CN117599253A - 一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法，通过制备具有不同数量和羧基结构的氨基酸水凝胶单体，向氨基酸水凝胶单体中添加无定形磷酸钙后进行自由基聚合，制备出负载无定形磷酸钙的氨基酸水凝胶，即氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料；本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料具有优异的机械性能和良好的稳定无定形磷酸钙的能力，扩大了在骨缺损修复和再生领域的应用，具有制备方法简单，原料易得，成本低廉，适合工业化扩大生产的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法。
背景技术
骨组织不仅提供了身体的结构和支持，还在多种生理过程中发挥关键作用，包括运动及保护内脏器官等。然而，外伤、骨折、感染、肿瘤切除等多种病因均可导致骨缺损，继而导致功能障碍、疼痛、畸形等问题，严重影响患者的生存质量和社会适应能力。因此，促进缺损区域骨再生的临床需求巨大。
目前，自体骨移植因无排异反应等优势仍是骨缺损修复的“金标准”。临床上常用的骨移植包括髂骨、肋骨和腓骨等，特别是带血管蒂的骨段移植与缺损区周围血管吻合，为骨段的生长和愈合提供充足的营养。但是自体骨治疗来源及骨塑形受限，难以应用于大范围组织缺损的修复，第二术区的开创易引起感染等并发症限制了其临床应用。新兴的生物活性材料因具有可控的机械强度可以发挥支架作用，可与生长因子或治疗性药物结合应用，能够促进细胞粘附与增殖，诱导细胞外基质分泌，促进新骨形成等优势，已被认为是骨缺损再生很有前景的治疗方式。
临床上人工合成植骨材料种类繁多，包括磷酸钙陶瓷、生物玻璃、金属、聚合物等。但上述人工合成植骨材料仍存在生物活性较差、血管化程度低、与机体整合速度慢、成骨性能不足等问题，难以获得满意的临床疗效。归根究底是因为这些材料的仿生度较差，只仿生了骨组织形成过程中的终末产物—成熟骨组织的成分，无法引导缺损部位重构骨组织的微观和宏观结构。
解决该瓶颈背后的核心科学问题是如何通过植骨材料以“自下而上”的方式引导骨组织微观和宏观结构的再生。早期阶段的骨形成并非通过磷酸钙晶体的经典成核方式，而是依赖于矿化前体无定形磷酸钙(ACP)的参与。ACP首先沉积在骨胶原基质的特定区域，随后发生结晶转化，形成矿化的胶原纤维，这一过程是骨组织结构的架构基础，也是“自下而上”骨形成的关键“源头”。但是，ACP的非晶态特性导致其储存和应用中易转变为结晶态。骨基质中约有10-15％的非胶原蛋白，这些非胶原蛋白富含谷氨酸和天冬氨酸，后者含有大量羧基，可以通过螯合钙离子以浓度依赖的方式稳定ACP。唐睿康(Osteoporotic BoneRecovery by a Highly Bone-Inductive Calcium Phosphate Polymer-Induced Liquid-Precursor.Adv.Sci.2019,6(19):1900683；Intraosseous Injection of CalciumPhosphate Polymer-Induced Liquid Precursor Increases Bone Density andImproves Early Implant Osseointegration in OvariectomizedRats.Int.J.Nanomedicine.2021,16:6217-6229.)等研究者使用带负电荷的聚阴离子水凝胶，如聚丙烯酸(PAA)和聚天冬氨酸(PASP)，负载ACP纳米团簇，用于治疗骨缺损或骨质疏松等疾病。动物实验表明，与临床上所用的胶原蛋白仿生骨基质及聚阴离子水凝胶负载HA相比，聚阴离子水凝胶负载ACP后显示出更优异的成骨性能。但是，该类水凝胶机械性能较差，植入体内后容易发生形变，无法提供骨缺损修复所需的早期机械支撑。此外，其他研究者(Bioinspired Silk Fibroin Mineralization for Advanced In Vitro BoneRemodeling Models.Adv.Funct.Mater.2022,32,2206992.)还尝试了另一种应用方式，即采用丝纤维蛋白作为支架，额外添加聚阴离子(PASP)稳定无定形磷酸钙，但是高浓度的聚阴离子会对骨组织细胞产生潜在的生物毒性。目前尚缺乏生物安全性好，具有稳定递送ACP的支架材料。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法，通过制备具有不同数量和羧基结构的氨基酸水凝胶单体，向氨基酸水凝胶单体中添加无定形磷酸钙后进行自由基聚合，制备出负载无定形磷酸钙的氨基酸水凝胶；具有优异的机械性能和良好的稳定无定形磷酸钙的能力，有利于氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料在骨缺损的修复和再生领域的应用。
为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将丙烯酰氨基酸单体粉末溶于双蒸水中，得到1-3mol/L的丙烯酰氨基酸单体溶液；
步骤2：将步骤1得到的丙烯酰氨基酸单体溶液与可溶性钙盐溶液进行混合搅拌2-30min，然后逐滴加入磷酸盐溶液持续搅拌2-30min，得到混合溶液A；
步骤3：将步骤2得到的混合溶液A与交联剂进行混合搅拌，得到混合溶液B；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液B与光引发剂进行混合搅拌2-30min，然后在蓝光或紫外光照射下，引发聚合反应，得到氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料。
