CN117568405A - 一种溶瘤腺病毒重组载体、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种溶瘤腺病毒重组载体、构建方法及其应用，涉及医学基因工程技术领域，所述溶瘤腺病毒重组载体是人类5型腺病毒基因，其E1A区缺失第920nt‑946nt区域，所述第920nt‑946nt区域的序列如SEQ ID NO：1所示，所述人类5型腺病毒基因的E3区缺失位于ADP基因的第29483nt‑29721nt区域，并在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点。通过使用BJ5183同源重组技术和体外无缝克隆技术结合获得。本发明通过调整人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5，简称Ad5)E3区域删除片段区域不同，增加了tBid表达量，进一步增强新型条件复制性腺病毒载体KD01杀伤效应。
Description
技术领域
本发明涉及医学基因工程技术领域，具体涉及一种溶瘤腺病毒重组载体、构建方法及其应用。
背景技术
癌症可利用手术、激素疗法、化学疗法、放射疗法和/或其它疗法来治疗，但在许多情况下，通常特征在于晚期的癌症不能用现有疗法来治愈。因此，需要新型癌细胞靶向方法，例如基因疗法。基因治疗(gene therapy)是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。作为基因治疗载体，溶瘤病毒治疗恶性肿瘤的发展前景良好。在众多溶瘤病毒疗法的载体中，重组腺病毒载体是应用最为广泛的，其临床可行性和安全性已获公认。
腺病毒(adenovirus)是一种非整合无包膜的双链DNA病毒，基因组大小约30-38kb，是一种直径为80-110nm的病毒颗粒，衣壳呈廿面体，由240个六邻体和12个五邻体组成。腺病毒载体是目前为止应用最广泛的溶瘤病毒产品，我国的P53腺病毒注射液今又生()是世界第一个获批临床应用的基因治疗药物。据统计，已开展临床试验的溶瘤病毒产品中腺病毒载体占比41.9％。
野生型人腺病毒在人类正常细胞和肿瘤细胞内均可复制，E1A和E1B是启动Ad复制的关键基因，其编码的蛋白质可分别与宿主细胞内抑癌基因Rb或p53的产物结合，消除细胞抑制病毒增殖的作用。敲除了E1A部分基因片段的溶瘤腺病毒在p53基因缺乏或异常的肿瘤中可以特异性复制，并产生复制依赖性细胞毒作用特异性杀伤癌细胞，而对正常人体细胞无明显的细胞毒作用。其腺病毒E1A与细胞内Rb基因结合促进宿主细胞进入细胞周期，腺病毒伴随宿主细胞复制而复制，在非复制细胞中，视网膜细胞瘤蛋白(pRB)可以结合基因调节蛋白E2F，从而抑制细胞增值。腺病毒E1A蛋白的CR2区域也与pRB相互作用，E2F得到释放并使病毒复制。腺病毒E1A CR2的缺失阻止了E1A与pRB的结合，病毒不能在正常细胞中释放E2F，也不会复制。在pRB突变或失调的肿瘤细胞中，E2F不再受pRB的负调控，可以激活病毒基因转录从而复制。本申请人前期工作证实E1A缺失27bp(Ad5920-946nt)可以在肿瘤细胞内条件复制和促进溶瘤腺病毒对肿瘤杀伤效应，详见专利CN 114317463A-一种携带TMTP1和tBid的溶瘤腺病毒重组体、其构建方法及应用。
腺病毒感染细胞后期腺病毒死亡蛋白(adenovirus death protein，ADP)使宿主细胞裂解进而释放成熟的子代腺病毒，释放的子代病毒进一步感染其它细胞。研究表明ADP缺失的载体可增加感染细胞内病毒载量达1000倍，感染的细胞如病毒工厂一样释放大量子代病毒，增强体内抗肿瘤效应。经典途径的细胞凋亡由BCL-2家族介导的线粒体外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)及半胱天冬蛋白酶caspase的活化所触发。MOMP引起包括细胞色素c在内的多种促凋亡因子自线粒体膜间隙释放进入细胞质；释放出的细胞色素c起始并参与凋亡小体的组装，随后活化caspase-9并进而激活效应caspase；效应caspase靶向并剪切一系列胞内蛋白质，最终引发细胞凋亡，这一系列的级连放大反应引发不可逆的凋亡，是内源性凋亡途径的终末环节，因而BAK和BAX被称为“效应器”；最后一类蛋白只含有BCL-2同源区域3(BH3-only)，包括BIM，BID。它们一方面可以与“抑制剂”结合，间接促进凋亡进程，另一方面直接激活“效应器”，促使其寡聚化。线粒体凋亡途径被激活后BID被剪切为P15、P13和P11片段，其中P15片段为其活性形式激活下游凋亡通路。tBid不仅通过BAX和BAD促进细胞线粒体凋亡，也可单独促进细胞线粒体凋亡途径；前期研究已证实将tBid和BIM分别插入腺病毒E3区，仅tBid插入腺病毒发挥作为其促进肿瘤细胞线粒体凋亡。多项研究证明tBid蛋白可通过线粒体引燃(mito-priming)使肿瘤细胞MOMP，进而导致肿瘤细胞的凋亡。
