CN117561071A - 生物工程化的免疫调节融合蛋白组合物 - Google Patents
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Abstract
本文提供了生物工程化的免疫调节融合蛋白及其用于调节免疫应答的用途，以及改善受试者对疫苗的反应的用途或治疗疾病或病症诸如癌症或病原体感染的用途。本文提供了一种单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40配体CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月12日提交的美国序列号63/160,686、2021年3月12日提交的美国序列号63/160,688、2021年3月12日提交的美国序列号63/160,691、2021年3月12日提交的美国序列号63/160,693、2021年3月12日提交的美国序列号63/160,694的权益，这些专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式递交，文件名为“14620-628-228_SEQ_LISTING”，创建日期为2022年3月6日，并且大小为150,953字节。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
1.技术领域
在一些实施方案中，本文提供了用于生物工程化的免疫调节融合蛋白的材料和方法及其用于检测、调节免疫应答和/或免疫相关病状的用途，以及用于筛选、诊断、影响、改善受试者对病原体或疫苗的反应或治疗疾病或病症诸如瘤形成、增生、癌症或病原体感染的材料和方法。
2.背景技术
免疫是涉及多种分子的多方面宿主应答。Manzoor Ahmad Mir，第1章-共刺激和共刺激分子简介，编辑：Manzoor Ahmad Mir，Developing Costimulatory Molecules forImmunotherapy of Diseases，Academic Press，2015，第1-43页，ISBN 9780128025857。参与免疫应答的一种此类分子是CD40配体(CD40L)(CD154)，一种肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，其存在于各种细胞和组织类型中并在CD4+T细胞上高度表达并与CD40受体多肽相互作用以增强共刺激信号传导。CD40受体多肽在多种先天性和适应性细胞(包括树突状细胞和B细胞)上表达。Adv Drug Deliv Rev.2019,15；141:92-103；Immunol Rev.2009年5月；229(1)。CD40激动剂可以增强抗原呈递，并且是单克隆抗体应用(诸如诊断、预后和治疗)的合适靶点。Cancers(Basel).2021年3月15日；13(6):1302。
3.发明内容
本发明的发明人理解，尤其是CD40激动剂单克隆抗体在不存在Fc交联的情况下表现不佳并且显示很少的临床益处，并且此外，CD40激动剂抗体的全身施用已经与不良事件和肝毒性相关联，确定并解决了本领域对用于调节免疫应答，以及改善受试者对疫苗的反应，或治疗疾病或病症诸如癌症或病原体感染(例如，病毒感染)的工程化CD40激动剂的改进构建体的未满足的需求。因此，在一个方面，本文提供了一种单链三聚体CD40LFc融合蛋白，包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40配体CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽。
在一些实施方案中，Fc单体肽通过肽系链与CD40L三聚体共价连接。在一些实施方案中，肽系链包含0个至20个氨基酸。
在一些实施方案中，CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的N末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的C末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。
在一些实施方案中，CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
在一些实施方案中，Fc单体肽包含人Fc序列。在一些实施方案中，人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。在一些实施方案中，人Fc序列包含IgG序列。在一些实施方案中，IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，IgG序列包含IgG1序列。在一些实施方案中，IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。在一些实施方案中，IgG序列包含IgG2序列。在一些实施方案中，IgG2序列包含SEQ ID NO:29或其片段。
在一些实施方案中，肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)3(SEQ IDNO:25)的组。
在一些实施方案中，肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化。在一些实施方案中，CD40多肽的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。在一些实施方案中，CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。在一些实施方案中，CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与野生型CD40L相比增强抗肿瘤活性。
在另一方面，本文提供了一种包含两个本文公开的单链三聚体CD40LFc融合蛋白的二聚体。在一些实施方案中，二聚体是同源二聚体。在一些实施方案中，二聚体通过Fc单体肽的缔合形成。
在另一方面，本文提供了一种编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包含编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸的载体，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包含编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包含药学上可接受的载体和单链三聚体CD40L融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包含单链三聚体CD40L融合蛋白的试剂盒，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一个方面，本文提供了一种包括用于提供单链三聚体CD40L融合蛋白的装置的系统，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在另一方面，本文提供了一种包括用于提供包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的装置的系统，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一个方面，本文提供了一种活化CD40多肽的方法，包括使CD40多肽与本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合时使CD40多肽活化。在另一方面，本文提供了一种活化CD40多肽的方法，包括使CD40多肽与包含两个本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触，其中所述单链三聚体CD40LFc融合蛋白二聚体在结合时使CD40多肽活化。在另一方面，本文提供了一种活化T细胞的方法，包括使T细胞在存在本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的情况下与抗原呈递细胞接触，其中抗原呈递细胞表达CD40多肽，并且其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合CD40多肽时使T细胞活化。在另一方面，本文提供了一种活化T细胞的方法，包括使T细胞在存在包含两个本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的情况下与抗原呈递细胞接触，其中抗原呈递细胞表达CD40多肽，并且其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合CD40多肽时使T细胞活化。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原。在另一方面，本文提供了一种活化树突状细胞的方法，包括使CD40多肽与本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合CD40多肽时使树突状细胞活化。在另一方面，本文提供了一种活化树突状细胞的方法，包括使CD40多肽与包含两个本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合CD40多肽时使树突状细胞活化。
在一些实施方案中，所述方法在体外进行。在一些实施方案中，所述方法在体内进行。在一些实施方案中，所述接触还包括施用包含药学上可接受的载体和单链三聚体CD40LFc融合蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，所述接触增强先天抗肿瘤免疫应答。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。在另一方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含两个本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用包含药学上可接受的载体和单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，所述治疗增强先天抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，所述方法还包括共同施用第二疗法。在一些实施方案中，所述癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。
在一个方面，本文提供了一种用于制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的方法，包括(a)将编码本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中；(b)在制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养宿主细胞，以及(c)从细胞或培养物中回收单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段。在另一方面，本文提供了一种制备包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的方法，各自包括(a)将编码本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中；(b)在制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养宿主细胞；(c)从细胞或培养物中回收单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段，以及(d)在有利于二聚化的条件下组合单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段。在另一方面，本文提供了一种制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的药物组合物的方法，包括将本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
在一个方面，本文提供了一种包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。在一些实施方案中，CD40L亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，CD40L亚基包含选自SEQID NO:20至22的序列中的任一者，或其片段。
在一些实施方案中，肽接头中的至少一个肽接头选自由EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)组成的组。在一些实施方案中，肽接头中的至少两个肽接头选自由EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)组成的组。在一些实施方案中，肽接头中的至少两个肽接头具有相同的序列。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含选自SEQ ID NO:35-38的任一个序列，或其片段。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白与非来源于CD40L的肽或多肽融合。
在另一方面，单链三聚体CD40L融合蛋白与肽系链融合。在一些实施方案中，肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQID NO:28)组成的组。在一些实施方案中，肽系链与单链三聚体CD40L融合蛋白的N末端融合。在一些实施方案中，肽系链与单链三聚体CD40L融合蛋白的C末端融合。
在另一方面，单链三聚体CD40L融合蛋白与Fc单体肽融合。在一些实施方案中，Fc单体肽包含人Fc序列。在一些实施方案中，人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。在一些实施方案中，人Fc序列包含IgG序列。在一些实施方案中，IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，IgG序列包含IgG1序列。在一些实施方案中，IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。在一些实施方案中，IgG序列包含IgG2序列。在一些实施方案中，IgG2序列包含SEQ ID NO:29或其片段。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白经由肽系链与Fc单体肽融合。在一些实施方案中，肽系链包含0个至20个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链选自由(G4S)3(SEQID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的N末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的C末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
在另一方面，单链三聚体CD40L融合蛋白与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化。在一些实施方案中，CD40多肽的活化增强T细胞和/或B细胞的免疫刺激功能。在一些实施方案中，CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比，B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞的活化增强。
在一些实施方案中，CD40多肽的活化包括增加CD40多肽的表达。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白与野生型CD40L相比增强抗肿瘤活性。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白与野生型CD40L相比增强促炎活性。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白与野生型CD40L相比增强感染性病原体的清除。
在另一方面，单链三聚体CD40L融合蛋白使B细胞群的抗体产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在另一方面，单链三聚体CD40L融合蛋白增加T细胞群对促炎细胞因子的分泌。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL 12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞因子产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在另一方面，单链三聚体CD40L融合蛋白将巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加至约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白将树突状细胞群中抗原呈递树突状细胞的最小百分比增加至约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在另一方面，多肽与药剂缀合。在一些实施方案中，药剂选自由放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物和化学发光化合物组成的组。
在另一方面，本文提供了一种编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种包含编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸的载体，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种包含编码单链三聚体CD40L融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种包含药学上可接受的载体和包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽的药物组合物，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种包含多肽的试剂盒，所述多肽包含单链三聚体CD40L融合蛋白，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种包括用于提供包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽的装置的系统，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在另一方面，本文提供了一种用于活化表达CD40多肽的靶细胞的方法，包括使靶细胞与有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白在结合CD40多肽时使靶细胞活化。
在一些实施方案中，靶细胞的活化测量为靶细胞的增殖或成熟增加。在一些实施方案中，靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，靶细胞的活化测量为靶细胞的存活时间延长。在一些实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是自然杀伤细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。
在另一方面，本文提供了一种用于促进B细胞群的抗体产生的方法，包括使B细胞与有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在一些实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在另一方面，使B细胞在存在抗原或编码抗原的多核苷酸的情况下与包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基，并且其中由B细胞产生的抗体特异性地结合至抗原。在一些实施方案中，所述方法进一步促进能够响应于抗原产生抗体的记忆B细胞的形成。
在一些实施方案中，多肽或多核苷酸在疫苗组合物或助剂组合物中。在一些实施方案中，抗原或编码抗原的多核苷酸在疫苗组合物中。在一些实施方案中，抗原源于或来源于感染性病原体。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。在一些实施方案中，抗原源于或来源于患病细胞。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
在一些实施方案中，抗原由抗原呈递细胞呈递。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，抗原与MHC I类或MHC II类复合物缔合。
在另一方面，本文提供了一种增加T细胞群分泌促炎细胞因子的方法，包括使T细胞群在存在有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的情况下与抗原呈递细胞群接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。在一些实施方案中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL 12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞因子产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在另一方面，本文提供了一种增加巨噬细胞群对患病细胞的吞噬作用的方法，包括使患病细胞、巨噬细胞，或患病细胞和巨噬细胞两者与有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，通过共培养用第一荧光染料标记的巨噬细胞和用第二荧光染料标记的患病细胞来测量巨噬细胞的吞噬作用，其中第一荧光染料和第二荧光染料不同。在一些实施方案中，通过测定包含患病细胞的巨噬细胞的百分比来测量吞噬性巨噬细胞的百分比。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞或被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
在另一方面，本文提供了一种增加树突状细胞群的抗原呈递的方法，包括使树突状细胞在存在抗原的情况下与有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，通过共培养用第一荧光染料标记的树突状细胞和用第二荧光染料标记的抗原来测量树突状细胞的抗原呈递，其中第一荧光染料和第二荧光染料不同。在一些实施方案中，通过测定树突状细胞群中与抗原共定位的树突状细胞的百分比来测量呈递抗原的树突状细胞的百分比。
在一些实施方案中，抗原源于或来源于感染性病原体。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。在一些实施方案中，抗原源于或来源于患病细胞。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
在一些实施方案中，多肽或多核苷酸在疫苗组合物或助剂组合物中。在一些实施方案中，抗原或编码抗原的多核苷酸在疫苗组合物中。
在另一方面，本文提供了一种增加靶细胞表达CD40多肽的方法，包括使靶细胞与有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在一些实施方案中，靶细胞是患病细胞。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是自然杀伤细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。
在一些实施方案中，患病细胞群减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在另一方面，本文提供了一种在患病细胞群周围的组织中形成促炎环境的方法，包括使组织与有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在一些实施方案中，组织中活化的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞的浸润增加。
在一些实施方案中，组织中促炎细胞因子的浓度增加。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL 12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，组织中抗原呈递细胞对源于或来源于患病细胞的抗原的呈递增加。
在一些实施方案中，组织中患病细胞的吞噬作用增加。
在一些实施方案中，组织中由细胞介导的细胞毒性诱导的患病细胞的凋亡增加。在一些实施方案中，组织中由抗体依赖性细胞毒性诱导的患病细胞的凋亡增加。
在一些实施方案中，组织中的患病细胞群减少。在一些实施方案中，组织中的患病细胞群减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在一些实施方案中，所述方法在体外或体内进行。
在另一方面，本文提供了一种消除受试者的患病细胞的方法，包括施用有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。
在一些实施方案中，患病细胞不表达CD40多肽。在一些实施方案中，患病细胞表达CD40多肽。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
在另一方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括施用有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。在一些实施方案中，所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，所述方法还包括共同施用第二疗法。在一些实施方案中，癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。
在另一方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的感染的方法，包括施用有效量的包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，其中单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。在一些实施方案中，所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗感染免疫应答。
在一些实施方案中，将多肽或多核苷酸与疫苗组合物共同施用以预防受试者的感染。在一些实施方案中，将多肽或多核苷酸与疫苗组合物同时或依次共同施用。
4.附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的具体实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1A-图1B示出了三聚体CD40L Fc融合蛋白的示例的示意图。图1A示出了CD40L三聚体设计优化的图示，其中设计分子以解决系链长度、接头长度和融合方向。图1B示出了“单体Fc”分子的图示，该分子是含有与Fc单体肽融合的CD40L三聚体(带圆圈)的单链融合蛋白，其中Fc在其CH3结构域中含有消除该分子的二聚体形成的突变。
图2A-图2B示出了蛋白A纯化后CD40L三聚体在Fc上的单分散性。图2A示出了TPP000161222的SDS-PAGE凝胶(左图)和SEC色谱图(右图)，而图2B示出了TPP000182983的SDS-PAGE凝胶和SEC色谱图。
图3示出了通过分析型超速离心(AUC)测量的尺寸排阻色谱法之后TPP000182983的单分散性。将所有样品一式两份进行分析(n＝2)。蛋白质主要在约7s时运行，主要物种种群占98％。还存在<1％的低分子量物质(LMWS)、<2％的二聚体和<1％的高分子量物质(HMWS)。
图4A-图4C示出了CD40激动剂与CD40的结合。图4A示出了使用Meso ScaleDiscovery(MSD)生物发光测定测量的CD40L三聚体与CD40R的结合。图4B示出了使用表面等离子体共振(SPR)测量的TPP000182983与CD40R的结合。图4C示出了使用表面等离子体共振(SPR)测量的TPP000161222与CD40R的结合。
图5A-图5C示出了使用图5A中的HEK-Blue报告基因测定、图5B中的单核细胞衍生的树突状细胞活化测定和图5C中的未经交联抗体处理的成熟树突状细胞活化测定测试的CD40L三聚体的功能活性。
图6A-图6E示出了使用CD86活化标记物(图6A)；CD40活化标记物(图6B)；CD83活化标记物(图6C)；HLA-DR活化标记物(图6D)和PDL1活化标记物(图6E)的树突状细胞活化测定对CD40L三聚体Fc的功能活性的评估。
图7A-图7B示出了在存在CD40激动剂和CEF肽的情况下由moDC产生的对CD8+T细胞(图7A)和CD4+T细胞(图7B)的T细胞应答。
5.具体实施方式
本公开部分基于具有有利的生物物理特性和增强的CD40活化的单个CD40L Fc融合蛋白的令人惊讶的发现，从而导致增强的T细胞和树突状细胞活化。因此，本发明的组合物和方法为靶向CD40-CD40L路径的新颖和改进的治疗策略提供了途径。
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均关于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。
本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同方案。此类等同方案旨在由本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其它元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B两者为真(或存在)。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等。在一个具体实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，受试者是对其有需要的受试者。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。出于降低发展与疾病相关的病理学的风险的目的，治疗可以施用于没有表现出疾病迹象和/或仅表现出疾病的早期迹象的受试者。
还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法中的一种序列比较算法或通过目视检查所测量的。
对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法进行(Adv.Appl.Math.2:482(1981)，通过使用Needleman&Wunsch的同源比对算法进行，JMol.Biol.48:443(1970)，通过搜索Pearson&Lipman的相似性方法进行(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))，通过这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，在威斯康星州遗传学软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)计算机化实施，或通过目测(大体参见，Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编辑，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.(1995年增补版)(Ausubel))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有所描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字词比对时，该短字词匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻近字词分数阈值(Altschul等人，出处同上)。这些初始邻近字词命中充当用于发起搜索以找到包含它们的较长HSP的种子。然后将字词命中沿每个序列在两个方向上延伸，只要可增加累积的比对分数。
对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和N(错配残基的处罚分数；始终<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。
两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅通过保守置换而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。
如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链均可被称为编码该蛋白质，或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”(或等同短语)包括为彼此的简并型式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语“核苷酸序列”还可以包括内含子，其程度使得编码该蛋白质的核苷酸序列在一些型式中可以含有内含子。
如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本文所公开的核酸分子转染的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的分子可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可指由氨基酸组成的分子，并且可被本领域的技术人员识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；天然修饰或干预修饰为例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
本文所述的肽序列根据通常的惯例书写，其中肽的N端区在左侧，并且C端区在右侧。虽然氨基酸的同分异构形式是已知的，但除非另外明确指明，它是所表示的氨基酸的L形式。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”广义地使用，并且包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆的抗体片段。一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。天然存在的抗体是由折叠成恒定结构域和可变结构域的两条重链和两条轻链组成的Y形分子。抗体结构，包括重链和轻链以及每条重链和轻链内的恒定区和可变区，是众所周知的。即，除了重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成的抗原结合区，其中每个可变区含有三个结构域(即互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3)。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片框架的非框架区内的三个高变区(HCDR1、HCDR2或HCDR3)中的一个高变区，或抗体VLβ-片框架的非框架区内的三个高变区(LCDR1、LCDR2或LCDR3)中的一个高变区。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。这些术语是指免疫球蛋白分子的相对于免疫球蛋白的其它部分(包含抗原结合位点的可变区)具有更保守的氨基酸序列的部分。恒定区可包含重链的CH1、CH2和CH3区和轻链的CL区。
术语“Fc区”是指抗体恒定区的羧基末端部分，并且涵盖重链的CH2和CH3区。两个CH3结构域彼此相互作用以形成同源二聚体，从而导致Fc的二聚化。
如本文所用，术语“Fc单体”或“mFc”或“Fc单体肽”是指包含由重链的CH2和CH3区组成的单体Fc区的羧基末端部分或其一部分的分子。在一些实施方案中，Fc单体肽包含人Fc序列。在一些实施方案中，人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。在一个实施方案中，人Fc序列包含IgG序列。在一些实施方案中，IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，IgG序列是IgG1序列。在一些实施方案中，IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。在一个实施方案中，IgG1序列包含SEQ ID NO:30或其片段。在另一个实施方案中，IgG1序列包含SEQ ID NO:31或其片段。在一些实施方案中，IgG序列包含IgG2序列。在一些实施方案中，IgG2序列包含SEQ ID NO:29或其片段。
本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含五大类或相应亚类中的任一者的Fc单体肽。在具体的实施方案中，本文提供的Fc单体肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一个实施方案中，本文提供的Fc单体肽是人IgG1和人IgG2同种型。在另外的实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的Fc单体肽组分具有沉默的效应子功能。
因此，本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可含有对应于κ或λ轻链恒定结构域的Fc单体肽。根据具体实施方案，本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包括具有来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区的Fc单体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一组基本上均质的抗体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该组的各个抗体是相同的。本文所公开的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的B细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。因此，本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自单克隆抗体的Fc单体。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，其包含通过约15个至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。因此，本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自单链抗体的Fc单体。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段以及/或者包含至少一种人重链多肽和/或轻链多肽的抗体。因此，本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自人抗体的Fc单体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指被修饰成提高与人抗体的序列同源性的非人抗体，使得抗体的抗原结合特性得以保留，但其在人体内的抗原性下降。因此，本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自人源化抗体的Fc单体。
