CN117587050A - 编码融合蛋白Pre F-CCD的重组DNA分子、应用及呼吸道合胞病毒DNA疫苗 - Google Patents

编码融合蛋白Pre F-CCD的重组DNA分子、应用及呼吸道合胞病毒DNA疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种编码融合蛋白Pre F‑CCD的重组DNA分子、应用及呼吸道合胞病毒DNA疫苗。本发明提供的重组质粒pVAX‑Pre F‑CCD可以起到较Pre F蛋白疫苗和Pre F‑CCD蛋白疫苗更优的效果。在体液免疫反应中，本发明的重组DNA疫苗不仅可以诱发哺乳动物呼吸道合胞病毒特异性F抗原的IgG抗体水平，还可以诱发特异性G抗原CCD区的IgG结合抗体。此外，本发明的重组DNA疫苗同时还可以提高中和抗体水平与诱发出针对F与G蛋白的Th1细胞免疫，可以有效的降低肺部病毒载量，抑制病毒的复制，避免造成疫苗增强疾病。

Description

编码融合蛋白Pre F-CCD的重组DNA分子、应用及呼吸道合胞 病毒DNA疫苗
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种编码融合蛋白Pre F-CCD的重组DNA分子、应用及呼吸道合胞病毒DNA疫苗。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)属副粘液病毒科、肺炎病毒属的一种负链RNA病毒。RSV的整个基因组可以编码多达10个的病毒蛋白，包括三种跨膜糖蛋白：起黏附作用的G蛋白，起融合作用的F蛋白和小型疏水蛋白SH蛋白。
RSV主要引发婴幼儿与老年人下呼吸道疾病，是婴幼儿急性下呼吸道感染的主要原因，几乎所有两岁以下的婴儿都经历过RSV感染，并且婴幼儿和老年人通常会发生反复感染，是一种严重危害婴幼儿健康的疾病。已有的针对RSV的药物帕利株单抗仅用于不足35周早产儿的先天性心脏病或肺部疾病，目前还没有在国内上市。最早研发的RSV疫苗是用福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)，在20世纪60年代进行了临床试验，但由于过度的Th2型炎症与Treg缺失，导致疫苗增强疾病(vaccine enhanced disease,VED)，接种FI-RSV的婴儿后不但没有受到疫苗的免疫保护，反而表现出了更加严重的感染病情，加重的病情从而导致了婴儿的死亡，因此对于RSV病毒目前尚无特异性的治疗药物和预防疫苗。目前RSV疫苗的研究大多为基于F蛋白，因F蛋白免疫后能够诱导高水平的中和抗体水平。其中根据构象不同将F蛋白分为融合前的F蛋白(Pre F)和融合后的F蛋白(Post F)，研究表明Pre F蛋白诱导的中和抗体水平远高于Post F。
此外RSV病毒囊膜表面还有G蛋白，其功能是介导细胞与病毒的黏附，在RSV A亚群和B亚群的同源性较差，此外，G蛋白为一个高度糖基化的蛋白质，且蛋白质结构松散，因此G蛋白疫苗难以诱发出好的中和抗体。然而，G蛋白其中心保守区域(Central conserveddomain,简称CCD)在两个亚型中同源性较高，而且没有糖基化，G蛋白主要以此保守区域跟细胞表面的CX3CR1受体结合，而使得RSV病毒感染肺部上皮细胞。因此针对G蛋白CCD区域进行免疫，能够刺激出有对不同亚型的RSV感染具有保护效果的中和抗体，进一步降低病毒感染引起的的病理症状。然而单独CCD肽段较难诱发出强的抗体反应，因此如何诱发出针对G蛋白CCD肽段的抗体即为一挑战。此外，二十世纪中所开展的灭活RSV疫苗(FI-RSV)临床试验显示，在RSV流行季有高达八成的接种了FI-RSV的婴幼儿住院，且造成数例幼儿死亡。这种由RSV灭活疫苗免疫接种造成的RSV感染后疾病反加重的现象被称为疫苗增强的疾病(vaccine enhanced disease，VED)。VED现象给RSV疫苗的研发带来极大的挑战，也提高了RSV G蛋白作为RSV疫苗靶标的困难。
为了能有效阻挡RSV分别经由F蛋白与G蛋白与细胞受体结合的感染途径，可将F蛋白与G蛋白一起作为抗原来开发疫苗。然而，多抗原蛋白质疫苗在工艺开发上，尤其在制剂开发的技术难度较高，且两个蛋白质分别表达与纯化成本极高。此外，F蛋白与G蛋白混合铝佐剂作为RSV疫苗，有可能诱发出Th2细胞免疫反应造成VED风险。
为了有效解决上述RSV疫苗开发的问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，为了降低F蛋白与G蛋白双抗原分子在传统疫苗开发上的成本与难度，并进一步藉由提升Th1细胞免疫反应，调降Th2细胞免疫来减低VED的风险，提供一种能够同时诱发了细胞免疫和体液免疫的DNA疫苗，期望免疫保护效果明显优于传统疫苗。
本发明的另一个目的在于，提供一种能够编码包含F蛋白和G蛋白CCD区域融合蛋白的重组DNA分子，期望使用该重组DNA分子制备得到的DNA疫苗能够同时表现出F蛋白和G蛋白CCD的免疫原性，诱导得到更高水平的中和抗体，且该中和抗体能够同时靶向RSV A亚群和B亚群。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包括编码呼吸道合胞病毒Pre F蛋白片段的第一DNA分子和编码呼吸道合胞病毒G蛋白CCD结构域的第二DNA分子；所述第一DNA分子和第二DNA分子通过Foldon三聚体和linker连接。
可选实施方式中，所述呼吸道合胞病毒Pre F蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
可选实施方式中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白CCD结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。
可选实施方式中，所述Foldon三聚体结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述linker编码的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
可选实施方式中，所述重组DNA分子具有如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种生物材料，包括如下(a)或(b)：
(a)含有前述实施方式任一项所述重组DNA分子的重组质粒，所述重组质粒的原始质粒优选为pVAX1；
(b)采用生物材料(a)转染宿主细胞得到的转化体。