所述步骤1中的丙烯酰氨基酸单体粉末的制备过程如下：
步骤1.1：将氨基酸与丙烯酰氯混合进行反应，反应过程中反应溶液的pH值调至7.5-8.5；待反应结束后，将反应溶液的pH值调至10.5-11.5，得到碱性溶液；所述氨基酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:(1.0-1.5)；所述氨基酸为甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸；
步骤1.2：采用乙酸乙酯对步骤1.1得到的碱性溶液进行洗涤，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至1.5-2.5，得到酸性溶液；所述乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：(2-4)；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，旋蒸，得到浓缩液；所述乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：(2-4)；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，离心，干燥，得到丙烯酰氨基酸单体粉末；所述正己烷与浓缩液的体积比为1：(5-8)；所述丙烯酰氨基酸单体包括丙烯酰甘氨酸、丙烯酰天冬氨酸或丙烯酰谷氨酸。
所述步骤1.1中的氨基酸还可以为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
所述步骤1.1中的室温反应时间为3-4h；所述步骤1.3中的旋蒸温度为20℃-30℃；所述步骤1.4中的离心转速为3000-10000rpm，离心时间为2-5min，干燥时间为3-8h，压力为0～-0.1MPa。
所述步骤2中丙烯酰氨基酸单体溶液，可溶性钙盐溶液以及磷酸盐溶液的体积比为(20-50)：(5-15)：(2-9)；所述可溶性钙盐溶液的浓度为10-30mmol/L，磷酸盐溶液的浓度为4-18mmol/L。
所述步骤2中可溶性钙盐溶液为CaCl2，CaCl2·2H2O，Ca(NO3)2或Ca(NO3)2·4H2O；磷酸盐溶液为Na2HPO4，K2HPO4或(NH4)2HPO4。
所述步骤3中的混合溶液A与交联剂的体积比为(100-400)：1；所述搅拌时间为2-30min；所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，所述PEGDA的平均分子量为250-10000，所述交联剂质量浓度为0.05％-0.2％。
所述步骤4中的混合溶液B与光引发剂的体积比为(15-40)：1；光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)，2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(1173)或苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)，光引发剂的质量浓度为2％-6％，所述交联反应时间为5-30s。
本发明还公开了一种氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料，采用一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法制备得到。
所述氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料为丙烯酰甘氨酸/无定形磷酸钙复合材料，丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料或丙烯酰谷氨酸/无定形磷酸钙复合材料。
相比现有技术，本发明具有以下优点：
1.本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的储能模量均大于耗损模量，表明该复合材料的体相更偏向于弹性固体，频率震荡测试并未破坏体相结构，同时在85％的应变下，氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的压缩强度至少有400kPa，具有优异的力学性能；且氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料内磷酸钙的结晶度低于80％，表明该复合材料作为骨修复材料能够向骨缺损区域稳定递送无定形磷酸钙，实现骨组织再生。
2.与现有技术中的高浓度的聚阴离子相比，本发明制备的氨基酸水凝胶单体细胞毒性小，具有优异的生物相容性，利于体内骨形成。
3.与现有文献中制备的BNP@CS-GEL(其中，CS-GEL为甲基丙烯酸化硫酸软骨素和明胶，BNP为黄芩苷)的成骨速率相比，经本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理后的新骨形成速度每天可达3-4μm，成骨速率显著提高了。
4.本发明通过采用具有不同数量和羧基结构的氨基酸水凝胶单体与无定形磷酸钙进行自由基聚合，制备出负载无定形磷酸钙的氨基酸水凝胶，制备方法简单，原料易得，成本低廉，适合工业化扩大生产。
