CN117551586A - 一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液及分离方法 - Google Patents

一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液及分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液，涉及共栖微生物分离技术领域，包括：培养液a和培养液b；培养液a包括基底液、10uM IAA；培养液b包括基底液、10uM cAMP；所述基底液包括10％TSB溶液，胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L；分离时，先对样品进行复苏，高通量分离培养样品微生物，并以酶标仪辅助确定最佳稀释浓度，本发明首次将cAMP应用于高通量分离筛选，且新增了样品复苏步骤，从而促进内生菌的活性和分离；侧重于尽可能多地分离出未培养微生物，提高植物共栖微生物的种类及属类，而不是局限于提升微生物菌株的数目。

Description

一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液及分离 方法
技术领域
本发明涉及共栖微生物分离技术领域，更具体地说是涉及一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液。
背景技术
植物微生物群对植物的生长、发育、防御等方方面面都起着至关重要的作用，被称为植物的“第二基因组”。这些独特的微生物菌种具备极大的潜力和价值，它们为农业乃至其他行业的应用提供不可或缺的菌种资源。建立植物共栖微生物的分离培养方法可以为农业微生物资源库的创建提供方法指导，对推动植物微生物学及农业发展意义重大。
传统平板分离法效率低，每次只能分离出几十到几百株菌，高通量筛菌可以达到快速分离几百株甚至几千株菌的效果，且分离纯度高。目前最常用的高通量分离方法为流式细胞仪法和极限稀释法。流式细胞仪法分离固然有多种优点，但是设备昂贵，操作复杂，维修成本高，且需要固定技术联用；而极限稀释法对实验设备要求低，适用面更广。
高通量微生物分离技术不应只具有快速分离成百上千的菌株的功能，也应具有能筛出未培养微生物的功能，以期能实现数量多、种类全的分离目标。未培养微生物之所以目前未被分离培养出来，主要是因为人工培养无法完全模拟原位环境，而生存环境的巨大改变往往导致微生物不可培养，例如常规的微生物培养基，其营养物浓度远远高于微生物生长的自然环境。而自然界中微生物数量庞大，其可利用的营养物质极其匮乏，多数处于“寡营养”状态。目前植物微生物高通量筛选方法多采用稀释的培养基来模拟环境(将常规微生物培养基进行稀释，使营养物浓度降低，也能增加可培养微生物的数量)。例如刘永鑫有提过根系微生物分离相关的方法，方法简洁明了，可操作性强，分离成本低，在专利CN111518729 A中就采用此方法，即用10％稀释的TSB培养基来进行96孔板的分离培养，但是有相关文献表明此方法分离的微生物约占50～60％，可能有很多微生物未被培养出来。在专利CN 116574610 A中对上述方法进行了改良，不仅采用10％TSB培养基，同时通过作物植株与1/10TSB培养基混合，经粉碎、发酵、过滤除菌复配了培养基添加液，进而改进了培养基配方；专利CN 116200270 A中，采用区别于上述的培养基，使用含有CCK8的液体培养基进行梯度稀释，进而进行高通量菌株分离；因此，如何设计培养基配方或许能为高通量分离培养技术进行优化和完善。另外，除了培养基需进一步改良之外，在实际操作上，现有技术方法(包括上述所列专利)都是通过肉眼观察孔度浑浊度在30％～40％时判断此时为最佳稀释度，但由于单菌在相对“寡营养”的小孔中生长缓慢，短期难以成长为“浑浊状态”，另外培养基自身的颜色也会影响肉眼判断“浑浊”或“变色”，因此对极限稀释法的最佳稀释倍数的选择存在较大误差，导致单孔菌种类过多达不到分离的效果或者完全无菌使菌种分离。除此之外，现有方法未有植物样品复苏步骤，而实际操作中样品由于运输或冷冻储存的原因，需要对样品进行复苏来保障菌株活性。
因此，如何提供一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液及分离方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液，包括：培养液a和培养液b；