E3的基因表达产物病毒基因组的复制无关，其主要功能是破坏宿主的免疫防御机制。E3基因的另一表达产物gp 19K蛋白可以在内质网上与MHC I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，以延缓MHC I的表达；E3基因还可以表达RIDa&β以及14.7Kd蛋白，这些蛋白可以抑制由TNF诱发的细胞凋亡，促进Fas降解，下调TNF受体水平。E3基因的产物之一为ADP，又称11.6Kd，ADP可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒颗粒；E3区基因包括gp19k、ADP、E3B等多个基因均共用一个表达框，其共用同一个启动子和polyA尾。研究表明，删除E3区某个基因插入外源基因可用于外源基因的表达，从而达到嵌入外源基因溶瘤腺病毒产品，但其外源基因插入的位置对于腺病毒E3区其他基因表达是否有影响和外源基因的表达量是否有影响是溶瘤腺病毒产品改造的关键所在。
腺病毒载体构建技术需要解决的问题包括：(1)构建过程简单易操作；(2)腺病毒基因组稳定性好，无明显腺病毒基因组碱基突变；(3)无野生型腺病毒污染。腺病毒载体构建技术迭代更新较快，最初的技术为体外连接法，这种方法需要将全长腺病毒基因组和一个含腺病毒基因组左末端序列的质粒，包括左端反向末端重复、包装信号和e1a的增强子序列。将得到的含目的基因的的基因组DNA直接转染包装细胞293，产生重组病毒颗粒。该构建技术需要培养野生型腺病毒以提取病毒基因组，仅能使用ClaI酶切位点，连接效率极低，可操作区域仅限E1区，而且野生型腺病毒污染概率高，目前已不适用溶瘤腺病毒的构建，已被淘汰。第二代技术使用真核细胞293细胞内同源重组，该技术需要骨架质粒和穿梭载体共转染腺病毒包装细胞293，该方法曾经被广泛使用，推动了腺病毒载体的发展。由于细胞内重组效率低，某些重组事件还可能产生可复制病毒(rcv)，必需经过噬斑纯化才能获得正确的克隆化的重组病毒，费时费力，正逐渐被其他方法替代。第三代腺病毒载体构建方案使用BJ5183细菌内同源重组的方法，该同源重组技术要点包括包含同源重组臂的目的基因片段和特异性酶切后的腺病毒骨架质粒，该技术优势为同源重组质粒发生在BJ5183，单克隆挑选和鉴定为细菌单克隆，方法简单易操作，且转染293细胞不存在野生型复制性病毒污染。第四代腺病毒载体构建技术使用无缝克隆技术包括NEB家的Gibson Assembly和NEBuilderHiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等，该技术需要目的基因插入位置特异性酶切位点，该技术简单方便，但需要特异性酶切位点，由于腺病毒载体酶切位点有限，仅仅使用无缝克隆技术构建腺病毒载体有限。
发明内容
本发明的目的在于提出一种溶瘤腺病毒重组载体(名称为KD01)、构建方法及其应用，通过调整人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5，简称Ad5)E3区域删除片段区域不同而增加tBid表达量，进一步增强新型条件复制性腺病毒载体KD01杀伤效应，用于肿瘤治疗。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种溶瘤腺病毒重组载体，所述溶瘤腺病毒重组载体是人类5型腺病毒基因，其E1A区缺失第920nt-946nt区域，所述第920nt-946nt区域的序列如SEQ ID NO：1所示，所述人类5型腺病毒基因的E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，并在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点。
本发明为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种溶瘤腺病毒重组载体，所述溶瘤腺病毒重组载体是人类5型腺病毒基因，其E1A区缺失第920nt-946nt区域，所述第920nt-946nt区域的序列如SEQ ID NO：1所示，其特征在于，所述人类5型腺病毒基因的E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，并在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点。