综上所述，本发明制备的实现了氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料具有优异的力学性能和稳定递送无定形磷酸钙的能力，既能够在骨缺损区域中作为支架材料，又能够通过合成的无定形磷酸钙(ACP)促进体内骨形成；且具有优异的生物相容性，满足临床上对用于骨缺损再生修复材料的性能要求，在修复不规则骨缺损、促进骨缺损再生中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的储能模量和损耗模量随震荡频率的变化曲线。
图2是本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的结晶度随时间的变化曲线。
图3是本发明制备的丙烯酰甘氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图。
图4是本发明制备的丙烯酰天冬氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图。
图5是本发明制备的丙烯酰谷氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图。
图6是本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达量。
图7是本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理大鼠颅骨缺损的新骨成骨速率。
图8是现有文献中制备的BNP@CS-GEL材料处理大鼠颅骨缺损的新骨成骨速率。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备丙烯酰氨基酸单体粉末
步骤1.1：将氨基酸与丙烯酰氯混合进行反应，所述氨基酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:(1-1.5)，优选为1:1.1；室温反应3-4h，优选3.75h；反应过程中溶液的pH值调至7.5-8.5，pH值优选为8；然后反应结束后，将反应溶液的pH值调至10.5-11.5，pH值优选11，得到碱性溶液；所述氨基酸为甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸；
步骤1.2：采用乙酸乙酯对步骤1.1得到的碱性溶液进行洗涤，乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：(2-4)，优选1：3，得到洗涤后的碱性溶液，乙酸乙酯在碱性溶液中能够去除未完全反应的丙烯酰氯；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至1.5-2.5，pH值优选为2，得到酸性溶液；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：(2-4)，优选1：3；采用旋蒸仪对萃取后的酸性溶液进行旋蒸，所述旋蒸温度为20℃-30℃，优选25℃，得到浓缩液；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，正己烷浓缩液的体积比为1：(5-8)，优选1：6；采用涡旋仪对沉降后的浓缩液进行涡旋振荡，混合均匀，离心，得到沉淀物；所述离心转速为3000-10000rpm，优选5000rpm，离心时间为2-5min，优选3.5min；将沉淀物在真空干燥箱中进行干燥，干燥时间为3-8h，优选4h，压力为0～-0.1MPa，优选-0.1MPa，得到丙烯酰氨基酸单体粉末，所述真空干燥箱的型号为泰斯特/DZ53T；所述丙烯酰氨基酸单体包括丙烯酰甘氨酸、丙烯酰天冬氨酸或丙烯酰谷氨酸；
步骤2：将步骤1中的丙烯酰氨基酸单体粉末溶于双蒸水中，采用涡旋仪进行涡旋振荡，混合均匀，得到丙烯酰氨基酸单体溶液，所述丙烯酰氨基酸单体溶液的浓度为1-3mol/L；
步骤3：将步骤2得到的丙烯酰氨基酸单体溶液与10-30mmol/L的可溶性钙盐溶液置于磁力搅拌器上进行搅拌，所述搅拌时间为2-30min，优选10min；然后逐滴加入4-18mmol/L的磷酸盐溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，持续搅拌2-30min，优选10min，所述丙烯酰氨基酸单体溶液，可溶性钙盐溶液以及磷酸盐溶液的体积比为(20-50)：(5-15)：(2-9)，优选20：5：3，得到混合溶液A；所述可溶性钙盐溶液为CaCl2，CaCl2·2H2O，Ca(NO3)2或Ca(NO3)2·4H2O；所述磷酸盐溶液为Na2HPO4，K2HPO4或(NH4)2HPO4；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液A与交联剂置于磁力搅拌器上进行混合搅拌；所述混合溶液A与交联剂的体积比为(100-400)：1，优选200：1，所述搅拌时间为2-30min，优选10min，得到混合溶液B；所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，所述PEGDA的平均分子量为250-10000，优选1000,所述交联剂的质量浓度为0.05％-0.2％，优选0.1％；
步骤5：向步骤4得到的混合溶液B中加入光引发剂进行混合搅拌2-30min，然后在蓝光或紫外光光照射下，引发聚合反应；光引发剂的质量浓度为2％-6％，优选5％，所述混合溶液B与光引发剂的体积比为(15-40)：1，优选20：1，所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)，2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(1173)或苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)，所述交联反应时间为5-30s，优选10s，得到氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料；所述氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料为丙烯酰甘氨酸/无定形磷酸钙复合材料，丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料或丙烯酰谷氨酸/无定形磷酸钙复合材料。
