CN117558462A - 一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物评价方法领域，为解决现有技术下药物和保健食品改善脾阳虚体质功效的评价方法操作复杂、评分标准无法量化、主观因素较大，并且时间成本和费用高昂的问题，提供一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，包括如下步骤：S1、将斑马鱼分为正常对照组、模型对照组和样品组，模型对照组和样品组水溶给予诱导剂建立斑马鱼脾阳虚模型，诱导剂为大黄水提物或番泻叶水提物；以S1所得各组斑马鱼在水溶给予待测药物或保健食品后的腹泻情况、运动能力及能量合成情况为主要指标评价待测药物或保健食品改善脾阳虚体质的功效。该方法的建模步骤简单、高效，可用于快速筛选药物和保健食品的健脾功效。

Description

一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法
技术领域
本发明涉及药物评价方法领域，尤其涉及一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法。
背景技术
脾气虚和脾阳虚是临床最为常见的脾虚证型，气虚是阳虚的初期阶段，而阳虚是在气虚的基础上加重，产生虚寒的表现。现代研究者将体质分为平和质、阴虚质、阳虚质、痰湿质、湿热质、气虚质、血瘀质、气郁质。在一般人群分析中，我国自然人群中平和质占32.1％，8种偏颇体质占67.86％。居于前3位的偏颇体质类型依次是气虚质(13.42％)、湿热质(9.08％)、阳虚质(9.04％)。阳虚体质就是人体阳气虚弱，失于温煦，以形寒肢冷等虚寒现象为主要特征的一种体质状态。从中医辨证的角度分析阳虚体质的人大多形体白胖，肌肉松软，平素畏冷，手足不温，喜热饮食，精神不振，睡眠偏多，面色白，目胞晦黯，口唇色淡，毛发易落，易出汗，大便溏薄，小便清长，舌淡胖嫩边有齿痕、苔润，脉象沉迟。发病多为寒证，或易从寒化，易病痰饮、肿胀、泄泻、阳痿。性格多沉静、内向。平素不耐受寒邪、耐夏不耐冬、易感湿邪。阳虚体质的现代研究显示：1)阳虚人群神经系统兴奋性异常：交感神经功能衰减、副交感功能亢进；2)免疫功能异常：体液和细胞免疫功能减退；3)物质代谢异常：能量代谢水平低下，并伴有一定程度的营养不良。因此，使用一些健脾和胃的药物/食物，对预防免疫功能低下、营养不良等亚健康状态的发生及进展非常有必要，符合中医“治未病”的原则。泄泻是脾胃虚弱的典型症状，建立动物脾虚泄泻模型有助于筛选具有健脾和胃的药物/食物。
现有的脾虚泄泻模型为小鼠模型，主要采用以下几种建模方式：1)采用苦寒中药煎剂；2)通过过食肥甘、偏食、禁食与足量食交替使小鼠饮食失节；3)采用利血平影响后交感神经末梢递质去甲肾上腺素的储存和释放，并降低脑内和外周神经中单胺类递质含量，从而降低交感神经的功能，使副交感神经功能亢进从而出现脾虚泄泻症状；4)切除肩胛间棕色脂肪+高脂+低温喂养；5)肌注氢化可的松+游泳+取血。建模后参考《中药新药临床研究指导原则》和《中医实验动物模型方法学》结合鼠的生物学特征，按照体重、体温、毛色、倦怠、食少、便溏等体征进行评分。以上几种模型具有如下缺点：1)需要1-4周方能建立成功，2)建模需要多种因素叠加方可成功，操作十分复杂；3)评分标准主观因素较大，影响模型严重程度的评判和药物/食物健脾功效强弱的评价；4)哺乳动物模型无法量化排便情况和肠腔变化。上述缺点导致采用哺乳动物建立脾阳虚模型的评价方法的时间成本和费用都较高，这不利于对大量药食两用的原料或配方的筛选和功效评价。饮食养生、起居养生、运动养生、四季养生、经络养生、药物调体是调整体质、减少疾病发生的主要方法，其中最重要的便是饮食养生。饮食养生是老百姓最易掌握、最易坚持的养生方法，能够起到较好的扶正驱邪、未病先防、既病防变的作用。因此，建立一种科学、高效评价改善脾阳虚体质的动物模型非常有必要。
发明内容
本发明首先为了克服现有技术下药物和保健食品改善脾阳虚体质功效的评价方法操作复杂、评分标准无法量化、主观因素较大，并且时间成本和费用高昂的问题，提供一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，该方法的建模步骤简单、高效，可用于快速筛选药物和保健食品的健脾功效。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，所述评价健脾功效方法包括如下步骤：
S1、将斑马鱼分为正常对照组、模型对照组和样品组，模型对照组和样品组水溶给予诱导剂建立斑马鱼脾阳虚模型，诱导剂为大黄水提物或番泻叶水提物；
S2、检测分析S1所得各组斑马鱼在水溶给予待测药物或保健食品后的腹泻情况、运动能力及能量合成情况，以腹泻情况、运动能力及能量合成情况为主要指标评价待测药物或保健食品改善脾阳虚体质的功效；
主要指标中有两项及以上被改善则具有改善脾阳虚体质的功效。
