CN117586765B - 一种发光纳米材料及其制备方法和在蛋白质检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种发光纳米材料及其制备方法和在蛋白质检测中的应用。本发明的发光纳米材料由表面修饰抗体的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@Cs2NaYF6核壳纳米颗粒和氧化石墨烯结合形成，通过激发产生发光光谱，且发光光谱随蛋白质浓度的改变产生变化，发光纳米材料能够实现对蛋白质的检测。发光纳米材料可实现蛋白质浓度的线性检测，并可于PBS和DMEM溶液中进行蛋白质检测，具有直接检测生物样本的能力。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种发光纳米材料及其制备方法和在蛋白质检测中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
现有的蛋白质检测技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光、质谱等检测方法，都具有包括繁琐的程序，低重复性，和有限的活体成像应用等一定的局限性。稀土掺杂的上转换纳米粒子能吸收两个或多个低能激发光子并转换为高能发射光子，直接由红外光产生可见和红外区域的上转换发射。稀土掺杂的上转换纳米粒子毒性低、发光强度高、光稳定性好、Stokes位移大；且因其激发光为红外光，可以有效避免生物样品自发荧光干扰，从而降低检测背景。但是稀土掺杂的上转换纳米粒子的共振能量转移却存在能量转移效率低的问题，通常上转换纳米粒子的尺寸往往大于10nm，荧光强度较弱，检测灵敏度低。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种发光纳米材料及其制备方法和在蛋白质检测中的应用。本发明提供的发光纳米材料通过激发产生发光光谱，且发光光谱随蛋白质浓度的改变产生变化，发光纳米材料能够实现对蛋白质的检测。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供给了一种发光纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、将四氟硼酸亚硝与Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒混合反应，再与聚乙烯亚胺混合反应，得到表面修饰有氨基和亚甲基的纳米颗粒；
S2、表面修饰有氨基和亚甲基的纳米颗粒与被1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化的抗体进行混合反应，得到表面连接抗体的纳米颗粒；
S3、将表面连接抗体的纳米颗粒与氧化石墨烯混合反应，得到发光纳米材料。
优选的，所述Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
S1-1、将镱盐、铒盐、钇盐、乙酸钠、油酸、油胺与1-十八烯在惰性气氛条件下加热混合反应获得混合反应液，将CsF的甲醇溶液滴入混合反应液，加热移除甲醇后进行溶剂热反应，纯化得到Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒，将Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒分散于环己烷中形成含有Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒的溶液备用；
S1-2、将钇盐、乙酸钠、油酸、油胺与1-十八烯在惰性气氛条件下加热混合反应获得混合反应液，将含有Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒的溶液加入到混合反应液中加热移除环己烷，再加入CsF的甲醇溶液，加热移除甲醇后进行溶剂热反应，纯化得到Cs2NaYF6:Yb3+,Er3 +@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒。
进一步优选的，步骤S1-1中：所述钇盐包括C6H9O6Y·4H2O，所述镱盐包括C6H17O10Yb·4H2O，所述铒盐包括Er(OOCCH3)3·4H2O，钇盐、镱盐、铒盐和乙酸钠的摩尔比为(94~72):(5~25):(1~3):100，油酸、油胺和1-十八烯的体积比为1:1:(1.8~2)，CsF与乙酸钠的摩尔比为(9.9~10.1):1。
进一步优选的，步骤S1-2中：所述钇盐包括C6H9O6Y·4H2O，钇盐、乙酸钠和CsF的摩尔比为1:1:(9.9~10.1)；
步骤S1-1中使用的乙酸钠和步骤S1-2中使用的乙酸钠的摩尔比为1:1。
进一步优选的，步骤S1-1和步骤S1-2中：加热混合反应的温度为115~125 ℃，加热混合反应至形成浅黄色透明的混合反应液；溶剂热反应的温度为320~340 ℃，时间为0.5~2h；所述纯化具体为加入乙醇后离心。
优选的，步骤S1中，Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒与四氟硼酸亚硝和聚乙烯亚胺的摩尔比为1:(3.3~3.5):(0.0076~0.0084)。