实施例1
一种用于骨缺损再生的丙烯酰甘氨酸/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备丙烯酰甘氨酸单体粉末
步骤1.1：将甘氨酸与丙烯酰氯混合进行反应，所述甘氨酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:1，室温反应3h，反应过程的溶液pH值调至7.5，反应结束后，将反应溶液的PH值调至10.5，得到碱性溶液；
步骤1.2：采用乙酸乙酯洗涤步骤1.1得到的碱性溶液，乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：2，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至1.5，得到酸性溶液；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：2；采用旋蒸仪对萃取后的酸性溶液进行旋蒸，所述旋蒸温度为20℃，得到浓缩液；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，正己烷浓缩液的体积比为1：5；采用涡旋仪对沉降后的浓缩液进行涡旋振荡，混合均匀，离心，得到沉淀物；所述离心转速为3000rpm，离心时间为2min；将沉淀物在真空干燥箱中进行干燥，干燥时间为3h，压力为-0.05MPa，得到丙烯酰甘氨酸单体粉末；
步骤2：将步骤1中的丙烯酰甘氨酸单体粉末溶于双蒸水中，采用涡旋仪进行涡旋振荡，混合均匀，得到丙烯酰甘氨酸单体溶液，所述丙烯酰甘氨酸单体溶液的浓度为1mol/L；
步骤3：将步骤2得到的丙烯酰甘氨酸单体溶液与10mmol/L的CaCl2溶液置于磁力搅拌器上进行搅拌，所述搅拌时间为2min；然后逐滴加入4mmol/L的Na2HPO4溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，持续搅拌2min，所述丙烯酰甘氨酸单体溶液，CaCl2溶液以及Na2HPO4溶液的体积比为50：5：2，得到混合溶液A；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)置于磁力搅拌器上进行混合搅拌；所述混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的体积比为400：1，所述搅拌时间为2min，得到混合溶液B；所述聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的平均分子量为250,聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的质量浓度为0.05％；
步骤5：向步骤4得到的混合溶液B中加入光引发剂LAP进行混合搅拌2min，然后在蓝光光照射下，引发聚合反应；光引发剂LAP的质量浓度为2％，所述混合溶液B与光引发剂LAP的体积比为40：1，所述交联反应时间为5s，得到丙烯酰甘氨酸/无定形磷酸钙复合材料，命名为PACG-ACP。
实施例2
一种用于骨缺损再生的丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备丙烯酰天冬氨酸单体粉末
步骤1.1：将天冬氨酸与丙烯酰氯混合进行反应，所述天冬氨酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:1.1，室温反应3.75h，反应过程的溶液pH值调至8，反应结束后，将反应溶液的PH值调至11，得到碱性溶液；
步骤1.2：采用乙酸乙酯洗涤步骤1.1得到的碱性溶液，乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：3，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至2，得到酸性溶液；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：3；采用旋蒸仪对萃取后的酸性溶液进行旋蒸，所述旋蒸温度为25℃，得到浓缩液；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，正己烷浓缩液的体积比为1：6；采用涡旋仪对沉降后的浓缩液进行涡旋振荡，混合均匀，离心，得到沉淀物；所述离心转速为5000rpm，离心时间为3.5min；将沉淀物在真空干燥箱中进行干燥，干燥时间为4h，压力为-0.1MPa，得到丙烯酰天冬氨酸单体粉末；
步骤2：将步骤1中的丙烯酰天冬氨酸单体粉末溶于双蒸水中，采用涡旋仪进行涡旋振荡，混合均匀，得到丙烯酰天冬氨酸单体溶液，所述丙烯酰天冬氨酸单体溶液的浓度为2.5mol/L；
