CN117586425A - 一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原,涉及生物医药技术领域。本发明的颗粒抗原能够维持稳定的融合前构象,并保留了诱导中和抗体的表位,稳定性高且免疫原性强。
Description
技术领域
本申请属于生物医药工程领域,特别涉及一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原及其制备方法和在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
背景技术
呼吸道病毒感染是全球最重要的公共卫生负担之一,每年导致全世界数百万人住院治疗。呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是2岁以下儿童和65岁以上成人急性下呼吸道感染的主要原因。尽管RSV感染引起的呼吸道疾病危害严重,但目前尚无专门针对RSV的有效治疗方法和预防性疫苗。纵观全球进入临床阶段的RSV疫苗,研发的主要方向集中在减毒活疫苗、重组亚单位疫苗和病毒载体疫苗。RSV疫苗开发主要针对3种目标人群,包括婴幼儿、孕妇和老年人(≥60岁)。年龄小于6个月的婴儿,主要通过mAbs实现被动免疫保护,或由孕妇接种RSV疫苗后经胎盘转移抗体来获得被动保护;对于年龄大于6个月的婴幼儿则可以通过主动免疫RSV减毒活疫苗来获得保护;针对孕妇和老年人,RSV疫苗的开发以亚单位疫苗为主。
主流疫苗抗原的选择主要集中在F蛋白,尤其是融合前构象的F蛋白(PreF)。融合前构象的F蛋白相比融合后构象的F蛋白可以暴露更多具有中和活性的潜在表位,如仅在PreF中存在的表位Φ和表位V。针对表位Φ和表位V产生的抗体具有优秀的中和活性,与融合前构象的F蛋白结合后,可以阻断通过F蛋白构象变化介导的病毒膜融合。
尽管已有大量关于RSV F蛋白融合前构象稳定性的研究,但其作为疫苗使用的安全性和有效性仍面临巨大的挑战。因此,提供一种安全性高且具有增强的免疫原性和改善的稳定性的RSV PreF蛋白,以及包含其的疫苗成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)颗粒抗原及其制备方法和在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)颗粒抗原,所述颗粒抗原由N端到C端依次包括RSV F重组蛋白、三聚化结构域和颗粒化结构域。
RSV F蛋白由574个氨基酸组成其无活性前体(称为“F0”或“F0前体”),其含有N-末端的信号肽序列(氨基酸1-25)。翻译后,在内质网中通过信号肽酶移除信号肽。F0前体的剩余部分(残基26-574)可通过弗林蛋白酶在两个多基础位点(a.a. 109/110和136/137)进一步切割,移除名为pep27的27个氨基酸的间插序列(氨基酸110-136)且生成两个名为F1(C-末端部分;氨基酸137-574)和F2(N-末端部分;氨基酸26-109)的连接的片段。F1含有其N-末端的疏水融合肽和两个七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近融合肽,且HRB靠近跨膜结构域(TMD)。F1和F2片段通过两个二硫键连接在一起。无信号肽序列的未切割的F0蛋白或F1-F2异二聚体可形成RSV F原体。三个此类原体组装以形成最终RSV F蛋白复合物,其为三个原体的同三聚体。
在本发明中,所述RSV F重组蛋白从N端至C端依次包含RSV F蛋白的F1截短片段和F2截短片段。
本发明中的所述RSV F重组蛋白为融合前构象,并包含诱导中和抗体的表位(例如表位Φ和表位V)。
在一些实施方式中,F2包含与SEQ ID NO:1的氨基酸26-105对应的RSV F蛋白多肽,F1包含与SEQ ID NO:1的氨基酸137-516对应的RSV F蛋白多肽。
在一些实施方式中,所述F1截短片段至少包含对应于野生型RSV F蛋白的第146-306位氨基酸残基,所述F2截短片段至少包含对应于野生型RSV F蛋白的第51-104位氨基酸残基。
在一些实施方式中,所述三聚化结构域为foldon、GCN4或MTQ,优选为GCN4。
在一些实施方式中,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施方式中,所述RSV F重组蛋白进一步包含选自以下的突变:一对或多对非天然二硫键突变、空腔填充突变以及天然存在的取代。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述非天然二硫键突变选自S55C+L188C、I148C+Y286C、H159C+I291C和K75C+E218C中的至少一组或任意组合。
在一些优选的实施例中,所述非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述空腔填充突变包括V296F、N67F、L158F、V154L、V154I、V187F、S190V、V192M、L193H、S190F、V207L、K77E、V56I、E60F、E82Y、G139W、K168W、Q202Y、V207F、T219F、V220W和L230F中的至少一个或任意组合。
在一些优选的实施例中,所述空腔填充突变为V296F、N67F和S190V的组合。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述天然存在的取代包括P102A、I379V、M447V和E218A中的至少一个或任意组合。