如本文所用，术语“CD40配体”或“CD40L”是指充当CD40/TNFRSF5(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的共刺激成员)的配体的蛋白质或蛋白质的片段。特定的CD40L序列可以从公众可访问的数据库诸如UniProt获得，例如UniProt登录号P29965。CD40L由细胞外结构域、茎区、跨膜螺旋和短胞质结构域组成。CD40L的活性位于215个氨基酸的细胞外结构域，其特征在于由β-折叠、α-螺旋环和β-折叠构成的夹层结构。该结构允许CD40L的三聚。术语CD40L还涵盖具有至少约50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性和充当CD40配体的能力的多肽或其任何片段。术语CD40L涵盖全长CD40L及其任何片段，例如，CD40L的细胞外结构域部分。该术语还涵盖可溶性CD40L(sCD40L)，其已经在不同的疾病背景中报道并且可以以单体和多聚体形式存在。在根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白或单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的上下文中，单独的CD40L组分称为“CD40L亚基”。由融合在一起的三个CD40L亚基组成的融合蛋白的部分也可以称为“CD40L三聚体”。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指涵盖两个或更多个连接在一起以产生不存在于同一天然存在的多肽中的序列的肽片段的蛋白质或多肽。
如本文所用，术语“单链三聚体CD40L Fc融合蛋白”是指包含通常连接(任选地通过如本文所述的肽系链)至三个CD40L亚基的单体Fc区(mFc)的蛋白质，如本文所述和图1所示。具体地，单链三聚体CD40LFc融合蛋白由三个CD40L细胞外结构域(ECD)或其片段组成，它们通过柔性肽接头彼此连接以形成通过肽系链连接至Fc单体肽的N末端或C末端的线性CD40L三聚体。因此，在不同的实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可以是CD40L三聚体的C末端或N末端Fc融合体。
在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的N末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:2。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:4。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ IDNO:5。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:6。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:7。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:8。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:9。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ IDNO:10。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:11。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:1的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白包含SEQ ID NO:2的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ IDNO:4的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:5的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:6的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:7的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:8的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:9的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白包含SEQ ID NO:10的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:11的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:12的片段。
在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的C末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:13。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:14。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:15。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:17。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:18。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:19。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:13的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:14的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:15的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:17的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白包含SEQ ID NO:18的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:19的片段。
在一些实施方案中，CD40配体亚基包含CD40L细胞外序列的一部分。在一些实施方案中，CD40L亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:20的片段。在另一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:21的片段。在另一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:22的片段。
在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:20。在另一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:21。在另一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:22。
在一些情况下，两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白，后者是优选的。在一个实施方案中，两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白形成同源二聚体Fc融合蛋白。在一个实施方案中，两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白形成异源二聚体Fc融合蛋白。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体仅包含Fc单体肽或其片段，并且另一个单体是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包括与参考或野生型Fc单体相比具有一个或多个氨基酸取代的变体Fc单体。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体Fc单体肽或其片段和除CD40L以外的蛋白质结构域，诸如受体、配体或其他结合配偶体。因此，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可以是作为双特异性分子的异源二聚体Fc融合蛋白的组分。
术语“双特异性分子(bispecific molecule)”是指具有两个结合结构域的分子，每个结合结构域能够特异性结合一种靶标蛋白质、配体、或其片段。因此，虽然双特异性分子可包括作为非抗体蛋白质、配体及其片段(包括重组抗原)的结合结构域，其可以特异性地结合另一种蛋白质。在一个实施方案中，双特异性分子可包含单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。术语“结合结构域(binding domain)”是指分子中负责与另一个分子或配体的特异性结合相互作用的部分。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价键或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点和靶分子诸如抗原的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能性片段对该表位的亲和力。结合分子(例如抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)为解离常数KD，其与亲和力成反比。KD值越低，结合分子的亲和力越高。结合分子与其配体(即，抗体和抗原)的不同复合物的KD值会有所变化，并且取决于kon和koff两者。结合结构域可以1×10-7M或更低，诸如1×10-8M或更低、5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、5×10-10M或更低或1×10-10M或更低的KD特异性地结合靶标。本文提供的结合分子的解离常数KD可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员众所周知的任何其他方法来确定。一个结合位点处的亲和力并不总是反映结合分子与其结合配偶体之间的相互作用的真实强度。
与本文所述的结合分子相关的术语，诸如“结合”、“特异性结合”和类似术语在本文中也可互换使用，并且是指特异性结合抗原诸如多肽的抗原结合结构域的结合分子。结合或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域可与相关抗原交叉反应。在某些实施方案中，结合或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域不与其它抗原交叉反应。结合至或特异性结合至抗原的结合分子或抗原结合结构域可例如通过免疫测定、 或本领域技术人员已知的其它技术来识别。在一些实施方案中，如使用实验技术诸如放射性免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的，当结合分子或抗原结合结构域以比与任何交叉反应性抗原更高的亲和力结合抗原时，它结合或特异性结合抗原。典型地，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍，并且可以是背景的10倍以上。参见例如Fundamental Immunology 332-36(Paul编辑，第2版，1989年)有关结合特异性的讨论。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域与“非靶”蛋白的结合程度小于结合分子或抗原结合结构域与其特定靶抗原结合的约10％，例如，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或RIA所确定的。关于诸如“特异性结合”、“特异性地结合”或“特异于”的术语意指与非特异性相互作用明显不同的结合。特异性结合可例如通过确定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量，该对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶的对照分子竞争来确定，例如过量的未标记靶。在这种情况下，如果标记靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性地抑制，则指示特异性结合。与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域包括能够以足够亲和力结合抗原的一种结合分子或抗原结合结构域，使得结合分子可用作例如靶向抗原的诊断剂。在某些实施方案中，结合至抗原的结合分子或抗原结合结构域具有小于或等于800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的平衡解离常数(KD)。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域结合至在来自不同物种(例如，在人类和食蟹猕猴物种之间)的抗原中保守的抗原表位。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，结合蛋白诸如CD40L)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，CD40/TNFRSF5)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用。结合分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且趋向于更长地保持结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中的任何方法都可用于本公开的目的。具体的例示性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“KD”或“KD值”可通过本领域已知的测定例如通过结合测定来测量。KD可在RIA中测量，例如用感兴趣抗体及其抗原的Fab版本进行(Chen等人，1999,J.Mol Biol293:865-81)。KD或KD值还可通过使用生物层干涉法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定由使用例如/>Red96系统、或由使用例如/>TM-2000或/>TM-3000来测量。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子共振(SPR)技术使用例如/>Red96、/>TM-2000或/>TM-3000系统来确定。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含非人(例如，骆驼、鼠类、非人灵长类)抗体的“人源化”形式的部分，这些抗体包括来自人免疫球蛋白(例如，受体抗体)的序列，其中天然CDR残基被来自非人物种诸如骆驼、小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，供体抗体)的具有期望的特异性、亲和力和能力的对应CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白序列的一个或多个FR区残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。进一步的细节参见Jones等人，1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-29；Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96；Carter等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；美国专利6800738；6719971；6639055；6407213；和6054297。
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员通常熟知的和/或使用常规方法通常采用的那些，诸如例如以下文献中描述的广泛利用的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版，2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑，2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑，2010)；以及Antibody Engineering，第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版，2010)。
除非本文另有定义，否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所阐述的术语的任何描述与以引用方式并入本文的任何文档冲突的情况下，将以下面所阐述的术语的描述为准。
在一个方面，本文提供了包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过柔性肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含三个CD40L ECD结构域，或其片段。在特定实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的每个CD40L亚基包含选自以下的任一个序列：
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:20或其片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:21或其片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:22或其片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ IDNO:33或其片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ IDNO:34或其片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ IDNO:20。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:21。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:22。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:33。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:34。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:20的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:21的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:22的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:33的片段。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白的CD40L亚基包含SEQ ID NO:34的片段。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:22的氨基酸序列的CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一CD40L亚基、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第二CD40L亚基和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第三CD40L亚基。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含三个用柔性肽接头彼此连接以形成线性CD40L三聚体的CD40L亚基。在特定实施方案中，连接融合蛋白中的CD40L亚基的柔性肽接头包含选自由EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)n(SEQ ID NO:39)组成的组的任一个序列，其中n为1至20的整数。在一些实施方案中，整数为1。在一些实施方案中，整数为2。在一些实施方案中，整数为3。在一些实施方案中，整数为4。在一些实施方案中，整数为5。在一些实施方案中，整数为6。在一些实施方案中，整数为7。在一些实施方案中，整数为8。在一些实施方案中，整数为9。在一些实施方案中，整数为10。在一些实施方案中，整数为11。在一些实施方案中，整数为12。在一些实施方案中，整数为13。在一些实施方案中，整数为14。在一些实施方案中，整数为15。在一些实施方案中，整数为16。在一些实施方案中，整数为17。在一些实施方案中，整数为18。在一些实施方案中，整数为19。在一些实施方案中，整数为20。
在一些实施方案中，柔性接头包含EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，柔性接头包含(G3S)3(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，肽接头包含序列EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少60％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少65％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肽接头包含序列(G3S)n(SEQ ID NO:39)，或者包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少60％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少65％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含具有100％序列同一性的氨基酸序列。
在特定实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含选自下表中所示序列的任一个序列，其中带下划线的部分对应于接头序列：
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含SEQ ID NO:35。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含SEQ ID NO:36。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含SEQ ID NO:37。在另一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白包含SEQ ID NO:38。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白还可以重组融合至例如异源肽或多肽(或其片段，例如融合至约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸的多肽)以产生更大的融合蛋白。因此，在一些实施方案中，本文提供了包含与非来源于CD40L的异源肽或多肽(在本申请中有时称为“非CD40L”肽或多肽)融合的CD40L三聚体的多肽。CD40L三聚体与非CD40L肽或多肽之间的连接可以是直接的或经由柔性肽系链进行。在一些实施方案中，非CD40L肽或多肽与CD40L三聚体的N末端融合。在一些实施方案中，非CD40L肽或多肽与CD40L三聚体的C末端融合。
因此，在一个方面，本文提供了包含直接或经由柔性肽系链与非CD40L肽或多肽融合的CD40L三聚体的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白的非CD40L部分包含Fc单体肽。
本文提供了一种单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
如本文所提供，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自IgG抗体的Fc区。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc区。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自IgG1抗体的Fc区。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自IgG2抗体的Fc区。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自IgG3抗体的Fc区。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可包含来自IgG4抗体的Fc区。在一些实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白可包含Fc单体(其是静默Fc区或经修饰的Fc区)，其具有遗传工程化的Fc结构域，该Fc结构域具有消除Fc受体的结合并消止抗体靶向细胞毒性(ADCC)效应子功能的关键突变。
在一些实施方案中，融合蛋白的三聚体CD40L部分基因融合或化学缀合至Fc区的C末端。在一些实施方案中，融合蛋白的三聚体CD40L部分基因融合或化学缀合至Fc区的N末端。
在一些实施方案中，Fc单体肽通过肽系链与CD40L三聚体共价连接。
如本文所用，术语“系链”或“肽系链”是指将融合蛋白的三聚体CD40L部分连接至Fc单体肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽系链包含0个至20个氨基酸(包括端点)。在一些实施方案中，肽系链包含0个至1个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含0个至5个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含0个至10个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含0个至15个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含5个至10个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含5个至15个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含5个至20个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含10个至15个氨基酸。在一些实施方案中，肽系链包含10个至20个氨基酸。相比之下，术语“接头”或“肽接头”是指将CD40L亚基彼此连接以形成三聚体的氨基酸序列。
在一个实施方案中，将融合蛋白的三聚体CD40L部分连接至Fc单体肽的肽系链具有序列(G4S)n(SEQ ID NO:40)，其中n为0至20的整数。在一些实施方案中，整数为1。在一些实施方案中，整数为2。在一些实施方案中，整数为3。在一些实施方案中，整数为4。在一些实施方案中，整数为5。在一些实施方案中，整数为6。在一些实施方案中，整数为7。在一些实施方案中，整数为8。在一些实施方案中，整数为9。在一些实施方案中，整数为10。在一些实施方案中，整数为11。在一些实施方案中，整数为12。在一些实施方案中，整数为13。在一些实施方案中，整数为14。在一些实施方案中，整数为15。在一些实施方案中，整数为16。在一些实施方案中，整数为17。在一些实施方案中，整数为18。在一些实施方案中，整数为19。在一些实施方案中，整数为20。
在一个实施方案中，柔性系链不包含(G4S)(SEQ ID NO:28)基序。在一个实施方案中，柔性系链包含(G4S)1(SEQ ID NO:28)。在一个实施方案中，柔性系链包含(G4S)2(SEQ IDNO:26)。在一个实施方案中，柔性系链包含(G4S)3(SEQ ID NO:24)。在一个实施方案中，柔性系链包含(G4S)4(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，肽系链包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，肽系链包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，肽系链包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，肽系链包含SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，肽系链包含序列(G4S)n(SEQ ID NO:40)，或者包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少60％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少65％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G4S)n(SEQ ID NO:40)具有100％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，将CD40L亚基彼此连接以形成融合蛋白的三聚体CD40L部分的肽接头可以是包含选自由EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)n(SEQ ID NO:39)组成的组的序列的柔性接头，其中n为1至20的整数。在一些实施方案中，整数为1。在一些实施方案中，整数为2。在一些实施方案中，整数为3。在一些实施方案中，整数为4。在一些实施方案中，整数为5。在一些实施方案中，整数为6。在一些实施方案中，整数为7。在一些实施方案中，整数为8。在一些实施方案中，整数为9。在一些实施方案中，整数为10。在一些实施方案中，整数为11。在一些实施方案中，整数为12。在一些实施方案中，整数为13。在一些实施方案中，整数为14。在一些实施方案中，整数为15。在一些实施方案中，整数为16。在一些实施方案中，整数为17。在一些实施方案中，整数为18。在一些实施方案中，整数为19。在一些实施方案中，整数为20。在一个实施方案中，柔性接头包含EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)。在一个实施方案中，柔性接头包含(G3S)3(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，肽接头包含序列EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)，或者包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少60％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少65％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)具有100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肽接头包含序列(G3S)n(SEQ ID NO:39)，或者包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少60％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少65％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含与(G3S)n(SEQ ID NO:39)具有100％序列同一性的氨基酸序列。
在特定实施方案中，根据本公开的融合蛋白中的Fc单体包含选自以下的任一个序列：
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在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的N末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:5。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:7。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:8。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:1的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ IDNO:2的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:4的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:5的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:6的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:7的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:8的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:9的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:10的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:11的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:12的片段。
在一些实施方案中，CD40L三聚体连接至Fc单体肽的C末端。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白包含SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:15。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:17。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:18。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:19。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:13的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:14的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:15的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:17的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白包含SEQ ID NO:18的片段。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:19的片段。
在一些实施方案中，CD40配体亚基包含CD40L细胞外序列的一部分。在一些实施方案中，CD40L亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:20。在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:21。在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:22。在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ IDNO:20的片段。在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:21的片段。在一个实施方案中，CD40L亚基包含SEQ ID NO:22的片段。