优选的，步骤S2中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺和抗体的质量比为(2~3):1:1，纳米颗粒与抗体的摩尔比为1:(0.0116~0.0119)。
优选的，步骤S3中，纳米颗粒与氧化石墨烯的摩尔比为1:(0.06~0.72)，纳米颗粒与氧化石墨烯的混合反应时间为0~240 min，不包括0。
第二方面，本发明提供了一种发光纳米材料，通过如第一方面所述的制备方法获得。
第三方面，本发明提供了如第二方面所述的发光纳米材料在蛋白质检测中的应用，其特征在于，所述蛋白质检测包括以下步骤：
将如第二方面所述的发光纳米材料与蛋白质混合，使用波长为980nm激光光源作为激发光，检测548nm左右的峰值数据，根据发光强度与蛋白质浓度的关系得到蛋白质浓度。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
1.本发明提供的发光纳米材料在980nm激发波长下光强度随蛋白质浓度的升高有明显升高，能够实现蛋白质浓度的检测。
2.本发明提供的发光纳米材料在具有较小的粒径和较高的荧光发射强度，仅需添加少量进行混合即可实现检测，能够有效减少工业检测流程。
3.本发明提供的发光纳米材料制备工艺简单、成本低廉，有利于工业化大规模生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的透射电镜(TEM)图；
图2为本发明实施例1制备的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的X-射线衍射（XRD）图；
图3为本发明实施例1制备的C@C-PEI,C@C-PEI-Ab和C@C-PEI-Ab-GO的傅里叶红外光谱（FTIR）图；
图4为本发明实施例1制备的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的发射光谱以及GO的吸收光谱；
图5为对GO的吸收光谱进行积分的积分值随GO浓度的变化；
图6为实施例2中C@C-PEI-Ab-GO的发光强度随与GO的反应时间的变化；
图7为实施例3中C@C-PEI-Ab-GO的淬灭效率随GO浓度的变化；
图8为包含了C@C-PEI-Ab和C@C-PEI-Ab-GO的发射光谱以及C@C-PEI-Ab与GO混合溶液的发射光谱；
图9为实施例3中不同GO浓度的C@C-PEI-Ab-GO的吸收光谱；
图10为实施例4中C@C-PEI-Ab-GO与蛋白质作用之后的发光强度随蛋白质浓度的变化；
图11为实施例4中C@C-PEI-Ab-GO与蛋白质作用之后的发光强度随作用时间的变化；
图12为实施例4中在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中C@C-PEI-Ab-GO与蛋白质作用之后的发光强度随蛋白质浓度的变化；
图13为实施例4在DMEM中C@C-PEI-Ab-GO与蛋白质作用之后的发光强度随蛋白质浓度的变化。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的制备
核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备：
（1）在三口烧瓶中加入C6H9O6Y·4H2O (0.42 mmol)、C6H17O10Yb·4H2O (0.075mmol)、Er(OOCCH3)3·4H2O (0.005 mmol)、C2H3O2Na·3H2O (0.5 mmol)再加入8 mL油酸，8mL油胺，15 mL十八烯，然后此溶液在氮气保护下加热到120 ℃，直到形成浅黄色透明溶液。随后溶液自然冷却至室温；
（2）取5 mmol CSF溶解于5 mL甲醇溶液，将此溶液加入上述溶液，加热混合溶液至70 ℃并保持30分钟，移除甲醇；
（3）将上述溶液在密闭环境中氮气保护下加热到320 ℃并保持1 h。随后溶液自然冷却到室温；
（4）在反应后的溶液中加入过量乙醇（40 mL），10000 r/min×10 min离心得到Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒，并分散于10 mL环己烷。
核壳结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6的制备：
（1）在三口烧瓶中加入C6H9O6Y·4H2O (0.5 mmol)、C2H3O2Na·3H2O (0.5mmol)再加入8 mL油酸，8 mL油胺，15 mL十八烯，然后此溶液在氮气保护下加热到120 ℃，直到形成浅黄色透明溶液。随后溶液自然冷却至室温；
（2）将上述合成的分散于10 mL环己烷的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+加入上述溶液，加热混合溶液至70 ℃并保持30分钟，移除环己烷；
（3）取5 mmol CsF溶解于5 mL甲醇，将此溶液加入上述溶液，加热混合溶液至70℃并保持30分钟，移除甲醇；