在一些优选的实施例中,所述天然存在的取代为P102A。
在一些实施方式中,所述RSV F重组蛋白进一步包含静电突变。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述静电突变包括K80E、E92D、G184N、V185N、K201Q、K209Q和S35F中的至少一个或任意组合。
在一些优选的实施例中,所述静电突变为G184N。
在一些实施方式中,所述RSV F重组蛋白、三聚化结构域和颗粒化结构域直接相连或通过接头序列连接,所述接头序列为GGGSSGS、GSGSG或G与S组成的4-10个氨基酸序列。
在一些实施方式中,F1截短片段和F2截短片段直接相连或通过接头序列连接,所述接头序列为GGGSSGS、GSGSG、GGPG或G与S组成的4-10个氨基酸序列。
本发明公开的颗粒抗原包含表达所需要的信号肽序列或者与纯化标签相连接的接头序列,这些信号肽序列或者与纯化标签相连接的接头序列可以在最终产物中除去。
在一些实施方式中,所述颗粒抗原包含表达所需要的异源信号肽。
在一些实施方式中,所述异源信号肽是IgG信号肽,氨基酸序列为MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO: 2)。
在一些实施方式中,所述颗粒抗原在载体构建时还引入了便于后续纯化的亲和标签,如strep tag(氨基酸序列:WSHPQFEK)、Monoclonal Flag-Tag(氨基酸序列:DYKDDDDK)和His tag(氨基酸序列:HHHHHHHH),这些标签序列可以在最终产物中除去。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C、I148C+Y286C和K75C+E218C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合,空腔填充突变为N67F、S190V和V296F的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述静电突变为G184N,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C、I148C+Y286C、K75C+E218C和H159C+I291C的组合,空腔填充突变为N67F、S190V和V296F的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述静电突变为G184N,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施方式中,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为MTQ,所述颗粒化结构域为ferritin。
在一些实施例中,所述颗粒抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7-12所示,优选为SEQ ID NO:10。
另一方面,本发明还公开一种编码所述融合多肽的核酸。
又一方面,本发明还公开一种包含所述核酸的表达载体。
又一方面,本发明还公开一种包含所述表达载体的宿主细胞。
又一方面,本发明还公开一种融合多肽在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
又一方面,本发明还公开一种预防RSV感染的疫苗,包含本发明所述的融合多肽;所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
又一方面,本发明公开一种预防RSV感染的疫苗,进一步包含免疫佐剂,所述免疫佐剂包含铝佐剂、角鲨烯、生育酚、MPL、LPA、CpG、poly(I:C)以及QS-21中的至少一种。
又一方面,本发明还提供制备所述融合多肽的方法,包括如下步骤:
S1、合成所述融合多肽对应的DNA序列,并克隆到质粒载体中;
S2、用重组质粒载体转染宿主细胞、并进行表达,所述宿主细胞为真核细胞;
S3、对培养产物进行纯化,得到所述融合多肽。
在一些实施方式中,本发明所述疫苗通常还包含药学可接受载体和/或赋形剂诸如缓冲剂。药学可接受载体和赋形剂是公知的,并且可以由本领域技术人员进行选择。任选地,药学可接受载体或赋形剂还含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的成分。增溶剂/稳定剂的例子包括去污剂,例如月桂树肌氨酸和/或吐温。另有一些增溶剂/稳定剂的例子包括精氨酸、蔗糖、海藻糖等。因此,本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过选定的使用途径向受试者施用的配制剂。合适的赋形剂包括但不限于甘油、聚乙二醇、KCl、钙离子、镁离子、锰离子、锌离子和其他二价阳离子相关盐等。
通常在佐剂选择时应能够在接受疫苗施用的受试者或受试者群体中增强Th1偏向性免疫应答,且在受试者或受试者群体中是安全且有效的。
又一方面,本发明还提供制备上述预防RSV感染的疫苗的方法,其包括:
S1、培养哺乳动物宿主细胞以表达所述融合多肽;
S2、纯化经步骤(1)表达的融合多肽;
S3、将纯化的融合多肽与免疫佐剂按比例充分混合。