第三方面，本发明提供一种融合蛋白，由前述实施方式任一项所述重组DNA分子编码或由前述实施方式所述生物材料表达得到。
第四方面，本发明提供了前述实施方式所述融合蛋白的非治疗目的的表达方法，包括(A)～(C)中任一项：
(A)由前述实施方式任一项所述的重组DNA分子体外表达获得；
(B)由前述实施方式所述的重组质粒体外表达获得的；
(C)由前述实施方式所述的转化体体外表达获得的。
第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述重组DNA分子、前述实施方式所述生物材料、前述实施方式所述融合蛋白或前述实施方式所述表达方法在呼吸道合胞病毒DNA疫苗制备中的应用。
第六方面，本发明提供了一种呼吸道合胞病毒DNA疫苗，包含前述实施方式任一项所述的重组DNA分子或前述实施方式所述的重组质粒；
本发明提供的重组DNA分子，不仅在哺乳动物细胞内能够正确转录和表达，除了可诱导出针对RSV F蛋白与G蛋白CCD抗体，还能够诱导机体产生Th1细胞免疫反应。因此经过本发明提供的重组DNA分子免疫的动物，在遭遇RSV病毒侵袭时，能产生了很好的保护效果。更进一步的，本发明提供的重组质粒pVAX-Pre F-CCD可以起到较Pre F蛋白疫苗、G蛋白疫苗和Pre F-CCD蛋白疫苗更优的免疫原性效果。在体液免疫反应中，本发明的重组DNA疫苗不仅可以提高哺乳动物呼吸道合胞病毒特异性F抗原的IgG抗体水平，还可以提高特异性G抗原CCD区(G162-195)的IgG抗体,同时还可以提高中和抗体水平，可以很好地降低肺部病毒载量，抑制病毒的复制；且，Pre F-CCD融合，较Pre F组而言，可产生协同作用，提高了anti-F的抗体滴度，即协同提高了免疫反应水平。而且通过肺部组织HE染色切片结果发现本发明的重组DNA疫苗可以很好地抑制哺乳动物的肺部炎性细胞的增殖和浸润，降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤，抑制RSV疫苗常见的VED现象，无明显副作用。同时，在细胞免疫反应中，本发明的重组DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应，而且能够诱导抗原特异性CD4 IFN-γ、CD4 TNF-α、CD8 IFN-γ以及CD8 TNF-αT细胞亚群的产生，且明显优于Pre F蛋白疫苗和Pre F-CCD蛋白疫苗组；并且进一步的发现本发明的pVAX-Pre F-CCD重组DNA疫苗不仅可以降低抗原特异性CD4+IL-4和CD4+IL-13T细胞亚群的比例，同时还可以增加RSV特异性Treg比例，预示该重组DNA疫苗是通过提高Th1细胞免疫，来调节Th2型细胞因子IL-4和IL-13分泌，以及增加Treg细胞比例来降低RSV疫苗引起的VED反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2pVAX-Pre F-CCD质粒酶切片段的琼脂糖凝胶电泳；
图2为实施例3pVAX-Pre F-CCD转染HEK293T细胞表达产物的特异性；
图3为实施例5小鼠免疫后21天anti-Pre F特异性抗体IgG的浓度；
图4为实施例5小鼠免疫后第21天anti-G162-195特异性抗体IgG的浓度；
图5为实施例6小鼠免疫后第21天anti-Pre F特异性抗体IgG的浓度；
图6为实施例6小鼠免疫后第21天anti-G162-195特异性抗体IgG的浓度；
图7为实施例6小鼠免疫后第21天血清中中和抗体的滴度；
图8为实施例6用ELISPOT检测小鼠免疫后第28天脾细胞产生特异性的IFN-γ的水平；
图9为实施例6小鼠免疫后第28天脾细胞中CD4+T细胞产生IFN-γ的水平；
图10为实施例6小鼠免疫后第28天脾细胞中CD4+T细胞产生TNF-α的水平；
图11为实施例6小鼠免疫后第28天脾细胞中CD8+T细胞产生IFN-γ的水平；
图12为实施例6小鼠免疫后第28天脾细胞中CD8+T细胞产生TNF-α的水平；
图13为实施例7小鼠免疫后第14天血清中Anti-Pre F的抗体滴度；
图14为实施例7病毒感染后小鼠体重的变化曲线；
图15为实施例7病毒感染5天后小鼠肺部病毒载量的对比；
图16为实施例7病毒感染后小鼠肺部的HE染色病理切片；
图17为实施例7病毒感染后小鼠肺部的HE染色病理评分；
图18为实施例7病毒感染后小鼠脾脏分泌Pre F多肽特异性的IFN-γ的水平；
图19为实施例7病毒感染后小鼠脾脏分泌G多肽特异性的IFN-γ的水平；
图20为实施例7病毒感染后小鼠脾脏中CD4+IFN-γT细胞数的比例；
图21为实施例7病毒感染后小鼠脾脏中CD4+TNF-αT细胞数的比例；
图22为实施例7病毒感染后小鼠脾脏中CD8+IFN-γT细胞数的比例；
图23为实施例7病毒感染后小鼠脾脏中CD8+TNF-αT细胞数的比例；
图24为实施例7病毒感染后小鼠肺门淋巴结中CD4+TNF-αT细胞数的比例；
图25为实施例7病毒感染后小鼠肺门淋巴结中CD8+TNF-αT细胞数的比例；
图26为实施例7病毒感染后小鼠脾脏中CD4+IL-4T细胞数的比例；
图27为实施例7病毒感染后小鼠脾脏中CD4+IL-13T细胞数的比例；
图28为实施例7病毒感染后小鼠肺门淋巴结中Treg细胞数的比例；
图29为实施例8小鼠初免后第14天血清中Anti-Pre F的抗体滴度；
图30为实施例8小鼠加强免疫后7天血清中Anti-Pre F的抗体滴度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
在具体的实施方式中，第一方面，本发明提供了一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包括编码呼吸道合胞病毒Pre F蛋白片段的第一DNA分子和编码呼吸道合胞病毒G蛋白CCD结构域的第二DNA分子；所述第一DNA分子和第二DNA分子通过Foldon三聚体和linker连接。
可选实施方式中，所述呼吸道合胞病毒Pre F蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。所述SEQ ID NO：1为呼吸道合胞病毒Pre F蛋白的1～513位氨基酸经缺失突变后得到的氨基酸序列。
可选实施方式中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白CCD结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。所述SEQ ID NO：3为G蛋白CCD部分的序列158～191位氨基酸。
