CN117567434A - 靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向CBFβ‑SMMHC蛋白的PROTAC类化合物及其制备方法与应用。本降解剂以CRBN配体作为E3泛素连接酶配体部分，通过不同长度的烷基侧链连接CBFβ‑SMMHC蛋白的配体，合成一系列目标产物PROTAC(靶向诱导蛋白降解联合体)分子。本发明化合物可以有效降解CBFβ‑SMMHC蛋白，从而抑制M4Eo型急性髓系白血病细胞的增殖。本发明化合物可用于制备治疗急性髓系白血病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种造血细胞分化受阻并异常增殖而导致的恶性血液肿瘤，具有高侵袭性和异质性。AML的诱因包括基因突变、缺失或染色体易位等。染色体易位导致基因发生重排，两个基因部分融合表达，异常产生的融合蛋白扰乱细胞正常的生理功能，并使造血细胞发生恶性转化。16号染色体倒置或易位可以产生的CBFβ-SMMHC融合基因，涉及的基因是核心结合因子B(Core binding factor B,CBFβ)和光滑肌球蛋白重链(Smooth muscle myosin heavy chain,SMMHC)。CBFβ-SMMHC是诱发M4Eo型白血病的主要原因，该蛋白包含CBFβN端的165个氨基酸和SMMHC的C端部分。
CBFβ-SMMHC型白血病每年新发病例约占同期AML病人的10％，由于该类白血病的分子病理机制尚未明确，现今临床治疗缺乏有效的靶向药物，主要依赖于阿糖胞苷和柔红霉素联合化疗，该治疗策略在年轻患者中五年生存率约为45-65％，然而60岁以上的老年患者的五年生存率仅约20％。同时CBFβ-SMMHC型白血病具有高复发率，青年患者3年复发率约为29％，老年患者3年复发率高达55％。因此，对CBFβ-SMMHC型白血病的深入研究以及探索更有效的靶向治疗策略势在必行，具有重要的科学意义和临床意义。
近年来，靶向蛋白降解的PROTAC技术的发展，为疾病的治疗提供了新的思路，不同于传统的小分子抑制剂通过结合靶蛋白的活性位点抑制靶蛋白的功能，PROTAC可与靶蛋白特异结合诱导靶蛋白降解，从而达到疾病治疗的目的。PROTAC由识别靶标蛋白的小分子配体、中间连接链和E3泛素连接酶配体三部分组成。这种双功能分子可以同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶，从而诱导靶蛋白通过蛋白酶体途径降解。相比于传统小分子抑制剂，PROTAC发挥功能所需的浓度更低，特异性更好。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明首要目的是提供一种靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物。
本发明的第二目的是提供靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物的制备方法。
本发明的第三目的是提供靶向CBFβ-SMMHC蛋白的在治疗急性髓系白血病方面的应用。所述的PROTAC类化合物能够有效降解CBFβ-SMMHC蛋白，进而抑制白血病细胞增殖，可以作为新的治疗急性髓系白血病药物进行开发，具有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供的PROTAC类化合物具有如下的结构通式如下：
通式中，E3连接酶是具有泛素化功能的由VHL(希佩尔-林道，von Hippel-Lindau)或CRBN(Cereblon)基因等编码的蛋白酶小分子，其配体具体表现为(VHL配体)、/>(带甲基VHL配体)、/>(泊马度胺)、(4-羟基沙利度胺)和/>(来那度胺)。Linker为连接基团，表示-亚烷基、-烷氧基和-杂环基，其中所述-亚烷基、-烷氧基或杂环基可选自以下基团中一或多种直链或带有支链的亚烷基、烷氧基或杂环基，如-(CH2)n-、-(CH2)nCO-、-NR1(CH2)nCO-、-NR2(CH2)n-、-(OCH2CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2OCH2)n-、-(CH2CH2OCH2)n-、-(CH2CH2OCH2CH2)n-、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂芳烃基或它们的任意组合，其中n表示1至20的自然数，R1、R2各自独立的选择H或者为C1-10烷基。