在一些情况下，两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白，后者是优选的。在一个实施方案中，两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白形成同源二聚体Fc融合蛋白。在一个实施方案中，两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白形成异源二聚体Fc融合蛋白。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体仅包含Fc单体肽或其片段，并且另一个单体是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。在一个实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体仅包含Fc单体肽，并且另一个单体是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。在一个实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体仅包含Fc单体肽的片段，并且另一个单体是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包括与参考或野生型Fc单体相比具有一个或多个氨基酸取代的变体Fc单体。在一些实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包含Fc单体肽或其片段和除CD40L以外的蛋白质结构域，诸如受体、配体或其他结合配偶体。在一个实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包含Fc单体肽和除CD40L以外的蛋白质结构域。在一个实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包含Fc单体肽的片段和除CD40L以外的蛋白质结构域。在一个实施方案中，除CD40L以外的蛋白质结构域是受体。在一个实施方案中，除CD40L以外的蛋白质结构域是配体。在一个实施方案中，除CD40L以外的蛋白结构域是另一种结合配偶体。因此，单链三聚体CD40LFc融合蛋白可以是作为双特异性分子的异源二聚体Fc融合蛋白的组分。因此，在一些实施方案中，提供了包含本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的双特异性分子。
在一些实施方案中，本文提供的CD40L三聚体与靶抗原重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)。在一个实施方案中，本文提供的CD40L三聚体与靶抗原重组融合。在一个实施方案中，本文提供的CD40L三聚体与靶抗原化学缀合。在一个实施方案中，化学缀合是共价缀合。在一个实施方案中，化学缀合是非共价缀合。在一些实施方案中，靶抗原与CD40L三聚体的C末端重组融合。在其他实施方案中，靶抗原与CD40L三聚体的N末端重组融合。在一些实施方案中，CD40L三聚体和靶抗原经由肽系链共价连接。
在具体的实施方案中，本文提供了一种单链三聚体CD40L-靶抗原融合蛋白，包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)靶抗原。
在一些实施方案中，靶抗原用于引发免疫应答。在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于病原体或患病细胞。如本文所用，“源于”病原体或患病细胞的靶抗原是指在天然存在或人工创造的条件下由病原体或患病细胞产生的天然抗原。源于病原体或患病细胞的抗原的示例包括但不限于由病原体或患病细胞在体内或体外表达的天然蛋白质。如本文所用，“来源于”病原体或患病细胞的靶抗原是指源于其的天然抗原的变体。例如，蛋白质或肽的变体可由对此类蛋白质或肽的天然或未修饰序列的氨基酸序列的一种或多种(诸如例如，约1种至约25种、约1种至约20种、约1种至约15种、约1种至约10种或约1种至约5种)变化得到。天然蛋白质的变体可以是天然存在的(诸如等位基因或剪接变体，或由免疫细胞片段化或加工的)，或者可以是人工构建的。在一些实施方案中，靶抗原源于病原体。在一些实施方案中，靶抗原源于患病细胞。在一些实施方案中，靶抗原来源于病原体。在一些实施方案中，靶抗原来源于患病细胞。
在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于由感染性病原体(诸如病毒、细菌、真菌或寄生虫)表达的蛋白质。在一个实施方案中，靶抗原源于由感染性病原体表达的蛋白质。在一个实施方案中，靶抗原来源于由感染性病原体表达的蛋白质。在一个实施方案中，病原体是病毒。在另一个实施方案中，病原体是细菌。在一个实施方案中，病原体是真菌。在另一个实施方案中，病原体是寄生虫。
在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于由被感染性病原体感染的患病宿主细胞表达的蛋白质。在一个实施方案中，靶抗原源于由患病宿主细胞表达的蛋白质。在一个实施方案中，靶抗原来源于由患病宿主细胞表达的蛋白质。在一些实施方案中，患病宿主细胞被感染性病原体感染。在一个实施方案中，病原体是病毒。在另一个实施方案中，病原体是细菌。在一个实施方案中，病原体是真菌。在另一个实施方案中，病原体是寄生虫。
在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于由感染性病原体产生的蛋白质。在一些实施方案中，靶抗原源于由感染性病原体产生的蛋白质。在一些实施方案中，靶抗原来源于由感染性病原体产生的蛋白质。在一些实施方案中，感染性病原体介导病原体进入宿主。在一个实施方案中，病原体是病毒。在另一个实施方案中，病原体是细菌。在一个实施方案中，病原体是真菌。在另一个实施方案中，病原体是寄生虫。
在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于由癌细胞或肿瘤基质细胞产生的蛋白质。在一些实施方案中，靶抗原源于由癌细胞产生的蛋白质。在一些实施方案中，靶抗原源于由肿瘤基质细胞产生的蛋白质。在一些实施方案中，靶抗原来源于由癌细胞产生的蛋白质。在一些实施方案中，靶抗原来源于由肿瘤基质细胞产生的蛋白质。
在具体的实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或其抗原片段。在一个实施方案中，靶抗原是TAA。在一个实施方案中，靶抗原是TAA的抗原片段。
在一些实施方案中，靶抗原被受试者的先天免疫系统识别。在一些实施方案中，靶抗原由抗原呈递细胞加工和呈递。在一些实施方案中，靶抗原由抗原呈递细胞在体外加工和呈递。在一些实施方案中，靶抗原由抗原呈递细胞在体内加工和呈递。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是B细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是自然杀伤细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是单核细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是粒细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是嗜中性粒细胞。
在一些实施方案中，靶抗原来源于在细胞表面上表达的蛋白质，其中该表达标记细胞凋亡(例如，经由细胞介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性)。
在一些实施方案中，靶抗原来源于在细胞表面上表达的蛋白质。在某些实施方案中，在细胞表面上标记的蛋白质标记细胞凋亡。在一些实施方案中，凋亡经由细胞介导的细胞毒性进行。在其他实施方案中，凋亡经由抗体依赖性细胞毒性进行。
在一些实施方案中，靶抗原来源于在细胞表面上表达的蛋白质，其中该表达标记细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，靶抗原来源于被受试者中的循环抗体特异性识别的蛋白质。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白还可以例如与诊断剂或可检测剂化学缀合(共价或非共价缀合)或重组融合。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白与另一分子化学缀合。在一个实施方案中，缀合是共价缀合。在另一个实施方案中，缀合是非共价缀合。在一个实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白与另一分子重组融合。在一些实施方案中，其他分子是诊断剂。在一些实施方案中，其他分子是可检测剂。在特定实施方案中，本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白与可检测物质偶联，该可检测物质包括但不限于各种酶，诸如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素；荧光材料，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于鲁米诺；生物发光材料，诸如但不限于荧光素酶、虫荧光素或水母发光蛋白；化学发光材料，诸如但不限于基于吖啶酯的化合物或HALOTAG；放射性材料，诸如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)，铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga和67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn或117Sn；使用各种正电子发射断层显像的正电子发射金属；和非放射性顺磁性金属离子。
在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白可与标记物或“标签”序列(诸如肽)融合，以促进纯化。在具体的实施方案中，标记物或标签氨基酸序列是六聚组氨酸肽，诸如在pQE载体中提供的标签(参见例如，QIAGEN,Inc.)等，其中许多是可商购获得的。例如，如Gentz等人，1989年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-24中所述，六聚组氨酸提供了便利的融合蛋白纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984年，Cell37:767-78)和“FLAG”标签。
用于融合或缀合部分(包括多肽)的方法是已知的(参见例如，Arnon等人，Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，发表于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld等人编辑，1985年)；Hellstrom等人，Antibodies for Drug Delivery，发表于Controlled Drug Delivery623-53(Robinson等人编辑，第2版，1987年)；Thorpe,Antibody Carriers of CytotoxicAgents in Cancer Therapy:A Review，发表于Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications 475-506(Pinchera等人编辑，1985年)；Analysis,Results,andFuture Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy，发表于Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin等人编辑，1985年)；Thorpe等人，1982年，Immunol.Rev.62:119-58；美国专利5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,723,125；5,783,181；5,908,626；5,844,095；和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人，1991年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:10535-39；Traunecker等人，1988年，Nature，331:84-86；Zheng等人，1995年，J.Immunol.154:5590-600；以及Vil等人，1992年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41)。
在一些实施方案中，包含本文提供的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽可以在与CD40结合时调节CD40。在某些实施方案中，包含本文提供的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽可以在与CD40结合时使CD40活化。
在一个方面，CD40在结合单链三聚体CD40L融合蛋白时活化。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白以小于约4nM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白以小于约3nM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白以小于约1nM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白以小于约500pM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L融合蛋白以小于约100pM的EC50活化CD40。
在一个方面，CD40在结合单链三聚体CD40L Fc融合蛋白时活化。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白以小于约4nM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白以小于约3nM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40LFc融合蛋白以小于约1nM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白以小于约500pM的EC50活化CD40。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白以小于约100pM的EC50活化CD40。
在某些实施方案中，EC50小于约1nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.9nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.8nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.7nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.6nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.5nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.4nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.300nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.2nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.19nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.18nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.17nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.16nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.15nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.14nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.13nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.12nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.11nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.1nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.09nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.08nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.07nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.06nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.05nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.04nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.03nM。在一个实施方案中，EC50小于约0.02nM。在一个实施方案中，EC50为或小于约0.01nM。在某些实施方案中。在一个实施方案中，EC50EC50小于约1pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.9pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.8pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.7pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.6pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.5pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.4pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.300pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.2pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.19pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.18pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.17pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.16pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.15pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.14pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.13pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.12pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.11pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.1pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.09pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.08pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.07pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.06pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.05pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.04pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.03pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.02pM。在一个实施方案中，EC50小于约0.01pM。在某些实施方案中。在一个实施方案中，EC50小于约1000pM。在一个实施方案中，EC50小于约900pM。在一个实施方案中，EC50小于约800pM。在一个实施方案中，EC50小于约700pM。在一个实施方案中，EC50小于约600pM。在一个实施方案中，EC50小于约500pM。在一个实施方案中，EC50小于约400pM。在一个实施方案中，EC50小于约300pM。在一个实施方案中，EC50小于约200pM。在一个实施方案中，EC50小于约190pM。在一个实施方案中，EC50小于约180pM。在一个实施方案中，EC50小于约170pM。在一个实施方案中，EC50小于约160pM。在一个实施方案中，EC50小于约150pM。在一个实施方案中，EC50小于约140pM。在一个实施方案中，EC50小于约130pM。在一个实施方案中，EC50小于约120pM。在一个实施方案中，EC50小于约110pM。在一个实施方案中，EC50小于约100pM。在一个实施方案中，EC50小于约90pM。在一个实施方案中，EC50小于约80pM。在一个实施方案中，EC50小于约70pM。在一个实施方案中，EC50小于约60pM。在一个实施方案中，EC50小于约50pM。在一个实施方案中，EC50小于约40pM。在一个实施方案中，EC50小于约30pM。在一个实施方案中，EC50小于约20pM。在一个实施方案中，EC50小于约10pM。
本文还提供了调节CD40多肽的方法，包括使CD40多肽与包含本文提供的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。本文还提供了活化CD40多肽的方法，包括使CD40多肽与包含本文提供的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。
还提供了活化CD40多肽的方法，包括使CD40多肽与单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合时使所述CD40多肽活化。
还提供了活化表达CD40多肽的靶细胞的方法，包括使靶细胞与包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触，从而产生活化的靶细胞。在具体的实施方案中，与靶细胞接触的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中多肽在结合CD40时使靶细胞活化。在一些实施方案中，活化的靶细胞依次活化另一个细胞。在一些实施方案中，活化的靶细胞活化T细胞。在一些实施方案中，活化的靶细胞活化T细胞群。
在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。在一个实施方案中，靶细胞是树突状细胞。在一个实施方案中，靶细胞是巨噬细胞。在一个实施方案中，靶细胞是自然杀伤细胞。在一个实施方案中，靶细胞是单核细胞。在一个实施方案中，靶细胞是粒细胞。在一个实施方案中，靶细胞是嗜酸性粒细胞。在一个实施方案中，靶细胞是粒细胞。在一个实施方案中，靶细胞是嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，靶细胞是朗格汉斯细胞。在一些实施方案中，靶细胞是前列腺腺细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是初始B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是基础呼吸细胞。
在一些实施方案中，活化的靶细胞活化另一个细胞。在一些实施方案中，活化的靶细胞活化不表达CD40多肽的另一个细胞。在一些实施方案中，活化的靶细胞活化免疫细胞。在一些实施方案中，活化的靶细胞活化T细胞。在一些实施方案中，活化的靶细胞活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、MAIT、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。在一个实施方案中，活化的靶细胞活化CD4+T细胞。在一个实施方案中，活化的靶细胞活化CD8+T细胞。在一个实施方案中，活化的靶细胞活化MAIT。在一个实施方案中，活化的靶细胞活化自然杀伤细胞。在一个实施方案中，活化的靶细胞活化嗜中性粒细胞。
在一些实施方案中，靶细胞的活化测量为靶细胞的增殖或成熟增加。在一个实施方案中，靶细胞的活化测量为靶细胞的增殖增加。在一个实施方案中，靶细胞的活化测量为靶细胞的成熟增加。在特定实施方案中，靶细胞的增殖或成熟增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约10％-100％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约100％-200％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约200％-300％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约300％-400％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约400％-500％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约500％-600％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约600％-700％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约700％-800％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约800％-900％。在另一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约900％-1000％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约10％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约20％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约30％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约40％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约45％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约50％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约55％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约60％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约65％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约70％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约75％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约80％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约85％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约90％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约95％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约100％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约125％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约150％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约175％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约200％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约250％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约300％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约400％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约500％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约600％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约700％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约800％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约900％。在一个实施方案中，靶细胞的增殖增加约1000％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约10％-100％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约100％-200％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约200％-300％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约300％-400％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约400％-500％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约500％-600％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约600％-700％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约700％-800％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约800％-900％。在另一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约900％-1000％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约10％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约20％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约30％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约40％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约45％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约50％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约55％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约60％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约65％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约70％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约75％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约80％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约85％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约90％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约95％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约100％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约125％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约150％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约175％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约200％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约250％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约300％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约400％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约500％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约600％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约700％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约800％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约900％。在一个实施方案中，靶细胞的成熟增加约1000％。
在一些实施方案中，靶细胞的活化测量为靶细胞的存活时间延长。在特定实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％-100％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约100％-200％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约200％-300％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约300％-400％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约400％-500％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约500％-600％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约600％-700％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约700％-800％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约800％-900％。在另一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约900％-1000％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约20％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约30％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约40％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约45％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约50％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约55％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约60％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约65％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约70％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约75％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约80％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约85％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约90％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约95％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约100％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约125％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约150％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约175％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约200％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约250％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约300％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约400％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约500％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约600％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约700％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约800％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约900％。在一个实施方案中，靶细胞的存活时间增加约1000％。