步骤3：将步骤2得到的丙烯酰天冬氨酸单体溶液与20mmol/L的CaCl2溶液置于磁力搅拌器上进行搅拌，所述搅拌时间为10min；然后逐滴加入12mmol/L的Na2HPO4溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，持续搅拌10min，所述丙烯酰天冬氨酸单体溶液，CaCl2溶液以及Na2HPO4溶液的体积比为20：5：3，得到混合溶液A；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)置于磁力搅拌器上进行混合搅拌；所述混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的体积比为200：1，所述搅拌时间为10min，得到混合溶液B；所述聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的平均分子量为1000，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的质量浓度为0.1％；
步骤5：向步骤4得到的混合溶液B中加入光引发剂LAP进行混合搅拌10min，然后在蓝光光照射下，引发聚合反应；光引发剂LAP的质量浓度为5％，所述混合溶液B与光引发剂LAP的体积比为20：1，所述交联反应时间为10s，得到丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料，命名为PAASP-ACP。
实施例3
一种用于骨缺损再生的丙烯酰谷氨酸/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备丙烯酰谷氨酸单体粉末
步骤1.1：将谷氨酸与丙烯酰氯混合进行反应，所述谷氨酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:1.5，室温反应4h，反应过程的溶液pH值调至8.5，反应结束后，将反应溶液的PH值调至11.5，得到碱性溶液；
步骤1.2：采用乙酸乙酯洗涤步骤1.1得到的碱性溶液，乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：4，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至2.5，得到酸性溶液；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：4；采用旋蒸仪对萃取后的酸性溶液进行旋蒸，所述旋蒸温度为30℃，得到浓缩液；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，正己烷浓缩液的体积比为1：8；采用涡旋仪对沉降后的浓缩液进行涡旋振荡，混合均匀，离心，得到沉淀物；所述离心转速为10000rpm，离心时间为5min；将沉淀物在真空干燥箱中进行干燥，干燥时间为8h，压力为-0.1MPa，得到丙烯酰谷氨酸单体粉末；
步骤2：将步骤1中的丙烯酰谷氨酸单体粉末溶于双蒸水中，采用涡旋仪进行涡旋振荡，混合均匀，得到丙烯酰谷氨酸单体溶液，所述丙烯酰谷氨酸单体溶液的浓度为3mol/L；
步骤3：将步骤2得到的丙烯酰天冬氨酸单体溶液与25mmol/L的CaCl2·2H2O溶液置于磁力搅拌器上进行搅拌，所述搅拌时间为15min；然后逐滴加入15mmol/L的K2HPO4溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，持续搅拌15min，所述丙烯酰谷氨酸单体溶液，CaCl2·2H2O溶液以及K2HPO4溶液的体积比为50：15：9，得到混合溶液A；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)置于磁力搅拌器上进行混合搅拌；所述混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的体积比为100：1，所述搅拌时间为30min，得到混合溶液B；所述聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的平均分子量为10000,聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的浓度为质量0.2％；
步骤5：向步骤4得到的混合溶液B中加入光引发剂2959进行混合搅拌15min，然后在蓝光光照射下，引发聚合反应；光引发剂LAP的质量浓度为6％，所述混合溶液B与光引发剂2959的体积比为15：1，所述交联反应时间为30s，得到丙烯酰谷氨酸/无定形磷酸钙复合材料，命名为PAGLU-ACP。
实施例4
一种用于骨缺损再生的丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备丙烯酰天冬氨酸单体粉末
步骤1.1：将天冬氨酸与丙烯酰氯混合进行反应，所述天冬氨酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:1.3，室温反应3.5h，反应过程的溶液pH值调至8.2，反应结束后，将反应溶液的PH值调至11.3，得到碱性溶液；
步骤1.2：采用乙酸乙酯洗涤步骤1.1得到的碱性溶液，乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：3.5，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至2.3，得到酸性溶液；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：3.5；采用旋蒸仪对萃取后的酸性溶液进行旋蒸，所述旋蒸温度为28℃，得到浓缩液；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，正己烷浓缩液的体积比为1：7；采用涡旋仪对沉降后的浓缩液进行涡旋振荡，混合均匀，离心，得到沉淀物；所述离心转速为8000rpm，离心时间为4min；将沉淀物在真空干燥箱中进行干燥，干燥时间为6h，压力为-0.1MPa，得到丙烯酰天冬氨酸单体粉末；