在一些实施方式中,还包括基因合成、表达载体的构建、纯化蛋白的冻干等额外步骤。可以通过本领域公知的许多方法的任一种或几种来从重组细胞培养物回收和纯化所表达的融合多肽,包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴/阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最后,可以在最终的纯化步骤中采用高效液相层析HPLC。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明通过对野生型RSV F蛋白(WT F蛋白)进行截短、重构、稳定化修饰和颗粒化,获得了重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原,其维持稳定的融合前构象并保留了诱导中和抗体的表位,同时确保了较强的免疫原性,可引起对RSV亚型A和B的有效中和抗体反应和结合抗体反应。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释,并不限定本发明的范围。其中:
图1:本发明实施例中F134蛋白的SDS-PAGE图。
图2:本发明实施例中F134蛋白的SEC-HPLC结果。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围,因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案,而非作为限制,本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明,本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述,但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明,均为常规方法或产品说明书所描述的方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
本发明公开的抗原或多肽可以包含起有助于纯化的作用的额外序列。例如多组氨酸标签、flag标签或颗粒化标签等。这些标签序列可以在最终产物中除去。本发明公开的抗原或多肽可以包含表达所所需要的信号肽序列或者与纯化标签相连接的linker序列,这些信号肽序列或者与纯化标签相连接的linker序列可以在最终产物中除去。
术语定义
在本申请中,术语“颗粒化结构域”或“颗粒标签”是指能够在多肽内促进多肽装配成多聚体的氨基酸序列。在本申请中,“ferritin”是指粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺旋杆菌铁蛋白。在本申请中,幽门螺旋杆菌铁蛋白具有单链结构。在本申请中,铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本申请中,“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。本申请中ferritin的序列如SEQ ID NO: 3所示。
在本申请中,术语“三聚化结构域”指能够在多肽内促进多肽装配成三聚体的氨基酸序列。三聚化的结构域例如:foldon、GCN4、MTQ。
在本申请中,术语“GCN4”是指酵母的转录激活因子GCN4,是一种通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质,本申请中GCN4的序列是IKRMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKIK(SEQ ID NO: 4)。
在本申请中,术语“MTQ”是一种三聚化模序,本申请中MTQ的序列是IKEEIAKIKEEQAKIKEKIAEIEKRIAEIEKRIAGGCC(SEQ ID NO: 5)。
在本申请中,术语“foldon”是指在噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的残基。在本发明中,foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基或突变体。在本申请中,foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。例如,可选地,其序列为PEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPA、AGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF、YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG或GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 6,本申请中foldon的序列),在本申请中,“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。
在本申请中,术语“DS-Cav1”是指RSV F蛋白的具有McLellan等人,Science, 342(6158), 592-598, 2013中所述的氨基酸序列的形式。
在本申请中,术语“D25”是指CN101778866B中所述的抗体,其具有重链CDR1:NYIIN,重链CDR2:GIIPVLGTVHYAPKFQG,重链CDR3:ETALVVSTTYLPHYFDN和轻链CDR1:QASQDIVNYLN,轻链CDR2:VASNLET,轻链CDR3:QQYDNLP的氨基酸序列。D25是RSV Pre-F融合前构象特异性单抗。