还提供了活化T细胞的方法，包括使T细胞在存在单链三聚体CD40LFc融合蛋白的情况下与抗原呈递细胞接触，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中抗原呈递细胞表达CD40多肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合CD40多肽时使T细胞活化。在一些实施方案中，抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原。
在一些实施方案中，通过T细胞对促炎细胞因子的分泌增加来测量T细胞群的活化。在一些实施方案中，促炎细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或它们的任何组合。在一个实施方案中，细胞因子是IL-1。在一个实施方案中，细胞因子是IL-2。在一个实施方案中，细胞因子是IL-6。在一个实施方案中，细胞因子是IL-12。在一个实施方案中，细胞因子是IL-17。在一个实施方案中，细胞因子是IL-22。在一个实施方案中，细胞因子是IL-23。在一个实施方案中，细胞因子是GM-CSF。在一个实施方案中，细胞因子是TNF-α。在一个实施方案中，细胞因子是IFN-γ。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原。在一些实施方案中，在通过单链三聚体CD40L Fc融合蛋白活化抗原呈递细胞时，通过抗原呈递细胞向T细胞的抗原呈递增加。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含B细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含巨噬细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含树突状细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含自然杀伤细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含单核细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含粒细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含嗜中性粒细胞。
还提供了活化树突状细胞的方法，包括使CD40多肽与单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合CD40时使树突状细胞多肽活化。
在一些实施方案中，该方法包括使CD40多肽与包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于促进B细胞群的抗体产生的方法，包括使B细胞与包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。在具体的实施方案中，与B细胞群接触的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一些实施方案中，使B细胞在存在靶抗原的情况下与包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触，并且其中由B细胞产生的抗体特异性地结合至抗原。在一些实施方案中，靶抗原与单链三聚体CD40L融合蛋白化学缀合或重组融合。在一些实施方案中，靶抗原由抗原呈递细胞呈递。在一些实施方案中，靶抗原与MHC I类复合物缔合。在一些实施方案中，靶抗原与MHC II类复合物缔合。在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于感染性病原体。在一些实施方案中，靶抗原源于或来源于患病细胞。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
在一些实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约10％-100％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约100％-200％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约200％-300％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约300％-400％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约400％-500％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约500％-600％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约600％-700％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约700％-800％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约800％-900％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约900％-1000％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约10％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约20％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约30％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约40％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约45％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约50％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约55％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约60％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约65％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约70％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约75％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约80％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约85％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约90％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约95％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约100％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约125％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约150％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约175％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约200％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约250％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约300％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约400％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约500％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约600％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约700％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约800％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约900％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约1000％。在一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约10％-100％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约100％-200％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约200％-300％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约300％-400％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约400％-500％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约500％-600％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约600％-700％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约700％-800％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约800％-900％。在另一个实施方案中，B细胞群的抗体产生增加约900％-1000％。在一些实施方案中，所述方法进一步促进能够响应于抗原产生抗体的记忆B细胞的形成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于增加免疫细胞群分泌促炎细胞因子的方法，包括使免疫细胞群在存在包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽的情况下与抗原呈递细胞群接触。在具体的实施方案中，与抗原呈递细胞群接触的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群向免疫细胞群呈递抗原。在一些实施方案中，免疫细胞群体包含T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞群是T细胞群。在具体的实施方案中，在抗原呈递细胞活化时，抗原呈递细胞群向免疫细胞群的抗原呈递增加。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约10％-20％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约20％-30％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约30％-40％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约40％-50％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约50％-60％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约60％-70％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约70％-80％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约80％-90％。在另一个实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约90％-99％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约10％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约20％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约30％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约40％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约45％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约50％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约55％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约60％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约65％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约70％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约75％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约80％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约85％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约90％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约95％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群中呈递抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约或99％。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含B细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含巨噬细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含树突状细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含自然杀伤细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含单核细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含粒细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞群包含嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或它们的任何组合。在一个实施方案中，细胞因子是IL-1。在一个实施方案中，细胞因子是IL-2。在一个实施方案中，细胞因子是IL-6。在一个实施方案中，细胞因子是IL-12。在一个实施方案中，细胞因子是IL-17。在一个实施方案中，细胞因子是IL-22。在一个实施方案中，细胞因子是IL-23。在一个实施方案中，细胞因子是GM-CSF。在一个实施方案中，细胞因子是TNF-α。在一个实施方案中，细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，细胞因子产生增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约10％-100％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约100％-200％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约200％-300％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约300％-400％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约400％-500％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约500％-600％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约600％-700％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约700％-800％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约800％-900％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约900％-1000％。在另一个实施方案中，细胞因子产生增加约10％-1000％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约20％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约30％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约40％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约45％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约50％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约55％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约60％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约65％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约70％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约75％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约80％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约85％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约90％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约95％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约100％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约125％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约150％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约175％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约200％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约250％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约300％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约400％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约500％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约600％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约700％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约800％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约900％。在一个实施方案中，细胞因子产生增加约1000％。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于增加巨噬细胞群对患病细胞的吞噬作用的方法，包括使患病细胞、巨噬细胞，或患病细胞和巨噬细胞两者与包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。在具体的实施方案中，与巨噬细胞群接触的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约10％-20％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约20％-30％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约30％-40％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约40％-50％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约50％-60％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约60％-70％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约70％-80％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约80％-90％。在另一个实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约90％-99％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约10％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约20％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约30％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约40％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约45％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约50％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约55％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约60％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约65％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约70％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约75％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约80％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约85％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约90％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约95％。在一些实施方案中，巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约或99％。
在一些实施方案中，通过共培养用第一荧光染料标记的巨噬细胞和用第二荧光染料标记的患病细胞来测量巨噬细胞的吞噬作用，其中第一荧光染料和第二荧光染料不同。在一些实施方案中，通过测定包含患病细胞的巨噬细胞的百分比来测量吞噬性巨噬细胞的百分比。在具体的实施方案中，患病细胞是癌细胞。在具体的实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于增加树突状细胞群的抗原呈递的方法，包括使树突状细胞与包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。在具体的实施方案中，与树突状细胞群接触的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，抗原源于或来源于感染性病原体。在一些实施方案中，抗原源于或来源于患病细胞。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。在一些实施方案中，抗原与包含单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽化学缀合或重组融合。
在一些实施方案中，通过共培养用第一荧光染料标记的树突状细胞和用第二荧光染料标记的抗原来测量树突状细胞的抗原呈递，其中第一荧光染料和第二荧光染料不同。在一些实施方案中，通过测定树突状细胞群中与抗原共定位的树突状细胞的百分比来测量呈递抗原的树突状细胞的百分比。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约10％-20％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约20％-30％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约30％-40％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约40％-50％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约50％-60％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约60％-70％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约70％-80％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约80％-90％。在另一个实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约90％-99％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约10％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约20％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约30％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约40％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约45％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约50％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约55％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约60％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约65％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约70％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约75％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约80％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约85％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约90％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约95％。在一些实施方案中，树突状细胞群中呈递抗原的树突状细胞的最小百分比增加约或99％。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于增加靶细胞表达CD40多肽的方法，包括使靶细胞与包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。在具体的实施方案中，与靶细胞接触的多肽是单链三聚体CD40LFc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一些实施方案中，靶细胞是患病细胞。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。在一些实施方案中，靶细胞是选自B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合的免疫细胞。
在一些实施方案中，患病细胞群减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约10％-20％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约20％-30％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约30％-40％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约40％-50％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约50％-60％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约60％-70％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约70％-80％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约80％-90％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约90％-99％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约10％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约20％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约30％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约40％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约45％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约50％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约55％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约60％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约65％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约70％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约75％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约80％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约85％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约90％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约95％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约99％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约100％。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于在患病细胞群周围的组织中形成促炎环境的方法，包括使组织与包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽接触。在具体的实施方案中，与组织接触的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一些实施方案中，组织中活化的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、MAIT、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞的浸润增加。在一些实施方案中，活化的B细胞的浸润增加。在一些实施方案中，CD4+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，CD8+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，树突状细胞的浸润增加。在一些实施方案中，巨噬细胞的浸润增加。在一些实施方案中，自然杀伤细胞的浸润增加。在一些实施方案中，单核细胞的浸润增加。在一些实施方案中，粒细胞的浸润增加。在一些实施方案中，嗜酸性粒细胞的浸润增加。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞的浸润增加。
在一些实施方案中，组织中促炎细胞因子的浓度增加。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或它们的任何组合。在一个实施方案中，细胞因子是IL-1。在一个实施方案中，细胞因子是IL-2。在一个实施方案中，细胞因子是IL-6。在一个实施方案中，细胞因子是IL-12。在一个实施方案中，细胞因子是IL-17。在一个实施方案中，细胞因子是IL-22。在一个实施方案中，细胞因子是IL-23。在一个实施方案中，细胞因子是GM-CSF。在一个实施方案中，细胞因子是TNF-α。在一个实施方案中，细胞因子是IFN-γ。
在一些实施方案中，组织中抗原呈递细胞对源于或来源于患病细胞的抗原的呈递增加。在一些实施方案中，组织中患病细胞的吞噬作用增加。在一些实施方案中，组织中由细胞介导的细胞毒性诱导的患病细胞的凋亡增加。在一些实施方案中，组织中由抗体依赖性细胞毒性诱导的患病细胞的凋亡增加。在一些实施方案中，组织中的患病细胞群减少。在一些实施方案中，组织中的患病细胞群减少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约10％-20％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约20％-30％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约30％-40％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约40％-50％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约50％-60％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约60％-70％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约70％-80％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约80％-90％。在另一个实施方案中，患病细胞群减少约90％-99％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约10％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约20％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约30％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约40％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约45％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约50％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约55％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约60％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约65％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约70％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约75％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约80％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约85％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约90％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约95％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约99％。在一个实施方案中，患病细胞群减少约100％。