步骤2：将步骤1中的丙烯酰天冬氨酸单体粉末溶于双蒸水中，采用涡旋仪进行涡旋振荡，混合均匀，得到丙烯酰天冬氨酸单体溶液，所述丙烯酰天冬氨酸单体溶液的浓度为2.8mol/L；
步骤3：将步骤2得到的丙烯酰天冬氨酸单体溶液与30mmol/L的Ca(NO3)2溶液置于磁力搅拌器上进行搅拌，所述搅拌时间为15min；然后逐滴加入18mmol/L的K2HPO4溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，持续搅拌15min，所述丙烯酰天冬氨酸单体溶液，Ca(NO3)2溶液以及K2HPO4溶液的体积比为50：15：9，得到混合溶液A；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)置于磁力搅拌器上进行混合搅拌；所述混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的体积比为300：1，所述搅拌时间为15min，得到混合溶液B；所述聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的平均分子量为1000，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的质量浓度为0.15％；
步骤5：向步骤4得到的混合溶液B中加入光引发剂1173进行混合搅拌15min，然后在紫外光光照射下，引发聚合反应；光引发剂LAP的质量浓度为5％，所述混合溶液B与光引发剂1173的体积比为30：1，所述交联反应时间为20s，得到丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料。
实施例5
一种用于骨缺损再生的丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备丙烯酰天冬氨酸单体粉末
步骤1.1：将天冬氨酸与丙烯酰氯混合进行反应，所述天冬氨酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:1，室温反应3.5h，反应过程的溶液pH值调至7.8，反应结束后，将反应溶液的PH值调至10.8，得到碱性溶液；
步骤1.2：采用乙酸乙酯洗涤步骤1.1得到的碱性溶液，乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：2.5，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至1.8，得到酸性溶液；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：2.5；采用旋蒸仪对萃取后的酸性溶液进行旋蒸，所述旋蒸温度为22℃，得到浓缩液；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，正己烷浓缩液的体积比为1：5；采用涡旋仪对沉降后的浓缩液进行涡旋振荡，混合均匀，离心，得到沉淀物；所述离心转速为4000rpm，离心时间为3min；将沉淀物在真空干燥箱中进行干燥，干燥时间为3h，压力为-0.1MPa，得到丙烯酰天冬氨酸单体粉末；
步骤2：将步骤1中的丙烯酰天冬氨酸单体粉末溶于双蒸水中，采用涡旋仪进行涡旋振荡，混合均匀，得到丙烯酰天冬氨酸单体溶液，所述丙烯酰天冬氨酸单体溶液的浓度为2mol/L；
步骤3：将步骤2得到的丙烯酰天冬氨酸单体溶液与20mmol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液置于磁力搅拌器上进行搅拌，所述搅拌时间为5min；然后逐滴加入12mmol/L的(NH4)2HPO4溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，持续搅拌5min，所述丙烯酰天冬氨酸单体溶液，Ca(NO3)2·4H2O溶液以及(NH4)2HPO4溶液的体积比为25：5：3，得到混合溶液A；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)置于磁力搅拌器上进行混合搅拌；所述混合溶液A与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的体积比为150：1，所述搅拌时间为5min，得到混合溶液B；所述聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的平均分子量为1000，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的质量浓度为0.08％；
步骤5：向步骤4得到的混合溶液B中加入光引发剂LAP进行混合搅拌5min，然后在紫外光光照射下，引发聚合反应；光引发剂LAP的质量浓度为3％，所述混合溶液B与光引发剂LAP的体积比为18：1，所述交联反应时间为8s，得到丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料。
图1为丙烯酰甘氨酸水凝胶/无定形磷酸钙(PACG-ACP),丙烯酰天冬氨酸水凝胶/无定形磷酸钙(PAASP-ACP)以及丙烯酰谷氨酸水凝胶/无定形磷酸钙(PAGLU-ACP)的储能模量和耗损模量随震荡频率的变化曲线，由图1可知，各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的储能模量G'均大于耗损模量G”，表明各组复合材料的体相更偏向于弹性固体，频率震荡测试并未破坏体相结构。