本发明提供的靶向CBFβ-SMMHC融合蛋白的PROTAC类化合物包括但不限于如下表1所示的化合物：
表1：靶向降解CBFβ-SMMHC融合蛋白的PROTAC类化合物(概览)
第二方面，提供靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物的制备方法，包括：
通式(I)所示靶向降解CBFβ-SMMHC融合蛋白的PROTAC类化合物的制备方法，将上述通式(I)所示的靶向降解CBFβ-SMMHC融合蛋白的PROTAC类化合物分为系列I：CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物，系列II：CRBN配体衍生物，系列III：PROTAC类化合物的合成路线。
其中，系列I中CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物所示的化合物，Linker为n＝1-20的-亚烷基。系列II中为CRBN配体衍生物，Linker为n＝1-20的-亚烷基。系列III中PROTAC类化合物的合成路线，为通式(I)所示化合物，Linker为n＝1-20的-亚烷基，E3 ligand为上述VHL配体、带甲基VHL配体、泊马度胺、来那度胺或4-羟基沙利度胺。
系列I中CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物的制备方法包括：
5-羟基吡啶醛与溴乙酸叔丁基酯在碳酸钾条件下于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中反应，得到化合物3后，与2-硝基-4-(三氟甲氧基)苯胺在5mol/LNaS2O4的乙醇溶液中在70℃下反应4h，得到化合物5。化合物5在TFA(三氟乙酸)的条件下于DCM(二氯甲烷)溶液中，室温反应1h，得到化合物6，再在HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，DIPEA(二异丙基乙胺)的条件下于DMF溶液中发生缩合反应，得到11d-e。
a Reagents and conditions：(a)K2CO3,DMF,rt,12h；(b)5mol/L NaS2O4,EtOH,70℃,4h.(c)TFA,DCM,rt,1h；(d)HATU,DIPEA,DMF,rt,4h.
系列I CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物的合成路线如图1所示；
系列II中CRBN配体衍生物的制备方法包括：
来那度胺与溴乙酸叔丁酯在碳酸钾条件下于DMF中反应，得到化合物8后，在TFA的条件下于DCM中，室温反应1h，得到化合物9，再与不同链长的叔丁基氨基甲酸酯在HATU和DIPEA的条件下于DMF溶液中发生缩合反应，得到11a-c。
aReagents and conditions：(a)K2CO3,DMF,rt,12h；(c)TFA,DCM,rt,1h；(d)HATU,DIPEA,DMF,rt,4h.
系列II CRBN配体衍生物的合成路线如图2所示；
系列III中PROTAC类化合物的制备方法包括：CBFβ-SMMHC抑制剂与不同链长的烷基链的CRBN配体衍生物，或者不同链长的CBFβ-SMMHC抑制剂与CRBN配体衍生物，在HATU、DIPEA条件下于DMF中反应，得到系列ⅡI PROTAC类化合物。
aReagents and conditions：(d)HATU,DIPEA,DMF,rt,4h.