可选实施方式中，其特征在于，所述Foldon三聚体结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述linker编码的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
可选实施方式中，所述重组DNA分子具有如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。SEQ IDNO：4与Pre F蛋白和G蛋白CCD结构域对应的基因序列相比，是经过本公司特有密码子优化体系优化得到的。
第二方面，本发明提供一种生物材料，包括如下(a)或(b)：
(a)含有前述实施方式任一项所述重组DNA分子的重组质粒，所述重组质粒的原始质粒优选为pVAX1；
(b)采用生物材料(a)转染宿主细胞得到的转化体，对于宿主细胞，本领域技术人员能够根据实际需求进行常规选择。
第三方面，本发明提供一种融合蛋白，由前述实施方式任一项所述重组DNA分子编码或由前述实施方式所述生物材料表达得到。
第四方面，本发明提供了前述实施方式所述融合蛋白的非治疗目的的表达方法，包括(A)～(C)中任一项：
(A)由前述实施方式任一项所述的重组DNA分子体外表达获得；
(B)由前述实施方式所述的重组质粒体外表达获得的；
(C)由前述实施方式所述的转化体体外表达获得的。
第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述重组DNA分子、前述实施方式所述生物材料、前述实施方式所述融合蛋白或前述实施方式所述表达方法在呼吸道合胞病毒DNA疫苗制备中的应用。
第六方面，本发明提供了一种呼吸道合胞病毒DNA疫苗，包含前述实施方式任一项所述的重组DNA分子或前述实施方式所述的重组质粒；
优选地，所述呼吸道合胞病毒DNA疫苗还包含佐剂，进一步优选为铝佐剂。
需要说明的是，对于所述佐剂本领域技术人员能够根据实际需求进行常规选择。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1重组DNA疫苗成分制备
1.呼吸道合胞病毒候选重组DNA疫苗的制备
1.1重组质粒的构建
Pre F-CCD重组DNA疫苗：本发明中的重组DNA疫苗选取呼吸道合胞病毒Pre F蛋白的1～513位氨基酸为骨架并进行缺失突变后得到氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽片段，并将G蛋白CCD部分片段(158～191位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)通过Foldon三聚体(SEQ ID NO：2)和氨基酸残基组成为GGGSGGGSS(SEQ ID NO：9)的linker连接在Pre F蛋白的C端，再在SEQ ID NO：3的末端通过GS的linker加上6个组氨酸His，从而构成Pre F-CCD蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。通过对Pre F-CCD对应的基因序列进行密码子优化，获得SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。通过全基因合成的方法合成SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，将合成的序列插入pVAX1载体的BamH I和EcoRI位点中，得到Pre F-CCD重组DNA疫苗(记为pVAX-Pre F-CCD)。
1.2重组质粒在体外的转染
从-80℃冰箱中取100μL DH5-α感受态细胞悬液，冰上解冻。加入重组质粒DNA溶液(体积不超过10μL)轻轻摇匀，冰上放置30min。42℃水浴中热击45s，迅速置于冰上冷却2min。向管中加入1mL的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，然后室温3000rpm，离心2min，离心后弃700μL上清液，剩余溶液混匀。用接种环蘸取上述菌液于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行Z字型划线，正面向上放置15min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养6～8h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入50mL含有50μg/mL卡那霉素的LB选择培养基中37℃220rpm培养6～8h。
1.3重组质粒提取
将上述菌液按照(体积比1：50)加入到200～400mL含有卡那霉素(50mg/mL母液，体积比1：1000使用)的LB选择培养基中，37℃220rpm培养12～16h。用EndoFreen PlasmidMaxi kit(QIAGEN，德国)进行质粒提取：将上述培养12～16h的菌液4℃，6000×g离心15min后弃上清收集菌体，加入10mL Buffer P1重悬菌液后加入10mL Buffer P2轻轻颠倒4～6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10mL Buffer P3，轻轻颠倒4～6次混匀终止裂解后，全部转移至QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50mL离心管中，加入2.5mL Buffer ER，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出QIAGEN-tip 500加入10mL Buffer QBT平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流吸附重组质粒，用30mL Buffer QC洗涤2次，再用15mL Buffer QN进行洗脱。每管样品用10.5mL异丙醇沉淀，4℃，13000×g离心30min。弃上清，加入70％(体积分数)乙醇洗涤1次，4℃，13000×g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入200μL无内毒素水进行重悬质粒，得到重组质粒。
2.呼吸道合胞病毒Pre F、Pre F-CCD蛋白的获得
Pre F蛋白的获得：本发明中的呼吸道合胞病毒Pre F蛋白编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将SEQ ID NO.1委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行表达并纯化得到所需要的Pre F蛋白。