在本申请中,术语“101F”是指US20060159695A1中所述的抗体,其具有重链CDR1:TSGMGVS,重链CDR2:HIYWDDDKRYNPSLKS,重链CDR3:LYGFTYGFAY和轻链CDR1:RASQSVDYNGISYMH,轻链CDR2:AASNPES,轻链CDR3:QQIIEDPWT的氨基酸序列。
在本申请中,术语“Mota”或“motavizumab”是指WO2007002543A2中所述的抗体,其具有重链CDR1:TSGMSVG,重链CDR2:DIWWDDKKDYNPSLKS,重链CDR3:SMITNWYFDV和轻链CDR1:SASSRVGYMH,轻链CDR2:DTSKLAS,轻链CDR3:FQGSGYPFT的氨基酸序列。
实施例1. 单独突变的F蛋白设计
本发明的各突变体是基于SEQ ID NO: 1中所述的野生型(简称WT)RSV F蛋白氨基酸序列来设计和制备的。本实施例说明各种F蛋白单突变体的设计,所述F蛋白单突变体以三聚体的形式提供,包括foldon结构域(SEQ ID NO: 6)和引入的氨基酸突变,例如添加非天然二硫键突变、空腔填充突变、静电突变。这些F蛋白单突变体包含IgG信号肽(SEQ IDNO: 2)、两个单独多肽链。多肽链之一,F2多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸26-106,除了如所述的引入的突变。另一多肽链包含连接至foldon结构域N-端的F1多肽(残基136-513),除了如所述的引入的突变,它们通用引入的修饰还包括del_P27替换为ARGSGSG、R106Q和F137S。另外还包含纯化标签His-Tag(HHHHHHHH)、亲和标签Monoclonal Flag-Tag(DYKDDDDK)和接头序列(例如GSGSG)。SEQ ID NO: 1的信号肽(残基1-25)和pep27(残基110-136)在表达过程期间从F0前体切割。
按下表设计各个RSV F蛋白单独突变体及对照组蛋白的氨基酸酸序列,氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列并进行基因合成。
表1. 仅含添加非天然二硫键的突变体
表2. 仅含空腔填充突变的突变体
表3. 仅含静电突变的突变体
实施例2. 质粒转化、制备及酶切鉴定
将合成的目的基因插入真核质粒pCHO3.1载体,用于转染和表达。将构建的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,将转入含有目的基因的质粒的甘油菌转接到150mL LB液体培养基(Amp终浓度为100μg/ml)中,在37℃、2000rpm下摇床培养过夜,用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取,对提取物测定质粒浓度、并进行酶切鉴定,具体的反应体系如表4所示。
表4. 酶切反应体系
结果显示,各质粒均能获得较高的扩增浓度。用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果显示,在相应大小的位置可见清晰的条带。对所有质粒的进行测序,经鉴定,所有质粒目的基因序列完全正确。
综上可知,载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中,并已成功获得扩增。
实施例3. 蛋白表达
通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中,经过培养后收集蛋白上清液。
将ExpiCHO-S细胞(Thermo)在补充有6mM L-谷氨酰胺(sigma/G5146)的EmCD CHO-S 203(Eminence/L20301)培养基中培养,提前一天按0.25E5 cells/孔密度铺96孔板(补加10% FBS),37℃、8%CO2的培养箱中静置培养。转染当天将铺有细胞的96孔板更换新鲜的含L-谷氨酰胺的EmCD CHO-S 203培养基。用含L-谷氨酰胺的EmCD CHO-S 203培养基配制转染孵育体系(体积为转染体积的50%),其中DNA用量1μg/ml,转染试剂PEI(Polysciences/24765-1)与DNA的比为3,将PEI与DNA混合静置孵育5min后加入铺有细胞的96孔板中,将培养物于37℃、8%CO2的培养箱中静置培养。转染24h后降温至32℃培养,按5%体积比添加Advanced Feed1(sigma/24368-1L)补料。转染后第7天停止培养收取上清。
实施例4. 单独突变的F蛋白筛选
使用PBS稀释包被抗体D25或包被抗体motavizumab(简称mota),至5ng/μL,96孔板每孔加入200μL,4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2% BSA / PBS封闭ELISA检测板,室温封闭1小时,用PBST清洗1次。每孔加入200 μL蛋白上清液,室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2% BSA / PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度(D25-1:8000,mota-1:16000),每孔加入200 μL,室温孵育1小时。用PBST清洗4次。加入100 μL底物溶液(TMB双组份溶液A:B=1:1混合),室温反应15-20min,添加100μL终止液,并读数OD值,并根据回归分析方程计算样品浓度。计算蛋白在4℃条件下放置7天后的PreF构象占比,以D25与Mota的活性浓度比值表示。
表5. F蛋白单突变体4℃放置7天的PreF构象占比