其中，培养液a包括基底液、10uM IAA；培养液b包括基底液、10uM cAMP；所述基底液包括10％TSB溶液，胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L。
一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法，过程包括：
1)植物样品的复苏及预处理：将植物样品剪碎，在无菌PBS溶液中复苏24h，得样本浸出液；然后将样本浸出液转至含有氯化镁溶液的容器中，室温静置15min，得待分离样本；
2)不同培养液的制备：配置培养液a和培养液b；其中，培养液a包括基底液、10uMIAA；培养液b包括基底液、10uM cAMP；所述基底液包括10％TSB溶液，胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L；
3)高通量分离培养样品微生物：分别将10000μl、2000μl、400μl、80μl、16μl的待分离样本加入含有1L 10％TSB溶液的容器中，稀释成100×、500×、2500×、12500×、72500×的梯度稀释液，密封、分装进96孔细胞培养板；未添加样品匀浆的10％TSB溶液转移至3个细胞培养板作为阴性对照，将培养板堆叠放置在室温下培养10d；
4)酶标仪辅助确定最佳稀释浓度，然后选择多个96孔细菌培养板上的候选孔，挑取细菌培养物，转移至1/2TSB固体平板上，在室温下培养3～5d，挑取单菌落转移至新的1/2TSB固体平板上，重复2次，挑取单菌落、摇菌、离心、去上清，重悬菌体，分离得到共栖微生物。
优选地，步骤1)中，氯化镁的摩尔浓度为10mM。
优选地，步骤3)中，每个孔160μl梯度稀释液，每种稀释度下的稀释液转移至多个细胞培养板。
优选地，步骤4)中，确定最佳稀释浓度为：采用酶标仪分别测在450nm、500nm、600nm下有菌组和对照组的OD值，计数有菌组与对照组OD值的平均值具有显著差异的小孔数，保留小孔数在30～40之间的96孔细胞培养板，此时该细胞培养板所对应的稀释度为最佳稀释度；从培养板每孔中吸取10μl样品移入96孔PCR板中，存储在-20℃冰箱用于后期细菌鉴定，在96孔细胞培养板每孔剩余样品中添加140μl的60％灭菌甘油，存储在-80℃冰箱。
优选地，步骤4)中，摇菌、离心、去上清，重悬菌体为：在28℃条件下转速180rpm，摇培5～7d将30ml菌液2900g离心10min，弃去上清液至剩余1ml，重悬菌体，吸取800μl的重悬菌液移入冻存管，加入等体积60％的无菌甘油，混匀，-80℃保存。
经由上述技术方案可知，本发明达到的技术效果是：
(1)本发明采用酶标仪辅助确定96孔板分离所需的最佳稀释度，与肉眼观察孔度和浑浊度相比，酶标仪辅助判断可以排除培养基自身颜色的影响，提供了一种更客观、准确和可重复的方式来量化菌液的浓度，以便对结果进行更好的评估；
(2)本发明首次将cAMP应用于高通量分离筛选，极大的提升了分离的种类数目；另外添加微量植物激素IAA辅助激素敏感类微生物分离的方法，辅助植物共栖微生物的分离筛选，cAMP及IAA的添加，使得传统的采用10％TSB或其他基底液的高通量分离方法得到显著优化；
(3)本发明相较于现有技术新增样品复苏步骤，从而促进内生菌的活性和分离；侧重于尽可能多的分离出未培养微生物，提高植物共栖微生物的种类及属类，而不是局限于提升微生物菌株的数目；
(4)现有技术大多针对特定植物的根际的微生物的分离，本发明增加植物各种部位及土壤适用的取样及处理方式，适用于大部分植物包括常见农作物的共栖微生物的分离培养，不局限于特定植物的部位、种类，更具有普适性。
附图说明
图1附图为培养液a(A)和培养液b(B)分离到的微生物平板图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1以烟草的共栖微生物分离为例
(1)烟草的取样及样品复苏