斑马鱼肠道结构与哺乳动物相似，分为前肠、中肠和后肠。斑马鱼胃肠道在细胞功能和解剖学方面与人类相似，均由内皮细胞、结缔组织、外纵肌和环状肌组成。斑马鱼前肠与哺乳动物胃一样上皮细胞呈圆柱状呈柱状且无纤毛，并表达两种哺乳动物胃的标记物sox2和barx1。斑马鱼的前肠与哺乳动物胃的发育相似，受相同的信号通路调节，例如Notch和Wnt。前肠和中肠主要参与营养物质的吸收，后肠主要参与水分吸收。斑马鱼的肠道分为粘膜层(上皮层、固有层)、肌肉层和浆膜层，与人类比较，缺少粘膜下层。斑马鱼的肠道细胞，与哺乳动物一致，存在上皮细胞、内分泌细胞、杯状细胞、神经元细胞和Cajal间质细胞等细胞，但缺乏帕内特细胞和年末淋巴小结相关上皮M细胞。目前人体肠道共8大细菌门，分别为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、疣微球菌门、梭杆菌门、蓝藻菌门和VadinBE97门，其中常见和实现主要功能的四大优势菌门(微生物占比厚壁菌门约60～65％、拟杆菌门约20～25％、变形菌门约5～10％和放线菌门占3％)占了全部98％的细菌。斑马鱼与人体肠道细菌的科属以及功能极其相近，斑马鱼约98％的肠道菌群也均集中在上述四大优势菌门。胃肠道功能和免疫相关基因在斑马鱼和哺乳动物间是高度保守的。因此，斑马鱼可以作为胃肠道疾病研究的动物模型。
本发明选用大黄水提物和番泻叶水提物作为建立斑马鱼脾阳虚模型的诱导剂，大黄和番泻叶可诱发斑马鱼泄泻，从而导致脾胃虚弱。腹泻、肢体倦怠、神疲乏力是脾虚的典型症状，通过检测待测样品处理后斑马鱼的腹泻情况、运动能力和能量合成情况可评价待测样品对脾阳虚的改善功效。当腹泻情况、运动能力和能量合成情况这三个主要指标满足两个或两个以上被改善时，可认为待测样品具有改善脾阳虚体质的功效。如果仅能满足一个指标被改善，则不具备改善脾阳虚体质的功效，如止泻药仅能改善腹泻而无法改善其余两个指标，同理减肥药只能提高能量代谢，而增强骨骼药只能增强运动能力，这些药品均不能改善脾阳虚体质。
作为优选，所述S2还包括检测分析S1所得各组斑马鱼在水溶给予待测药物或保健食品后的肠腔扩张情况、炎症反应情况以作为评价待测药物或保健食品改善脾阳虚体质的功效的辅助指标。
肠腔扩张(肠道面积增大)、炎症反应(肠道中性粒细胞数量增加)为辅助指标，用以进一步表征待测样品的健脾功效。
作为优选，所述大黄水提物的浓度为100-500μg/mL，番泻叶水提物处理的浓度为1000-2000μg/mL。
作为优选，所述诱导剂的诱导时间为24-72h。
作为优选，所述斑马鱼为3-5dpf的野生型AB或3-5dpf的转基因中性粒细胞绿色荧光MPO品系斑马鱼。
作为优选，所述S2中腹泻情况的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼尼罗红1-5h后，洗脱尼罗红，在水溶给予各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后，使用荧光显微镜观察各组斑马鱼的肠道荧光强度，以肠道荧光强度的统计学分析结果评价斑马鱼的腹泻情况。
作为优选，所述S2中运动能力的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后置于行为分析仪中录制视频，分析总运动距离，以总运动距离的统计学分析结果评价斑马鱼的运动能力。
作为优选，所述S2中能量合成情况的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后，使用ATP含量测定试剂盒孵育斑马鱼后再用全波长酶标仪读取荧光值，分析ATP含量，以ATP含量的统计学分析结果评价斑马鱼的能量合成减少情况。
作为优选，所述S2中肠腔面积的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后用解剖显微镜观察分析其肠腔面积，以肠腔面积的统计学分析结果评价斑马鱼的肠腔扩张情况。
作为优选，所述S2中炎症反应情况的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后，用荧光显微镜观察分析斑马鱼的肠道中性粒细胞数量，以肠道中性粒细胞数量的统计学分析结果评价斑马鱼的炎症反应情况；
或/和水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后，检测斑马鱼体内aqp3和il-1β基因相对表达量，以aqp3和il-1β基因相对表达量的统计学分析结果评价斑马鱼的腹泻和炎症反应情况。
在消化系统中，水通道蛋白的作用主要是对胃肠道内的水液代谢进行调控，对维持机体内水液含量的相对稳定具有重要意义。肠道aqp3表达水平的降低可引起肠道水液重吸收功能的障碍，导致粪便质地稀溏甚至水样便。IL-1β在调节炎症反应中起到一定的作用，其是由免疫细胞或者非免疫细胞生成。肠道钠-钾-ATP酶的活性可能被IL-1β抑制，进而减少肠道对水、钠的吸收。同时在炎症因子IL-1β的影响下胃肠道胆碱能神经对乙酰胆碱和其他炎性介质的反映程度会不同程度的增高。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)评价结果具有直观性，斑马鱼通体透明，在体式显微镜下可明显观察到胃肠腔扩大，在荧光显微镜下可明显观察到胃肠道中的荧光食物尼罗红可观察到的红色荧光、中性粒细胞可观察到绿色荧光颗粒，因此使用斑马鱼建立的便于观察胃肠道变化的理想模型可将中医证型以可视化的检测指标量化，减少主观因素干扰结果判断；
(2)造模方法简单、造模周期短，可批量筛选药物/食物的健脾功效。
附图说明
图1是实施例1中4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物1天肠蠕动表型图。