在85％的应变下，本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的压缩强度如表1所示，表明本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料具有优异的力学性能。
表1为氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的压缩强度
模拟体内环境，将所述复合材料置于模拟体液(SBF)中，氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料与模拟体液的体积比为1：40；于恒温箱中放置0-14天，所述恒温箱的温度为37℃；在第3、7、14天取出氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料，清洗后冷冻干燥，采用X-射线衍射(XRD)仪检测复合材料中磷酸钙的晶型。如图2所示，在第3天时，各组氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料内磷酸钙的结晶度小于40％，而在第14天，各组氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料内磷酸钙的结晶度仍低于80％，表明本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料具有良好的促成骨活性。
将各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料灭菌后与MC3T3-E1细胞共培养7天，采用活/死染色方法检测各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的细胞相容性，采用RT-PCR检测各组细胞成骨相关基因量，细胞成骨相关基因表达包括RUNX2、OPN、OSX和ALP的表达，以检测各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的体外促成骨能力。图3为丙烯酰甘氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图，图4为丙烯酰天冬氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图，图5为丙烯酰谷氨酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图，图3，图4，图5中绿色荧光和红色荧光分别代表活细胞和死细胞，由图3，图4，图5可知，在各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理MC3T3-E1细胞的荧光显微镜图中几乎没有红色荧光，MC3T3-E1细胞呈现正常形态，表明各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料均具有良好的生物相容性。
为进一步验证本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的体外促成骨能力，设置对照组(CON)，该对照组仅采用培养基培养MC3T3-E1细胞；如图6所示，培养7天后，各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理的MC3T3-E1细胞中，RUNX2、OPN、OSX和ALP基因表达水平较对照组(CON)显著升高，表明各组氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料具有良好的体外促成骨能力。
采用大鼠颅骨缺损模型进一步验证本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的体内早期成骨能力。在氨基酸水凝胶植入骨缺损区域后的2周和4周，用茜素红/四环素进行连续荧光标记，以评估新骨的形成。如图7所示，经本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理后的新骨形成速度每天可达3-4μm，明显高于现有文献中BNP@CS-GEL材料处理后的新骨形成速度(图8)(Baicalin Nanocomplexes with an In Situ-Forming Biomimetic Gel Implant for Repair of Calvarial Bone Defects viaLocalized Sclerostin Inhibition.ACS Appl.Mater.Interfaces 2023,15,9044-9057)。
Claims (10)
1.一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将丙烯酰氨基酸单体粉末溶于双蒸水中，得到1-3mol/L的丙烯酰氨基酸单体溶液；
步骤2：将步骤1得到的丙烯酰氨基酸单体溶液与可溶性钙盐溶液进行混合搅拌2-30min，然后逐滴加入磷酸盐溶液持续搅拌2-30min，得到混合溶液A；
步骤3：将步骤2得到的混合溶液A与交联剂进行混合搅拌，得到混合溶液B；
步骤4：将步骤3得到的混合溶液B与光引发剂进行混合搅拌2-30min，然后在蓝光或紫外光照射下，引发聚合反应，得到氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的丙烯酰氨基酸单体粉末的制备过程如下：
步骤1.1：将氨基酸与丙烯酰氯混合进行反应，反应过程中反应溶液的pH值调至7.5-8.5；待反应结束后，将反应溶液的pH值调至10.5-11.5，得到碱性溶液；所述氨基酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:(1.0-1.5)；所述氨基酸为甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸；
