CN117545346A

CN117545346A - 对抑制乙酰乳酸合酶的除草剂有抗性的芝麻植物、组合物及其生产方法

Info

Publication number: CN117545346A
Application number: CN202280041271.4A
Authority: CN
Inventors: Z·佩莱格; Y·嘉德瑞; A·阿夫纳瑞
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2024-02-09
Also published as: AU2022289765A1; WO2022259249A1; EP4351321A1; BR112023024858A2; MX2023014277A; US20240298601A1

Abstract

本发明涉及对抑制植物酶乙酰乳酸合酶(ALS)的除草剂有抗性的芝麻植物，并且进一步涉及组合物及其生产方法。

Description

对抑制乙酰乳酸合酶的除草剂有抗性的芝麻植物、组合物及其生产方法

技术领域

本发明涉及对除草剂有抗性的芝麻植物，特别是涉及对抑制植物酶乙酰乳酸合酶(ALS)活性的除草剂有抗性的芝麻植物，并进一步涉及组合物及其生产方法。

背景技术

芝麻(Sesamumindicum L.；基因组2n＝2x＝26)属于胡麻(Padaliaceae)科胡麻(Sesamum)属，在全世界是一种重要的油料作物。它的种子用于多种用途，如生产油和芝麻酱、烹饪和烘焙，以及作为药品中使用的成分的来源。芝麻种子被认为是最好的油料种子之一，因为所述种子含有相当大量的高品质油、蛋白质、碳水化合物和大量必需矿物质营养素(Teboul等，2021.Genes,11:1221)。近年来，作为向更健康的植物基食品来源发展的全球趋势的一部分，对芝麻种子(和二次产品)的需求不断增长。

然而，目前的芝麻种子生产大多局限于发展中国家，使用费力且不划算的传统种植经验。尽管芝麻具有经济和农业潜力，但它是一种“孤儿作物”，在现代遗传学和育种方面的研究有限。因此，有必要弥合由目前有限的生产和市场造成的知识差距，以开发适合现代化大规模农业实践的新品种。

杂草侵扰是导致芝麻植物发育和产量下降的主要生物因素。由于其在初始生长阶段发育缓慢(Gadri等人，2020.Plant Science,295:110105；Langham等，2007年，关于芝麻的除草剂研究综述(Review of herbicide research on sesame(Sesamumindicum L.))，ASGA，Gainesville，FL，USA)，芝麻是杂草的劣势竞争对手。此外，其延长的“关键期”(即作物生长周期中必须防治杂草以防止显著产量损失的时期)进一步强调了高效杂草防治实践的重要性。已发现取决于生长程度、天数和杂草侵扰程度，芝麻的“关键期”持续长达10周(例如Aref等，2013.Assiut Journal of Agricultural Sciences,44:32-45；Karnas等，2019.Weed Biology and Management,19:121-128；Vilan 2017，提交给以色列耶路撒冷希伯来大学的硕士学位论文)。因此，如果在此期间不防治杂草，可能会导致产量严重下降，从西孟加拉邦的约60％和土耳其的约78％(分别为Duary和Hazra，2013.Indian Journal ofWeed Science,45:253-256和Karnas等，2019，同上)直至产量完全损失(由Singh等，1992.Agricultural Reviews,13:163-175综述)。

自1940年引入以来，化学品(即除草剂)为杂草防治提供了最具成本效益和效率的做法。在大多数主要作物中，除草剂有利地实现选择性杂草防治。然而，大多数使用中的化学除草剂会对芝麻植物造成一些损害。尽管已在近40个国家中测试了已知除草剂(132种除草剂和58种除草剂组合物)的大多数作用模式，但它们都导致芝麻减产(由Langham等，2018.Sesame Weed Control Part 1.Sesame Research LLC,doi:10.13140/RG.2.2.21216.94722综述)。发现某些作为乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂的除草剂是安全的；然而，这组除草剂仅对禾本科杂草的萌发后防治有效。