图2是实施例1中4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物1天运动轨迹图。
图3是实施例1中3dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天运动轨迹图。
图4是实施例1中4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天运动轨迹图。
图5是实施例1中4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天肠腔面积表型图。
图6是实施例1中3dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天肠腔面积表型图。
图7是实施例1中4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物1天肠腔面积表型图。
图8是实施例1中4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天肠道炎症表型图。
图9是实施例2中补中益气丸和附子理中丸处理后斑马鱼肠道荧光强度典型图。
图10是实施例2中补中益气丸和附子理中丸处理后斑马鱼运动轨迹典型图。
图11是实施例2中补中益气丸和附子理中丸处理后斑马鱼肠道中性粒细胞典型图。
图12是实施例2中补中益气丸和附子理中丸处理后斑马鱼肠腔面积典型图。
图13是实施例3中附子提取物处理后斑马鱼运动轨迹典型图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方法对本发明做进一步的描述。
下述实施方法中使用的实验动物、仪器和试剂为：
1.实验动物
野生型AB品系斑马鱼；转基因中性粒细胞荧光Tg(mpx:EGFP)品系斑马鱼；
2.主要仪器和试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)；斑马鱼行为分析系统(Zebra Lab 3.22.3.31，Viewpoint，China)；6孔板/96孔板(浙江贝兰伯生物科技有限公司，China)；
尼罗红(批号SLBP9326V，Sigma，India)；二甲基亚砜(DMSO，批号BCCD8942，Sigma，Switzerland)；甲基纤维素(批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；番泻叶或大黄水提物的制备方法：称取番泻叶或生大黄4.00g，加入40mL超纯水，100℃水浴1小时，筛网过滤残渣后，使用离心管收集分装母液，浓度为100mg/mL，-20℃冷冻保存。临用时取出分装母液室温溶解。
实施例1
1脾阳虚建模条件摸索：
1.1随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，每孔容量为3mL；28℃处理1天后，洗脱大黄水提物和番泻叶水提物，每个实验组均水溶饲喂尼罗红3h，洗脱尼罗红，28℃处理1天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠道荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发腹泻作用。
1.2第二次脾阳虚建模条件摸索
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物125μg/mL组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1000μg/mL组番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，28℃处理1天后，每个实验组随机选取8尾斑马鱼置于行为分析仪录制视频，分析总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发运动能力减弱作用。
1.3第三次脾阳虚建模条件摸索
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于行为分析仪录制视频，分析总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发运动能力减弱作用。
1.4第四次脾阳虚建模条件摸索
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于行为分析仪录制视频，分析总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发运动能力减弱作用。
1.5第五次脾阳虚建模条件摸索
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，每天喂食2次。28℃处理2天后，每个实验组斑马鱼置于96孔板中，每3尾斑马鱼1孔，使用ATP含量测定试剂盒，孵育1h后，用全波长酶标仪读取荧光值，分析ATP含量。
1.6第六次脾阳虚建模条件摸索