步骤1.2：采用乙酸乙酯对步骤1.1得到的碱性溶液进行洗涤，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的pH值调至1.5-2.5，得到酸性溶液；所述乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：(2-4)；
步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，旋蒸，得到浓缩液；所述乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：(2-4)；
步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，离心，干燥，得到丙烯酰氨基酸单体粉末；所述正己烷与浓缩液的体积比为1：(5-8)；所述丙烯酰氨基酸单体包括丙烯酰甘氨酸、丙烯酰天冬氨酸或丙烯酰谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1.1中的氨基酸还可以为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
4.根据权利要求2所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1.1中的室温反应时间为3-4h；所述步骤1.3中的旋蒸温度为20℃-30℃；所述步骤1.4中的离心转速为3000-10000rpm，离心时间为2-5min，干燥时间为3-8h，压力为0～-0.1MPa。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2中丙烯酰氨基酸单体溶液，可溶性钙盐溶液以及磷酸盐溶液的体积比为(20-50)：(5-15)：(2-9)；所述可溶性钙盐溶液的浓度为10-30mmol/L，磷酸盐溶液的浓度为4-18mmol/L。
6.根据权利要求1或5所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2中可溶性钙盐溶液为CaCl2，CaCl2·2H2O，Ca(NO3)2或Ca(NO3)2·4H2O；磷酸盐溶液为Na2HPO4，K2HPO4或(NH4)2HPO4。
7.根据权利要求1所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的混合溶液A与交联剂的体积比为(100-400)：1；所述搅拌时间为2-30min；所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，所述PEGDA的平均分子量为250-10000，所述交联剂质量浓度为0.05％-0.2％。
8.根据权利要求1所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤4中的混合溶液B与光引发剂的体积比为(15-40)：1；光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)，2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(1173)或苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)，光引发剂的质量浓度为2％-6％，所述交联反应时间为5-30s。
9.一种氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料，其特征在于：采用权利要求1-8任一项所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料，其特征在于：所述氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料为丙烯酰甘氨酸/无定形磷酸钙复合材料，丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料或丙烯酰谷氨酸/无定形磷酸钙复合材料。
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| CN202311614764.5A CN117599253A (zh) | 2023-11-29 | 2023-11-29 | 一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法 |
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| CN202311614764.5A CN117599253A (zh) | 2023-11-29 | 2023-11-29 | 一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法 |
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| CN117599253A true CN117599253A (zh) | 2024-02-27 |
Family
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2023
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