系列III PROTAC类化合物的合成路线如图3所示；
第三方面，提供上述任意一种靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物在制备CBFβ-SMMHC蛋白降解剂中的应用。
第四方面，提供上述任意一种靶向降解CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。治疗急性髓系白血病的药用化合物，包含上述CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物或其药理或生理上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。PROTAC类化合物或其药理或生理上可接受的盐作为CBFβ-SMMHC降解剂。
相较于现有技术，本发明的优点及有益效果如下：
本发明提供了靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物合成方法，通过不同长度侧链连接CBFβ蛋白配体和CRBN配体，合成了一系列的目标PROTAC类化合物。所述的化合物能够有效降解CBFβ-SMMHC蛋白，从而抑制白血病细胞增殖，可以作为新的治疗急性髓系白血病药物进行开发，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明系列I CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物的合成路线图。
图2为本发明系列II CRBN配体衍生物的合成路线图。
图3为本发明系列III PROTAC类化合物的合成路线图。
图4为本发明免疫印迹实验检测PROTAC类化合物对CBFβ-SMMHC蛋白的降解。
图5为本发明流式细胞实验检测PROTAC类化合物对CBFβ-SMMHC蛋白的降解。
图6为本发明PROTAC类化合物对白血病细胞增殖的影响。
具体实施方式
为了阐明本发明实施的目的、技术方案和优势，结合以下实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：2-((6-甲酰吡啶-3-基)氧基)乙酸叔丁酯(3)的制备：
分别称取5-羟基吡啶醛2(1.0equiv.)和K2CO3(2.0equiv.)置于100毫升单口瓶中，用DMF溶解，搅拌10分钟左右，加入2-溴乙酸叔丁酯1(1.1equiv.)室温下反应过夜。反应完全后，加水淬灭，并用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化得到化合物3。得到淡黄色固体，产率为75％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.00(s,1H),8.45(s,1H),7.97(d,J＝8.6Hz,1H),7.28(d,J＝4.7Hz,1H),4.67(s,2H),1.50(s,9H).
实施例2：2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸叔丁酯(5)的制备：
分别称取2-硝基-4-(三氟甲氧基)苯胺3(1.0equiv.)和2-((6-甲酰吡啶-3-基)氧基)乙酸叔丁酯4(1.0equiv.)置于100毫升单口瓶中，乙醇溶解，再加入5mol/L的Na2S2O4溶液，70℃下回流4小时TLC监测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化得到化合物，得到淡黄色固体5，产率为67％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.03(s,1H),8.38(d,J＝8.8Hz,1H),8.33(d,J＝2.8Hz,1H),7.74(d,J＝36.4Hz,1H),7.34(dd,J＝8.7,2.9Hz,1H),7.21–7.14(m,1H),4.65(s,2H),1.51(s,9H).
实施例3：2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸(6)的制备：
称取2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸叔丁酯5(1.0equiv.)置于50毫升的单口瓶中，加入1mL的三氟乙酸，室温下反应1h，TLC监测，反应完全后用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化。得到黄色固体6，产率为95％。
酰胺缩合的一般程序(11a-c)：
2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)，将不同侧链的叔丁基氨基甲酸酯10a-c和HATU(3.0equiv.)溶解在干燥的2mL DMF中，然后在室温下搅拌10min，最后加入DIPEA(1.2equiv.)于室温下反应3-4h。TLC检测11a-c完全反应后，用乙酸乙酯和水提取残留物三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，150：1-10：1)纯化粗产物11a-c。黄色固体，产率69-85％。
实施例4：(4-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(11a)的制备：
称取化合物2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)，将叔丁基(4-氨基丁基)氨基甲酸酯10a和HATU(3.0equiv.)溶解在干燥的2mLDMF中，然后在室温下搅拌10min，最后加入DIPEA(1.2equiv.)于室温下反应3-4h。TLC监测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化。得黄色固体11a，产率为69％，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.39(s,1H),7.73(t,J＝7.9Hz,1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.23(d,J＝8.3Hz,1H),4.96(s,1H),4.64(q,J＝14.1Hz,2H),3.19(s,1H),3.09(d,J＝6.4Hz,2H),2.80(dd,J＝24.5,12.6Hz,2H),1.51(d,J＝7.1Hz,4H),1.40(s,9H).
实施例5：(6-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺基)己基)氨基甲酸叔丁酯(11b)的制备：
称取化合物2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)，将叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯10b和HATU(3.0equiv.)溶解在干燥的2mLDMF中，然后在室温下搅拌10min，最后加入DIPEA(1.2equiv.)于室温下反应3-4h。TLC监测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化。得黄色固体11b，产率为74％，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.37(s,1H),7.73(t,J＝7.9Hz,1H),7.55–7.43(m,2H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),5.05–4.93(m,1H),4.79(s,1H),4.63(s,2H),3.45–3.27(m,2H),3.07(s,2H),2.92–2.74(m,2H),2.26(d,J＝94.5Hz,2H),1.60–1.53(m,9H),1.35-1.24(m,6H).