Pre F-CCD蛋白的获得：本发明的Pre F-CCD编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，将SEQ ID NO.5委托泰州市百英生物科技有限公司进行表达并纯化得到所需要的PreF-CCD蛋白。
3.本发明当中pVAX1载体是ThermoFisher公司的产品，产品目录号V26020。铝佐剂(Alum)是InvivoGen公司的产品，产品目录号VAC-ALU-250。
实施例2重组质粒鉴定
为了验证上述实施例1的pVAX-Pre F-CCD重组质粒构建是否成功，对质粒进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定该重组质粒DNA是否为目的条带。
酶切反应体系如下表1所示，反应体系总体积为20μL。
表1酶切反应体系试剂用量
将上述反应体系混匀后，置于37℃水浴1～3h以完成消化反应。将酶切后质粒DNA样品每样20μL与2μL 10×Loading buffer混匀后，加入制备好的琼脂糖凝胶胶孔中，接通电源，调至恒压150V，时间设置40min进行电泳。电泳完成后将胶板放在凝胶成像仪中进行拍照，观察结果。
结论：如图1所示，pVAX1载体大小为2998bp，对于Pre F-CCD的基因片段大小为1671bp，经限制性酶BamHI和XhoI双酶切后两个片段分别大约在2000bp左右和3000bp左右，符合预期，质粒的片段大小正确。
实施例3重组质粒在哺乳动物细胞中转录鉴定
为了验证实施例1构建的重组质粒在哺乳动物细胞内是否能够有效转录，通过DNA体外转染、提取RNA、qPCR的方法进行鉴定。
1.重组质粒体外转染
从液氮中取出冻存的HEK293T细胞株一管，37℃水浴2～3min，表面消毒后，在生物安全柜中吸取细胞培养液至15mL离心管中，1500rpm离心3min弃上清除去DMSO。加入10mL无血清的DMEM培养液洗涤一次，1500rpm离心3min弃上清。用含10％(体积比)小牛血清的DMEM培养液5mL重悬细胞，加入T25细胞瓶，于37℃，5％CO2培养2～3代备用。37℃胰酶(含体积比为0.25％的EDTA)消化细胞1min并用完全培养基终止后，以6～7×106细胞/孔的密度平铺于100mm培养皿，加5mL生长培养基(不含1％青霉素/链霉素)于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
将15μg pVAX-Pre F-CCD无菌重组质粒加入至1.5mL无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，同时将75μL的阳离子脂质体于1.5mL无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min，将上述重组质粒pVAX-Pre F-CCD与脂质体(体积比1:1)混合，室温放置20min，得到重组质粒DNA/脂质体复合物。
将上述重组质粒DNA/脂质体复合物按3mL/皿加入至上述培养24h的100mm培养皿中，于37℃，5％CO2培养箱分别孵育至48h进行后续实验。
2.蛋白提取
将pVAX-Pre F-CCD重组质粒转染到HEK293T细胞株中，转染48h结束后，去除转染后的培养液，用预冷的PBS洗一遍，弃去PBS，加入500μL裂解液(使用前按体积比1：100加入EDTA及蛋白酶抑制剂)混匀后吹打至出现絮状漂浮物。置于12,000rpm 4℃离心5min。吸出上清至1.5mL离心管中，每样取出48μL上清液，加入12μL 5×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，12,000rpm室温离心10min备用。
3.样品上样及SDS-PAGE电泳
将煮沸离心后的上清样本每孔加40μL于SDS-PAGE胶孔中，接通电源，调至恒压150V，时间设置40min进行电泳。电泳结束后取出SDS-PAGE进行转膜制作。取PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，将PVDF膜置于1×转膜平衡液中1min。
4.转膜
以正极为底面按照：eBlot L1转膜垫片、PVDF膜、凝胶、eBlot L1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用滚轮排除层间气泡。封闭：将PVDF膜从取出放入盛有1×TBST+5％(质量百分数)脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，每次10min，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗溶液(Anti-Pre F血清(1)体积比1:1000稀释；Anti-G血清(2)体积比1:500稀释)反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10min，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将PVDF膜放入二抗溶液中(Goat anti-mouse IgG HRP(金斯瑞)，体积比1:1000稀释)反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10min，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液A液3mL和B液3mL以体积比1：1比例混合后加入到PVDF膜孵育1～2min，拍照。
结论：如图2所示，对于F抗体(Anti-F)可以识别Pre F和pVAX-Pre F-CCD，对于G抗体(Anti-G)可以识别pVAX-Pre F-CCD和G蛋白。因此，从条带大小来看，阳性对照Pre F蛋白有516个氨基酸，蛋白大小大概是57kD，位于55～70kD的Marker条带之间，符合预期；阳性对照G蛋白有303个氨基酸，蛋白大小大概为33kD，主条带位于35～55kD的Marker条带之间，稍微偏大，总体上符合预期。pVAX-Pre F-CCD有556个氨基酸，蛋白大小约为62kD，位于70kDMarker条带附近，符合预期，因此本发明RSV候选DNA疫苗pVAX-Pre F-CCD在体外转染48h后，在细胞内能够检测到抗原蛋白G蛋白和F蛋白的表达，且蛋白表达正确。
实施例4 RSV候选DNA疫苗免疫原性的评价