在各种除草剂MOA中，一个常见的活性靶是乙酰乳酸合酶(ALS)，也称为乙酰羟基酸合酶(AHAS)。ALS是催化包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在内的支链氨基酸生物合成中的初始步骤的关键酶(Umbarger,1978.Annual Reviews in Biochemistry,47:533-606)。这种酶的抑制主要导致植物饥饿，但副作用例如2-酮基丁酸盐的积累和光合产物运输的分散也已被显示与植物死亡有关(《咪唑林除草剂》(The Imidazoline Herbicides)，1991，Shaner和O'Connor主编，CRC Press)。抑制ALS的除草剂防治许多杂草物种，具有低的哺乳动物毒性，并且在许多作物中具有选择性(Yu等，2010.Journal of Experimental Botany,61:3925-3934)。抑制ALS的除草剂根据其分子结构分为5个化学类别：咪唑啉酮类(IMI)、磺酰脲类(SU)、嘧啶基硫代苯甲酸酯类(PTB)、三唑并嘧啶类(TP)和磺酰氨基羰基三唑啉酮类(SCT)。咪唑啉酮和磺酰脲类是使用最广泛的类别，并包括可利用的最大的商业化的除草剂(Saari等，1993，《植物对除草剂的抗性》(Resistance to Herbicides in Plants)，S.B.Powles和J.A.M.Holtum主编，Lewis Publ.CRC Press,Boca Raton,FL)。ALS基因上不同位点处的点突变抗性在各种杂草物种中已被天然发现(weedscience.org)，并已在作物中被诱导(例如Tan等，2005.Pest Management Science,61:246-257；国际(PCT)申请公开号WO 2007/149069)。产生除草剂抗性ALS的其他突变来源已经被记载在例如美国专利第5,605,011号、美国专利申请公开号2003/0097692和国际(PCT)申请WO 2012/049268中。

抗性突变的遗传特征已被归类为半显性遗传，其中杂合体等位基因表现出中等抗性(Ghanizadeh等，2019.Critical Reviews in Plant Sciences,38:295-312)。

种类繁多的抑制ALS的除草剂使农民能够独立于生长阶段防治各种杂草物种。然而，这些高效除草剂不能用于芝麻，因为传统芝麻植物/商业芝麻品种对这些抑制ALS的除草剂高度敏感。

因此，迫切需要开发具有增强的除草剂抗性的新的芝麻品种，以确保高产和可持续性。

发明内容

本发明解决了上述需求，提供了对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)活性的除草剂有抗性的芝麻植物。具体而言，本发明提供了包含具有单一突变的突变型ALS基因的芝麻植物及其部分，所述植物与野生型芝麻相比对至少一种抑制ALS的除草剂具有降低的亲和性。包含所述突变型ALS基因的芝麻植物对在萌发前或萌发后施用的抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性，使得杂草可以在整个芝麻生长期中得到防治，这在农业栽培中是显著的优势。出乎意料的是，所述抗性芝麻植物在萌发后暴露于使用抑制ALS的除草剂的处理后，与所述植物在(通过机械或手动除草获得)无杂草条件下生长时获得的产量相比，进一步表现出显著更高的产量。不希望受到任何特定理论或作用机制束缚，所述抗性可归因于除草剂结合位点处蛋白质构象的变化，这是由于丙氨酸替换为缬氨酸的单一突变引起的，导致除草剂对ALS酶的亲和性降低。

根据某些方面，本发明提供一种芝麻(Sesamumindicum L.)植物或其部分，其包含至少一个包含突变型乙酰乳酸合酶编码基因(mALS)的细胞，其中所述mALS编码与野生型芝麻ALS(SiALS)蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并且其中所述植物对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性。

根据某些实施方案，所述野生型SiALS蛋白包含与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在第188位处包含丙氨酸。

根据某些实施方案，所述野生型SiALS蛋白包含与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少95％或更高同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在第188位处包含丙氨酸。

根据某些示例性实施方案，所述野生型SiALS蛋白包含SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列。

根据某些实施方案，所述mALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。

根据某些当前示例性实施方案，所述丙氨酸被缬氨酸替换(Ala188Val)。根据这些实施方案，所述mALS蛋白在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的第188位处包含氨基酸缬氨酸。

根据某些当前示例性实施方案，所述mALS蛋白包含SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列。

根据某些实施方案，所述野生型SiALS基因包含与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列，其中所述序列在第562-564位处包含丙氨酸编码序列。根据某些实施方案，所述野生型SiALS基因包含与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少95％或更高同一性的核酸序列，其中所述序列在第562-564位处包含丙氨酸编码序列。