蛋白上清液在4℃放置7天后,与DS-Cav1对照组相比,仅含添加非天然二硫键突变的F蛋白单突变体F24、F27、F30、F31、F32、F35、F38、F40、F41、F46、F53和F123,以及仅含空腔填充突变的F蛋白单突变体F58、F76、F79、F80、F81、F84、F85和F107仍具有较高的PreF构象占比。因此,在F蛋白单突变体的设计中,空腔填充突变N67F、L158F、V187F、S190V、V192M、V495L、S190F和E82Y,以及添加的非天然二硫键突变V164C+K293C、V151C+I288C、S55C+V188C、S56C+V187C、S59C+V193C、T397C+E487C、S443C+S466C、T323C+I475C、I332C+P480C、S146C+N460C、A149C+Y458C和S150C+Q302C,这些突变设计对PreF构象的稳定化做出了重要贡献。而仅含静电突变的F蛋白单突变体F91~F104并不能仅依靠此种突变方式在4℃的长时间贮存中达到良好的稳定PreF构象的效果。
实施例5. 组合突变颗粒抗原设计
在筛选中,发明人意外地发现,虽然一些组合突变颗粒抗原引入的均为经单独突变筛选出的有利于在4℃长期贮存中维持Pre-F构象稳定的突变,但它们在60℃高温条件下维持蛋白活性或Pre-F构象热稳定性方面却表现不佳。因此,在设计组合突变颗粒抗原时并不完全摒弃在单独突变筛选时欠佳的方案,并针对F1域和F2域包含的氨基酸残基、三聚化结构域和颗粒化结构域进行筛选。
按照下表进一步设计在RSV F重组蛋白中具有组合突变的颗粒抗原,组合突变颗粒抗原N端信号肽为IgG信号肽(SEQ ID NO:2),与IgG信号肽的C端相连的是组合突变的RSVF重组蛋白,其中F1域截短片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸146-306,F2域截短片段包含SEQID NO:1的氨基酸51-104,与RSV F重组蛋白的C端相连的三聚化结构域是GCN4或MTQ,与三聚化结构域的C端相连的是颗粒化结构域为ferritin,其中还加入了便于纯化的亲和标签。
氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列进行基因合成,经质粒转化、制备和酶切鉴定正确后通过CHO表达系统表达目的蛋白。
表6. 组合突变颗粒抗原设计
注:下划线表示各蛋白相对于F131的变化。
参照实施例2的方法进行质粒转化、制备及酶切鉴定,质粒扩增后测定浓度,各质粒均能获得较高的扩增浓度。对所有质粒的进行测序,经鉴定,所得质粒目的基因序列完全正确。载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中,并已成功获得扩增。
再参照实施例3的方法通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中,经过培养后收集蛋白上清液。图1为F134蛋白的SDS-PAGE图,图2为F134蛋白的SEC-HPLC结果。
实施例6. 组合突变颗粒蛋白上清中蛋白活性、构象占比及构象热稳定性评价
组合突变颗粒蛋白表达三天后,10000rpm离心收集表达的细胞上清,另取表达上清,在60℃和70℃条件下分别孵育1小时,再采用双抗体夹心ELISA法,以101F作为包被抗体,D25、motavizumab(后续简称Mota)或AM14作为标记抗体检测配对,检测表达的各组合突变颗粒蛋白的蛋白活性,在不同温度下孵育后不同结构的占比及Siteφ表位的构象热稳定性。其中,蛋白活性以表位特异性中和抗体检测活性浓度表示,不同结构占比以0d的D25或AM14与Mota的活性浓度比值表示,构象热稳定性以60℃-1h/0d、70℃-1h/0d的D25活性浓度比值表示,结果如下表所示。
表7. 不同温度条件的上清蛋白活性
注:“/”表示未检测到反应性或未测定
表8. 结构占比与构象热稳定性
注:“/”表示未检测到反应性或未测定
可以看出,组合突变颗粒抗原都能够正常表达,其中F134和F136表达的蛋白活性较高,F132和F133在F131的基础上分别增加了H159C+I291C和K75C+E218C突变,F135在F134的基础上同时增加了H159C+I291C和K75C+E218C突变,但D25浓度反而降低,Mota浓度变化不大或降低,仅AM14浓度有所提高,即蛋白活性并没有明显的提高,说明非天然二硫键突变S55C+L188C和I148C+Y286C的组合即可获得较好的蛋白活性。F134在F131的基础上增加了V296F和静电突变G184N,D25、Mota和AM14浓度提高70-140%,说明空腔突变组合N67F+S190V+V296F和静电突变G184N在提高蛋白活性方面有积极作用。F136将F131的三聚化结构域GCN4替换为MTQ,D25浓度变化不大,Mota和AM14浓度明显提高,说明三聚化结构域对蛋白活性有一定影响。
在不同结构占比方面,F131、F134和F135的D25占比较高,说明本发明提供的融合多肽呈融合前构象。其中,F132相对于F131的D25占比明显降低,AM14占比稍有提高,说明非天然二硫键突变S55C+L188C和I148C+Y286C的组合即可获得较多的融合前构象。F134与F131的D25和AM14占比相差不大,说明增加空腔突变V296F和静电突变G184N在改变融合前构象方面作用不明显。F136相对于F131的D25占比明显降低,但AM14占比有所提高。