为了评估实施例1制备的疫苗抗原成分的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫应答的影响，从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买了无特定病原体的6周龄BALB/c雌性小鼠，于艾棣维欣(苏州)生物制品有限公司的实验动物中心饲养。用实施例1所得到疫苗抗原成分进行疫苗配置，免疫分组及试剂用量如表2所示，配置过程如表3所示，第1组为PBS注射组，第2组为10μg Pre F+100μg铝佐剂(Alum)组，第3组为5μg pVAX-Pre F-CCD组，第4组为25μg pVAX-Pre F-CCD组，小鼠第一次免疫当天定义为第0天，免疫前一天为-1天，免疫后一天为第1天，以此类推。第0、14天分别免疫1针，第1～2组每次每只小鼠免疫200μL，于右后腿外侧肌肉注射；第3～4组为每次每只小鼠免疫30μL，肌肉注射疫苗后用电脉冲仪进行电击。并于第14、21天采集小鼠血液样品，分离血清，用于检测特异性抗体实验。
表2免疫分组和试剂用量
表3疫苗配置过程
实施例5抗原特异性抗体检测
为了评估实施例4制备的不同分组的疫苗对小鼠体液免疫应答的影响，采用ELISA法检测小鼠初次免疫后第21天血清中抗原特异性抗体IgG(anti-F，anti-G162～195)的滴度。
具体实验方法，包被：用抗原包被液稀释抗原，96孔板包被2μg/mL PreF蛋白或1μg/mL Biotin-RSV G162～195多肽+1μg/mL链霉亲和素(Streptavidin)，按每孔100μL加入至96孔酶标板，2～8℃孵育过夜。封闭：弃包被液，PBST洗涤3次，按每孔150μL加入3％(体积比)BSA封闭1h。一抗(待测血清)孵育：弃封闭液，用PBST洗板3次，待测血清使用1％(体积比)BSA连续2倍梯度稀释7次，每孔加100μL，37℃孵育1h。二抗孵育：弃待测液，用PBST洗板3次，用1％(体积分数)BSA稀释二抗(Goat anti-mouse IgG-HRP)，每孔加100μL，37℃孵育1h。显色：弃二抗，PBST洗涤6次，按每孔100μL加TMB显色液，室温显色10～20min(显色后变为蓝色)。终止：每孔加50μL 2M H2SO4终止显色(终止显色后变为亮黄色)。10min内用酶标仪检测读数(A450～A620)。
结论：图3结果显示Pre F+Alum蛋白疫苗组、pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组免疫小鼠后均可以诱导高水平的anti-F的抗体滴度。两个剂量(5μg和25μg)pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组anti-F的抗体滴度显著高于Pre F+Alum蛋白疫苗组，且高剂量pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组anti-F的抗体滴度略高于低剂量组。
图4结果显示Pre F+Alum蛋白疫苗组未能诱导出anti-G162-195的抗体；Pre F+G+Alum蛋白疫苗组和两个剂量(5μg和25μg)pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组则可以诱导高水平的anti-G162-195的抗体滴度。两个剂量(5μg和25μg)pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组anti-G162-195的抗体滴度显著高于Pre F+G+Alum蛋白疫苗组。
实施例6 RSV候选DNA疫苗与Pre F-CCD蛋白疫苗免疫原性的比较
为了评估实施例1制备的RSV候选DNA疫苗pVAX-Pre F-CCD与Pre F-CCD蛋白疫苗免疫后体液免疫和细胞免疫的应答，从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买了无特定病原体的6周龄BALB/c雌性小鼠，于艾棣维欣(苏州)生物制品有限公司的实验动物中心饲养。用实施例1所得到疫苗成分进行疫苗配置，配置过程如表4所示；免疫分组：第1组为PBS注射组，第2组为10μgPre F+100μg Alum组，第3组为10μg Pre F-CCD+100μg Alum组，第4组为25μg pVAX-Pre F-CCD组，小鼠第一次免疫当天定义为第0天，免疫前一天为-1天，免疫后一天为第1天，以此类推。第0、14天分别免疫1针，第1～3组为每次每只小鼠免疫100μL，于右后腿外侧肌肉注射，第4组为每次每只小鼠免疫30μL，于右后腿外侧肌肉注射疫苗后用电脉冲仪进行电击。并于第14、21天采集小鼠血液样品，分离血清，用于检测特异性抗体实验。
表4疫苗配置过程
1.抗原特异性抗体检测
采用ELISA法检测小鼠免疫后第21天血清中抗原特异性抗体IgG(anti-F，anti-G162-195)的滴度。ELISA实验方法同实施例5一致。
结论：图5结果显示Pre F+Alum蛋白疫苗组、Pre F-CCD+Alum蛋白疫苗组、pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组免疫后均可以诱导高水平的anti-F的抗体滴度，而Pre F-CCD+Alum蛋白疫苗组和pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组的anti-F的抗体滴度显著高于Pre F+Alum蛋白疫苗组，且该两组的anti-F的抗体水平相当。可见，Pre F-CCD融合，较Pre F组而言，可产生协同作用，协同提高了anti-F的抗体滴度，即提高了免疫反应水平。
图6结果显示pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组可以诱导高水平的anti-G162-195的抗体，其显著高于Pre F-CCD+Alum蛋白疫苗组。
2.中和抗体的检测
取免疫后第21天血清，将待测血清56℃水浴加热灭活30min后，用无血清DMEM培养基稀释成(体积比)1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024，稀释6个梯度后，将待测血清与RSV A2病毒(100TCID50)在37℃下混合铺于96孔板中，放置2h。然后将Hep-2细胞进行胰酶消化，用4％(体积比)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基稀释成2×104细胞/100μL加入放有血清和病毒液的96孔板中。5天后，用预冷的80％丙酮固定细胞，然后用5％(体积比)BSA封闭细胞。洗涤后将rabbit anti-Pre F IgG加入孔板，37℃孵育1h。洗涤后再加入Goat anti-rabbitIgG-HRP显色，用酶标仪检测读数(A450/A620)。