根据某些示例性实施方案，所述野生型SiALS基因包含SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列。

根据某些实施方案，所述丙氨酸编码序列包含SEQ ID NO：2的第562-564位核酸。

根据某些实施方案，所述mALS多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的第562-564位处包含为除丙氨酸以外的氨基酸编码的替换密码子。

根据某些实施方案，所述替换密码子编码氨基酸缬氨酸。根据这些实施方案，所述mALS多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的第563位中包含核苷酸胸腺嘧啶(T)。

根据某些当前示例性实施方案，所述mALS多核苷酸包含SEQ ID NO：4中阐述的核酸序列。

根据某些实施方案，所述编码突变型乙酰乳酸合酶的突变型多核苷酸是所述芝麻植物内源的编码ALS的基因(mSiALS)的突变体。

根据某些实施方案，所述编码突变型乙酰乳酸合酶的突变型多核苷酸是外源多核苷酸。所述外源多核苷酸可以是编码所述突变的ALS蛋白(mALS)的突变的内源ALS基因或异源ALS基因。

根据某些实施方案，所述植物或其部分就所述mALS多核苷酸而言是纯合的。

根据某些实施方案，所述植物或其部分就所述mALS多核苷酸而言是杂合的。

应该明确地理解，尽管就编码对抑制ALS的除草剂具有降低的亲和性的突变型ALS蛋白的突变型基因而言纯合的芝麻植物与杂合植物相比对抑制ALS的除草剂表现出更高的耐受性，通常为抗性，但所述杂合植物与包含野生型SiALS基因的植物相比显示出明显增强的耐受性/抗性。

根据某些实施方案，不论向所述植物、其部分或所述植物的栖息地施用除草剂的时间如何，本发明的芝麻植物对抑制ALS的除草剂均有抗性。除草剂的施用时间包括芝麻植物萌发前(播种后幼苗出现之前)；萌发后第一对两片真叶阶段时；以及此后直至植物成熟的任何时间。

应该明确地理解，根据本发明的教导，所述对抑制ALS的除草剂有抗性的植物是可育的。

根据某些实施方案，当在标准芝麻生长条件下生长时，所述mALS基因和/或mALS蛋白对所述芝麻植物的生长速率和模式基本上没有有害影响。

根据某些示例性实施方案，所述对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性的植物在萌发后暴露于使用所述抑制ALS的除草剂的处理后，与所述植物在通过替代杂草防治方法(即手动除草)获得的无杂草条件下生长时获得的产量相比，产生更高的种子产量。

根据某些实施方案，所述抑制ALS的除草剂是选自除草有效的咪唑啉酮类(IMI)、磺酰脲类(SU)、嘧啶基硫代苯甲酸酯类(PTB)、三唑并嘧啶类(TP)和磺酰氨基羰基三唑啉酮(SCT)的类型。

根据某些实施方案，所述咪唑啉酮除草剂选自5-(甲氧基甲基)-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(甲氧咪草烟(Imazamox))、5-甲基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(甲基咪草烟(Imazapic))、5-乙基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(咪唑乙烟酸(Imazethapyr))、2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(灭草烟(Imazapyr))、4-甲基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)苯甲酸(咪草酸(Imazamethabenz))、4-甲基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)苯甲酸甲酯(咪草酸甲酯(Imazamethabenzmethyl))、2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)喹啉-3-甲酸(灭草喹(Imazaquin))和1-(2-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)磺酰基-3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)脲(唑吡嘧磺隆(Imazosulfuron))。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述磺酰脲除草剂选自2-[(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨甲酰基氨磺酰基]-4-甲酰胺基-N,N-二甲基苯甲酰胺(甲酰胺磺隆(foramsulfuron))和1-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)-3-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基]磺酰脲(三氟啶磺隆(trifloxysulfuron))。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂选自N-(2,6-二氟苯基)-8-氟-5-甲氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-2-磺酰胺(双氟磺草胺(Florasulam))和2-氯-6-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)硫烷基苯甲酸钠(嘧草硫醚(Pyrithiobac sodium))。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述磺酰氨基羰基三唑啉酮是2-[(4-甲基-5-酮基-3-丙氧基-1,2,4-三唑-1-羰基)氨磺酰基]苯甲酸甲酯(丙苯磺隆(Propoxycarbazone))。