使用方法
根据某些实施方案，所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白可以在缓冲组合物中提供以供储存或使用。用于储存所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的合适缓冲液将用于维持
在一个方面，本文提供了一种治疗疾病的方法。
本文还提供了一种用于治疗的如本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。此类疗法包括根据本文及其所有实施方案所定义的治疗方法和治疗用途的那些疗法。
本文还提供了一种用于治疗疾病或病症的如本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。此类方法包括根据本文及其所有实施方案所定义的疾病或病症的治疗方法的那些方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于消除受试者的患病细胞的方法，包括向受试者施用有效量的包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。在具体的实施方案中，向受试者施用的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，患病细胞不表达CD40多肽。在一些实施方案中，患病细胞表达CD40多肽。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，患病细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
本文还提供了一种用于消除受试者的患病细胞的如本文所述的单链三聚体CD40LFc融合蛋白。在某些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在其他实施方案中，患病细胞是用病原体感染的细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。在具体的实施方案中，向受试者施用的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
还提供了治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，该方法包括施用同源二聚体。在一些实施方案中，该方法包括施用同源二聚体。
本文还提供了一种用于治疗癌症的包含如本文所述的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。此类治疗包括根据本文及其所有实施方案所定义的治疗癌症的方法的那些治疗。在具体的实施方案中，用于治疗癌症的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
本文还提供了一种用于治疗癌症的如本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。此类治疗包括根据本文及其所有实施方案所定义的治疗癌症的方法的那些治疗。
本文还提供了一种用于治疗癌症的包含两个如本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体。此类治疗包括根据本文及其所有实施方案所定义的治疗癌症的方法的那些治疗。
在一些实施方案中，癌症是实体癌。在一些实施方案中，癌症是液体癌。在一些实施方案中，癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。在一个实施方案中，癌症是黑色素瘤。在一个实施方案中，癌症是间皮瘤。在一个实施方案中，癌症是晚期实体瘤。在一个实施方案中，癌症是淋巴瘤。
在一些实施方案中，该方法包括施用包含药学上可接受的载体和单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，该方法包括施用同源二聚体。在一些实施方案中，该方法包括施用异源二聚体。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法增强先天抗肿瘤免疫应答。如本文所用，“抗肿瘤免疫应答”是指被募集、引发和/或活化以发动针对特定肿瘤靶标的免疫应答的个体的免疫细胞，例如T细胞、B细胞或其他抗原呈递细胞(例如，树突状细胞(DC))。在一些实施方案中，由包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽活化的抗原呈递细胞可以依次活化另外的细胞类型，诸如T细胞。另选地，抗肿瘤免疫应答包括肿瘤负荷的减少。该术语还涵盖细胞因子的募集，诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以增强免疫激活和/或诱导始发态细胞向淋巴结的迁移。
在一个实施方案中，该疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。在一些实施方案中，癌症是实体瘤癌症。在其他实施方案中，癌症是血癌。
在一些实施方案中，癌症是肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻窦癌、皮肤癌、软组织肉瘤、脊椎癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌。
在一些实施方案中，肾上腺癌是肾上腺皮质癌(ACC)、副肾皮质癌、嗜铬细胞瘤或神经母细胞瘤。在一些实施方案中，肛门癌是鳞状细胞癌、一穴肛原癌、腺癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，阑尾癌是神经内分泌肿瘤(NET)、粘液腺癌、杯状细胞类癌、肠型腺癌或印戒细胞腺癌。在一些实施方案中，胆管癌是肝外胆管癌、腺癌、肝门部胆管癌、肝门周围胆管癌、远端胆管癌或肝内胆管癌。在一些实施方案中，膀胱癌是移行细胞癌(TCC)、乳头状癌、扁平癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施方案中，骨癌是原发性骨癌、肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤或转移性骨癌。在一些实施方案中，脑癌是星形细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、混合胶质瘤、垂体腺癌、垂体腺瘤、颅咽管瘤、生殖细胞肿瘤、松果体区肿瘤、髓母细胞瘤或原发性CNS淋巴瘤。在一些实施方案中，乳腺癌是乳腺腺癌、浸润性乳腺癌、非浸润性乳腺癌、乳腺肉瘤、化生性癌、腺样囊性癌、叶状肿瘤、血管肉瘤、HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌或炎性乳腺癌。在一些实施方案中，宫颈癌是鳞状细胞癌或腺癌。在一些实施方案中，结直肠癌是结直肠腺癌、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、类癌瘤、粘液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠道类癌瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，食道癌是腺癌或鳞状细胞癌。在一些实施方案中，胆囊癌是腺癌、乳头状腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施方案中，妊娠滋养细胞疾病(GTD)是葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤(PSTT)或上皮样滋养细胞肿瘤(ETT)。在一些实施方案中，头颈癌是喉癌、鼻咽癌、下咽癌、鼻腔癌、鼻窦癌、唾液腺癌、口腔癌、口咽癌或扁桃体癌。在一些实施方案中，霍奇金淋巴瘤是经典霍奇金淋巴瘤、结节硬化型、混合细胞型、富于淋巴细胞型、淋巴细胞消减型或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在一些实施方案中，肠癌是小肠癌(small intestine cancer)、小肠癌(smallbowel cancer)、腺癌、肉瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤或淋巴瘤。在一些实施方案中，肾癌是肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、乳头状RCC、嫌色细胞RCC、集合管RCC、未分类RCC、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾盂癌或肾肉瘤。在一些实施方案中，白血病是急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在一个具体的实施方案中，白血病是AML。在一些实施方案中，肝癌是肝细胞癌(HCC)、纤维板层样HCC、胆管癌、血管肉瘤或肝转移。在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌、小细胞癌、组合小细胞癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞未分化癌、肺结节、转移性肺癌、腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌、唾液腺型肺癌、肺类癌、间皮瘤、肺肉瘤样癌或恶性颗粒细胞肺肿瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤是浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣性黑色素瘤、恶性雀斑样痣性黑色素瘤、无色素性黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、眼球黑色素瘤或转移性黑色素瘤。在一些实施方案中，间皮瘤是胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤或睾丸间皮瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是活动性骨髓瘤或冒烟型骨髓瘤。在一些实施方案中，神经内分泌肿瘤是胃肠道神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤或肺神经内分泌肿瘤。在一些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、前体T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATLL)、毛细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、自然杀伤细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、阿斯伯格综合症、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、全身性ALCL、肠病型T细胞淋巴瘤(EATL)或肝脾γ/δT细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，口腔癌是鳞状细胞癌、疣状癌、小唾液腺癌、淋巴瘤、良性口腔肿瘤、嗜酸性肉芽肿、纤维瘤、颗粒细胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、骨软骨瘤、脂肪瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤、乳头状瘤、尖锐湿疣、疣状黄瘤、化脓性肉芽肿、横纹肌瘤、牙源性肿瘤、白斑、红斑、鳞状细胞唇癌、基底细胞唇癌、口腔癌、牙龈癌或舌癌。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢上皮癌、粘液性上皮卵巢癌、子宫内膜样上皮卵巢癌、透明细胞上皮卵巢癌、未分化上皮卵巢癌、卵巢低恶性潜能肿瘤、原发性腹膜癌、输卵管癌、生殖细胞瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤、卵巢生殖细胞癌、内胚窦瘤、性索-间质瘤、性索-性腺间质瘤、卵巢间质肿瘤、粒层细胞瘤、颗粒-卵泡膜细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、卵巢肉瘤、卵巢癌肉瘤、卵巢腺肉瘤、卵巢平滑肌肉瘤、卵巢纤维肉瘤、库肯勃瘤或卵巢囊肿。在一些实施方案中，胰腺癌是胰腺外泌腺癌、胰腺内分泌腺癌或胰腺腺癌、胰岛细胞瘤或神经内分泌肿瘤。在一些实施方案中，前列腺癌是前列腺腺癌、前列腺肉瘤、移行细胞癌、小细胞癌或神经内分泌肿瘤。在一些实施方案中，鼻窦癌是鳞状细胞癌、粘膜细胞癌、腺样囊性细胞癌、腺泡细胞癌、鼻窦未分化癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、上颌窦癌、筛窦癌或鼻咽癌。在一些实施方案中，皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、Merkel细胞癌、卡波西肉瘤(KS)、光化性角化病、皮肤淋巴瘤或角化棘皮瘤。在一些实施方案中，软组织癌是血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤(DL)、粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤(MRCL)、高分化脂肪肉瘤(WDL)、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(RMS)或滑膜肉瘤。在一些实施方案中，脊椎癌是脊椎转移瘤。在一些实施方案中，胃癌是胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤、胃类癌瘤、I型ECL细胞类癌、II型ECL细胞类癌或III型ECL细胞类癌。在一些实施方案中，睾丸癌是精原细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊癌、绒毛膜癌、畸胎瘤、性腺间质瘤、睾丸间质细胞瘤或睾丸支持细胞瘤。在一些实施方案中，喉癌是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、喉鳞状细胞癌、喉腺癌、淋巴上皮瘤、梭形细胞癌、疣状癌、未分化癌或淋巴结癌。在一些实施方案中，甲状腺癌是乳头状癌、滤泡状癌、Hürthle细胞癌、甲状腺髓样癌或未分化癌。在一些实施方案中，子宫癌是子宫内膜癌、子宫内膜腺癌、子宫内膜样癌、浆液性腺癌、腺鳞癌、子宫癌肉瘤、子宫肉瘤、子宫平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤或未分化肉瘤。在一些实施方案中，阴道癌是鳞状细胞癌、腺癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施方案中，外阴癌是鳞状细胞癌或腺癌。
在一个方面，该受试者是有需要的受试者。在另一方面，该受试者是人类。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。该术语是指当施用于患有或易患疾病、病症和/或病状的受试者时足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、病症和/或病状的症状发作的量。本领域普通技术人员应当理解，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案来施用。
根据特定实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、或五者或更多者的治疗量：(i)减小或改善要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的严重程度；(ii)减少要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展；(iv)引起要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状消退；(v)预防要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中要治疗的疾病、障碍或病症或与之相关联的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如要治疗的疾病、障碍或病症、施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人或动物、是否施用了其他药物，并且无论治疗是预防性的还是治疗性的。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。
如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与癌症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选地癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。
在一些实施方案中，如本文所提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段与第二疗法联合使用。在一些实施方案中，第二疗法选自由手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、骨髓移植、冷冻消融术和射频消融术组成的组。
在一些实施方案中，第二疗法是免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法涵盖单克隆抗体、肿瘤不可知的治疗(诸如检查点抑制剂)、T细胞疗法(诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法)或癌症疫苗。
如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用至受试者之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周以前)，与此同时，或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周以后)施用。
在另一方面，本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的感染的方法，包括向受试者施用有效量的包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。在具体的实施方案中，向受试者施用的多肽是单链三聚体CD40LFc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗感染免疫应答。在一个实施方案中，所述治疗增强先天抗感染免疫应答。在一个实施方案中，所述治疗增强体液抗感染免疫应答。在一个实施方案中，所述治疗增强细胞介导的抗感染免疫应答。
本文还提供了一种用于治疗感染的包含如本文所述的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。此类治疗包括根据本文及其所有实施方案所定义的治疗感染的方法的那些治疗。在具体的实施方案中，用于治疗感染的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
本文还提供了一种用于治疗感染的如本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。此类治疗包括根据本文及其所有实施方案所定义的用于治疗感染的方法的那些治疗。
本文还提供了一种用于治疗感染的包含两个如本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体。此类治疗包括根据本文及其所有实施方案所定义的治疗感染的方法的那些治疗。
在一些实施方案中，感染由感染性病原体(诸如病毒、细菌、真菌或寄生虫)引起。在一个实施方案中，病原体是病毒。在另一个实施方案中，病原体是细菌。在一个实施方案中，病原体是真菌。在另一个实施方案中，病原体是寄生虫。在一些实施方案中，将多肽与疫苗组合物共同施用以预防受试者的感染。
在一些实施方案中，将多肽与疫苗组合物同时或依次共同施用。
在另一方面，本文提供了一种用于改善受试者对疫苗的反应的方法，包括向受试者施用有效量的包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽。在一个具体的实施方案中，将单链三聚体CD40L融合蛋白与疫苗同时或依次施用于受试者。在具体的实施方案中，向受试者施用的多肽是单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。在一些实施方案中，所述治疗增强对疫苗的先天的、体液的或细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，所述治疗增强对疫苗的先天免疫应答。在一个实施方案中，所述治疗增强对疫苗的体液免疫应答。在一个实施方案中，所述治疗增强对疫苗的细胞介导的免疫应答。
在一些实施方案中，疫苗针对感染性病原体，诸如病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一个实施方案中，病原体是病毒。在另一个实施方案中，病原体是细菌。在一个实施方案中，病原体是真菌。在另一个实施方案中，病原体是寄生虫。在另一个实施方案中，疫苗是针对癌症的。在另一个实施方案中，疫苗是针对肿瘤的。在另一个实施方案中，疫苗是针对过敏原的。还考虑其他类型的疫苗。在一些实施方案中，将多肽与疫苗组合物共同施用以增强受试者对疫苗的免疫应答。在一些实施方案中，多肽充当疫苗的助剂。
在一些实施方案中，将本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者是人。在另外其他实施方案中，经由口服递送、经颊递送、经鼻递送或吸入递送向受试者施用单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
在另外其他实施方案中，本文提供了本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白用于治疗受试者的疾病或病症的用途。在一些实施方案中，经由口服递送向受试者施用治疗分子。在一些实施方案中，经由经颊递送向受试者施用治疗分子。在一些实施方案中，经由经鼻递送向受试者施用治疗分子。在一些实施方案中，经由吸入递送向受试者施用治疗分子。
还提供了一种包括用于提供单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的装置的系统，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包括用于提供包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的装置的系统，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包括用于提供编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸的装置的系统，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一个方面，本文提供了一种包括用于提供载体的装置的系统，该载体包含编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种包含宿主细胞的系统，该宿主细胞包含载体，该载体包含编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在另一方面，本文提供了一种提供用于提供药物组合物的装置的系统，该药物组合物包含药学上可接受的载体和单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
在一个方面，本文提供了一种提供包含单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的试剂盒的系统，该融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
还提供了编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的核酸分子以及编码本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的组分的核酸分子。也提供了套件，其包含载体和用于该载体的包装。还提供了包含载体的宿主细胞，该载体含有编码本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的核酸分子。
还提供了一种用于制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的方法。
在一个方面，本文提供了一种用于制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的方法，包括(a)将编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中，该融合蛋白包含(i)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(ii)Fc单体肽；(b)在制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养宿主细胞，以及(c)从细胞或培养物中回收单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段。
在另一方面，本文提供了一种制备包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的方法，包括(a)将编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中，该融合蛋白包含(i)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(ii)Fc单体肽；(b)在制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养宿主细胞；(c)从细胞或培养物中回收单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段，以及(d)在有利于二聚化的条件下组合单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段。
在另一方面，本文提供了一种制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的药物组合物的方法，包括将单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
在另一方面，本文提供了一种制备包含单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的疫苗组合物的方法，包括将单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段与疫苗抗原组合以获得疫苗组合物。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段包含具有促进异源二聚化的互补CH3结构域的IgG样分子。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段包含重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段包含IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段包含Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段包含Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段包含基于scFv和双体抗体的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白质或载剂分子融合。
在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵臼结构(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)、AzymetricTMplatform(Zymeworks)和DuoBody(Genmab A/S)。
在一些实施方案中，重组IgG样双靶向分子包括双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联mAb(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)和CovX体(CovX/Pfizer)。
在一些实施方案中，IgG融合分子包括双重可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)以及TvAb(Roche)。
在一些实施方案中，Fc融合分子可包括ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、双亲和性重靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)和双(ScFv)2-Fab(National Research Center for AntibodyMedicine--China)。
如本文所用，“同源二聚化”是指两个相同的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的Fc单体肽之间的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有相同的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的分子。
如本文所用，“异源二聚化”是指单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的Fc单体肽与不同的Fc融合肽之间的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
“杵臼结构”策略(参见例如PCT公布WO2006/028936)可用于产生全长单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成杵臼结构的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637；或美国专利公布US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405AY407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述。
在某些实施方案中，本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白以小于约1pM、小于约0.9pM、小于约0.8pM、小于约0.7pM、小于约0.6pM、小于约0.5pM、小于约0.4pM、小于约0.300pM、小于约0.2pM、小于约0.19pM、小于约0.18pM、小于约0.17pM、小于约0.16pM、小于约0.15pM、小于约0.14pM、小于约0.13pM、小于约0.12pM、小于约0.11pM、小于约0.1pM、小于约0.09pM、小于约0.08pM、小于约0.07pM、小于约0.06pM、小于约0.05pM、小于约0.04pM、小于约0.03pM、小于约0.02pM或小于约0.01pM的EC50使CD40活化。在某些实施方案中，EC50小于约1000pM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约190pM、小于约180pM、小于约170pM、小于约160pM、小于约150pM、小于约140pM、小于约130pM、小于约120pM、小于约110pM、小于约100pM、小于约90pM、小于约80pM、小于约70pM、小于约60pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM或小于约10pM。
在某些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的浓度为约0.000005ng/mL、约0.00005ng/mL、约0.0005ng/mL、约0.005ng/mL、约0.01ng/mL、约0.02ng/mL、约0.03ng/mL、约0.04ng/mL、约0.05ng/mL、约0.06ng/mL、约0.07ng/mL、约0.08ng/mL、约0.09ng/mL、约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1.0ng/mL、约10ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL或约1000ng/mL。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的一种或多种组分是人的。在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的一种或多种组分是人源化的。
在一些实施方案中，单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的Fc单体肽衍生自IgG抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG2抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG3抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG4抗体。
在另一个总的方面，本发明涉及包含编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的多核苷酸的载体。根据本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记物和复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可以用于根据本文所提供的实施方案生成重组表达载体。根据本公开，此类技术是本领域技术人员所熟知的。
在另一个总的方面，本发明涉及包含载体的宿主细胞，该载体包含编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的多核苷酸。在另一个总的方面，本发明涉及包含编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的多核苷酸的宿主细胞。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞都可以用于重组表达本文所提供的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如Fc单体肽)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如单链三聚体CD40LFc融合蛋白)。根据具体实施方案，通过常规方法诸如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其中将该重组表达载体稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸有效表达。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了包含用于递送本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的装置和药学上可接受的载体的药物组合物。
还提供了制备药物组合物的方法，包括将本文所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”意指包含本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白连同药学上可接受的载体的产品。因此，药物组合物可包含本文提供的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，并且包含它们的组合物也可用于制备用于本文提及的治疗应用的药物。
如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其它材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的有效性或本文所提供的组合物的生物活性的非毒性材料。根据特定实施方案，鉴于本公开，本文可以使用适用于具有融合蛋白作为活性成分的药物组合物的任何药学上可接受的载体。
药物活性成分与药学上可接受的载剂的制剂为本领域中已知的，例如，“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(例如，第21版(2005年)以及任何后续版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载剂可用于配制本文所提供的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％w/w、70％w/w、75％w/w、80％w/w、85％w/w、90％w/w或至少95％w/w的水。