结论：中和抗体检测结果如图7所示，pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗可诱导产生高水平的中和抗体，预防RSV病毒感染。
3.IFN-γELISpot
免疫后第28天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，加入含有10％(体积比)FBS的RPMI1640培养基终止裂解；离心后将单细胞悬浮在补充有10％(体积比)FBS，1％(体积比)青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，对制备好的单细胞悬液计数。
通过使用小鼠IFN-γELISpot试剂盒(Dakewe，SZ，中国)进行IFN-γELISpot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗IFN-γ抗体的孔中，并在37℃的CO2培养箱中用Pre F肽库刺激24h，每孔中肽库浓度为2.5μg/mL(终浓度)(溶于RPMI1640+10％FBS)。根据产品说明书进行操作。培养基(NC)和PMA/Iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过iSpot Reader(AID，德国Straβberg)进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位(SFU)。
结论：IFN-γELISpot结果如图8所示，RSV候选DNA疫苗pVAX-Pre F-CCD免疫后第28天能有效诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应，显著高于Pre F+Alum蛋白疫苗组和Pre F-CCD+Alum蛋白疫苗组，说明该DNA疫苗的细胞免疫效果更优。
4.抗原特异性T细胞检测
进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是CD4和CD8 T细胞功能的影响，在免疫后28天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。
流式细胞仪检测实验：在免疫后28天，取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液；将脾细胞悬液，37℃，5％CO2下用Pre F肽库或PMA /Iono刺激，同时利用5μg/mL的Brefedlin A(BD，CA，美国)与2μM的Monensin(BD，CA，美国)阻断9h。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用Live/Dead dye染色30min，然后洗涤，并在4℃下于黑暗中分别用抗小鼠CD3，CD4，CD8a抗体染色30min。然后洗涤，用固定/通透缓冲液透化细胞1h，并用抗小鼠IFN-γ和抗小鼠TNF-α在4℃下进行60min细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200μL PBS重悬，使用流式细胞仪(ThermoFisher，MA，美国)进行采集，最终用FlowJo软件(BD，CA，美国)进行分析。
结论：结果如图9～12所示，RSV候选DNA疫苗pVAX-Pre F-CCD免疫后第28天能够显著诱导高水平的抗原特异性CD4+TNF-αT细胞亚群以及CD8+IFN-γ、CD8+TNF-αT细胞亚群的产生，其明显优于PreF+Alum蛋白疫苗组和Pre F-CCD+Alum蛋白疫苗组，CD4+IFN-γ略优于其他组，进一步说明该DNA疫苗具有更优秀细胞免疫效果。
实施例7 RSV候选DNA疫苗预防RSV感染验证
为了检测RSV候选DNA疫苗免疫后对预防小鼠感染RSV的实际效果，验证疫苗是否对小鼠在病毒感染后起到保护作用，在小鼠免疫后第28天进行RSV攻毒，攻毒5天后对小鼠的肺部病毒载量、肺部病理及细胞免疫应答进行了检测。实验分组：第1组为PBS注射组(未攻毒组)，第2组为PBS组(攻毒组)，第3组为FI-RSV组(攻毒组)，第4组为10μg Pre F+100μgAlum组(攻毒组)，第5组为25μg pVAX-Pre F-CCD组(攻毒组)。其中第3组灭活疫苗FI-RSV的制备方法为107TCID50RSV病毒(美国ATCC，catalog no.VR-26TM)经甲醛72h，37℃反应后，利用50000×g高速离心1h纯化后制得浓缩灭活RSV原液，取50μL灭活原液加入等量铝佐剂混合后，放置摇床上进行混合振荡30min，每只小鼠注射100μL。免疫过程和试剂配置方法与实施例3相同，于初次免疫后14，21天分别采取小鼠血清，检测血清中的特异性抗体水平。
初次免疫后28天时，用异氟烷麻醉小鼠后，用RSV病毒滴鼻感染每组小鼠，病毒用量为2×106pfu/每只小鼠，并连续5天监测小鼠体重的变化，第33天安乐死小鼠，采集肺组织，左肺制成肺脏匀浆液，进行病毒载量测定，右肺固定做HE切片进行病理检查。采集脾细胞和肺门淋巴结进行细胞免疫应答的检测。
1.特异性抗体检测
采用ELISA法检测小鼠初次免疫后14天血清中抗原特异性抗体IgG(anti-F)的滴度。ELISA实验方法同实施例5一致。
结论：如图13所示，在初次免疫后14天，pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组小鼠血清中的anti-F的抗体滴度显著高于Pre F+Alum蛋白疫苗组和FI-RSV灭活疫苗组，说明该DNA疫苗具有更优秀的抗体应答效果。
2.RSV攻毒后小鼠体重的变化
如图14所示，与未攻毒组小鼠(PBS-No-infection)相比，FI-RSV组小鼠体重显著下降，下降率高达10％，提示该组小鼠在攻毒后产生严重的VED，而其他组小鼠与未攻毒组相比无显著差异，且pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组与未攻毒组相比小鼠体重变化幅度最小，优于其他组，证明该DNA疫苗并未产生明显副作用。
3.肺部RSV病毒载量检测