实施例6：(8-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(11c)的制备：
称取化合物2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)，将叔丁基(8-氨基辛基)氨基甲酸酯10c和HATU(3.0equiv.)溶解在干燥的2mLDMF中，然后在室温下搅拌10min，最后加入DIPEA(1.2equiv.)于室温下反应3-4h。TLC监测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化。得黄色固体11c，产率为85％，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.47(s,1H),7.69(t,J＝8.0Hz,1H),7.48(d,J＝6.8Hz,1H),7.40(t,J＝5.8Hz,1H),7.18(d,J＝8.4Hz,1H),5.05–4.91(m,1H),4.77(s,1H),4.61(s,2H),3.30(d,J＝7.3Hz,2H),3.03(d,J＝7.1Hz,2H),2.93(d,J＝12.5Hz,1H),2.86–2.74(m,J＝23.0,11.9Hz,3H),1.52(d,J＝8.0Hz,2H),1.38(s,9H),1.22(d,J＝14.1Hz,10H).
实施例7：(10-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)癸基)氨基甲酸叔丁酯(11d)的制备：
称取化合物2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸6(1.0equiv.)，将叔丁基(10-氨基癸基)氨基甲酸酯10d和HATU(3.0equiv.)溶解在干燥的2mLDMF中，然后在室温下搅拌10min，最后加入DIPEA(1.2equiv.)于室温下反应3-4h。TLC监测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化。得黄色固体11d，产率为85％，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.47(d,J＝2.8Hz,1H),8.29(d,J＝8.8Hz,1H),8.23(t,J＝5.8Hz,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.61–7.54(m,2H),7.20(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.75(q,J＝5.9,4.3Hz,1H),4.70(s,2H),3.13(q,J＝6.6Hz,2H),2.92–2.85(m,2H),1.42(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),1.36(s,9H),1.35–1.30(m,2H),1.36-1.16(m,8H).
实施例8：(12-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)十二烷基)氨基甲酸叔丁酯(11e)的制备：
称取化合物2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸6(1.0equiv.)，将叔丁基(12-氨基十二烷基)氨基甲酸酯10e和HATU(3.0equiv.)溶解在干燥的2mLDMF中，然后在室温下搅拌10min，最后加入DIPEA(1.2equiv.)于室温下反应3-4h。TLC监测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化。得黄色固体11e，产率为85％，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.92(s,1H),8.48(d,J＝2.8Hz,1H),8.29(d,J＝8.8Hz,1H),8.22(t,J＝5.8Hz,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.61–7.54(m,2H),7.22–7.19(m,J＝8.8,2.4,1.0Hz,1H),6.74(t,J＝5.8Hz,1H),4.70(s,2H),2.87(q,J＝6.6Hz,2H),2.54–2.46(m,2H),1.44–1.37(m,2H),1.36(s,9H),1.34–1.27(m,2H),1.13(d,J＝7.5Hz,16H).