在一个实施方案中，药物组合物可被配制为可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。注射可以例如皮下、肌内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送。
在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，诸如压片和/或包衣片，以及胶囊剂(例如，硬明胶胶囊或软明胶胶囊)。药物组合物也可为例如用于重构的小药囊、糖衣丸、粉末、颗粒剂、锭剂或粉末的形式。
剂型可以是速释型，在这种情况下它们可包含水溶性或水分散性载剂，或者它们可被延迟释放、缓释或改变释放，在这种情况下它们可包含在胃肠道中或在皮下调节剂型的溶解速率的水不溶性聚合物。
在其它实施方案中，药物组合物可以鼻内、颊内或舌下递送。
水性制剂中的pH可介于pH 3和pH 10之间。在一个本文所提供的实施方案中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本文所提供的另一个实施方案中，制剂的pH为约3.0至约7.0。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性示例包括：精氨酸、天冬氨酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三嗪和三(羟甲基)氨基甲烷、以及它们的混合物。缓冲剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本文所提供的另选实施方案。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性示例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苄醇、溴代硝基丙二醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己啶、氯苯甘油醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞以及它们的混合物。防腐剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本文所提供的另选实施方案。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含等渗剂。该实施方案的非限制性示例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(诸如甘油、1,2-丙二醇、丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)以及它们的混合物。等渗剂的另一个示例包括糖。糖的非限制性示例可包括单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉或羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个示例是糖醇，其中术语“糖醇”被定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性示例包括甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。等渗剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本文所提供的替代物。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性示例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐、以及它们的混合物。螯合剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的另选实施方案。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性示例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中稳定剂是羧基纤维素/羟基纤维素及其衍生物(诸如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲基硫代乙醇、聚乙二醇(诸如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐类(诸如氯化钠)、含硫物质(诸如单硫代甘油)或巯乙酸。稳定剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本文所提供的另选实施方案。
在本文所提供的另外的实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选地一种表面活性剂、至少一个种表面活性剂、或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指任何由水溶性部分(亲水性)和脂溶性和部分(亲脂性)组成的分子或离子。例如，表面活性剂可选自由阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂组成的组。表面活性剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本文所提供的另选实施方案。
在本文所提供的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如例如EDTA、和/或苯甲脒盐酸盐(HCl)。蛋白酶抑制剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/mL至约20mg/mL的浓度存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本文所提供的另选实施方案。
在另一个总的方面，本发明涉及一种制备包含本文公开的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的药物组合物的方法，包括将单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
6.实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
在一组实施方案(A组实施方案)中，提供了：
A1.一种单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40配体(CD40L)亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽。
A2.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
A3.根据实施方案A2所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
A4.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
A5.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
A6.根据实施方案A5所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
A7.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
A8.根据实施方案A7所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
A9.根据实施方案A8所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。
A10.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
A11.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
A12.根据实施方案A11所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
A13.根据实施方案A12所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
A14.根据实施方案A13所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
A15.根据实施方案A14所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述IgG序列包含IgG1序列。
A16.根据实施方案A15所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
A17.根据实施方案A14所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
A18.根据实施方案A17所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29或其片段。
A19.根据实施方案A1所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
A20.根据实施方案A2所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ IDNO:28)组成的组。
A21.根据实施方案A1至A20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化。
A22.根据实施方案A21所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40多肽的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
A23.根据实施方案A22所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
A24.根据实施方案A23所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40L多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
A25.根据实施方案A1至A24中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与野生型CD40L相比增强抗肿瘤活性。
A26.一种二聚体，包含两个根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
A27.根据实施方案A26所述的二聚体，其中所述二聚体是同源二聚体。
A28.根据实施方案A26所述的二聚体，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
A29.一种多核苷酸，其编码根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
A30.一种载体，包含根据实施方案A29所述的多核苷酸。
A31.一种宿主细胞，包含根据实施方案A30所述的载体。
A32.一种宿主细胞，包含根据实施方案A29所述的多核苷酸。
A33.一种药物组合物，包含药学上可接受的载体和根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
A34.一种试剂盒，包含根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40LFc融合蛋白。
A35.根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或根据实施方案26至28中任一项所述的二聚体，用于治疗。
A36.根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或根据实施方案26至28中任一项所述的二聚体，用于治疗疾病或病症。
A37.根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或根据实施方案26至28中任一项所述的二聚体，用于消除受试者的患病细胞。
A38.根据实施方案A37所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述患病细胞是癌细胞或被病原体感染的细胞。
A39.根据实施方案A1至A25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或根据实施方案26至28中任一项所述的二聚体，用于治疗癌症。
A40.根据实施方案A39所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述癌症是实体癌或液体癌。
A41.根据实施方案A39所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。
A42.根据实施方案A1至A25所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或根据实施方案26至28中任一项所述的二聚体，用于治疗感染。
A43.根据实施方案A42所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
A44.根据实施方案A1至A25所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或根据实施方案26至28中任一项所述的二聚体，用于疫苗组合物的施用。
A43.根据实施方案A44所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述疫苗是针对癌症、感染性病原体或过敏原的疫苗。
在另一组实施方案(B组实施方案)中，提供了：
B1.一种系统，包括用于提供单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的装置，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽。
B2.根据实施方案B1所述的系统，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
B3.根据实施方案B2所述的系统，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
B4.根据实施方案B1所述的系统，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
B5.根据实施方案B1所述的系统，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
B6.根据实施方案B5所述的系统，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
B7.根据实施方案B1所述的系统，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
B8.根据实施方案B7所述的系统，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
B9.根据实施方案B8所述的系统，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:16或其片段。
B10.根据实施方案B1所述的系统，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
B11.根据实施方案B1所述的系统，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
B12.根据实施方案B11所述的系统，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
B13.根据实施方案B12所述的系统，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
B14.根据实施方案B13所述的系统，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
B15.根据实施方案B14所述的系统，其中所述IgG序列是IgG1序列。
B16.根据实施方案B15所述的系统，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
B17.根据实施方案B14所述的系统，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
B18.根据实施方案B17所述的系统，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
B19.根据实施方案B1所述的系统，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。B20.根据实施方案B2所述的系统，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ IDNO:28)组成的组。
B21.根据实施方案B1至B20中任一项所述的系统，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化。
B22.根据实施方案B21所述的系统，其中所述CD40多肽的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
B23.根据实施方案B22所述的系统，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
B24.根据实施方案B22所述的系统，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
B25.根据实施方案B1至B24中任一项所述的系统，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
B26.一种系统，包括用于提供包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的装置，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
B27.根据实施方案B26所述的系统，其中所述二聚体是同源二聚体。
B28.根据实施方案B26所述的系统，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
B29.一种系统，包括用于提供编码根据实施方案B1至B25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸的装置。
B30.一种系统，包括用于提供包含根据实施方案B29所述的多核苷酸的载体的装置。
B31.一种系统，包括用于提供包含根据实施方案B30所述的载体的宿主细胞的装置。
B32.一种系统，包括用于提供包含根据实施方案B29所述的多核苷酸的宿主细胞的装置。
B33.一种系统，包括用于提供药物组合物的装置，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据实施方案B1至B25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
B34.一种系统，包括用于提供试剂盒的装置，所述试剂盒包含根据实施方案B1至B25中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白。
在另一组实施方案(C组实施方案)中，提供了：
C1.一种活化CD40多肽的方法，包括使所述CD40多肽与单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合时使所述CD40多肽活化。
C2.根据实施方案C1所述的方法，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
C3.根据实施方案C2所述的方法，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
C4.根据实施方案C1所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
C5.根据实施方案C1所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
C6.根据实施方案C5所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
C7.根据实施方案C1所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
C8.根据实施方案C7所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
C9.根据实施方案C8所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:16或其片段。
C10.根据实施方案C1所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
C11.根据实施方案C1所述的方法，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
C12.根据实施方案C11所述的方法，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
C13.根据实施方案C12所述的方法，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
C14.根据实施方案C13所述的方法，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
C15.根据实施方案C14所述的方法，其中所述IgG序列是IgG1序列。
C16.根据实施方案C15所述的方法，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
C17.根据实施方案C14所述的方法，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
C18.根据实施方案C17所述的方法，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
C19.根据实施方案C1所述的方法，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
C20.根据实施方案C2所述的方法，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
C21.根据实施方案C1至C20中任一项所述的方法，包括与野生型CD40L相比CD40多肽的增强的活化。
C22.根据实施方案C21所述的方法，其中所述CD40多肽的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
C23.根据实施方案C21所述的方法，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
C24.根据实施方案C21所述的方法，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
C25.根据实施方案C1至C24中任一项所述的方法，包括与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
C26.一种活化CD40多肽的方法，包括使所述CD40多肽与包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合时使所述CD40多肽活化。
C27.根据实施方案C26所述的方法，还包括施用同源二聚体。
C28.根据实施方案C26所述的方法，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
C29.根据实施方案C1至C28中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
C30.根据实施方案C1至C28中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
C31.根据实施方案C30所述的方法，进一步地，其中所述接触包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物。
C32.根据实施方案C31所述的方法，其中所述接触增强先天抗肿瘤免疫应答。
C33.一种活化T细胞的方法，包括使所述T细胞在存在单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的情况下与抗原呈递细胞接触，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽，其中所述抗原呈递细胞表达CD40多肽；并且其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合所述CD40多肽时使T细胞活化。
C34.根据实施方案C33所述的方法，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
C35.根据实施方案C34所述的方法，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
C36.根据实施方案C33所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
C37.根据实施方案C33所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
C38.根据实施方案C37所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
C39.根据实施方案C33所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
C40.根据实施方案C39所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
C41.根据实施方案C40所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。
C42.根据实施方案C33所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
C43.根据实施方案C33所述的方法，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
C44.根据实施方案C43所述的方法，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
C45.根据实施方案C44所述的方法，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
C46.根据实施方案C45所述的方法，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
C47.根据实施方案C46所述的方法，其中所述IgG序列是IgG1序列。
C48.根据实施方案C47所述的方法，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
C49.根据实施方案C46所述的方法，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
C50.根据实施方案C49所述的方法，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
C51.根据实施方案C33所述的方法，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
C52.根据实施方案C34所述的方法，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
C53.根据实施方案C33至C52中任一项所述的方法，还包括与野生型CD40L相比所述CD40多肽的增强的活化。
C54.根据实施方案C53所述的方法，其中所述CD40多肽的增强的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
C55.根据实施方案C53所述的方法，还包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
C56.根据实施方案C53所述的方法，还包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
C57.根据实施方案C33至C56中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
C58.一种活化T细胞的方法，包括使CD40多肽在存在包含两个单链三聚体CD40LFc融合蛋白的二聚体的情况下与抗原呈递细胞接触，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中所述抗原呈递细胞表达CD40多肽，并且其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合所述CD40多肽时使所述T细胞活化。
C59.根据实施方案C58所述的方法，还包括施用同源二聚体。
C60.根据实施方案C58所述的方法，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
C61.根据实施方案C33至C60中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
C62.根据实施方案C33至C60中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
C63.根据实施方案C62中任一项所述的方法，进一步地，其中所述接触包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40LFc融合蛋白的药物组合物。
C64.根据实施方案C63所述的方法，其中所述接触增强先天抗肿瘤免疫应答。
C65.一种活化树突状细胞的方法，包括使CD40多肽与单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合所述CD40多肽时使所述树突状细胞活化。
C66.根据实施方案C65所述的方法，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
C67.根据实施方案C66所述的方法，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
C68.根据实施方案C65所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
C69.根据实施方案C65所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
C70.根据实施方案C69所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
C71.根据实施方案C65所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
C72.根据实施方案C71所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
C73.根据实施方案C72所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。
C74.根据实施方案C65所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
C75.根据实施方案C65所述的方法，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
C76.根据实施方案C75所述的方法，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
C77.根据实施方案C76所述的方法，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
C78.根据实施方案C77所述的方法，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
C79.根据实施方案C78所述的方法，其中所述IgG序列是IgG1序列。
C80.根据实施方案C79所述的方法，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
C81.根据实施方案C78所述的方法，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
C82.根据实施方案C81所述的方法，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
C83.根据实施方案C65所述的方法，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
C84.根据实施方案C66所述的方法，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
C85.根据实施方案C65至C84中任一项所述的方法，包括与野生型CD40L相比CD40多肽的增强的活化。
C86.根据实施方案C85所述的方法，其中所述CD40多肽的增强的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
C87.根据实施方案C85所述的方法，还包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
C88.根据实施方案C85所述的方法，还包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
C89.根据实施方案C65至C88中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
C90.一种活化树突状细胞的方法，包括使CD40多肽与包含两个单链三聚体CD40LFc融合蛋白的二聚体接触，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合所述CD40多肽时使所述树突状细胞活化。
C91.根据实施方案C90所述的方法，还包括施用同源二聚体。
C92.根据实施方案C90所述的方法，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
C93.根据实施方案C54至C92中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
C94.根据实施方案C54至C92中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
C95.根据实施方案C94中任一项所述的方法，进一步地，其中所述接触包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40LFc融合蛋白的药物组合物。
C96.根据实施方案C95所述的方法，其中所述接触增强先天抗肿瘤免疫应答。
在另一组实施方案(D组实施方案)中，提供了：
D1.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽。
D2.根据实施方案D1所述的方法，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
D3.根据实施方案D2所述的方法，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
D4.根据实施方案D1所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
D5.根据实施方案D1所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
D6.根据实施方案D5所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
D7.根据实施方案D1所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
D8.根据实施方案D7所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
D9.根据实施方案D8所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:16或其片段。
D10.根据实施方案D1所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
D11.根据实施方案D1所述的方法，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
D12.根据实施方案D11所述的方法，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
D13.根据实施方案D12所述的方法，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
D14.根据实施方案D13所述的方法，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
D15.根据实施方案D14所述的方法，其中所述IgG序列是IgG1序列。
D16.根据实施方案D15所述的方法，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
D17.根据实施方案D14所述的方法，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
D18.根据实施方案D17所述的方法，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
D19.根据实施方案D1所述的方法，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
D20.根据实施方案D2所述的方法，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
D21.根据实施方案D1至D20中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比CD40多肽的增强的活化。
D22.根据实施方案D21所述的方法，其中所述CD40多肽的增强的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
D23.根据实施方案D22所述的方法，其中所述CD40多肽的增强的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