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，每孔容量为3mL；28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠腔面积，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发肠腔扩张作用；统计学处理结果采用mean±SE表示；用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
1.7第七次脾阳虚建模条件摸索
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，每孔容量为3mL；28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠腔面积，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发肠腔扩张作用；用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
1.8第八次脾阳虚建模条件摸索
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，每孔容量为3mL；28℃处理1天后洗脱大黄水提物和番泻叶水提物，斑马鱼继续孵育1天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠腔面积，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发肠腔扩张作用；用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
1.9第九次脾阳虚建模条件摸索
随机选取5dpf转基因中性粒细胞荧光Tg(mpx：EGFP)品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组、大黄水提物250μg/mL组、大黄水提物500μg/mL组、番泻叶水提物1500μg/mL组和番泻叶水提物2000μg/mL组，每孔容量为3mL；28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠道中性粒细胞数量，以该指标的统计学分析结果评价样品诱发炎症作用；统计学处理结果采用mean±SE表示；用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
2实验结果
2.1第一次脾阳虚建模结果
如表1和图1所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至5dpf，洗脱诱导剂，孵育至6dpf，斑马鱼肠蠕动明显加快，这表明大黄水提物、番泻叶水提物均可诱发出明显的腹泻症状。
表1.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物1天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，***p<0.001。
2.2第二次脾阳虚建模结果
如表2和图2所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至5dpf，斑马鱼运动能力明显减弱，结果表明大黄水提物250μg/mL和500μg/mL、番泻叶水提物2000μg/mL均可诱发出明显的肢体倦怠、神疲乏力的症状。
表2.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物1天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。
2.3第三次脾阳虚建模结果
如表3和图3所示，3dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至5dpf，斑马鱼运动能力明显减弱，结果表明大黄水提物250μg/mL和500μg/mL可诱发出明显的肢体倦怠、神疲乏力的症状，番泻叶水提物1500μg/m和2000μg/mL未诱发出明显的肢体倦怠、神疲乏力的症状。番泻叶水提物未诱发出模型可能与肠道未完全发育，影响诱导剂吸收有关。
表3.3dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，***p<0.001。
2.4第四次脾阳虚建模结果
如表4和图4所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至6dpf，斑马鱼运动能力明显减弱，结果表明大黄水提物、番泻叶水提物均可诱发出明显的肢体倦怠、神疲乏力的症状。
表4.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，**p<0.01。
2.5第五次脾阳虚建模结果
如表5所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至6dpf，斑马鱼ATP含量减少，结果表明，大黄水提物、番泻叶水提物均可诱导能量合成减少。
表5.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
2.6第六次脾阳虚建模结果