酰胺缩合12a-c的一般程序：2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸6(1.0equiv.)，2-((2-(2,6-二氧吡啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺衍生物11a-c(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)，溶解于2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12a-c完全反应后，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，150：1-10：1)纯化粗产物，以提供产物12a-c。
酰胺缩合12d-e的一般程序：将2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)、2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺衍生物11d-e(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)溶解在2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12d-e的完全反应，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，200：1-10：1)纯化粗产物，以提供产物(12d-e)。
实施例9：2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(4-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)丁基)乙酰胺(12a)的制备：
2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸6(1.0equiv.)，(4-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺基)丁基氨基甲酸叔丁酯11a(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)，溶解于2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12a的完全反应，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，150：1-10：1)纯化粗产物，得到白色固体12a，产率为57％，m.p.139.7-140.8℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.27(s,1H),11.17(s,1H),8.49(d,J＝2.9Hz,1H),8.30(d,J＝9.0Hz,2H),8.04(t,J＝5.9Hz,1H),7.81(t,J＝7.9Hz,1H),7.69–7.56(m,2H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.39(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(d,J＝10.3Hz,1H),5.14(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),4.80(s,2H),4.71(s,2H),3.17(d,J＝6.3Hz,4H),2.96–2.86(m,J＝18.8,14.4,5.4Hz,1H),2.61(d,J＝17.2Hz,2H),2.10–2.01(m,1H),1.46(s,4H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.39,170.43,167.41,167.30,167.23,165.99,155.72,155.51,153.04,144.36,143.87,142.60,140.97,139.78,138.46,123.20,122.83,120.76,118.40,117.09,116.48,67.92,67.47,49.24,38.47,31.38,31.11,26.84,22.44.HRMS(ESI)calcd for C34H30F3N7O9[M+H]+,738.2130；found 738.2131。
实施例10：2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(6-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)己基)乙酰胺(12b)的制备：
2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸6(1.0equiv.)，叔丁基(6-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺基)己基)氨基甲酸酯11b(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)，溶解于2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12b的完全反应，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，150：1-10：1)纯化粗产物，得到白色固体12b，产率为67％，m.p.152.5-153.4℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.18(s,1H),9.15(s,1H),8.48(s,1H),8.35–8.22(m,2H),7.98(t,J＝5.8Hz,1H),7.81(t,J＝7.9Hz,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.62–7.57(m,2H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.39(d,J＝8.5Hz,1H),7.21(d,J＝10.9Hz,1H),5.14(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),4.78(s,2H),4.71(s,2H),2.96–2.87(m,J＝16.7,13.7,5.3Hz,1H),2.60(dd,J＝17.0,12.7Hz,2H),2.11–2.01(m,1H),1.43(q,J＝6.5Hz,4H),1.30–1.23(m,4H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.32,170.40,167.27,167.22,167.14,166.00,164.81,155.65,155.45,153.32,141.40,138.38,137.41,133.47,122.99,122.86,120.77,120.43,117.24,116.53,113.12,112.09,68.04,67.57,49.26,38.72,31.42,29.48,29.40,26.47,26.42,22.45.HRMS(ESI)calcd for C36H34F3N7O9[M+H]+,766.2443；found 766.2443。
实施例11：2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(8-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)辛基)乙酰胺(12c)的制备：
2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酸6(1.0equiv.)，(8-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酰胺基)辛基)氨基甲酸叔丁酯11c(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)，溶解于2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12c的完全反应，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，150：1-10：1)纯化粗产物，得到白色固体12c，产率为48％，m.p.132.5-133.4℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.25(s,1H),11.17(s,1H),8.48(d,J＝2.8Hz,1H),8.29(d,J＝8.8Hz,1H),8.23(t,J＝5.8Hz,1H),7.95(t,J＝5.8Hz,1H),7.81(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.59(dd,J＝8.8,2.9Hz,1H),7.51(d,J＝7.2Hz,1H),7.39(d,J＝8.5Hz,1H),7.21(d,J＝8.8Hz,1H),5.14(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),4.78(s,2H),4.71(s,2H),3.19–3.07(m,4H),2.99–2.83(m,1H),2.65–2.57(m,1H),2.07–2.03(m,J＝7.6,2.8Hz,2H),1.41(p,J＝6.4Hz,4H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.30,170.38,167.25,167.21,167.11,165.99,155.61,155.44,153.31,144.42,141.42,138.34,137.38,134.27,133.46,123.08,122.84,120.76,117.25,116.52,113.09,112.06,105.13,68.05,67.59,49.27,38.78,31.41,29.51,29.40,29.17,29.14,26.76,22.46.HRMS(ESI)calcd for C38H38F3N7O9[M+H]+,794.2756；found794.2761.