（4）将上述溶液在密闭环境中氮气保护下加热到330 ℃并保持1 h。随后溶液自然冷却到室温；
（5）在反应后的溶液中加入过量乙醇（40 mL），10000 r/min×10 min离心得到Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒（记为C@C），并分散于10mL环己烷。
Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的表面修饰并连接Ab和GO：
（1）在试管中加入6 mL环己烷，10 mL N-N-二甲基甲酰胺（DMF）和200 mg NOBF4，搅拌10 min;
（2）加入5 mL分散于环己烷的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6，搅拌30 min，12000r/min×10 min离心，将沉淀分散于5 mL DMF；
（3）在试管中加入100 mg聚乙烯亚胺（PEI），10mL DMF和上述沉淀分散于DMF形成的溶液，搅拌过夜，12000r/min×10min离心，水洗一次，分散于20mL水，即得C@C-PEI；
（4）将50 mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），20 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于15mL水，加入20 mg抗体（Ab），搅拌2h进行活化；
（5）在步骤（4）活化后得到的额溶液中加入10 mL分散于水的C@C-PEI，搅拌过夜，12000 r/min×15 min离心，水洗一次，分散于20 mL水，即得C@C-PEI-Ab；
（6）取10 mL分散于水的C@C-PEI-Ab，加入3 mL氧化石墨烯溶液（GO，浓度为90 μg/mL），搅拌240 min，12000r/min×15min离心，水洗两次，分散于20mL水，即得C@C-PEI-Ab-GO。
图1为1制备的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的透射电镜(TEM)图，标尺为20nm，表现为六边形状，Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@Cs2NaYF6纳米颗粒尺寸分别为20nm左右和25nm左右。
图2为制备的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的X-射线衍射（XRD）图，纳米颗粒的XRD图与标准卡片（JSPDF#20-1214）完全一致，表明制备的纳米颗粒是纯相且没有任何杂质。
图3为C@C-PEI，C@C-PEI-Ab，C@C-PEI-Ab-GO的傅里叶红外光谱（FTIR）图，其中显示-CH2的伸缩振动（峰位于2958、2854 cm-1处）和-NH2的伸缩振动（峰位于1415cm-1处），表明C@C已被PEI有效包裹；在1655和1543cm-1处的峰与酰胺键的弯曲振动相关，表明Ab已成功加载到C@C-PEI上。1238cm-1处的峰为C-O（环氧基）的伸缩振动峰，1068 cm-1处的峰为C-O（烷氧基）的伸缩振动峰，表明GO已成功加载到C@C-PEI-Ab上。
图4为制备的Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+和Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6纳米颗粒的发射光谱图和GO的吸收光谱图，Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6的发光强度明显高于Cs2NaYF6:Yb3 +,Er3+,且在其发射峰所处波长548nm处GO存在吸收，表明GO可以对Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@Cs2NaYF6的发光产生淬灭作用。
图5为对GO的吸收光谱进行积分的积分值随GO浓度的变化，随着GO浓度的增加其吸收强度呈线性增加，表明GO浓度越高其对发光强度的抑制效果就越强。
实施例2
与实施例1不同的是，将C@C-PEI-Ab与氧化石墨烯溶液的搅拌混合时间分别调整为0、30、60、90、120、150、180、210、240、270 min，检测得到的C@C-PEI-Ab-GO的发光强度，如图6所示，随着GO培养时间的增加其发光强度逐渐减小，当培养时间达到240 min后其发光强度几乎不再随着培养时间发射改变，表明最佳的氧化石墨烯混合时间为240 min。
实施例3
与实施例1不同的是，将氧化石墨烯溶液的浓度调整为0、15、30、45、60、90、105、120、150、180、450 μg/mL，得到C@C-PEI-Ab-GO。
比较C@C-PEI-Ab和不同GO浓度得到的C@C-PEI-Ab-GO的淬灭效率，如图7所示，随着GO浓度（0、15、30、45、60、90、105、120、150、180 μg/mL）的增加其淬灭效率逐渐增加，当GO浓度达到90 μg/mL后其淬灭效率趋于饱和，表明GO最佳浓度为90 μg/mL。