应该明确地理解，本发明的植物可以对单一或多种抑制ALS的除草剂类型有抗性。根据某些示例性实施方案，本发明的植物对多种抑制ALS的除草剂类型有抗性，多种抑制ALS的除草剂包括萌发前抑制ALS的除草剂和萌发后抑制ALS的除草剂。

根据某些实施方案，所述植物部分选自种子、花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎和芽。每种可能性代表本发明的单独实施方案。源自所述植物或其部分的细胞和组织培养物也涵盖在本发明内。

根据某些实施方案，本发明的以对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性为特征的芝麻植物进一步以蒴果不开裂为特征。

根据某些实施方案，本发明的芝麻植物是非转基因植物。

根据某些实施方案，所述非转基因植物通过经定点突变在所述植物的乙酰乳酸合酶编码基因内产生突变而产生。根据某些实施方案，定点突变通过基因编辑方法，使用至少一种人造工程化核酸酶来进行。根据某些实施方案，所述核酸内切酶选自caspase 9(Cas9)、Cpf1、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。根据某些实施方案，所述突变使用CRISPR/Cas系统、CRISPR/Cas同源系统或改良的CRISPR/Cas系统来插入。

根据其他实施方案，本发明的芝麻植物是转基因植物，其包含至少一个包含至少一种外源多核苷酸的细胞，所述外源多核苷酸编码与野生型SiALS相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的mALS蛋白。

所述对至少一种抑制ALS的除草剂具有降低的亲和性的mALS蛋白和编码它的多核苷酸如上文中所述。

根据某些示例性实施方案，本发明提供了本发明的芝麻植物的种子，其中从所述种子生长的芝麻植物包含至少一个包含突变型乙酰乳酸合酶编码基因(mALS)的细胞，其中所述mALS编码与野生型芝麻ALS(SiALS)蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并且其中所述植物对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性。

根据其他某些方面，本发明提供了一种产生对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在所述植物内源的编码ALS的基因的至少一个等位基因中引入至少一个突变，其中所述至少一个突变导致编码的ALS蛋白与由非突变基因编码的ALS蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低。

所述野生型和突变型蛋白和编码它们的多核苷酸以及所述抑制ALS的除草剂如上文所描述。

根据其他方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码与野生型芝麻ALS蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白。

根据某些实施方案，所述编码的ALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。

根据某些实施方案，所述编码的ALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。

根据某些示例性实施方案，所述编码的蛋白质在第188位处包含氨基酸缬氨酸。

根据某些当前示例性实施方案，所述编码的蛋白质包含SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列。

根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的第562-564位处包含编码除丙氨酸以外的氨基酸的替换密码子。

根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列的第562-564位处包含编码除丙氨酸以外的氨基酸的替换密码子。

根据某些示例性实施方案，所述分离的多核苷酸在第562-564位处包含编码缬氨酸的密码子。根据某些当前示例性实施方案，所述分离的多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的第563位中包含核苷酸胸腺嘧啶(T)。

根据其他当前示例性的实施方案，所述分离的多核苷酸在SEQ ID NO：2的第563位中包含核苷酸胸腺嘧啶(T)，以形成SEQ ID NO：4。

根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸被包含在DNA构建体中，所述构建体进一步包含至少一个调控元件。根据某些实施方案，所述调控元件选自启动子、增强子、终止序列及其任何组合。根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸或包含它的DNA构建体被包含在植物细胞相容性表达载体内。

包含本发明的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸的DNA构建体和/或表达载体的宿主芝麻植物细胞，以及包含所述宿主细胞的芝麻植物，也涵盖在本发明的范围之内。

根据其他方面，本发明提供了一种鉴定对至少一种类型的抑制ALS的除草剂具有增强的耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在从所述植物获得的遗传材料中检测通过包含SEQ ID NO：5(CAGGTTCCCCGTCGTATG)和SEQ ID NO：6(TCCTTGACAACCCGAGGA)中阐述的核酸序列的一对引物进行扩增的核酸标志物的存在。根据某些实施方案，所述扩增的标志物包含SEQ ID NO：7(ATCGGCACTGATGTTTTCCAAGAAACCCCTATTGTTGAGGTAACTA GGTCGATTACCAAGCATAATTATCTTGTTTTAGATGTTGAGGATAT)中阐述的核酸序列。