D24.根据实施方案D22所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
D25.根据实施方案D1至D24中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
D26.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
D27.根据实施方案D26所述的方法，还包括施用同源二聚体。
D28.根据实施方案D26所述的方法，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
D29.根据实施方案D1至D28中任一项所述的方法，还包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物。
D30.根据实施方案D1至D29中任一项所述的方法，其中所述治疗增强先天抗肿瘤免疫应答。
D31.根据实施方案D1至D30中任一项所述的方法，还包括共同施用第二疗法。
D32.根据实施方案D1至D31中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。
在另一组实施方案(E组实施方案)中，提供了：
E1.一种用于制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的方法，包括(a)将编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中，所述融合蛋白包含(i)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(ii)Fc单体肽；(b)在制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养宿主细胞，以及(c)从细胞或培养物中回收单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段。
E2.根据实施方案E1所述的方法，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接。
E3.根据实施方案E2所述的方法，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
E4.根据实施方案E1所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
E5.根据实施方案E1所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
E6.根据实施方案E5所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
E7.根据实施方案E1所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
E8.根据实施方案E7所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
E9.根据实施方案E8所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQID NO:16或其片段。
E10.根据实施方案E1所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
E11.根据实施方案E1所述的方法，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
E12.根据实施方案E11所述的方法，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
E13.根据实施方案E12所述的方法，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
E14.根据实施方案E13所述的方法，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
E15.根据实施方案E14所述的方法，其中所述IgG序列是IgG1序列。
E16.根据实施方案E15所述的方法，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
E17.根据实施方案E14所述的方法，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
E18.根据实施方案E17所述的方法，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
E19.根据实施方案E1所述的方法，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ IDNO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
E20.根据实施方案E2所述的方法，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
E21.根据实施方案E1至E20中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化。
E22.根据实施方案E21所述的方法，其中所述CD40多肽的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
E23.根据实施方案E22所述的方法，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
E24.根据实施方案E23所述的方法，其中所述CD40多肽的活化包括与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
E25.根据实施方案E1所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
E26.一种制备包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的方法，各自包括(a)将编码单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中，所述融合蛋白包含(i)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(ii)Fc单体肽；(b)在制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养宿主细胞；(c)从细胞或培养物中回收单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段，以及(d)在有利于二聚化的条件下组合单链三聚体CD40LFc融合蛋白或其片段。
E27.根据实施方案E26所述的方法，其中所述二聚体包括同源二聚体。
E28.根据实施方案E26所述的方法，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
E29.一种制备单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的药物组合物的方法，包括将根据实施方案E1至E25中任一项制备的所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
在另一组实施方案(F组实施方案)中，提供了：
F1.一种增加受试者的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)
通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。F2.一种增加患有癌症的受试者对癌抗原的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F3.一种增加被病原体感染的受试者对所述病原体的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F4.一种增加施用疫苗的受试者对疫苗抗原的免疫应答的方法，其中
所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F5.根据实施方案F1至F4中任一项所述的方法，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸。
F6.根据实施方案F1至F5中任一项所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
F7.根据实施方案F1至F6中任一项所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的N末端。
F8.根据实施方案F1至F7中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段。
F9.根据实施方案F1至F8中任一项所述的方法，其中所述CD40L三聚体连接至所述Fc单体肽的C末端。
F10.根据实施方案F1至F9中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
F11.根据实施方案F1至F10中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16或其片段。
F12.根据实施方案F1至F11中任一项所述的方法，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
F13.根据实施方案F1至F12中任一项所述的方法，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列。
F14.根据实施方案F13所述的方法，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列。
F15.根据实施方案F14所述的方法，其中所述人Fc序列包含IgG序列。
F16.根据实施方案F15所述的方法，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
F17.根据实施方案F16所述的方法，其中所述IgG序列是IgG1序列。
F18.根据实施方案F17所述的方法，其中所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段。
F19.根据实施方案F16所述的方法，其中所述IgG序列包含IgG2序列。
F20.根据实施方案F19所述的方法，其中所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29，或其片段。
F21.根据实施方案F1至F20中任一项所述的方法，其中所述肽接头选自包含EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)的组。
F22.根据实施方案F1至F20中任一项所述的方法，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
F23.根据实施方案F1至F22中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比CD40多肽的增强的活化。
F24.根据实施方案F23所述的方法，其中所述CD40多肽的增强的活化增强树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫刺激功能。
F25.根据实施方案F24所述的方法，其中所述CD40多肽的增强的活化包括与野生型CD40L相比增强的T细胞活化。
F26.根据实施方案F22所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的树突状细胞活化。
F27.根据实施方案F1至F26中任一项所述的方法，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含与野生型CD40L相比增强的抗肿瘤活性。
F28.一种增加受试者的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F29.一种增加患有癌症的受试者对癌抗原的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F30.一种增加被病原体感染的受试者对所述病原体的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F31.一种增加施用疫苗的受试者对疫苗抗原的免疫应答的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，每个融合蛋白包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基；和(b)Fc单体肽。
F32.根据实施方案F28至F31中任一项所述的方法，还包括施用同源二聚体。
F33.根据实施方案F28至F32中任一项所述的方法，其中所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
F34.根据实施方案F28至F33中任一项所述的方法，还包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物。
F35.根据实施方案F28至F34中任一项所述的方法，还包括共同施用第二疗法。
本文描述了本发明的特定实施方案。在阅读前述描述后，所公开的实施方案的变型对于本领域的技术人员来说可能变得显而易见，并且预期那些技术人员可适当地采用此类变型。因此，本发明旨在以不同于本文具体描述的方式实践，并且本发明包括在适用法律允许的情况下在所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或以其它方式与上下文明显矛盾，否则在其所有可能变型中的上述元素的任何组合均涵盖于本发明中。已描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行各种修改。因此，实施例部分中的描述旨在说明而非限制权利要求书中描述的本发明的范围。
7.实施例
实施例1：方法和材料
可溶性三聚体CD40L Fc融合构建体的设计：CD40L是由细胞外结构域、茎区、跨膜螺旋和短胞质结构域组成的膜蛋白。CD40L的活性位于细胞外结构域，并且选择该结构域用于Fc融合构建体的产生。将CD40L ECD(Uniprot ID：P29965)与柔性接头和系链融合在一起以形成具有效应子功能沉默的人IgG1和人IgG2同种型的N末端融合体。CD40L亚基之间的接头是9个或12个氨基酸，并且针对柔性进行选择，尽管没有测试其他长度。选择最后一个CD40L亚基和Fc之间的系链以提高柔性，并且范围为0个至20个氨基酸。另外，产生了CD40L的C末端Fc融合体。在Fc的C末端和第一个CD40L亚基的N末端之间放置5个至20个氨基酸的柔性系链。在CD40L亚基之间使用9个或12个氨基酸的柔性接头。在效应子沉默的人IgG1和IgG2A同种型上构建C末端三聚体CD40L Fc融合体。设计具有与huIgG分子融合的CD40L三聚体束的激动剂CD40L的最初尝试在蛋白A纯化后产生高分子量物质(HMWS)并且不适于进一步开发。通过用基于结构的原理重新设计蛋白质来优化蛋白质的生物物理和功能特性。蛋白质设计有各种亚基内接头、系链和Fc附接点(图1A)。
此外，为了检验CD40L三聚体融合蛋白本身具有活性的假设(即，不通过它们的Fc部分之间的相互作用形成CD40L三聚体融合蛋白的两个拷贝的二聚体)，还设计并构建了含有与Fc单体肽融合的CD40L三聚体的分子，该Fc单体肽在CH3结构域中具有消除二聚体形成的突变(“单体Fc”分子，参见例如图1B)。
实施例2：表达和纯化
Expi293F细胞在无血清Expi293TM表达培养基(Invitrogen)中生长。将细胞在37℃和8％ CO2处在轨道式震荡器上保持在锥形瓶中。细胞以3.0×106个细胞/ml转染。将质粒DNA在Opti-MEM I中稀释。将Expifectamine 293在Opti-MEM I中稀释并在室温处温育5min。将DNA混合物与Expifectamine 293一起温育并在室温处温育20min-30min。将DNA/Expifectamine 293复合物添加到细胞培养物中并返回到培养箱。转染后16h-18h，将适当体积的增强剂添加到细胞培养物中。在第6天收获细胞培养物上清液，通过以3000g离心10分钟以沉淀细胞来收获。将上清液储存在4℃处，直至纯化。
具有Tecan液体处理器的0.6ml RoboColumn Eshmuno A(MERCK MILLIPORE，目录号1.25163.0001)柱用于纯化蛋白质。将上清液以0.6mL/min的流速施加到柱上以进行最大捕获。使用8倍柱体积的PBS洗涤柱，直到获得如通过UV A280监测的清洁基线。使用50mM柠檬酸盐(pH3.0)将蛋白质从柱上洗脱，并用1M Tris-HCl(pH 9.0)中和。使用Zebra Spin脱盐柱将蛋白质脱盐到作为最终缓冲液的dPBS中。使用非变性和变性SDS PAGE凝胶测试级分中重组蛋白的存在并合并。通过SDS PAGE和分析型尺寸交换柱(aSEC)认为纯化的蛋白质>80％纯。第二步色谱精制通过Superdex200凝胶过滤色谱法使用PBS流动相完成。合并对应于约150kDa的级分并储存在-80℃处，直至使用。
如使用HPLC(aSEC)(表1，下文)和SDS-PAGE凝胶(图2A-图2B)通过单分散Fc同源二聚体的水平所确定，新设计的三聚体显示纯度的显著提高。
表1.通过aSEC蛋白A纯化后测量的与Fc融合的工程化CD40L三聚体的单分散性
| 蛋白AA | 蛋白A后的单体％ |
| TPP000182980 | 79.36 |
| TPP000182981 | 79.01 |
| TPP000182982 | 73.61 |
| TPP000182983 | 81.2 |
| TPP000182984 | 77.2 |
| TPP000182985 | 77.68 |
| TPP000182986 | 80.23 |
| TPP000182988 | 70.59 |
| TPP000182989 | 76.75 |
| TPP000182990 | 78.66 |
| TPP000182991 | 77.21 |
| TPP000182992 | 76.2 |
| TPP000182993 | 65.74 |
| TPP000182994 | 75.82 |
| TPP000182995 | 78.92 |
| TPP000182996 | 76.59 |
| TPP000182997 | 71.78 |
| TPP000182021 | 79.12 |
| TPP000161222 | 38.76 |
通过aSEC测定，原始分子在蛋白A纯化后具有38％纯度(TPP000161222)，并且在SDS-PAGE凝胶中显示突出的高分子物质带(图2A-2B)。相比之下，新设计的三聚体显示出65％-81％的纯度范围，如通过aSEC所测定的(表1)。使用尺寸排阻色谱法进一步精制三聚体，其中TPP000161222在通过分析型超速离心(AUC)测量时显示98％的单分散性，包括高分子量和低分子量物质的不期望的物质小于2％(图3)。
构建体的序列：
字体方案：CD40L-接头-CD40L-接头-CD40L-系链-人IgG Fc
TPP000183311|OVTSB10|重_链|hsctCD40LG2_EKWv2NPQ(SEQ ID NO:1)
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>TPP000183310|OVTSB9|重_链|hsctCD40LG2_EKWv2NPQ_G4S3(SEQ ID NO:2)
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>TPP000182997|C4LW30|成熟_蛋白|NPQ_G3S3_sthCD40L_G4S2_IgG1_AAS(SEQ IDNO:3)
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGG SGGGSGGGSNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGG GSGGGSGGGSNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLG GGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>TPP000182996|C4LW29|成熟_蛋白|NPQ_G3S3_sthCD40L_G4S3_IgG1_AAS(SEQ IDNO:4)
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGG SGGGSGGGSNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGG GSGGGSGGGSNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLG GGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>TPP000182995|C4LW28|成熟_蛋白|NPQ_G3S3_sthCD40L_G4S4_IgG1_AAS(SEQ IDNO:5)
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>TPP000182994|C4LW27|成熟_蛋白|NPQ_G3S3_sthCD40L_G4S_IgG1_AAS(SEQ IDNO:6)
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>TPP000182993|C4LW26|成熟_蛋白|NPQ_G3S3_sthCD40L_IgG1_AAS(SEQ ID NO:7)
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>TPP000182992|C4LW25|成熟_蛋白|NPQ_sthCD40L_G4S2_IgG1_AAS(SEQ ID NO:8)
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>TPP000182991|C4LW24|成熟_蛋白|NPQ_sthCD40L_G4S3_IgG1_AAS(SEQ ID NO:9)
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>TPP000182990|C4LW23|成熟_蛋白|NPQ_sthCD40L_G4S4_IgG1_AAS(SEQ ID NO:10)
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>TPP000182989|C4LW22|成熟_蛋白|NPQ_sthCD40L_G4S_IgG1_AAS(SEQ ID NO:11)
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>TPP000182988|C4LW21|成熟_蛋白|NPQ_sthCD40L_IgG1_AAS(SEQ ID NO:12)
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字体方案：人IgGFc-系链CD40L-接头-CD40L-接头-CD40L
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实施例3：HEK-BLUE测定
为了确保分子是功能活性CD40激动剂，使用HEK-Blue报告基因细胞系(Invivogen)测定三聚体融合蛋白激活天然CD40受体的能力。
在含有DMEM、2mM GlutaMAX、10％热灭活的FBS、100ug/mL的Normocin和100ug/mL的Pen-Strep的生长培养基中培养来自Invivogen的HEK-Blue CD40L细胞。在测试培养基(DMEM+10％热灭活的FBS+100ug/mL PenStrep)中以2.8×105个细胞/ml制备细胞用于测定设置。将180μl细胞悬浮液添加到96孔板中，最终密度为5×104个细胞/孔。将20uL的测试品添加到每个孔中，每孔总体积为200μL。将板在CO2培养箱中在37℃处温育20h-24h。根据制造商的方案制备来自Invivogen的QUANTI-Blue溶液，并且将180μl溶液添加到96孔平底板的每个孔中。将20uL诱导的HEK-Blue CD40L细胞上清液添加到测定板中，并在37℃处温育。使用分光光度计(635nm)测定SEAP水平。使用HEK-Blue报告基因测定测试的CD40L三聚体的功能活性在图5A中示出。单核细胞衍生的树突状细胞活化测定的结果在图5B中示出。没有交联抗体处理的成熟树突状细胞活化测定的结果在图5C中示出。
与使用HEK-Blue报道基因测定的原始分子TPP000182983相比，TPP000161222显示活性增加100倍(图5A)。
实施例4：MSD电化学发光检测测定
使用Meso Scale Discovery生物发光测定(MSD)测定比较工程化分子的结合特性，以测量融合蛋白与重组CD40受体的结合。
将链霉抗生物素蛋白传感器板用10ug/ml生物素化的CD40在4℃处涂覆过夜。用含0.05％ Tween 20的PBS(PBST)洗涤板3次。在含0.2％牛血清白蛋白的PBS中制备三倍稀释系列的测试品，并在室温处在振荡的情况下将50ul施加到板并持续1小时。用PBST洗涤板3次，并且在室温处在振荡的情况下施加最终浓度为2ug/ml的抗人Fc检测试剂并持续1小时。用PBST洗涤板3次，并且向板中添加150ul的1X读数缓冲液，并且在MSD仪器上收集数据。将数据导入GRAPHPAD Prism 8软件，并基于三个独立实验的结果进行分析和绘图。
与使用MSD和SPR的最初设计的三聚体相比，新设计的三聚体显示出增加的结合(描述在实施例4和实施例5中)(图4A-图4C)。
实施例5：CD40L的表面等离子体共振分析
使用表面等离子体共振(SPR)测定比较工程化分子的结合特性，以测量融合蛋白与重组CD40受体的结合。
使用Biacore技术的表面等离子体共振(SPR)需要将一种相互作用物固定或捕获在传感器表面上。另一种相互作用物流过改性的传感器表面。通过测量仪器响应的变化，实时监测发生在传感器表面上的两种蛋白质的相互作用。使用Biacore 8K光学生物传感器(GE Healthcare)进行CD40L的SPR实验。在含有0.05％ P20的HBS缓冲液中制备样品，并且在25℃处使用C1传感器芯片进行实验。用100mM Gly pH12-0.3％ Triton对芯片进行预处理，随后共价固定山羊抗人Fc抗体。将山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体在pH 4.5的10mM乙酸钠缓冲液中稀释，并且使用胺偶联化学将约600个应答单元(RU)偶联至C1芯片的羧甲基化葡聚糖表面。使用乙醇胺-HCl使表面上剩余的反应性基团失活。为了进行结合实验，捕获>50个应答单元(RU)的CD40L-Fc融合构建体，随后以50μL/min注射浓度为4.7nM至300nM的hu CD40。监测缔合阶段3分钟，并且监测解离阶段10分钟。通过注入0.85％ H3PO4使传感器芯片表面再生。不含CD40L构建体的流通池用作参考。使用Insight软件，版本2(GEhealthcare)处理数据。对数据进行双参考减法以校正缓冲液对信号和仪器噪声的贡献。
有趣的是，与使用MSD和SPR的最初设计的三聚体相比，新设计的三聚体显示出增加的结合(图4A-图4C)。
实施例6：CDc+树突状细胞活化测定
为了评估三聚体融合体活化人源性免疫细胞的能力，采用CMV回忆测定(实施例7，下文)和树突状细胞交叉呈递测定。
将预分选的CD1c+树突状细胞解冻，然后在37℃培养箱中以2×106个细胞/mL在含有80ng/mL GM-CSF和80ng/mL IL-4的完全RPMI 1640(10％FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素)(PeproTech,Inc)中温育过夜。第二天，将细胞用完全RPMI洗涤，并以1×105个细胞/孔铺板在96孔圆底平板中。将树突状细胞用滴定浓度的所选CD40激动剂分子活化，并在37℃处温育24小时。将细胞洗涤并对细胞外树突状细胞活化标记物进行流式细胞分析。
在存在和不存在三聚体融合蛋白的情况下测量细胞表面标记物(主要是CD80和CD86)的相对变化。令人惊讶地，当与其他已知的CD40L激动剂三聚体相比时，TPP000182983显示增加的DC活化和T细胞活化(实施例7，下文)(图6A-图6E和图7A-图7B)。
为了检验CD40L三聚体融合蛋白本身具有活性的假设(即，不通过它们的Fc部分之间的相互作用形成CD40L三聚体融合蛋白的两个拷贝的二聚体)，设计并构建了含有与Fc单体肽融合的CD40L三聚体的分子，该Fc单体肽在CH3结构域中具有消除二聚体形成的突变(“单体Fc”分子，参见例如图1B)。这些单体Fc分子在24小时人DC活化测定中用两个单独的供体进行测试。在与野生型CD40L相似的水平上观察到APC活化标记物CD86的上调(数据未显示)，表明CD40L三聚体单独具有活性。
实施例7：使用单核细胞衍生的树突状细胞的T细胞活化测定
将预分选的单核细胞解冻，然后在37℃培养箱中以2×106个细胞/mL在含有80ng/mL GM-CSF和80ng/mL IL-4的完全RPMI 1640(10％ FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素)(PeproTech,Inc)中在5天内分化成单核细胞衍生的树突状细胞。在第3天，添加含有160ng/mL GM-CSF和160ng/mL IL-4的等体积完全RPMI。在第5天，将细胞用完全RPMI洗涤，并以3×104个细胞/孔接种在96孔圆底平板中。为了使用单核细胞衍生的DC评估T细胞活化，添加滴定量的所选CD40激动剂分子、3x105个匹配的供体T细胞、最终浓度为1ug/mL的CEF肽(巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)和流感病毒肽；ImmunoSpot)和最终浓度为10μg/mL的IL-15(PeproTech,Inc)。在第2天，用含有20μg/mLIL-15和20IU/mL IL-2(R&D Systems)的完全RPMI替换一半培养基。在第5天，用含有20ug/mL IL-15、20IU/mL IL-2、最终浓度为1ug/mL的CEF肽、1:200最终浓度的CD107a抗体(Biolegend)和1X蛋白质转运抑制剂混合物(Thermo Fisher)的完全RPMI替换一半培养基。随后将细胞在37℃培养箱中温育过夜，然后进行流式细胞分析以产生细胞内效应细胞因子。
总之，实施例表明，新优化的CD40L三聚体TPP000182983是稳定且功能优异的CD40激动剂。
实施例8：分析型超速离心
将样品装载到配备有1.2cm Beckman中心件(额定为50K rpm)和石英窗的离心池中。将离心池装配并扭转至130lbs。将离心池置于An-50(8孔)或An-60(4孔)转子中并置于Beckman Optima AUC室内。在开始运行之前，利用室中的转子将AUC的温度平衡至20.5℃并持续至少一小时。对于mAb样品，按以下设置来运行：40K rpm，扫描计数(250次扫描)、扫描收集频率(90秒)、数据分辨率(10μM)。在280nm处收集吸光度数据。最初使用软件程序DCDT(Philo 2006)分析数据，以确定弯月面位置并观察沉降分布图。然后使用直接边界拟合软件(Stafford和Sherwood，Biophys Chem 108(1-3):231-243(2004))分析数据。通过DCDT+确定弯月面位置，将基线设定为7.2，并手动选择拟合范围。使用两种物质非相互作用模型来拟合数据，第一种物质对应于单体，以及第二种物质对应于二聚体。
实施例9：抗肿瘤活性
为了获得工程化分子的体内抗肿瘤活性，在用工程化分子TPP000182983(C4LW16)处理的人CD40敲入小鼠模型中评估结肠腺癌肿瘤生长。选择TPP000182983的剂量和方案来模拟来自基因递送平台的编码蛋白的表达(例如，以由mRNA、腺相关病毒或溶瘤病毒等编码的形式)，并且与重组蛋白疗法相比被认为是次优的。
将5×105个MC38 5AG细胞植入人CD40敲入小鼠。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分成治疗组和对照组。然后，在随机化后的第1、4和6天，对小鼠静脉内施用20μg的TPP000182983或阴性对照同种型抗体，并且测量随时间推移的肿瘤生长。
在治疗期期间，TPP000182983表现出强的抗肿瘤活性，与同种型对照相比，肿瘤生长抑制为49.99％，并且p值为0.036(数据未显示)。
这些结果表明，工程化的三聚体CD40L融合蛋白可以有效地抑制肿瘤生长，即使在次优的低剂量处也是如此。
实施例10：病毒清除
在人CD40敲入小鼠模型中评估工程化分子增强病毒清除的能力。通过尾静脉给一组6至12周龄的雌性小鼠静脉内注射1×107pfu流感病毒。将接种的小鼠随机分成治疗组和对照组。然后用包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽静脉内输注治疗组中的小鼠。用PBS或阴性对照同种型抗体输注对照组中的小鼠。随时间推移测量小鼠的病毒滴度。
在治疗期期间，与施用阴性对照同种型抗体或PBS的小鼠相比，施用工程化的三聚体CD40L融合蛋白的小鼠具有更低的病毒滴度和更快的病毒清除。
这些结果表明，根据本公开的工程化的三聚体CD40L融合蛋白有效地增强流感病毒的清除。
实施例11：疫苗助剂
评估工程化的三聚体CD40L融合蛋白在人CD40敲入小鼠中增强对疫苗组合物的免疫应答的能力。
将人CD40敲入小鼠随机分组并施用包含靶病毒抗原的疫苗组合物。将包含根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的多肽与疫苗组合物同时或依次施用于小鼠(治疗组)。在对照组中，给小鼠施用PBS代替工程化的三聚体CD40L融合蛋白。随时间推移监测治疗组和对照组中小鼠对病毒抗原的免疫应答。结果表明，与对照组中的小鼠相比，治疗组中的小鼠对病毒抗原表现出显著更高的免疫应答。特别地，特异性地结合至靶病毒抗原的抗体的滴度显著更高，并且与对照相比，治疗组的小鼠中产生抗体的浆细胞的浓度在治疗组的小鼠中显著更高。
在观察期结束时处死治疗组和对照组中的小鼠，并且分离已知被病毒感染的解剖组织(例如，肺)并准备用于进一步分析。在原位免疫组织化学研究中，使用AlexaTMFluor488对树突状细胞的细胞特异性标记物进行染色，因此在荧光显微镜下将组织样品中的树突状细胞显现为绿点。用AlexaTMFluor 568对疫苗组合物中使用的靶病毒抗原进行染色，从而将抗原分子显现为红点。呈递病毒抗原的树突状细胞显现为两个荧光信号的共定位。使用荧光显微镜测量组织样品中树突状细胞的总数和呈递病毒抗原的树突状细胞的百分比。结果显示，与仅接受疫苗组合物的小鼠(对照组)相比，接受疫苗组合物和工程化的三聚体CD40L融合蛋白的小鼠(治疗组)中呈递病毒抗原的成熟树突状细胞的百分比显著增加。
为了进一步评估工程化的三聚体CD40L融合蛋白对抗原呈递细胞呈递病毒抗原的影响，进行免疫沉淀研究以测量病毒抗原和MHC复合物之间的缔合。根据标准方案制备来自处死小鼠的解剖肺组织的匀浆。将匀浆与包被有单克隆抗体的珠子一起温育，该单克隆抗体在合适的条件下特异性地结合至I类MHC或II类MHC II分子，以使抗体与其靶蛋白和组织样品中的蛋白复合物缔合。然后通过离心将珠子与组织分离，将与包被抗体缔合的蛋白质和蛋白质复合物一起拉下。然后对下拉的蛋白质样品进行处理以通过蛋白质印迹分析其含量。使用特异性针对靶病毒抗原的单克隆抗体。结果显示，与仅接受疫苗组合物的小鼠(对照组)相比，用从接受疫苗组合物和工程化的三聚体CD40L融合蛋白的小鼠(治疗组)分离的样品中的MHC分子(在该研究中检查的I类和II类分子)免疫沉淀的病毒抗原的量显著增加。
这些结果表明，当作为助剂与疫苗共同施用时，根据本公开的工程化的三聚体CD40L融合蛋白有效地增强对疫苗的免疫应答。增加的免疫应答至少可以归因于免疫动物中抗原呈递细胞(诸如树突状细胞)对病毒抗原的呈递增加。
为了监测工程化的三聚体CD40L融合蛋白对长期免疫记忆的影响，在第0天给小鼠施用初始剂量的疫苗组合物与包含根据本公开的三聚体CD40L融合蛋白的多肽的组合(治疗组)。然后将小鼠分成第一组加强免疫的小鼠和第二组未加强免疫的小鼠，其中加强免疫的小鼠在第7天给予疫苗组合物的第二次施用，而未加强免疫的小鼠在第7天给予PBS。在对照组中，小鼠在第0天单独施用疫苗组合物，并且在第7天分成加强免疫组和未加强免疫组以分别接受第二剂量的疫苗组合物或PBS。随时间推移监测治疗组和对照组中小鼠对病毒抗原的免疫应答。
结果表明，治疗组和对照组中的小鼠在接受初始剂量的疫苗组合物之后都产生特异性地结合至靶病毒抗原的抗体。对于治疗组中的小鼠，在第14天和第28天，未加强免疫的小鼠中的抗体滴度保持较高并且与加强免疫的小鼠中的抗体滴度相当。对于对照组中的小鼠，在第28天，未加强免疫的小鼠中的抗体滴度显著低于加强免疫的小鼠。在第28天处死小鼠，并且观察到对照组中的小鼠产生记忆B细胞，而对照组小鼠(加强免疫或未加强免疫)未观察到记忆B细胞形成。
这些结果表明，根据本公开的工程化的三聚体CD40L融合蛋白有效地增强体液免疫应答和靶向病毒抗原的抗体产生，并且促进针对病毒的免疫记忆的更快形成。根据本公开的工程化的三聚体CD40L融合蛋白可以用作专门定制用于预防受试者的靶病毒感染的疫苗组合物的助剂。
实施例12：FC单体肽活性
Fc单体肽被设计成检验Fc单体具有活性的假设。在24小时人DC活化测定中用两个单独的供体测试Fc单体。与WT CD40L活性类似，CD86上调，这是APC活化的标志，从而表明Fc单体具有活性。
实施例13：用于确定治疗的适合性的预后方法
可以使用预后测定来鉴定将受益于用根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的治疗的患有癌症或实体瘤的患者的个体或亚群，该预后测定在施用单链三聚体CD40L融合蛋白时寻找预后标记物的存在或不存在，或升高或降低的水平。因此可以治疗被鉴定为对用根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的治疗有反应的受试者。另选地，可以使用离体预后测定进一步筛选它们的来自单链三聚体CD40L融合蛋白的潜在益处，例如，以鉴定癌症或实体瘤是否将对包括施用根据本公开的单链三聚体CD40L融合蛋白的治疗更具反应性。
离体预后测定包括提供来自候选受试者的测试生物样品和对照生物样品，其中这些生物样品包含已经用单链三聚体CD40L融合蛋白体内或离体刺激的表达CD40的抗原呈递细胞；检测测试生物样品内的至少一种生物标记物的表达水平；以及将生物标记物的表达水平与未与单链三聚体CD40L融合蛋白接触的对照生物样品中检测到的对应表达水平进行比较。用于这些离体预后测定的生物标记物包括其表达水平是对治疗干预的反应性的预后指标的蛋白质和/或基因。
*****
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，而是旨在涵盖如本说明书所定义的本发明实质和范围内的修改。
序列表
<110> 詹森生物科技公司(Janssen Biotech, Inc.)