比较C@C-PEI-Ab和C@C-PEI-Ab-GO的发射光谱以及C@C-PEI-Ab与GO混合溶液（3mL，90 μg/mL）的发射光谱，如图8所示，通过连接方式加入的GO明显对C@C-PEI-Ab-GO的发光强度具有淬灭作用，而单纯将C@C-PEI-Ab与GO混合则几乎没有淬灭作用。
图9为不同GO浓度制备得到的C@C-PEI-Ab-GO的吸收光谱，随GO浓度（15、45、150、450 μg/mL）增加C@C-PEI-Ab-GO的吸收强度逐渐增加，表明GO浓度越高其对C@C-PEI-Ab-GO的光强度的抑制效果就越强。
实施例4
实施例1发光纳米材料（C@C-PEI-Ab-GO）进行蛋白质检测：
（1）从上述分散于20mL水的C@C-PEI-Ab-GO中取9份1mL溶液，分别加入1mL的蛋白质PBS溶液，浓度分别为33.61pg/mL，65.04 pg/mL，94.5 pg/mL，122.14 pg/mL，148.15 pg/mL，254 pg/mL，336 pg/mL，417 pg/mL，496 pg/mL，摇晃2h进行反应；
（2）使用荧光光谱仪对样品进行发光性能检测，所用激光光源波长为980nm，选取548nm左右的峰值数据制作发光强度随蛋白质浓度变化的图，如图10所示，随着蛋白质浓度的增加其发光强度呈线性增加，表明蛋白质浓度越多脱离GO层的C@C-PEI-Ab就越多；
（3）取9份1mL分散于水的C@C-PEI-Ab-GO，都加入496pg/mL的蛋白质水溶液，并分别反应0min，30min，60min，90min，120min，150min，180min，210min，240min；
（4）使用荧光光谱仪对样品进行发光性能检测，所用激光光源波长为980nm，选取548nm左右的峰值数据制作发光强度随与蛋白质反应时间变化的图，如图11所示，随着与蛋白质作用时间的增加其发光强度逐渐增加，表明与蛋白质作用时间越长脱离GO层的C@C-PEI-Ab就越多；
（5）将C@C-PEI-Ab-GO加入含有不同浓度蛋白质的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中进行检测，如图12所示，随着蛋白质浓度的增加发光强度同样呈线性增加，表明在PBS溶液中该发光纳米材料同样能够进行蛋白质检测；
（6）将C@C-PEI-Ab-GO加入含有不同浓度蛋白质的DMEM中进行检测，如图13所示，随着蛋白质浓度的增加发光强度同样呈线性增加，表明在DMEM溶液中该发光纳米材料同样能够进行蛋白质检测。
基于本实施例，C@C-PEI-Ab-GO可实现蛋白质浓度的线性检测，并可于PBS和DMEM溶液中进行蛋白质检测，具有直接检测生物样本的能力。
实施例5
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中，步骤（1）在三口烧瓶中加入C6H9O6Y·4H2O (0.49 mmol)、C6H17O10Yb·4H2O (0.005 mmol)、Er(OOCCH3)3·4H2O(0.005 mmol)、C2H3O2Na·3H2O (0.5 mmol)再加入8 mL油酸，8 mL油胺，15 mL十八烯。
实施例6
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中，步骤（1）在三口烧瓶中加入C6H9O6Y·4H2O (0.36 mmol)、C6H17O10Yb·4H2O (0.125 mmol)、Er(OOCCH3)3·4H2O(0.015 mmol)、C2H3O2Na·3H2O (0.5 mmol)再加入8 mL油酸，8 mL油胺，15 mL十八烯。
实施例7
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中，步骤（1）在三口烧瓶中加入C6H9O6Y·4H2O (0.42 mmol)、C6H17O10Yb·4H2O (0.075 mmol)、Er(OOCCH3)3·4H2O(0.005 mmol)、C2H3O2Na·3H2O (0.5 mmol)再加入8 mL油酸，8 mL油胺，16 mL十八烯。
实施例8
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中步骤（1）中加热至115 ℃。
实施例9
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中步骤（1）中加热至125 ℃。
实施例10
与实施例1不同的是，核壳结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6的制备过程中步骤（1）中加热至115 ℃。
实施例11
与实施例1不同的是，核壳结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6的制备过程中步骤（1）中加热至125 ℃。
实施例12
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中步骤（3）中加热到320 ℃并保持2 h。
实施例13