根据某些方面，本发明提供了一种产生对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在对抑制ALS的除草剂敏感的芝麻植物的至少一个细胞中引入至少一个多核苷酸，所述多核苷酸编码对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的ALS蛋白。

根据某些实施方案，与野生型SiALS蛋白中的丙氨酸相比，所述对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的ALS蛋白在第188位处包含缬氨酸。

所述对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的ALS蛋白和编码它的分离的多核苷酸如上文中所描述。

根据其他某些方面，本发明提供了一种在根据本发明的教导的对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性的至少一种芝麻植物附近防治杂草的方法，所述方法包括以足以抑制所述杂草生长的量向所述杂草和所述植物施用至少一种抑制ALS的除草剂。

根据某些实施方案，所述抑制ALS的除草剂的量不显著抑制对所述除草剂有抗性的芝麻植物的生长。

根据某些实施方案，所述抑制ALS的除草剂的量抑制对所述除草剂敏感的相应芝麻植物的生长。

根据某些实施方案，所述抑制ALS的除草剂量导致对所述除草剂有抗性的芝麻植物的种子产量与在通过替代性杂草防治方法获得的无杂草环境中生长的对所述除草剂有抗性的相应芝麻植物的产量相比提高，其中所述除草剂在萌发后施用。

应该理解，本文公开的每个方面和实施方案的任何组合均明确地涵盖在本发明的公开内容中。

从下文给出的详细描述，本发明的其他实施方案和完整适用范围将变得显而易见。然而应该理解，所述详细描述和具体实例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅仅作为说明给出，因为对于本领域技术人员来说，在本发明的精神和范围之内的各种改变和修改将从该详细描述变得显而易见。

附图说明

图1A-1D演示了SiALS基因中的点突变的鉴定和验证。图1A：SiALS基因中的一个区段的基因组序列。标记了点突变和氨基酸替换。图1B：用于野生型(S-416)、突变型(SiRM)和杂交(F₁)植物(H)之间的分离的高分辨率熔解(HRM)标志物。每种基因型的选中物(野生型-右侧品系、突变型-左侧品系和杂交-中间品系)以相对荧光单位(RFU)进行度量。图1C：在施用逐渐增加剂量的甲氧咪草烟下野生型(上方)和SiRM(下方)品系的代表性照片：未处理对照(0)、3(1/8X)、6(1/4X)、12(1/2X)、24(X)、48(2X)、96(4X)、96(8X)和384(16X)g a.i.ha^-1(g活性成分每公顷)。推荐剂量(X＝24g a.i.ha^-1)被下划线。图1D：相对于未处理对照组计算的芽干重。线曲线表示基因型平均值(n＝5)。阴影区域表示标准误差。抗性指数(RI)表示WT与SiRM之间的ED₅₀比率。

图2A-2F示出了杂交(F1)植物对甲氧咪草烟施用(48g a.i.ha^-1)做出响应的遗传和生理特征。图2A-D：处理后3、4、7和11天(DAT)植物的目测特征。图2E：WT、F₁和SiRM植物对甲氧咪草烟施用做出响应的光合同化(A)的纵向小时动力学。图2F：整个实验期间冠层覆盖率(绿色像素)的纵向动力学。实线曲线表示基因型平均值(n＝4)。阴影区域表示标准误差。

图3A-3F演示了杂交(F₁)植物对甲氧咪草烟施用(48g a.i.ha^-1)做出响应的遗传和生理特征。图3A：在未处理对照(UTC)和甲氧咪草烟施用(IMA，48g a.i.ha^-1)(IMA)下野生型(WT，S-416)、杂交(F₁)和突变型(SiRM)植物在实验结束时(施用后21天)的代表性照片。图3B-3D：在UTC下和对甲氧咪草烟施用做出响应WT、F₁和SiRM植物的节长(B)、到第一朵花的长度(C)和芽干重(D)。数据在施用后21天获得。