实施例12：2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(10-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)癸基)乙酰胺(12d)的制备：
将2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)、(10-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)癸基)氨基甲酸叔丁酯11d(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)溶解在2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12d的完全反应，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，200：1-10：1)纯化粗产物，得到白色固体12d，产率为52％，m.p.113.5-134.7℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.24(d,J＝12.4Hz,1H),11.16(s,1H),8.47(d,J＝2.8Hz,1H),8.31–8.23(m,2H),7.96(q,J＝5.6,4.7Hz,1H),7.85–7.72(m,2H),7.59(dd,J＝8.7,3.1Hz,1H),7.53–7.42(m,2H),7.39(dd,J＝8.6,3.3Hz,1H),7.21(dd,J＝15.5,8.6Hz,1H),5.18–5.10(m,1H),4.77(s,2H),4.70(s,2H),3.14(d,J＝6.2Hz,2H),3.02(d,J＝3.5Hz,2H),2.93–2.82(m,2H),2.63–2.54(m,J＝15.5,4.2Hz,2H),1.46–1.33(m,6H),1.31–1.21(m,8H)。13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.27,170.37,167.22,167.08,165.98,155.63,155.51,141.44,138.34,137.39,133.48,122.87,120.79,117.24,116.51,110.00,109.05,105.47,68.05,67.60,49.26,31.42,29.44,29.25,29.17,26.84,26.76,22.46.HRMS(ESI)calcd forC40H42F3N7O9[M+H]+,844.2888；found 844.2880。
实施例13：2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(12-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)十二烷基乙酰胺(12e)的制备：
将2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)乙酸9(1.0equiv.)、(12-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)十二烷基)氨基甲酸叔丁酯11e(1.1equiv.)和HATU(3.0equiv.)溶解在2mL干DMF中，然后在室温下搅拌10分钟，最后加入DIPEA(1.2equiv.)并在室温下反应3-4h。TLC检测12e的完全反应，残留物用乙酸乙酯和水萃取三次。合并并浓缩有机相，并通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，200：1-10：1)纯化粗产物，得到白色固体12e，产率为65％，m.p.122.3-123.1℃。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),8.96(s,1H),8.47(d,J＝2.9Hz,1H),8.28(d,J＝8.8Hz,1H),8.23(t,J＝5.8Hz,1H),7.95(t,J＝5.7Hz,1H),7.83–7.78(m,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.61–7.55(m,2H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.39(d,J＝8.5Hz,1H),7.21(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),5.18–5.06(m,1H),4.77(s,2H),4.70(s,2H),3.12(d,J＝5.7Hz,4H),2.95–2.84(m,2H),2.70–2.54(m,2H),1.45–1.33(m,4H),1.31–1.20(m,4H),1.14(m,12H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.26,170.36,167.23,167.09,166.00,155.61,155.49,153.21,141.45,138.34,137.38,133.48,123.02,122.87,120.80,117.25,116.52,68.07,67.63,49.27,38.77,31.44,29.52,29.46,29.28,29.16,26.84,26.75,22.45。HRMS(ESI)calcdfor C40H42F3N7O9[M+H]+,872.3201；found 872.3196。
实施例14：免疫印迹实验检测PROTAC类化合物对CBFβ-SMMHC蛋白的降解
过表达CBFβ-SMMHC的U937细胞以5x105个每毫升的密度铺于6孔板中，12小时后，分别加DMSO或图4所示的PROTAC类化合物，处理6小时后收细胞进行免疫印迹检测，图4中CBFβ-SMMHC简写为CS，实验结果显示连接链长度与化合物降解活性密切相关，12a和12b降解效果较差，而12c-e有效地将CS蛋白水平降解至约20％。
实施例15：流式细胞实验检测PROTAC类化合物对CBFβ-SMMHC蛋白的降解
过表达HaloTag-CBFβ-SMMHC的U937细胞以5x105个每毫升的密度铺于6孔板中，12小时后，分别加DMSO或图5所示的PROTAC类化合物，处理6小时后加HaloTag染色剂，收细胞进行流式检测，实验结果表明连接链长度与化合物降解活性密切相关，其中12d对CBFβ-SMMHC蛋白的降解效果最好。