与实施例1不同的是，核结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+的制备过程中步骤（3）中加热到340 ℃并保持0.5 h。
实施例14
与实施例1不同的是，核壳结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6的制备过程中步骤（3）中加热到320 ℃并保持2 h。
实施例15
与实施例1不同的是，核壳结构Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6的制备过程中步骤（3）中加热到340 ℃并保持0.5 h。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种发光纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将四氟硼酸亚硝与Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒混合反应，再与聚乙烯亚胺混合反应，得到表面修饰有氨基和亚甲基的纳米颗粒；
S2、表面修饰有氨基和亚甲基的纳米颗粒与被1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化的抗体进行混合反应，得到表面连接抗体的纳米颗粒；
S3、将表面连接抗体的纳米颗粒与氧化石墨烯混合反应，得到发光纳米材料;
所述Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
S1-1、将镱盐、铒盐、钇盐、乙酸钠、油酸、油胺与1-十八烯在惰性气氛条件下加热混合反应获得混合反应液，将CsF的甲醇溶液滴入混合反应液，加热移除甲醇后进行溶剂热反应，纯化得到Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒，将Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒分散于环己烷中形成含有Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒的溶液备用；
S1-2、将钇盐、乙酸钠、油酸、油胺与1-十八烯在惰性气氛条件下加热混合反应获得混合反应液，将含有Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+纳米颗粒的溶液加入到混合反应液中加热移除环己烷，再加入CsF的甲醇溶液，加热移除甲醇后进行溶剂热反应，纯化得到Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@Cs2NaYF6核壳纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-1中：所述钇盐包括C6H9O6Y·4H2O，所述镱盐包括C6H17O10Yb·4H2O，所述铒盐包括Er(OOCCH3)3·4H2O，钇盐、镱盐、铒盐和乙酸钠的摩尔比为(94~72):(5~25):(1~3):100，油酸、油胺和1-十八烯的体积比为1:1:(1.8~2)，CsF与乙酸钠的摩尔比为(9.9~10.1):1。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-2中：所述钇盐包括C6H9O6Y·4H2O，钇盐、乙酸钠和CsF的摩尔比为1:1:(9.9~10.1)；
步骤S1-1中使用的乙酸钠和步骤S1-2中使用的乙酸钠的摩尔比为1:1。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-1和步骤S1-2中：加热混合反应的温度为115~125 ℃，加热混合反应至形成浅黄色透明的混合反应液；溶剂热反应的温度为320~340 ℃，时间为0.5~2 h；所述纯化具体为加入乙醇后离心。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，Cs2NaYF6:Yb3+,Er3+@ Cs2NaYF6核壳纳米颗粒与四氟硼酸亚硝和聚乙烯亚胺的摩尔比为1:(3.3~3.5):(0.0076~0.0084)。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(2~3):1:1，纳米颗粒与抗体的摩尔比为1:(0.0116~0.0119)。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，纳米颗粒与氧化石墨烯的摩尔比为1:(0.06~0.72)，纳米颗粒与氧化石墨烯的混合反应时间为0~240 min，不包括0。
8.一种发光纳米材料，其特征在于，通过如权利要求1-7所述的制备方法获得。
9.如权利要求8所述的发光纳米材料在非疾病诊断和治疗目的的蛋白质检测中的应用，其特征在于，所述蛋白质检测包括以下步骤：
将如权利要求8所述的发光纳米材料与蛋白质混合，使用波长为980nm激光光源作为激发光，检测548nm左右的峰值数据，根据发光强度与蛋白质浓度的关系得到蛋白质浓度。
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