本发明的有益效果是：本发明通过在人类5型腺病毒基因的E1A区缺失第920nt-946nt区域，在使灭活E1a蛋白的Rb结合特性的同时，达到尽可能保留E1a转录激活特性的效果，达到条件复制性腺病毒；同时通过在人类5型腺病毒基因的E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，且构成缺失区插入如SEQ ID NO：2所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列，来增加tBid表达量，进一步增强新型条件复制性腺病毒载体KD01杀伤效应，用于肿瘤治疗。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
本发明的第二个目的是提供一种溶瘤腺病毒重组载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成E1/Δ27bp基因，所述E1/Δ27bp基因为人类5型腺病毒基因，其E1A缺失第920nt-946nt区域，再将合成的所述E1/Δ27bp基因与Pshuttle-CMV双酶切后的产物利用无缝克隆连接技术，构建获得Pshuttle-E1/△27bp；
(2)利用BJ5183同源重组技术将构建获得的所述Pshuttle-E1/Δ27bp与Padeasy-1共转染在BJ5183内进行同源重组，获得Pad-E1/Δ27bp；
(3)合成E3/delADP/tBid，所述E3/delADP/tBid为人类5型腺病毒基因的，其E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，且在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点(对应ad526342-31142nt，并缺失ADP区域29483-29721)；
(4)将获得的所述Pad-E1/Δ27bp与合成的所述E3/delADP/tBid共转染BJ5183进行同源重组，获得Pad-E1A/△27bp-E3/delADP/tBid；
(5)将获得的所述Pad-E1A/Δ27bp-E3/delADP/tBid利用ClaI酶切纯化转染293细胞，获得溶瘤腺病毒重组载体。
其中通过PacI酶切KD01质粒后进行纯化，再转染293细胞最终获得KD01腺病毒溶瘤产品。
采用上述方案的有益效果是：本发明腺病毒载体构建方案使用BJ5183同源重组技术和体外无缝克隆技术结合方案获得溶瘤腺病毒重组载体(KD01)，实现溶瘤腺病毒重组载体KD01构建简单易操作，无野生型腺病毒污染等优势。且通过调整人类5型腺病毒E3区域删除片段区域不同，而增加tBid表达量，进一步增强新型条件复制性腺病毒载体KD01杀伤效应，用于肿瘤治疗。
进一步，步骤(1)中，取E1/del，并对E1/del进行PCR扩增合成所述E1/Δ27bp基因，对E1/del进行PCR扩增的PCR引物为Pxc1-147和Pxc1-3897，所述Pxc1-147的核苷酸的序列如SEQ ID NO：3所示，所述Pxc1-3897的核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步，步骤(1)中，所述无缝克隆连接技术在NEBuider HiFi DNA Assemblymaster Mix试剂盒中进行。
进一步，步骤(3)包括以下具体步骤：
(3-1)通过Peasy-blunt-Ad5-E3-delADP质粒和PENTER-Bid质粒构建获得Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid；
(3-2)以构建获得的所述Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid为模板，采用M13F和M13R为引物进行PCR扩增，获得E3/delADP/tBid。
进一步，步骤(3)包括以下具体步骤：
(3-1)通过Peasy-blunt-Ad5-E3-delADP质粒和PENTER-Bid质粒构建获得Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid；
(3-11)骨架质粒Peasy-blunt-Ad5-E3-delADP进行ClaI酶切，回收酶切产物；
(3-12)取PENTER-Bid质粒进行PCR获得tBid目的片段；
(3-13)应用NEBuider HiFi DNA Assembly master Mix试剂盒将3-11)和3-12)产物体外连接；
(3-14)连接产物转化T1感受态，挑取克隆测序鉴定，命名为Peasy-Blunt-E3/delADP/tBid(对应ad5 26342-31142nt，并缺失ADP区域29483-29721)。