<120> 生物工程化的免疫调节融合蛋白组合物
<130> 14620-628-228 / JBI6455WOPCT1
<140>
<141>
<150> US 63/160,694
<151> 2021-03-12
<150> US 63/160,693
<151> 2021-03-12
<150> US 63/160,691
<151> 2021-03-12
<150> US 63/160,688
<151> 2021-03-12
<150> US 63/160,686
<151> 2021-03-12
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP000183311 - OVTSB10 - 重链 - hsctCD40LG2_EKWv2NPQ
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610 615 620
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Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg
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<223> 接头
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 25
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<211> 20
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<223> 接头
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> 接头
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser
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<211> 229
<212> PRT
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<220>
<223> Fc单体v.1
<400> 29
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Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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195 200 205
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225
<210> 30
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc单体v.2
<400> 30
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Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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225 230
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<211> 223
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<213> 人工序列
<220>
<223> Fc单体v.3
<400> 31
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<210> 32
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP000161222 - C40W33 - 成熟蛋白
<400> 32
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65 70 75 80
Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro
85 90 95
Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
100 105 110
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
115 120 125
Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Ser
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser
145 150 155 160
Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
165 170 175
Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
180 185 190
Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
195 200 205
Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu
210 215 220
Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
225 230 235 240
His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
245 250 255
Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
260 265 270
Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Lys Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ile Ala Ala His
290 295 300
Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala
305 310 315 320
Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn
325 330 335
Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala
340 345 350
Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe
355 360 365
Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu
370 375 380
Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln
385 390 395 400
Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val
405 410 415
Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe
420 425 430
Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
435 440 445
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
450 455 460
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
465 470 475 480
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
485 490 495
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
500 505 510
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
515 520 525
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
530 535 540
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
545 550 555 560
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
565 570 575
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
580 585 590
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
595 600 605
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
610 615 620
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
625 630 635 640
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
645 650 655
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665
<210> 33
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40L v.4
<400> 33
Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val
1 5 10 15
Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val
20 25 30
Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr
35 40 45
Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser
50 55 60
Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe
65 70 75 80
Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro
85 90 95
Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
100 105 110
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
115 120 125
Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
130 135 140
<210> 34
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40L v.5
<400> 34
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser
1 5 10 15
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu
20 25 30
Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu
35 40 45
Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg
65 70 75 80
Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys
85 90 95
Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser
115 120 125
His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
130 135 140
<210> 35
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40L三聚体v.1
<400> 35
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn
20 25 30
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
35 40 45
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
50 55 60
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Trp Leu Lys Ser Pro
65 70 75 80
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
85 90 95
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
100 105 110
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
115 120 125
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Glu
130 135 140
Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
145 150 155 160
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
165 170 175
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
180 185 190
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
195 200 205
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
210 215 220
Leu Trp Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
225 230 235 240
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
245 250 255
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
260 265 270
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
275 280 285
Gly Leu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ile
290 295 300
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
305 310 315 320
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
325 330 335
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
340 345 350
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
355 360 365
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Trp Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
370 375 380
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
385 390 395 400
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
405 410 415
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
420 425 430
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
435 440
<210> 36
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40L三聚体v.2
<400> 36
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn
20 25 30
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
35 40 45
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
50 55 60
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro
65 70 75 80
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
85 90 95
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
100 105 110
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
115 120 125
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Pro Gln Ile Ala
145 150 155 160
Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln
165 170 175
Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu
180 185 190
Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile
195 200 205
Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala
210 215 220
Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg
225 230 235 240
Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly
245 250 255
Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala
260 265 270
Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr
275 280 285
Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
305 310 315 320
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
325 330 335
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
340 345 350
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
355 360 365
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
370 375 380
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
385 390 395 400
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
405 410 415
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
420 425 430
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
435 440 445
Gly Leu Leu Lys Leu
450
<210> 37
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40L三聚体v.3
<400> 37
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn
20 25 30
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
35 40 45
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
50 55 60
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro
65 70 75 80
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
85 90 95
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
100 105 110
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
115 120 125
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Glu
130 135 140
Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
145 150 155 160
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
165 170 175
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
180 185 190
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
195 200 205
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
210 215 220
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
225 230 235 240
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
245 250 255
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
260 265 270
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
275 280 285
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser
290 295 300
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr
305 310 315 320
Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn
325 330 335
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
340 345 350
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
355 360 365
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro
370 375 380
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
385 390 395 400
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
405 410 415
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
420 425 430
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
435 440 445
<210> 38
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40L三聚体v.4
<400> 38
Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val
1 5 10 15
Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val
20 25 30
Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr
35 40 45
Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser
50 55 60
Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe
65 70 75 80
Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro
85 90 95
Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
100 105 110
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
115 120 125
Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Ser
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser
145 150 155 160
Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
165 170 175
Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
180 185 190
Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
195 200 205
Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu
210 215 220
Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
225 230 235 240
His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
245 250 255
Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
260 265 270
Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Lys Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Ile Ala Ala His
290 295 300
Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala
305 310 315 320
Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn
325 330 335
Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala
340 345 350
Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe
355 360 365
Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu
370 375 380
Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln
385 390 395 400
Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val
405 410 415
Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe
420 425 430
Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
435 440
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 杂项_特征
<222> (1)..(4)
<223> GGGS可重复n次，其中n为1至20的整数
<400> 39
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 杂项_特征
<222> (1)..(5)
<223> GGGGS可重复n次，其中n为1至20的整数
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
Claims (54)
1.一种包含单链三聚体CD40配体(CD40L)融合蛋白的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白包含通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)，
任选地，其中所述CD40L亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述CD40L亚基包含选自SEQ ID NO:20至22的序列中的任一者，或其片段。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述肽接头中的至少一个肽接头选自由EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)和(G3S)3(SEQ ID NO:25)组成的组；
任选地，其中所述肽接头中的至少两个肽接头具有相同的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白包含选自SEQ ID NO:35-38的任一个序列，或其片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白与非来源于CD40L的肽或多肽融合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白与肽系链融合；
任选地，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组；并且/或者
任选地，其中所述肽系链与所述单链三聚体CD40L融合蛋白的N末端或所述单链三聚体CD40L融合蛋白的C末端融合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白与Fc单体肽融合。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列；
任选地，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列，
任选地，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，
任选地，其中
(i)所述IgG序列包含IgG1序列，并且所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段，或者
(ii)所述IgG序列包含IgG2序列，并且所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29或其片段。
9.根据权利要求7或8所述的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白经由肽系链与所述Fc单体肽融合；
任选地，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸；
任选地，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的多肽，其中所述CD40L三聚体连接至
(a)所述Fc单体肽的N末端，
任选地，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的任一个序列，或其片段；或者
(b)所述Fc单体肽的C末端，
任选地，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白：
(a)与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化；
任选地，其中所述CD40多肽的所述活化包括
(i)T细胞和/或B细胞的免疫刺激功能增强；
(ii)与野生型CD40L相比，B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞的活化增强；以及/或者
(iii)所述CD40多肽的表达增加；
(b)与野生型CD40L相比增强抗肿瘤活性；
(c)与野生型CD40L相比增强促炎活性；
(d)与野生型CD40L相比增强感染性病原体的清除；
(e)使B细胞群的抗体产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；
(f)增加T细胞群对促炎细胞因子的分泌；
任选地，其中所述促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合；
任选地，其中所述细胞因子产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；
(g)将巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加至约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％；以及/或者
(h)将树突状细胞群中抗原呈递树突状细胞的最小百分比增加至约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽与药剂缀合；
任选地，其中所述药剂是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
13.一种单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，包含(a)通过肽接头彼此共价连接的三个CD40L亚基(CD40L三聚体)；和(b)Fc单体肽。
14.根据权利要求13所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述肽接头是EGKSSGSGS(SEQ ID NO:23)或(G3S)3(SEQ ID NO:25)。
15.根据权利要求113或14所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述Fc单体肽通过肽系链与所述CD40L三聚体共价连接，任选地，其中所述肽系链包含0个至20个氨基酸，并且/或者
任选地，其中所述肽系链选自由(G4S)3(SEQ ID NO:24)、(G4S)2(SEQ ID NO:26)、(G4S)4(SEQ ID NO:27)和G4S(SEQ ID NO:28)组成的组。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40配体亚基包含CD40L细胞外结构域的一部分。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40L三聚体连接至
(a)所述Fc单体肽的N末端，
任选地，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQID NO:1-12的任一个序列，或其片段；或者
(b)所述Fc单体肽的C末端，
任选地，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白包含选自SEQID NO:13-19的任一个序列，或其片段。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述CD40配体亚基包含选自SEQ ID NO:20-22的序列中的任一者，或其片段。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述Fc单体肽包含人Fc序列，
任选地，其中所述人Fc序列包含选自免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的序列，
任选地，其中所述IgG序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，
任选地，其中
(i)所述IgG序列包含IgG1序列，并且所述IgG1序列包含SEQ ID NO:30或31，或其片段，或者
(ii)所述IgG序列包含IgG2序列，并且所述IgG2序列包含SEQ ID NO:29或其片段。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白：
(a)与野生型CD40L相比增强CD40多肽的活化；
任选地，其中所述CD40多肽的所述活化包括
(i)T细胞和/或B细胞的免疫刺激功能增强；
(ii)与野生型CD40L相比，B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞的活化增强；以及/或者
(iii)所述CD40多肽的表达增加；
(b)与野生型CD40L相比增强抗肿瘤活性；
(c)与野生型CD40L相比增强促炎活性；
(d)与野生型CD40L相比增强感染性病原体的清除；
(e)使B细胞群的抗体产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；
(f)增加T细胞群对促炎细胞因子的分泌；
任选地，其中所述促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合；
任选地，其中所述细胞因子产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；
(g)将巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加至约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％；以及/或者
(h)将树突状细胞群中抗原呈递树突状细胞的最小百分比增加至约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
21.一种二聚体，包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白；
任选地，其中
(i)所述二聚体是同源二聚体；或者
(ii)所述二聚体通过所述Fc单体肽的缔合形成。
22.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的多肽、根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或根据权利要求21所述的二聚体。
23.一种载体，包含根据权利要求22所述的多核苷酸。
24.一种宿主细胞，包含根据权利要求22所述的多核苷酸或根据权利要求23所述的载体。
25.一种药物组合物，包含：
(i)药学上可接受的载体，以及
(ii)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽、根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或根据权利要求21所述的二聚体。
26.一种试剂盒，包含根据权利要求1至12中任一项所述的多肽、根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或根据权利要求21所述的二聚体。
27.一种用于制备以下项的方法：
(a)单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段，所述方法包括：
(i)将编码根据权利要求8至15中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中；
(ii)在制备所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养所述宿主细胞，以及
(iii)从所述细胞或培养物中回收所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段；或者
(b)包含两个单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体，所述方法包括：
(i)将编码根据权利要求8至15中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的多核苷酸引入到宿主细胞中；
(ii)在制备所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的条件下培养所述宿主细胞；
(iii)从所述细胞或培养物中回收所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段，以及
(iv)在有利于二聚化的条件下组合单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段；或者
(c)单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段的药物组合物，所述方法包括将根据权利要求8至15中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或其片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
28.一种系统，包括用于提供根据权利要求1至12中任一项所述的多肽、根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白或根据权利要求21所述的二聚体的装置。
29.一种活化以下项方法：
(a)CD40多肽，所述方法包括：
(i)使所述CD40多肽与根据权利要求1至12中任一项所述的多肽接触，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白在结合时使所述CD40多肽活化；
(ii)使所述CD40多肽与根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合时使所述CD40多肽活化；或者
(iii)使所述CD40多肽与包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合时使所述CD40多肽活化；
(b)靶细胞，所述方法包括：
(i)使所述靶细胞与根据权利要求1至12中任一项所述的多肽接触，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白在结合时使所述靶细胞活化；
(ii)使所述靶细胞与根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合时使所述靶细胞活化；或者
(iii)使所述细胞与包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40LFc融合蛋白的二聚体接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合时使所述靶细胞活化；
任选地，其中所述靶细胞是抗原呈递细胞；
任选地，其中所述靶细胞是B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞或嗜酸性粒细胞或它们的组合；
任选地，其中所述靶细胞是B细胞；
任选地，其中所述靶细胞是树突状细胞；
任选地，其中所述靶细胞是巨噬细胞；
任选地，其中在活化时，所述靶细胞使第二细胞活化；
任选地，其中所述第二细胞是T细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合；任选地，其中所述第二细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法是活化靶细胞的方法，其中所述靶细胞的活化测量为：
(a)所述靶细胞的增殖或成熟增加；
任选地，其中所述靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；或者
(b)所述靶细胞的存活时间延长；
任选地，其中所述靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述接触还包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物；
任选地，其中所述接触增强先天抗肿瘤免疫应答。
32.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用：
(a)治疗有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的多肽；
(b)治疗有效量的根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或者
(c)治疗有效量的包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体。
33.根据权利要求32所述的方法，还包括施用包含药学上可接受的载体和所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的药物组合物，
任选地，其中所述治疗增强先天抗肿瘤免疫应答。
34.根据权利要求32或33所述的方法，还包括共同施用第二疗法。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。
36.一种用于促进B细胞群的抗体产生的方法，包括
(a)使所述B细胞群与根据权利要求1至12中任一项所述的多肽接触，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白在结合时使所述B细胞活化；
(b)使所述B细胞群与根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白接触，其中所述单链三聚体CD40LFc融合蛋白在结合时使所述B细胞活化；或者
(c)使所述B细胞群与包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40LFc融合蛋白的二聚体接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合时使所述B细胞活化；
任选地，其中所述B细胞群的抗体产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述B细胞群在存在抗原的情况下接触，并且其中由所述B细胞产生的所述抗体特异性地结合至所述抗原；
任选地，其中所述方法进一步促进能够响应于所述抗原产生所述抗体的记忆B细胞的形成。
38.一种增加树突状细胞群的抗原呈递的方法，包括使所述树突状细胞在存在所述抗原的情况下与有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触；
任选地，其中所述树突状细胞群中呈递所述抗原的树突状细胞的最小百分比增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
39.根据权利要求38所述的方法，其中通过共培养用第一荧光染料标记的树突状细胞和用第二荧光染料标记的所述抗原来测量所述树突状细胞的所述抗原呈递，其中所述第一荧光染料和所述第二荧光染料不同；
任选地，其中通过测定所述树突状细胞群中与所述抗原共定位的树突状细胞的百分比来测量呈递所述抗原的树突状细胞的百分比。
40.一种增加免疫细胞群分泌促炎细胞因子的方法，包括：
(a)使所述免疫细胞群在存在根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的情况下与抗原呈递细胞群接触，其中所述单链三聚体CD40L融合蛋白在结合时使所述抗原呈递细胞活化；
(b)使所述免疫细胞群在存在根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40LFc融合蛋白的情况下与抗原呈递细胞群接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白在结合时使所述抗原呈递细胞活化；或者
(c)使所述免疫细胞群在存在包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体的情况下与抗原呈递细胞群接触，其中所述单链三聚体CD40L Fc融合蛋白二聚体在结合时使所述抗原呈递细胞活化；
其中在活化时，所述抗原呈递细胞使所述免疫细胞群活化；
任选地，其中所述抗原呈递细胞向所述免疫细胞群呈递抗原；
任选地，其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合；
任选地，其中所述细胞因子产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；
任选地，其中，在所述抗原呈递细胞活化时，所述抗原向所述免疫细胞群的呈递增加；
任选地，其中所述抗原呈递细胞群中呈递所述抗原的抗原呈递细胞的最小百分比增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％；
任选地，其中所述抗原呈递细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、B细胞或它们的组合；任选地，其中所述免疫细胞群包含T细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述多肽、所述单链三聚体CD40LFc融合蛋白或所述二聚体在疫苗组合物或助剂组合物中。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的方法，其中所述抗原在疫苗组合物中。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的方法，其中所述抗原源于或来源于
(a)感染性病原体；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合；
(b)患病细胞；
(c)被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合；或者
(d)癌细胞。
44.根据权利要求36至43中任一项所述的方法，其中所述抗原由抗原呈递细胞呈递；
任选地，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞；
任选地，其中所述抗原与MHC I类或MHC II类复合物缔合。
45.一种增加巨噬细胞群对患病细胞的吞噬作用的方法，包括使所述患病细胞、所述巨噬细胞，或所述患病细胞和所述巨噬细胞两者与有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触；
任选地，其中所述巨噬细胞群中吞噬性巨噬细胞的最小百分比增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％；
任选地，其中通过共培养用第一荧光染料标记的巨噬细胞和用第二荧光染料标记的患病细胞来测量巨噬细胞的所述吞噬作用，其中所述第一荧光染料和所述第二荧光染料不同。
46.根据权利要求45所述的方法，其中通过测定包含所述患病细胞的巨噬细胞的百分比来测量吞噬性巨噬细胞的百分比；
任选地，其中所述患病细胞是癌细胞或被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
47.一种增加靶细胞表达CD40多肽的方法，包括使所述靶细胞与有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述靶细胞是：
(a)患病细胞，
(b)癌细胞，
(c)被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合；或者
(d)B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、
粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或它们的组合；
任选地，其中所述患病细胞群减少约10％、约20％、约30％、
约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、
约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
49.一种在患病细胞群周围的组织中形成促炎环境的方法，包括使所述组织与有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体接触；
任选地，其中：
(a)所述组织中活化的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞的浸润增加；
(b)所述组织中促炎细胞因子的浓度增加；
任选地，其中所述促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、
IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，或它们的任何组合；
(c)所述组织中抗原呈递细胞对源于或来源于所述患病细胞的抗原的呈递增加；
(d)所述组织中所述患病细胞的吞噬作用增加；
(e)所述组织中由细胞介导的细胞毒性诱导的所述患病细胞的凋亡增加；
(f)所述组织中由抗体依赖性细胞毒性诱导的所述患病细胞的凋亡增加；并且/或者
(g)所述组织中所述患病细胞群减少；
任选地，其中所述组织中所述患病细胞群减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
50.一种消除受试者的患病细胞的方法，包括向所述受试者施用有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体；
任选地，其中：
(a)所述患病细胞不表达CD40多肽；
(b)所述患病细胞表达CD40多肽；
(c)所述患病细胞是癌细胞；或者
(d)所述患病细胞是被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或它们的组合。
51.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体；
任选地，其中
(a)所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗肿瘤免疫应答；
(b)所述方法还包括共同施用第二疗法；并且/或者
(c)所述癌症选自由黑色素瘤、间皮瘤、晚期实体瘤和淋巴瘤组成的组。
52.一种治疗有需要的受试者的感染的方法，包括向所述受试者施用有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体；
任选地，其中：
(a)所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗感染免疫应答；
(b)向所述受试者共同施用疫苗组合物以预防所述受试者的所述感染；
任选地，其中，所述疫苗组合物同时或依次共同施用。
53.一种增加有需要的受试者对抗原的应答的方法，包括向所述受试者施用有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体；
任选地，其中所述抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原。
54.一种增加有需要的受试者对疫苗的反应的方法，包括向所述受试者施用所述疫苗和有效量的(i)根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，(ii)根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白，或(iii)包含两个根据权利要求13至20中任一项所述的单链三聚体CD40L Fc融合蛋白的二聚体；
任选地，其中所述疫苗是针对肿瘤、癌症、病原体或过敏原的疫苗。
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| CN202280034522.6A Pending CN117561071A (zh) | 2021-03-12 | 2022-03-11 | 生物工程化的免疫调节融合蛋白组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117561071A (zh) |
-
2022
- 2022-03-11 CN CN202280034522.6A patent/CN117561071A/zh active Pending
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Legal Events
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