实施例16：PROTAC类化合物对白血病细胞增殖的影响
将病人来源的CBFβ-SMMHC型白血病细胞铺于6孔板中，分别用DMSO或12d处理细胞，加药浓度如图6所示，24小时后对细胞计数，实验结果显示12d能够浓度依赖性地抑制白血病细胞的增殖。
Claims (9)
1.一种靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物，其特征在于：所述PROTC类化合物的结构式如通式(I)所示：
通式中，E3 ligand为VHL或CRBN配体；Linker为不同链长的连接基团。
2.根据权利要求1所述的靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物，其特征在于：所述Linker为烷基，环烷基，醚链，哌啶，吡啶或者氮杂环等。
3.根据权利要求2所述的靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物，其特征在于：Linker是被一或多个选自以下基团中断一或多次的直链或带有支链的亚烷基或烷氧基：
-(CH2)n-、-(CH2)nCO-、-NR1(CH2)nCO-、-NR2(CH2)n-、-(OCH2CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2OCH2)n-、-(CH2CH2OCH2)n--(CH2CH2OCH2CH2)n-、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂芳烃基或它们的任意组合；
其中n表示1至20的自然数，R1、R2各自独立的选择H或者为C1-10烷基。
4.根据权利要求3所述的靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物，其特征在于：所述PROTAC类化合物包括下列化合物：
2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(4-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)丁基)乙酰胺；
2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(6-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰氨基)己基)乙酰胺；
2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(8-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)辛基)乙酰胺；
2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(10-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)癸基)乙酰胺；
2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(12-(2-((6-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并咪唑-2-基)吡啶-3-基)氧基)乙酰胺基)十二烷基)乙酰胺。
5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物的方法，其特征在于：所述PROTAC类化合物包括：系列I：CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物，系列II：CRBN配体衍生物，系列III：靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物；
所述系列Ⅰ中CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物的制备方法，包括如下步骤：5-羟基吡啶醛与溴乙酸叔丁基酯在碳酸钾条件下于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中反应，得到产物后，与2-硝基-4-(三氟甲氧基)苯胺在5mol/LNaS2O4的乙醇溶液中在70℃下反应4h；产物在TFA(三氟乙酸)的条件下于DCM(二氯甲烷)溶液中，室温反应1h，再在HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，DIPEA(二异丙基乙胺)的条件下于DMF溶液中发生缩合反应，得到CBFβ-SMMHC抑制剂及其衍生物；
所述系列II中CRBN配体衍生物的制备方法，包括如下步骤：来那度胺与溴乙酸叔丁酯在碳酸钾条件下于DMF中反应，得到产物后，在TFA的条件下于DCM中，室温反应1h，产物化合物再与不同链长的叔丁基氨基甲酸酯在HATU和DIPEA的条件下于DMF溶液中发生缩合反应，得到CRBN配体衍生物
所述系列III中PROTAC类化合物的制备方法，包括如下步骤：CBFβ-SMMHC抑制剂与不同链长的烷基链的CRBN配体衍生物，或者不同链长的CBFβ-SMMHC抑制剂与CRBN配体衍生物，在HATU、DIPEA条件下于DMF中反应，得到靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物。
6.一种如权利要求1-4任一项所述的靶向CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物在制备CBFβ-SMMHC蛋白降解剂中的应用。
7.一种如权利要求1-4任一项所述的靶向降解CBFβ-SMMHC蛋白的PROTAC类化合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述治疗急性髓系白血病的药物，包含权利要求1-4任一项所述的PROTAC类化合物，或PROTAC类化合物药理或生理上可接受的盐。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述治疗急性髓系白血病的药物，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
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