(3-2)以构建获得的所述Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid为模板，采用M13F和M13R为引物进行PCR扩增，获得E3/delADP/tBid。
进一步，所述M13R的核苷酸的序列如SEQ ID NO：11所示，所述M13R的核苷酸的序列如SEQ ID NO：12所示。
进一步，步骤(3)中，取PENTER-Bid质粒进行PCR扩增获得线粒体凋亡肽tBid，对PENTER-Bid质粒进行PCR的引物为tBid-ADP-F和tBid-ADP-R，所述tBid-ADP-F的核苷酸的序列如SEQ ID NO：5所示，所述tBid-ADP-R的核苷酸的序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明的第三个目的是提供一种溶瘤腺病毒重组载体的应用，如上述所述的溶瘤腺病毒重组载体在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
采用上述方案的有益效果是：本发明通过调整人类5型腺病毒E3区域删除片段区域不同得到增加tBid表达量的溶瘤腺病毒重组载体KD01，进一步增强新型条件复制性腺病毒载体KD01杀伤效应，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
进一步，所述治疗恶性肿瘤药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂或控释剂。
所述治疗恶性肿瘤药物为药学上可接受的任意剂型均可。所述治疗恶性肿瘤药物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
进一步，所述恶性肿瘤包括肺癌、肝癌、人恶性黑色素瘤或卵巢癌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明KD01载体设计图；
图2为本发明KD01载体图谱；
图3为本发明KD01载体的构建图I；
图4为本发明KD01载体的构建图II；
图5为本发明KD01载体、M0载体及M6载体的设计对照图；
图6为本发明tBid表达RT-PCR检测对照图；
图7为本发明western Blot检测外源基因tBid表达对照图；
图8为本发明cck-8测量细胞存活率对照图；
图9为本发明肺癌皮下瘤体积变化对照图；
图10为本发明肝癌皮下瘤体积变化对照图；
图11为本发明原位转移瘤模型中肿瘤体积对照图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
质粒和感受态的来源说明：
表1质粒名称及来源
表2所需要的感受态及来源
| 感受态名称 | 来源 | 货号 |
| BJ5183 | 上海唯地生物技术有限公司 | CAT：DL1076S |
| BJ5183-AD-1 | 上海唯地生物技术有限公司 | CAT：DL1075S |
| T1感受态 | 北京全式金生物技术有限公司 | CAT：CD501 |
实施例1：溶瘤腺病毒重组载体KD01的构建
本实施例涉及一种溶瘤腺病毒重组载体(如图1-5所示)的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成E1/Δ27bp基因，所述E1/Δ27bp基因为人类5型腺病毒基因，其E1A缺失第920nt-946nt区域，再将合成的所述E1/Δ27bp基因与Pshuttle-CMV双酶切后的产物利用无缝克隆连接技术，构建获得Pshuttle-E1/△27bp；
其包括如下具体的步骤(如图3)：
1-1：凯德维斯委托金唯智公司基因合成E1/del(Ad5920-946nt)基因(E1含有人类5型腺病毒的104-4001nt序列，缺失了人类5型腺病毒对应的920-946区域，参考文献：Zhou，J.，et al.，Novel oncolytic adenovirus selectively targets tumor-associatedpolo-1ike kinase 1and tumor cell viability.Clin Cancer Res，2005.11(23)：p.8431-40.)，使用如下表3所示的引物PCR获得目的片段E1/Δ27bp(对应Ad5 147-3897nt，缺失Ad5 920-946nt)；
表3 E1/Δ27bp对应的引物
| 引物名称 | 序列 | 序列号 |
| Pxc1-147 | TAAGCGACGGATGTGGCAAAAGT | SEQ ID NO：3 |
| Pxc1-3897 | CCAACAGCTGCTGAGAAACGACA | SEQ ID NO：4 |
1-2：将Pshuttle-CMV质粒进行双酶切(MfeI和BsrGI)，回收酶切后产物；