在湖南省郴州市桂阳烟区选取代表性采样点，在每个采样点样点“S”形多点采样，采集烟区耕作层(0-20cm)土壤为根际土样本，记作BS；随机挖取生长正常、充分成熟、形态完整的5株烟株，分别用无菌剪刀裁剪出茎、叶样品，以株为单位，分别将茎、叶分装至不同无菌自封袋中，分别为茎、叶样本，记作ST、LF；将烟株抖落根系表面土壤，将根系样品置加冰的冰盒中，转移至含20ml无菌10mM PBS溶液的无菌50ml离心管中，放置于常温(或低于常温)摇床120rpm，室温下震荡20min，使用无菌镊子将根系转移至新的无菌50ml离心管中待用，剩余悬浮液高速离心(6,000×g，4℃)20min收集土壤即为根际土样本，记为RS；挑出的根系经表面消毒后，用于根内生微生物的分离，为根样本，记为RT。所有样品短期储存(2周内)条件为4℃冷藏，长期储存(6个月以内)条件应为-20℃，样品不宜放置时间过长，避免菌株失活导致分离率低。
做高通量分离前对样品进行复苏。将根、茎、叶等植物样品剪碎，各称取6g，根际土和根围土则直接称取6g，分别加入灭菌后的50mL离心管中，倒入20mL无菌PBS溶液，封口膜封口，室温，过夜复苏24h。取复苏后的各样本浸出液200μl转至含有25ml 10mM氯化镁的50ml管中，混匀，室温静置15min，即得待分离样本。
2.培养液的配制
称取30份15g TBS培养基粉末，分别加入30个装有500ml水的1L的三角瓶中，配制成10％TSB溶液，此溶液为基底液。向10个装有基底液的三角瓶中加0.875mg IAA粉末，搅拌均匀，用1m NaOH和HCl调pH为6.8～7.2，为培养液a。向10个装有基底液的三角瓶中加1.645mg cAMP粉末，搅拌均匀，用1m NaOH和HCl调pH为6.8～7.2，为培养液b。
3.高通量分离培养样品微生物组
将复苏后的浸出液转至含有200ml 10mM氯化镁的500ml三角瓶中，混匀，室温静置15min。分别取10000μl、2000μl、400μl、80μl、16μl的待分离菌液样品各加入5个含有1L基底液的试剂瓶、5个含有1L培养液a的试剂瓶、5个含有1L培养液b的试剂瓶，形成不同的待分离液。在生物安全柜中，摇匀每瓶稀释液，将50ml稀释液倒入13cm无菌方皿中，用排枪吸取液体移入96孔细胞培养板的每个孔中，每孔160μl，每瓶稀释液转移8个细胞培养板，同时设置未添加稀释液的10％TSB溶液转移3个细胞培养板作为阴性对照。用封板膜将每一个细胞培养板封口。将培养板放置在室温下孵育10天。10天后各取不同稀释度的96孔细胞培养板3个，用酶标仪测其450nm、500nm、600nm下有菌组和对照组的OD值，计数有菌组与对照组OD值的平均值具有显著差异的小孔数，小孔数在30～40之间的96孔细胞培养板所对应的稀释度为最佳稀释度，保留最佳稀释度下剩余的5个96孔细胞培养板。经试验结果如表1～表3所示：
表1采用基底液培养时的培养板保留情况
100× 500× 2500× 12500× 72500×
LF 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
ST 不保留 保留 不保留 不保留 不保留
RT 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
RS 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
BS 不保留 不保留 不保留 保留 不保留
表2采用培养液a时的培养板保留情况
100× 500× 2500× 12500× 72500×
LF 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
ST 不保留 保留 不保留 不保留 不保留
RT 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
RS 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
BS 不保留 不保留 不保留 保留 不保留
表3采用培养液b时的培养板保留情况
100× 500× 2500× 12500× 72500×
LF 不保留 不保留 不保留 保留 不保留
ST 不保留 保留 不保留 不保留 不保留
RT 不保留 不保留 保留 不保留 不保留
RS 不保留 不保留 不保留 保留 不保留
BS 不保留 不保留 不保留 保留 不保留
共保留LF细胞培养板15个，ST细胞培养板15个，RT培养板15个，RS培养板15个，BS培养板15个，预测共分离菌株约为15×5×96×0.35＝2520个(每板按35个浑浊算)。根据培养板保留情况，可以获得不同样品的最佳稀释度，以叶片样本为例：采用基底液时，LF待分离样本的最佳稀释度为2500×；采用培养液a时，最佳稀释度为2500×；采用培养液b时，最佳稀释度为12500×。