在构象热稳定性方面,经60℃或70℃处理后,F132、F134和F135的D25占比较高,其中F134尤为突出。F132相对于F131的构象热稳定性有所提高,说明非天然二硫键突变H159C+I291C对改善构象热稳定性有积极作用。F134相对于F131的构象热稳定性显著提高,说明空腔突变组合N67F+S190V+V296F和静电突变G184N在提高构象热稳定性有非常明显的积极作用。F136相对于F131的构象热稳定性变化不明显,说明三聚化结构域对构象热稳定性影响不大。
可见,本发明的组合突变颗粒抗原具有较高的蛋白活性,呈融合前构象,且在极端温度条件下具有很高的构象热稳定性,尤其是F134在各方面表现俱佳。
实施例7. 免疫检测
选择6-8周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫,随机分组,每组6只,在0天、21天通过肌肉注射对小鼠进行疫苗双点免疫,左、右腿各50μL,候选抗原为F134,PBS为阴性对照组。抗原剂量为12μg/只小鼠。分别在第20天和第35天收集血清,采集的血清储存于-20℃,后续进行中和抗体和结合抗体检测。
7.1荧光斑点减少中和试验:
委托中科国邦(北京)检验检测有限公司进行荧光斑点减少中和试验。具体步骤为:
(1)样品准备:室温解冻样品,血清样品56℃热灭活30min,30min后取出并冷却至室温。
(2)样品加样及稀释:40倍初始稀释,后续4倍稀释,作6个稀释度。取96孔板,第2列做为细胞对照(CC),第3列做为病毒对照(VC)。于B4-B11孔中加入已稀释20倍的样品,使用多道移液器对B4-B11孔中液体轻柔的反复混匀,然后进行4倍比稀释,直至G4-G11孔中。另取阳性参考品和阴性参考品进行加样及稀释。
(3)病毒稀释:在冰盒上将RSV病毒稀释至800~1200FFU/孔,加入除细胞对照外的各孔。
(4)将上述96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1h。
(5)将HEp-2细胞消化计数,使用完全培养基调整至2.0×105个/mL,100 µL/孔加入到96孔板中。
(6)置于37℃、5%CO2培养箱中培养,24-28小时后用细胞成像多功能微孔板检测系统进行GFP荧光斑点计数,并记录结果。
(7)50%中和抗体抑制率(ND50)的计算:将仪器读取的荧光斑点数值输入数据分析模板,使用Reed-Muench法计算样品50%中和抗体抑制率(ND50)。
结果如表9所示。可以看出,免疫3周后,未检测到明显的中和抗体,免疫5周后,相对于阴性对照组,在添加AS01佐剂的情况下,F134能够诱导产生较高的中和抗体。
表9. 中和抗体滴度
7.2结合抗体检测:
(1)待检血清样本使用样本稀释液稀释;
(2)阳性对照血清使用样品稀释液1:10000倍稀释,阴性对照血清使用样品稀释液1:200倍稀释;
(3)加样:将系列稀释的待测血清样本、阴性对照血清、阳性对照血清和空白对照溶液(样品稀释液作为空白对照)以100μl/孔加至pre-F酶标板中,待测血清样本加1孔,对照溶液加2孔;IgG-UNLB标曲酶标板条以100μl/孔加入样品稀释液;
(4)温育:酶标板置于37℃温育30分钟,于自动洗板机用洗涤液洗板5次;
(5)加酶:将酶标二抗(HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L),ABclonal)以100μl/孔加至酶标板内,置于37℃温育30分钟,于自动洗板机用洗涤液洗板5次;
(6)显色:显色A液与显色B液(飞净生物)等体积混匀,100μl/孔加至酶标板内,于室温避光孵育15分钟;
(7)终止:以50μl/孔加入终止液终止反应;
(8)读板:用酶标仪在波长450nm处测定吸光度(参比波长为620nm),结果如下表。
表10. (3周血清)Pre-F特异性IgG含量(μg/ml)
表11. (5周血清)Pre-F特异性IgG含量(μg/ml)
使用颗粒抗原F134免疫3周后,诱导产生的PreF-IgG GMC(几何平均浓度)明显高于对照组,而且在加入佐剂后在保持这种优势的同时更是使几何平均浓度提高至未加佐剂时的58倍(73.32/1.26)。免疫5周后,F134诱导产生了更多的PreF-IgG,在加入佐剂后,PreF-IgG GMC可提高至第3周的27倍(1979.17/73.32)。
由上述实验可以看出,本发明提供的疫苗组合物可诱导产生针对RSV病毒的高滴度的中和抗体,这也提示在病毒入侵时疫苗将提供较好的保护性效果,对RSV候选疫苗的研发具有重要意义。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (27)
1.一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)颗粒抗原,其特征在于,所述颗粒抗原由N端到C端依次包括RSV F重组蛋白、三聚化结构域和颗粒化结构域,其中,所述RSV F重组蛋白从N端至C端依次包含RSV F蛋白的F1截短片段和F2截短片段,所述RSV F重组蛋白包含选自以下的突变:一对或多对非天然二硫键突变、空腔填充突变以及天然存在的取代,所述RSV F重组蛋白为融合前构象,并包含诱导中和抗体的表位。
2.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述F1截短片段至少包含对应于野生型RSV F蛋白的第146-306位氨基酸残基,所述F2截短片段至少包含对应于野生型RSV F蛋白的第51-104位氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述三聚化结构域为foldon、GCN4或MTQ。