1-3：使用NEBuider HiFi DNA Assembly master Mix试剂盒(Cat：E2621S)体外连接上述1-2)的酶切后产物和1-1)E1/Δ27bp，反应体系如下表4；
表4构建Pshuttle-E1/Δ27bp的反应体系
| Pshuttle-CMV(MfeI和BsrGI)酶切后产物 | 50ng |
| E1/del(Ad5 920-926nt)PCR产物 | 50ng |
| NEBuider HiFi DNA Assembly master Mix | 10ul |
| DdH20 | To 20ul |
| 反应条件和时间 | 50℃ 15分钟 |
1-4：连接产物转化T1感受态，挑取克隆测序鉴定，挑单克隆，得到Pshuttle-E1/Δ27bp；
(2)利用BJ5183同源重组技术将构建获得的所述Pshuttle-E1/Δ27bp与Padeasy-1共转染在BJ5183内进行同源重组，获得Pad-E1/Δ27bp；
2-1：Pshuttle-E1/Δ27线性化：PmeI酶切Pshuttle-E1/Δ27，纯化其酶切后产物；
2-2：将(1)产物钙转入BJ5183-AD-1感受态，其内携带Padeasy-1质粒，具体步骤严格按照说明书执行(Luo，J.，et al.，A protocol for rapid generation of recombinantadenoviruses using the AdEasy system.Nat Protoc，2007.2(5)：p.1236-47.)，分别对同源重组后质粒继续质粒大小、PCR和测序进行鉴定；
2-3：鉴定正确的质粒转入感受态T1中，并进行挑菌、摇菌、质粒提取、PCR测序鉴定获取Pad-E1/Δ27；
2-4：体外连接获得E3区穿梭载体Peasy-Blunt-E3/delADP/tBid：
(3)合成E3/delADP/tBid，所述E3/delADP/tBid为人类5型腺病毒基因，其E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，并在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点(如图4)；
3-1：构建Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid
3-11：骨架质粒Peasy-blunt-Ad5-E3-delADP进行ClaI酶切，回收酶切产物；
3-12：取PENTER-Bid质粒进行PCR获得tBid目的片段，PCR引物设计如下表5；
表5 tBid的PCR引物
3-13：应用NEBuider HiFi DNA Assembly master Mix试剂盒将3-11)和3-12)产物体外连接；
3-14：连接产物转化T1感受态，挑取克隆测序鉴定，命名为Peasy-Blunt-E3/delADP/tBid(对应ad5 26342-31142nt，并缺失ADP区域29483-29721)。
3-2：以Peasy-Blunt-E3/delADP/tBid为模板，M13F和M13R引物(如表6)PCR获取E3-delADP/tBid产物。
表6 tBid的PCR引物
| 引物名称 | 序列 | 序列号 |
| M13F | CATGGACCGTAGCATCCCTC | SEQ ID NO：11 |
| M13R | TCTCTAGGGTAGGCCTGCAG | SEQ ID NO：12 |
(4)将获得的所述Pad-E1/Δ27bp与合成的所述E3/delADP/tBid共转染BJ5183进行同源重组，获得Pad-E1A/Δ27bp-E3/delADP/tBid；
4-1：Pad-E1/△27线性化：SpeI酶切Pshuttle-E1/△27，纯化其酶切后产物；
4-2：将4-1产物和3-2产物同时钙转入BJ5183感受态，分别对同源重组后质粒继续质粒大小、PCR和测序进行鉴定；
4-3：鉴定正确的质粒转入感受态T1中，并进行挑菌、摇菌、质粒提取、PCR测序鉴定获取Pad-E1/△27--E3/delADP/tBid；
(5)利用ClaI酶切位点和体外连接方式，获得溶瘤腺病毒重组载体(KD01)；PacI酶切KD01质粒后纯化，转染293细胞最终获得KD01腺病毒溶瘤产品。
实施例2：溶瘤腺病毒重组载体M0的构建
与实施例1相比，本实施例构建的溶瘤腺病毒重组载体M0(如图5)，除了在E3区位于ADP基因缺失第29483nt-29721nt区域构成的缺失区不插入如SEQ ID NO：22所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列外，其余与实施例1相同。
实施例3：溶瘤腺病毒重组载体M6的构建