如表6和图5所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至6dpf，斑马鱼肠道面积明显扩张，结果表明，大黄水提物、番泻叶水提物均可诱发肠腔内大量渗出物充盈肠道，产生腹泻症状。
表6.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，**p<0.01。
2.7第七次脾阳虚建模结果
如表7和图6所示，3dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至5dpf，斑马鱼肠道面积未见明显变化，结果表明，大黄水提物、番泻叶水提物对3dpf斑马鱼没有诱发出大量的渗出物充盈肠道，可能与肠道未完全发育，影响诱导剂吸收有关。
表7.3dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天效应(n＝10，mean±SE)。
2.8第八次脾阳虚建模结果
如表8和图7所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至5dpf，洗脱诱导剂，孵育至6dpf，斑马鱼肠道面积未见明显变化，结果表明，大黄水提物、番泻叶水提物诱发大量渗出物充盈肠道的作用有一定的自愈性，除肠蠕动指标外，其余指标诱导剂需维持2天以上。
表8.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物1天效应(n＝10，mean±SE)。
组别 浓度(μg/mL) 肠腔面积(像素)
正常对照组 - 79113±5436
大黄水提物 500 72347±6312
番泻叶水提物 2000 80761±7833
2.8第八次脾阳虚建模结果
如表9和图8所示，4dpf给予斑马鱼大黄水提物或番泻叶水提物至6dpf，斑马鱼肠道中性粒细胞明显增加，结果表明，大黄水提物、番泻叶水提物均可诱发出明显的炎症反应。
表9.4dpf斑马鱼给予大黄水提物、番泻叶水提物2天效应(n＝10，mean±SE)
与正常对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
3结果分析
综上所述，以250-500μg/mL番泻叶水提物或1500-2000μg/mL大黄水提物为诱导剂处理3-5dpf斑马鱼至少1天以上，可以建立斑马鱼脾阳虚模型，该斑马鱼脾阳虚模型以腹泻(肠道荧光强度减少)、肢体倦怠、神疲乏力(总运动距离减少)、能量合成(ATP含量)为最主要的指标，以肠腔扩张(肠道面积增大)、炎症反应(肠道中性粒细胞数量增加)为辅助指标。
实施例2
补中益气丸和附子理中丸的改善脾阳虚体质功效评价
1评价步骤如下：
1.1随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予番泻叶2000μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型；28℃处理1天后，洗脱番泻叶水提物，每个实验组均水溶饲喂尼罗红3h，洗脱尼罗红，分别水溶给予补中益气丸和附子理中丸，28℃处理24h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠道荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品改善腹泻功效。
1.2随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予番泻叶2000μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型；同时，分别水溶给予补中益气丸和附子理中丸；28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于行为分析仪录制视频，分析总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品改善运动能力功效。
1.3随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，每天喂食2次；设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予番泻叶2000μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型。同时，分别水溶给予补中益气丸和附子理中丸；28℃处理2天后，每个实验组斑马鱼置于96孔板中，每3尾斑马鱼1孔，使用ATP含量测定试剂盒，孵育1h后，用全波长酶标仪读取荧光值，分析ATP含量，以该指标的统计学分析结果评价样品增加能量功效。
1.4随机选取4dpf转基因中性粒细胞荧光Tg(mpx：EGFP)品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼；设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予番泻叶2000μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型；同时，分别水溶给予补中益气丸和附子理中丸；28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠道中性粒细胞数量，以该指标的统计学分析结果评价样品炎症消退功效。