攻毒5天后，安乐死小鼠，用手术剪打开胸腔，取下肺并称重，加入300μL无菌PBS，然后用组织匀浆机60Hz匀浆90s，100μL/管分装。取出1管，12000rpm离心1min，吸取上清，补加100μL无菌PBS，使用SteadyPure病毒DNA/RNA提取试剂盒，按照说明书方法，提取匀浆液中病毒RNA。使用cDNA转录试剂盒Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix forqPCR(gDNA digester plus)对提取的RNA进行cDNA合成，按照说明书方法并使用42℃，2min去除基因组DNA，再使用25℃5min，42℃30min，85℃5min的条件进行合成；再使用qPCR检测试剂盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)进行实时定量PCR，PCR反应条件：95℃、5min 1个循环，95℃、10s，60℃、20s，40个循环，同时以含有RSV N基因的质粒为标准品计算待测样本cDNA中RSV N基因含量。使用的引物为:正向引物：5’-TACGGTGGGGAGTCTTAGCA-3’(SEQ ID No：7)；反向引物：5’-CACCACCCAATTTTTGGGCA-3’(SEQID No：8)。
结论：结果如图15所示，与未攻毒组相比，PBS攻毒组的肺部病毒载量显著增高。与PBS攻毒组相比，FI-RSV,Pre F+Alum、pVAX-Pre F-CCD组小鼠肺部病毒载量显著降低，且pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组明显优于Pre F+Alum蛋白疫苗组，说明pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗具有更优秀的保护效果，可以预防RSV病毒感染，抑制肺部病毒复制。
4.肺部病理切片、染色、读片
小鼠肺标本用4％多聚甲醛室温固定24h后，石蜡包埋。切片后用苏木精和伊红(HE)染色，拍照观察后通过炎症细胞浸润评分评价肺部炎症和损伤程度：0-正常；1-minimal(最小)；2-slight(轻微)；3-moderate(中等)；4-sever(严重)。
结论：如图16所示，肺部切片HE染色结果显示，相比于没有攻毒的小鼠(Non-infection)，PBS免疫组攻毒后小鼠支气管周围有少量的淋巴细胞浸润；FI-RSV免疫攻毒组中支气管周围细胞浸润非常严重，肺泡中也有大量的淋巴细胞浸润，气管壁增厚。Pre F+Alum，pVAX-Pre F-CCD免疫攻毒组小鼠支气管周围淋巴细胞数量与FI-RSV组相比显著降低，且气管壁显著变薄。病理评分的结果如图17所示，FI-RSV组的病理评分显著高于PBS攻毒组，而Pre F+Alum，pVAX-Pre F-CCD免疫攻毒组小鼠肺部病理评分显著低于FI-RSV组，且pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组优于Pre F+Alum蛋白疫苗组，病理评分最低，说明pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组抑制肺部VED反应效果最优。
1.细胞免疫应答的检测
5.1IFN-γELISpot实验
刺激物分别为Pre F蛋白多肽库和G蛋白多肽库，每孔Pre F肽库浓度为2.5μg/mL(终浓度)，G蛋白肽库浓度为5μg/mL(终浓度)，分别刺激18小时，其他实验过程参照实施例6。
结论：如图18～19所示，pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组小鼠脾细胞分泌的Pre F蛋白(图18)和G蛋白(图19)特异性的IFN-γ水平均优于Pre F+Alum组，说明该DNA疫苗具有更优秀的细胞免疫效果。
5.2抗原特异性T细胞检测
在攻毒后5天，从免疫小鼠的脾脏或淋巴结制备单细胞悬液，将细胞悬液置于37℃，5％CO2下用0.2μg/mL CD28 Monoclonal Antibody(ThermoFisher，MA，美国)与Pre F肽库同时刺激，或PMA/Iono刺激，同时利用5μg/mL的Brefedlin A(BD，CA，美国)与2μM的Monensin(BD，CA，美国)阻断9h。对脾细胞或淋巴细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色：将刺激的细胞用Live/Dead dye染色30min，然后洗涤，并在4℃下于黑暗中分别用抗小鼠CD3，CD4，CD8a抗体染色30min。然后洗涤，用固定/通透缓冲液透化细胞1h，并用抗小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13、Foxp3在4℃下于黑暗中进行60min细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200μL PBS重悬，使用流式细胞仪(ThermoFisher，MA，美国)进行采集，最终用FlowJo软件(BD，CA，美国)进行分析。
结论：脾细胞中的细胞因子检测结果如图20-23所示，pVAX-Pre F-CCD组小鼠的脾细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的CD4+T细胞比例以及CD8+T细胞比例显著升高，明显优于其他组，进一步说明pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗促进细胞免疫效果最优，可以显著促进Th1型的细胞免疫应答。
淋巴细胞中的细胞因子检测结果如图24～25所示，与PBS免疫攻毒组相比，Pre F+Alum组，pVAX-Pre F-CCD组小鼠的肺门淋巴结细胞中分泌TNF-α的CD4+T比例显著升高，且pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗免疫组优于Pre F+Alum蛋白疫苗免疫组，进一步说明该DNA疫苗促进细胞免疫具有更优秀的效果。
Th2型细胞因子检测结果如图26～27所示，与PBS免疫攻毒组和Pre F+Alum蛋白免疫组相比，pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗组脾细胞中分泌IL-4和IL-13的CD4+T细胞比例有所降低；而IL-4和IL-13属于Th2型的细胞因子，大部分研究表明，RSV疫苗引起的VED现象多数是由Th2型细胞因子引起的，说明本发明的pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗可以抑制Th2型细胞因子的分泌，抑制VED的产生。