与实施例1相比，本实施例构建的溶瘤腺病毒重组载体M6(如图5)，除了在E3区位于ADP基因缺失第29223nt-29630nt区域构成缺失区且插入如SEQ ID NO：22所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列外，其余与实施例1相同。
实施例4：溶瘤腺病毒重组体的治疗效应的鉴定
1、tBid表达检测
1.1 RT-PCR检测E3区插入基因tBid的mRNA表达水平
第一天将1×105的A549细胞和HEPG2细胞(均购买于ATCC)接种入一12孔板中，24小时将纯化的M0、M6和KD01(实施例1-3制备的得到的M0、M6和KD01)病毒分别以1moi的病毒量加入A375细胞系，24和48小时后收取细胞渣进行mRMA提取、逆转录和RT-PCR检测(如表7)，结果如图6。
表7 RT-PCR检测的引物
| 引物名称 | 序列 | 序列号 |
| tBid-qF | CATGGACCGTAGCATCCCTC | SEQ ID NO：7 |
| tBid-qR | TCTCTAGGGTAGGCCTGCAG | SEQ ID NO：8 |
| GAPDH-F | GGTTGCCAAACCTTATCAGAAATG | SEQ ID NO：9 |
| GAPDH-R | TTCACCTGTTCCACAGCCTTG | SEQ ID NO：10 |
由图6可知，在1moi腺病毒(M0、M6和KD01)感染两株细胞系后，48h后检测tBidmRNA水平，结果显示KD01在两株细胞中(A549和HepG2)的tBid mRNA水平表达水平明显高于M6。
1.2 western Blot检测外源基因tBid表达
第一天将1×105的A549和HEPG2细胞接种入一12孔板中，24小时将纯化的M0、M6和KD01病毒分别以1moi的病毒量加入A375细胞系，72小时后收取细胞渣，蛋白裂解液裂解细胞后，常规western blot检测tBid表达量，使用抗体bid(cat：8762)购买自Cell SignalingTechnology公司；结果如图7。
由图7可知，1moi的KD01感染A549细胞和HepG2细胞72小时后检测在tBid蛋白水平明显高于M6。
1.3 cck-8测量细胞存活率
在96孔培养板中种入5×103个肿瘤细胞(分别为A375、A549、ES-2及HEPG2)其中A375购买于ATCC，ES-2购买于ATCC，培养液为10％FBSDMEM或RIPM1640，到第二天大约70％细胞融合，吸取液体，将MOI对应的新型溶瘤腺病毒数量用细胞对应的培养基稀释至100μl后加入培养孔中，轻轻晃动液体三次，在37℃、5％CO2的培养箱中孵育72h后，加入cck-8测量细胞存活率，结果如图8。
由图8可知，在A375、A549、ES-2及HEPG2四株细胞系中，KD01对上述细胞的杀伤效应均强于M6，tBid的高表达增强了其杀伤效应。
2、体内实验评估KD01、M6和M0溶瘤病毒重组体对肿瘤组织杀伤效应
2.1肺癌皮下瘤动物模型：
4-6周大小BALB/c nu裸鼠(购买于购买于鼠来宝(武汉)生物科技有限公司)，单侧腋窝脂肪垫下种植2×106A549肿瘤细胞，四周后，待肿瘤黄豆大小，将小鼠分为四组(n＝6)，六组分别为：PBS组，M0组、M6组和KD01组，各组连续肿瘤内注射腺病毒1×108PFU，隔一天一次，共注射四次。从肿瘤种植后开始，每三天测量肿瘤体积，肿瘤体积变化如图9所示。
由图9可知，在A549荷瘤模型中，KD01抑瘤效应与M6和M0抑瘤效应相比均较好。
2.2肝癌皮下瘤动物模型：
4-6周大小BALB/c nu裸鼠，单侧腋窝脂肪垫下种植1×106HEPG2细胞，四周后，待肿瘤黄豆大小，将小鼠分为四组(n＝6)，六组分别为：PBS组，M0组、M6组和KD01组，各组连续肿瘤内注射腺病毒1×108PFU，隔一天一次，共注射四次。从肿瘤种植后开始，每三天测量肿瘤体积，肿瘤体积变化如图10所示。
由图10可知，在HepG2荷瘤模型中，KD01抑瘤效应与M6和M0抑瘤效应相比均较好。
2.3原位转移瘤模型中肿瘤体积
建立肺癌皮下瘤模型，如上述2.1所述，不再重复的叙述，将1×109pfu个KD01病毒瘤内注射入A549模型中，隔天一针，共三次，1个月后观察其各个器官，结果如下图11。
由图11可知，在高剂量KD01(1x109/只)注射后包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏均未出现明显肉眼外观变化，毒副作用较小。