用排枪从保留的培养板每孔中吸取10μl样品移入96孔PCR板中，存储在-20℃冰箱用于细菌鉴定。在后续使用PCR板前，用微孔板离心机将板内液体离心至管底再揭开PCR封板膜以避免污染。在96孔细胞培养板每孔剩余样品中添加140μl的60％灭菌甘油，存储在-80℃冰箱。
96孔PCR板经后续鉴定，培养液a较基底液菌种类型增加0.9％，培养液b较基底液增加5％。类别增加率略有提升，并不显著，一是因为数据受实验培养板数目的影响，二是因为部分菌浓度受IAA或CAMP抑制，因此看起来较基底液变化不明显。然而培养液a和培养液b可分离出基底液没有分离出的微生物，例如培养液a的RS组的3号板和5号板、RT组的3号板分离出了木霉属(Trichoderma)，在培养液b的BS组的3号板分离到了脆弱拟杆菌属(Burkholderia)见图1。因此培养液a和培养液b可以作为基底液的辅助培养法，填补基底液分离不到的菌种，三种培养液共同使用，将会大大提升分离的菌株的种类和属类。下述表1为分离到的菌株情况，F1、F2、F4、F6、F10、F16、A3、A4、A5为难培养微生物。
表1鉴定的代表性菌属(部分)
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种用于植物共栖微生物高通量分离方法的培养液，其特征在于，包括：培养液a和培养液b；
其中，培养液a包括基底液、10uM IAA；培养液b包括基底液、10uM cAMP；所述基底液即10％TSB溶液，包括胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L。
2.一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法，其特征在于，过程包括：
1)植物样品的复苏及预处理：将植物样品剪碎，在无菌PBS溶液中复苏24h，得样本浸出液；然后将样本浸出液转至含有氯化镁溶液的容器中，室温静置15min，得待分离样本；
2)高通量分离培养样品微生物：分别向培养液a、培养液b，基底液中按比例加入待分离样本，配置成梯度分别为100×、500×、2500×、12500×、72500×的梯度稀释液，密封、分装进96孔细胞培养板；未添加待分离样本的10％TSB溶液转移至3个细胞培养板作为阴性对照；将培养板堆叠放置在室温下培养10d；
3)酶标仪辅助确定最佳稀释浓度，然后选择多个96孔细菌培养板上的候选孔，挑取细菌培养物，转移至1/2TSB固体平板上，在室温下培养3～5d，挑取单菌落转移至新的1/2TSB固体平板上，重复2次，挑取单菌落、摇菌、离心、去上清，重悬菌体，分离得到共栖微生物。
3.根据权利要求2所述的一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法，其特征在于，步骤1)中，氯化镁的摩尔浓度为10mM。
4.根据权利要求2所述的一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法，其特征在于，步骤3)中，每个孔160μl梯度稀释液，每种稀释度下的稀释液转移至多个细胞培养板。
5.根据权利要求2所述的一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法，其特征在于，步骤4)中，确定最佳稀释浓度为：采用酶标仪分别测在450nm、500nm、600nm下有菌组和对照组的OD值，计数有菌组与对照组OD值的平均值具有显著差异的小孔数，保留小孔数在30～40之间的96孔细胞培养板，此时该细胞培养板所对应的稀释度为最佳稀释度；从培养板每孔中吸取10μl样品移入96孔PCR板中，存储在-20℃冰箱用于后期细菌鉴定，在96孔细胞培养板每孔剩余样品中添加140μl的60％灭菌甘油，存储在-80℃冰箱。
6.根据权利要求2所述的一种基于极限稀释法的植物共栖微生物高通量分离方法，其特征在于，步骤4)中，摇菌、离心、去上清，重悬菌体为：在28℃条件下转速180rpm，摇培5～7d将30ml菌液2900g离心10min，弃去上清液至剩余1ml，重悬菌体，吸取800μl的重悬菌液移入冻存管，加入等体积60％的无菌甘油，混匀，-80℃保存。
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