采用扫描电镜对聚己内酯复合矿化胶原纤维进行能谱分析，结果如图3所示，结果表明Ca、C、N、O、P元素分布均匀。
采用扫描电镜对聚己内酯复合矿化胶原纤维局部进行能谱分析，测定C、N、O、P、Ca元素含量，结果如图4所示，结果显示C、N、O、P、Ca元素含量分别为：61.2％，8.9％，26.6％，1.2％，2.1％。
对制备的聚己内酯复合矿化胶原纤维进行热重分析，结果如图5所示，结果显示聚己内酯复合矿化胶原纤维质量随温度上升而下降，最终维持恒定的质量即矿化物质磷酸盐的质量，即26％。
采用红外光谱对制备的聚己内酯复合矿化胶原纤维进行表征，结果如图6所示，其中，A为聚己内酯复合矿化胶原纤维红外光谱图；B为矿化物质磷酸盐的代表性波数(603cm－1、632cm－1、963cm－1、1029cm－1、1099cm－1)；C为代表Ⅰ型胶原蛋白的特征谱线酰胺Ⅰ(1633cm－1、1643cm－1和1660cm－1)。
图7为0.1MPa、60℃条件下物理压合后的聚己内酯复合矿化胶原纤维膜的图片，其中A为侧面图，B为弯曲的侧面图，C为弯曲后的侧面图，D为正面图。
通过纳米压痕对物理压合后的聚己内酯复合矿化胶原纤维膜进行模量测定，结果如图8所示，图8中左图为纳米压痕曲线图，MC1、MC2、MC3、MC4、MC5分别表示物理压合后聚己内酯复合矿化胶原纤维膜的五个不同位置点的纳米压痕的载荷与深度轨迹，五条曲线基本重叠说明样本材质均一且有支撑刚度；右图为材料硬度和杨氏模量图。
采用扫描电镜观察聚己内酯复合矿化胶原纤维及聚己内酯两者之间的神经雪旺细胞的粘附性差异，结果如图9所示，图9中左图为1000倍扫描电镜下电纺后的聚己内酯膜的神经雪旺细胞粘附情况，右图为1000倍扫描电镜下电纺后的聚己内酯复合矿化胶原膜的神经雪旺细胞粘附情况。红色箭头指向粘附的神经雪旺细胞。明显可见，添加了矿化胶原后的聚己内酯可以显著提升对神经雪旺细胞的粘附性。
图10为1000倍扫描电镜下电纺后的聚己内酯膜和聚己内酯复合矿化胶原膜的神经雪旺细胞粘附数量统计结果。***表示P值小于0.001，两组之间具有显著差异。
图11为神经端帽实物图前端，内直径从左到右依次为(单位：毫米)：2，2，2，2，3。
图12为神经端帽实物图后端，内直径从左到右依次为(单位：毫米)：0.5，1，1.5，2，3。
图13为神经端帽俯视图，长度从左到右依次为(单位：毫米)：10，10，10，10，10。
动物实验
选择周龄为7周的雄性SD大鼠，利用异氟烷气体麻醉方式麻醉大鼠并维持，然后将其置于俯卧位。剃完两个下肢后，先后用聚维酮碘和75％酒精先后对动物皮肤进行消毒。在臀大肌和股二头肌之间解剖右侧坐骨神经。借助1cm长的塑料管段，在管段两端的坐骨神经进行了尖锐地横断处理，缺损可以避免自发神经再生。在实验组中，将长度为10mm、前后内径为2mm和1mm圆台状的聚己内酯复合矿化胶原的神经端帽放置在近端神经上。然后使用11-0单丝尼龙缝线将长度为4mm的神经残端固定到内径为2mm开口的神经端帽上。空白组不缝合神经端帽，其余操作同实验组。止血，用4-0尼龙缝合伤口，术后连续三天每天分别注射一次青霉素钾抗炎和美洛昔康镇痛。
实验结果如图14所示，其中左图为大鼠左后肢体坐骨神经离断，未予治疗四周后形成神经瘤的外观图；右图为给大鼠坐骨神经离断后应用2:1比例神经端帽治疗四周后效果图，可见本发明制备的神经端帽完全预防了神经瘤的形成，末端神经呈向内聚合自然终止状态。
用电子爪触觉测痛仪对大鼠足底进行测痛分析。结果如图15所示，大鼠体内动物实验发现，相较于内直径比为2mm:2mm的中空圆柱状的神经端帽，2mm:0.5mm、2mm:1mm、2mm:1.5mm这三种新型中空圆台状的神经端帽能够更显著地抑制神经的疼痛，值更接近健侧或完全健康的大鼠，如左图所示。右图为电子测痛仪外观(Ugo Basile 37550)。测量实验方法参照“Chaplan SR,Bach FW,Pogrel JW,Chung JM,Yaksh TL.Quantitative assessmentof tactile allodynia in the rat paw.J Neurosci Methods.1994Jul；53(1):55-63.”
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，由纳米纤维成膜后压制而成；
所述纳米纤维由聚己内酯和矿化胶原的混合溶液制备得到。
2.根据权利要求1所述的用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，所述聚己内酯和矿化胶原的质量比为2：(0.56～1)。
3.根据权利要求1所述的用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，所述矿化胶原中含有针状羟基磷灰石晶体。
4.根据权利要求1所述的用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，所述针状羟基磷灰石晶体在混合溶液中的含量为12wt％～26wt％。
5.根据权利要求1所述的用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，所述端帽为圆台状或圆柱状，且两端开口。
6.根据权利要求5所述的用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，所述圆台两个截面的直径比为0.5～1.5：2。
7.根据权利要求1所述的用于预防神经瘤的端帽，其特征在于，所述端帽的厚度为0.5mm～1.0mm，所述端帽的长度为6～10mm。
8.权利要求1～7任一项所述的用于预防神经瘤的端帽的制备方法，包括以下步骤：
S1)将聚己内酯和矿化胶原的混合溶液纺丝成膜；
S2)将得到的膜材料叠加或对叠，压合得到厚膜；
S3)将得到的厚膜与圆台状或圆柱状模具贴合，形状固定后得到用于预防神经瘤的端帽。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚己内酯和矿化胶原的混合溶液为聚己内酯溶液与矿化胶原冻干粉末混合得到。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述压合的压力为100N～200N，温度为25～60℃，时间为10～30分钟。
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