图4A-4D演示了野生型和SiRM植物对甲基咪草烟和咪唑乙烟酸的响应。图4A：野生型(S-416，上方)和SiRM(下方)植物的代表性照片；图4B：对施用剂量逐渐增加的甲基咪草烟的剂量响应。未处理对照(0)、6(1/8X)、12(1/4X)、24(1/2X)、48(X)、96(2X)、192(4X)、384(8X)和768(16X)g a.i.ha^-1。推荐剂量(X＝48g a.i.ha^-1)被下划线。线曲线(虚线：SiRM；实线-WT)表示基因型平均值(n＝5)。阴影区域表示标准误差。图4C：野生型(S-416，上方)和SiRM(下方)植物的代表性照片；图4D：对施用剂量逐渐增加的咪唑乙烟酸的剂量响应。未处理对照(0)、1.25(1/8X)、2.5(1/4X)、5(1/2X)、10(X)、20(2X)、40(4X)、80(8X)和160(16X)ga.i.ha^-1。推荐剂量(X＝10g a.i.ha^-1)被下划线。线曲线(虚线：SiRM；实线-WT)表示基因型平均值(n＝5)。阴影区域表示标准误差。

图5A-5E示出了在田间条件下对甲氧咪草烟的响应。图5A：田间条件(左侧，未处理的对照长芒苋)和施用甲氧咪草烟(右侧，40g a.i.h^-1)下地块的Ariel照片。图5B：在施用甲氧咪草烟(40g a.i.h^-1)后84天野生型(S-416，WT)和突变型(SiRM)的照片。图5C：每个地块杂草数量的定量。图5D：实验结束时的种子产量。图5E：在对照(上方)和施用甲基咪草烟(48g a.i.ha^-1)下在田间生长的WT(S-416；左)和SiRM(右)植物的Arial图像观察。

图6A-6C示出了萌发前施用甲基咪草烟对SiRM植物的影响。图6A：在黏土土壤中对SiRM品系进行萌发前甲基咪草烟施用的剂量响应。图6B：萌发前甲基咪草烟施用(144ga.i.h^-1)对野生型(S-416)和突变型(SiRM)植物发育和冠层覆盖率的影响。图6C：SiRM植物的根体积对增加速率的甲基咪草烟的响应。

图7A-7E显示了SiRM对抑制ALS的除草剂的响应。图7A-7E：野生型(S-416，上方)和SiRM(下方)植物的代表性照片和对施用剂量逐渐增加的下述除草剂的剂量响应：(A)三氟啶磺隆(X＝12g a.i.ha^-1)，(B)甲酰胺磺隆(X＝450g a.i.ha^-1)，(C)丙苯磺隆(X＝48ga.i.ha^-1)，(D)双氟磺草胺(X＝4g a.i.ha^-1)，和(E)嘧草硫醚(X＝68g a.i.ha^-1)。推荐剂量被下划线。相对于未处理对照(UTC)计算芽干重。线曲线(虚线-SiRM；实线-WT)表示基因型平均值(n＝5)。阴影区域表示标准误差。

图8A-8D示出了野生型(WT；图8A-8B)和突变型(SiRM；图8C-8D)ALS蛋白的理论蛋白质构型。

图9A-9G示出了在田间条件下萌发前施用甲基咪草烟对杂草防治的影响。图9A：播种后25天田地的Arial照片。图9B：田地中的代表性地块上的放大。图9C：在实验结束时记录的总杂草干重。图9D：开花时间；图9E：到第一个蒴果的高度；图9F：每株植物的分枝数；图9G：种子产量。箱线图代表平均值(n＝6)，通过Dunnett检验进行统计分析，将处理与无杂草对照进行比较。

具体实施方式

杂草侵扰是阻止将芝麻作物植入到集约农业系统中的主要农艺学因素。因此，开发新的杂草防治实践是非常必要的。本发明首次公开了对抑制ALS的除草剂具有高耐受性和/或抗性的芝麻品系。所述抗性通过诱导突变和选择对除草剂有抗性的植物来获得。获得的抗性植物在第188位(相对于SEQ ID NO：1中所示的芝麻ALS氨基酸参考序列)丙氨酸密码子中携带单一突变，这导致在除草剂结合位点处ALS蛋白的构型发生朝向降低除草剂对酶的亲和性的变化。本发明的带有突变型ALS的芝麻植物对在萌发前和萌发后施用的抑制ALS的阔叶除草剂具有耐受性。因此，本发明显著有助于在芝麻中采用综合杂草管理，以满足全球对芝麻日益增长的需求。