Treg细胞检测结果如图28所示，与PBS免疫攻毒组相比，FI-RSV组小鼠肺门淋巴结细胞中Treg细胞的比例显著降低。与FI-RSV组相比，Pre F+Alum组，pVAX-Pre F-CCD组小鼠的脾细胞中Treg的比例显著升高，且pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗免疫组优组于Pre F+Alum蛋白疫苗免疫组，预示该DNA疫苗组可以通过增加Treg细胞比例来抑制RSV疫苗引起的VED反应。
实施例8
本发明中的重组DNA疫苗选取呼吸道合胞病毒Pre F蛋白，即SEQ ID NO：1所示氨基酸为骨架，除本发明SEQ ID NO：1所示的PreF氨基酸序列，前期实验还选用如SEQ ID NO：6所示的的PreF蛋白(PreF2)进行了免疫筛选实验。小鼠初免后14天以及加强免疫后7天采用同实施例5一致的ELISA实验方法检测了免疫小鼠血清中抗原特异性抗体IgG(anti-F)的滴度。如图29和30所示，初免后14天以及加强免疫后7天Pre F+Alum蛋白疫苗组小鼠血清中的anti-F的抗体滴度明显高于Pre F2+Alum蛋白疫苗组。因此认为Pre F蛋白的免疫原性优于Pre F2蛋白，在后期设计Pre F-CCD重组DNA疫苗时选取的是Pre F蛋白作为本发明DNA疫苗的F骨架蛋白，另外，我们也将Pre F2蛋白作为Pre F-CCD重组DNA疫苗的F骨架蛋白设计了pVAX-Pre F2-CCD DNA疫苗，设计方案同实施例1一致，后期的实验结果也进一步验证了本发明的pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗明显优于pVAX-Pre F2-CCD DNA疫苗的免疫效果。
以上结果说明，本发明设计的呼吸道合胞病毒DNA疫苗pVAX-Pre F-CCD不仅在哺乳动物细胞内能够正确转录和表达，而且具有免疫原性，对小鼠产生了很好的保护效果，能够诱导机体产生很高的体液免疫和细胞免疫反应，更重要的是，该DNA疫苗甚至可以起到较PreF蛋白疫苗和Pre F-CCD蛋白疫苗更优的效果。在体液免疫反应中，本发明的DNA疫苗不仅可以提高哺乳动物呼吸道合胞病毒特异性F抗原的IgG抗体水平，还可以提高特异性G抗原CCD区(G162-195)的IgG抗体,同时还可以提高中和抗体水平，可以很好地降低肺部病毒载量，抑制病毒的复制；而且通过肺部组织HE染色切片结果发现本发明的DNA疫苗可以很好的抑制哺乳动物的肺部炎性细胞的增殖和浸润，降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤，抑制RSV疫苗常见的VED现象，无明显副作用。同时，在细胞免疫反应中，本发明的DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应，而且能够诱导抗原特异性CD4 IFNγ、CD4 TNF-α、CD8 IFNγ以及CD8 TNF-αT细胞亚群的产生，且明显优于PreF蛋白疫苗和Pre F-CCD蛋白疫苗组；并且进一步的发现本发明的pVAX-Pre F-CCD DNA疫苗不仅可以降低抗原特异性CD4+IL-4和CD4+IL-13T细胞亚群的比例，同时还可以增加RSV特异性Treg比例，预示该DNA疫苗是通过抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-13以及增加Treg细胞比例来降低RSV疫苗引起的VED反应。
因此，本发明开发了一种呼吸道合胞病毒DNA疫苗，所述疫苗可用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染引发的疾病。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.重组DNA分子，其特征在于，所述重组DNA分子包括编码呼吸道合胞病毒Pre F蛋白片段的第一DNA分子和编码呼吸道合胞病毒G蛋白CCD结构域的第二DNA分子；
所述第一DNA分子和第二DNA分子通过Foldon三聚体和linker连接。
2.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒Pre F蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒G蛋白CCD结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其特征在于，所述Foldon三聚体结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述linker编码的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的重组DNA分子，其特征在于，所述重组DNA分子具有如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。
6.生物材料，其特征在于，包括如下(a)或(b)：
(a)含有权利要求1～5任一项所述重组DNA分子的重组质粒，所述重组质粒的原始质粒优选为pVAX1；
(b)采用生物材料(a)转染宿主细胞得到的转化体。
7.融合蛋白，其特征在于，由权利要求1～5任一项所述重组DNA分子编码或由权利要求6所述生物材料表达得到。
8.权利要求7所述融合蛋白的非治疗目的的表达方法，其特征在于，包括(A)～(C)中任一项：
(A)由权利要求1～5任一项所述的重组DNA分子体外表达获得；
(B)由权利要求6所述的重组质粒体外表达获得的；
(C)由权利要求6所述的转化体体外表达获得的。
9.权利要求1～5任一项所述重组DNA分子、权利要求6所述生物材料、权利要求7所述融合蛋白或权利要求8所述表达方法在呼吸道合胞病毒DNA疫苗制备中的应用。
10.呼吸道合胞病毒DNA疫苗，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述的重组DNA分子或权利要求6所述的重组质粒。
CN202210966782.9A 2022-08-12 2022-08-12 编码融合蛋白Pre F-CCD的重组DNA分子、应用及呼吸道合胞病毒DNA疫苗 Pending CN117587050A (zh)

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