1.5随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予番泻叶2000μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型；同时，分别水溶给予补中益气丸和附子理中丸；28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析肠腔面积，以该指标的统计学分析结果评价样品肠腔扩张改善功效。
1.6随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予番泻叶2000μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型。同时，分别水溶给予补中益气丸和附子理中丸；设置3个生物学重复；28℃处理2天后，使用RNA快速提取试剂盒提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外-可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2.00μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μL cDNA，通过q-PCR检测β-actin、aqp3和il-1β基因的表达。用β-actin作为基因表达的内参，计算aqp3和il-1β基因的RNA相对表达量(引物序列见表10)。
表10.引物序列信息
(1)～(6)统计学处理结果采用mean±SE表示；用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
2实验结果
2.1实验(1)～(3)结果见表11、图9和图10。模型对照组与正常对照组比较，肠道荧光强度明显减弱，总运动距离明显减少，ATP含量减少，表明饲喂番泻叶水提物后斑马鱼肠蠕动加快，出现腹泻，同时运动能力下降，能量合成减少。给予补中益气丸和附子理中丸后，斑马鱼肠道荧光较模型对照组明显增加，表明补中益气丸和附子理中丸有明显改善脾虚腹泻功效；给予补中益气丸和附子理中丸后，斑马鱼总运动距离和ATP含量明显增加，表明补中益气丸和附子理中丸有明显改善脾虚运动能力功效和增加能量功效，缓解肢体倦怠、神疲乏力的症状。
表11.补中益气丸和附子理中丸处理后肠道荧光强度、总运动距离和ATP含量(n＝10，mean±SE)
与模型对照组多组间比较，*p<0.05，***p<0.001；与模型对照组两组间比较，#p<0.05。
2.2实验(4)～(5)结果见表12、图11和图12。模型对照组与正常对照组比较，肠道中性粒细胞数量明显增加，肠腔面积明显扩大，表明饲喂番泻叶水提物后斑马鱼肠道出现炎症，造成大量液体渗出，肠腔扩张。给予补中益气丸和附子理中丸后，斑马鱼肠道中性粒细胞较模型对照组明显减少，表明补中益气丸和附子理中丸有炎症消退功效；给予补中益气丸和附子理中丸后，斑马鱼肠腔面积明显减小，表明补中益气丸和附子理中丸能够减少炎性渗出。
表12.补中益气丸和附子理中丸处理后斑马鱼肠道中性粒细胞数量和肠腔面积(n＝10，mean±SE)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.3实验(6)结果见表13。模型对照组与正常对照组比较，aqp3基因相对表达量明显下调，il-1β基因相对表达量明显上调，与饲喂番泻叶水提物后斑马鱼出现腹泻和炎症的症状相符。给予补中益气丸和附子理中丸后，斑马鱼aqp3基因相对表达量明显上调，il-1β基因相对表达量明显下调，表明补中益气丸和附子理中丸改善脾虚腹泻功效与调节aqp3基因相对表达量相关，炎症消退功效与调节il-1β基因相对表达量相关。
表13.补中益气丸和附子理中丸处理后aqp3和il-1β基因相对表达量(n＝3，mean±SE)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实施例3
附子提取物的改善脾阳虚体质功效评价(一)评价步骤如下：
1.1随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。设置正常对照组和模型对照组和阳性对照组附子理中丸31.2μg/mL，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予大黄水提物500μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型。同时，水溶给予附子提取物，28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于行为分析仪录制视频，分析总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品改善运动能力功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