4.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述颗粒化结构域为ferritin。
5.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述非天然二硫键突变选自S55C+L188C、I148C+Y286C、H159C+I291C和K75C+E218C中的至少一组或任意组合。
6.如权利要求5所述的颗粒抗原,其特征在于,所述非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合。
7.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述空腔填充突变包括V296F、N67F、L158F、V154L、V154I、V187F、S190V、V192M、L193H、S190F、V207L、K77E、V56I、E60F、E82Y、G139W、K168W、Q202Y、V207F、T219F、V220W和L230F中的至少一个或任意组合。
8.如权利要求7所述的颗粒抗原,其特征在于,所述空腔填充突变为V296F、N67F和S190V的组合。
9.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述天然存在的取代包括P102A、I379V、M447V和E218A中的至少一个或任意组合。
10.如权利要求9所述的颗粒抗原,其特征在于,所述天然存在的取代为P102A。
11.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述RSV F重组蛋白还包括静电突变。
12.如权利要求11所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述静电突变包括K80E、E92D、G184N、V185N、K201Q、K209Q和S35F中的至少一个或任意组合,优选为G184N。
13.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述RSV F重组蛋白、三聚化结构域和颗粒化结构域直接相连或通过接头序列连接,F1截短片段和F2截短片段直接相连或通过接头序列连接。
14.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述颗粒抗原包含表达所需要的异源信号肽。
15.如权利要求14所述的颗粒抗原,其特征在于,所述异源信号肽是SEQ ID NO: 2所示的IgG信号肽。
16.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
17.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
18.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C、I148C+Y286C和K75C+E218C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
19.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合,空腔填充突变为N67F、S190V和V296F的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述静电突变为G184N,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
20.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C、I148C+Y286C、K75C+E218C和H159C+I291C的组合,空腔填充突变为N67F、S190V和V296F的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述静电突变为G184N,所述三聚化结构域为GCN4,所述颗粒化结构域为ferritin。
21.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,相对于SEQ ID NO: 1中所示的野生型RSV F蛋白序列,所述RSV F重组蛋白包含的非天然二硫键突变为S55C+L188C和I148C+Y286C的组合,空腔填充突变为N67F和S190V的组合,所述天然存在的取代为P102A,所述三聚化结构域为MTQ,所述颗粒化结构域为ferritin。
22.如权利要求1所述的颗粒抗原,其特征在于,所述颗粒抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO: 7-12所示。
23.编码如权利要求1-22所述颗粒抗原的核酸。
24.包含权利要求23所述核酸的表达载体。
25.包含权利要求24所述表达载体的宿主细胞。
26.权利要求1-22中任一项所述的颗粒抗原在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
27.一种预防RSV感染的疫苗,其特征在于,包含权利要求1-22中任一项的颗粒抗原;所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
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