综上可知，本发明通过调整人类5型腺病毒E3区域删除片段区域不同而增加tBid表达量，进一步增强新型条件复制性腺病毒载体KD01杀伤效应，用于肿瘤治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种溶瘤腺病毒重组载体，所述溶瘤腺病毒重组载体是人类5型腺病毒基因，其E1A区缺失第920nt-946nt区域，所述第920nt-946nt区域的序列如SEQ ID NO：1所示，其特征在于，所述人类5型腺病毒基因的E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，并在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示的线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点。
2.一种如权利要求1所述溶瘤腺病毒重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成E1/Δ27bp基因，所述E1/Δ27bp基因为人类5型腺病毒基因，其E1A缺失第920nt-946nt区域，再将合成的所述E1/Δ27bp基因与Pshuttle-CMV双酶切后的产物利用无缝克隆连接技术，构建获得Pshuttle-E1/Δ27bp；
(2)利用BJ5183同源重组技术将构建获得的所述Pshuttle-E1/Δ27bp与Padeasy-1共转染在BJ5183内进行同源重组，获得Pad-E1/Δ27bp；
(3)合成E3/delADP/tBid，所述E3/delADP/tBid为人类5型腺病毒基因，其E3区缺失位于ADP基因的第29483nt-29721nt区域，并在缺失区域插入如SEQ ID NO：2所示线粒体凋亡肽tBid的基因序列并引入ClaI酶切位点；
(4)将获得的所述Pad-E1/Δ27bp与合成的所述E3/delADP/tBid共转染BJ5183进行同源重组，获得Pad-E1A/Δ27bp-E3/delADP/tBid；
(5)将获得的所述Pad-E1A/Δ27bp-E3/delADP/tBid利用PacI酶切纯化转染293细胞，获得溶瘤腺病毒重组载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，取E1/del，并对El/del进行PCR扩增合成所述E1/Δ27bp基因，对El/del进行PCR扩增的PCR引物为Pxc1-147和Pxc1-3897，所述Pxc1-147的核苷酸的序列如SEQ ID NO：3所示，所述Pxc1-3897的核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无缝克隆连接技术在NEBuider HiFi DNA Assembly master Mix试剂盒中进行。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)包括以下具体步骤：
(3-1)通过Peasy-blunt-Ad5-E3-delADP质粒和PENTER-Bid质粒构建获得Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid；
(3-2)以构建获得的所述Peasy-Blunt-Ad5-E3/delADP/tBid为模板，采用M13F和M13R为引物进行PCR扩增，获得E3/delADP/tBid。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述M13R的核苷酸的序列如SEQ IDNO：11所示，所述M13R的核苷酸的序列如SEQ ID NO：12所示。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，取PENTER-Bid质粒进行PCR扩增获得线粒体凋亡肽tBid，对PENTER-Bid质粒进行PCR的引物为tBid-ADP-F和tBid-ADP-R，所述tBid-ADP-F的核苷酸的序列如SEQ ID NO∶5所示，所述tBid-ADP-R的核苷酸的序列如SEQ ID NO：6所示。
8.一种如权利要求1所述溶瘤腺病毒重组载体的应用，其特征在于，所述溶瘤腺病毒重组载体在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述一种溶瘤腺病毒重组载体的应用，其特征在于，所述治疗恶性肿瘤药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂或控释剂。
10.根据权利要求8所述一种溶瘤腺病毒重组载体的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括肺癌、肝癌、人恶性黑色素瘤或卵巢癌。
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