1.2随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，每天喂食2次。设置正常对照组和模型对照组和阳性对照组附子理中丸31.2μg/mL，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予大黄水提物500μg/mL建立斑马鱼脾阳虚模型。同时，水溶给予附子提取物，28℃处理2天后，每个实验组斑马鱼置于96孔板中，每3尾斑马鱼1孔，使用ATP含量测定试剂盒，孵育1h后，用全波长酶标仪读取荧光值，分析ATP含量，以该指标的统计学分析结果评价样品增加能量功效。
(二)结果分析：
如表14和图13所示，模型对照组与正常对照组比较，总运动距离明显减少、ATP含量下降，表明饲喂大黄水提物后斑马鱼运动能力下降、能量合成减少。给予附子提取物后，斑马鱼总运动距离明显增加、能量合成增多，表明附子提取物有明显改善脾阳虚功效，能够缓解肢体倦怠、神疲乏力的症状。
表14.附子提取物处理后斑马鱼总运动距离和ATP含量(n＝10，mean±SE)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。

Claims (10)

1.一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述评价健脾功效方法包括如下步骤：
S1、将斑马鱼分为正常对照组、模型对照组和样品组，模型对照组和样品组水溶给予诱导剂建立斑马鱼脾阳虚模型，诱导剂为大黄水提物或番泻叶水提物；
S2、检测分析S1所得各组斑马鱼在水溶给予待测药物或保健食品后的腹泻情况、运动能力及能量合成情况，以腹泻情况、运动能力及能量合成情况为主要指标评价待测药物或保健食品改善脾阳虚体质的功效；
主要指标中有两项及以上被改善则具有改善脾阳虚体质的功效。
2.根据权利要求1所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述S2还包括检测分析S1所得各组斑马鱼在水溶给予待测药物或保健食品后的肠腔扩张情况、炎症反应情况以作为评价待测药物或保健食品改善脾阳虚体质的功效的辅助指标。
3.根据权利要求1或2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述大黄水提物的浓度为100-500 μg/mL，番泻叶水提物处理的浓度为1000-2000 μg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述诱导剂的诱导时间为24-72 h。
5.根据权利要求1或2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述斑马鱼为3-5 dpf的野生型AB或3-5 dpf的转基因中性粒细胞绿色荧光MPO品系斑马鱼。
6.根据权利要求1或2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述S2中腹泻情况的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼尼罗红1-5 h后，洗脱尼罗红，在水溶给予各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72 h后，使用荧光显微镜观察各组斑马鱼的肠道荧光强度，以肠道荧光强度的统计学分析结果评价斑马鱼的腹泻情况。
7.根据权利要求1或2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述S2中运动能力的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后置于行为分析仪中录制视频，分析总运动距离，以总运动距离的统计学分析结果评价斑马鱼的运动能力。
8.根据权利要求2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述S2中能量合成减少情况的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72 h后，使用ATP含量测定试剂盒孵育斑马鱼后再用全波长酶标仪读取荧光值，分析ATP含量，以ATP含量的统计学分析结果评价斑马鱼的能量合成减少情况。
9.根据权利要求2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述S2中肠腔面积的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72h后用解剖显微镜观察分析其肠腔面积，以肠腔面积的统计学分析结果评价斑马鱼的肠腔扩张情况。
10.根据权利要求2所述的一种评价药物和保健食品改善脾阳虚体质的方法，其特征是，所述S2中炎症反应情况的检测方法为：水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72 h后，用荧光显微镜观察分析斑马鱼的肠道中性粒细胞数量，以肠道中性粒细胞数量的统计学分析结果评价斑马鱼的炎症反应情况；
或/和水溶给予S1所得各组斑马鱼待测药物或保健食品24-72 h后，检测斑马鱼体内aqp3和il-1β基因相对表达量，以aqp3和il-1β基因相对表达量的统计学分析结果评价斑马鱼的腹泻和炎症反应情况。
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