定义

在本文中，术语“植物”和“芝麻植物”在最广泛的意义上可互换使用。所述术语还指主要分化成在植物发育的任何阶段存在的结构的多个植物细胞。此类结构包括但不限于根、茎、芽、叶、花、花瓣和果实。根据某些示例性实施方案，本发明的芝麻植物是为商业生产芝麻种子而种植的耐寒品种。根据某些示例性实施方案，本发明的芝麻植物是闭果型的，即其特征在于当完全成熟(成熟)时明显闭合的蒴果(果实)。

本文所使用的术语“植物部分”通常是指芝麻植物的部分。植物部分的实例包括但不限于花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实(蒴果)、茎、芽和种子。术语“植物部分”还涵盖可以再生芝麻植物的单细胞和细胞组织，例如在所述植物部分中完整的植物细胞、细胞团和组织培养物。

术语“乙酰乳酸合酶”、“ALS”、“ALS蛋白”和“ALS酶”在本文中可互换使用，并且是指参与丙酮酸向乙酰乳酸转化的酶(也被称为乙酰羟基酸合酶[AHAS])：

2CH₃COCO₂ ^-→^-O₂CC(OH)(CH₃)COCH₃+CO₂

所述反应使用焦磷酸硫胺素以便连接两个丙酮酸分子。这个反应产生的产物乙酰乳酸最终变成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。根据某些实施方案，对于野生型SiALS，所述术语是指具有SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列的芝麻SiALS或与在第188位处包含丙氨酸的SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的酶。

应该明确地理解，野生型芝麻SiALS基因或编码的蛋白质可能包含也可能不包含引起Ala188替换的突变之外的突变。在两个多肽或核酸序列的上下文中，本文所使用的“序列同一性”或“同一性”包括是指所述两个序列中在比对时相同的残基。当使用序列同一性百分率指称蛋白质时，应该认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基替换，并因此不改变分子的功能性质。在序列因保守替换而不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分数以校正所述替换的保守性质。因此类保守替换而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的手段对于本领域技术人员来说是公知的。通常，这涉及将保守替换作为部分而非完全错配进行评分，从而提高序列同一性百分率。因此，例如，在相同的氨基酸被给予1的评分并且非保守替换被给予0的评分的情况下，保守替换被给予0至1之间的评分。例如，根据Henikoff S和Henikoff JG的算法来计算保守替换的评分(来自蛋白质区段的氨基酸替换矩阵(Amino acid substitution matrices from protein blocks)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(22),10915-9,1992)。

同一性(例如同源性百分数)可以使用任何同源性比较软件，包括例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastN、BlastX或Blastp软件，通过例如使用默认参数来确定。

根据本发明的某些当前示例性实施方案，所述同一性是全局同一性，即在本发明的整个氨基酸或核酸序列上而不是在其部分上的同一性。

术语“基因”是指包含产生RNA或多肽所需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。多肽可以由全长编码序列或其任何部分进行编码。术语“其部分”在用于指称基因时是指该基因的片段。片段的大小可以在几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸的范围内。因此，“包含基因的至少一部分的核酸序列”可以包含所述基因的片段或整个基因。

术语“基因”还包括结构基因的编码区，并包括位于5'和3'两端上与编码区相邻的距任一端约1kb距离内的序列，使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区3'或下游并存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“分离的多核苷酸”在本文中可互换使用。这些术语包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物或其杂交体，其为单链或双链、直链或支链，并且任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。所述术语还包括RNA/DNA杂交体。

本文所使用的关于ALS酶与除草剂的相互作用的术语“降低的亲和性”是指mALS酶-除草剂相互作用与相应的野生型ALS-除草剂相互作用相比降低至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多。mALS-除草剂亲和性的降低导致除草剂对mALS活性的抑制降低或没有抑制。根据某些实施方案，所述mALS酶在抑制ALS的除草剂存在下显示出的活性是其在不存在所述除草剂情况下的活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同。根据某些其他或可选实施方案，所述mALS酶在抑制ALS的除草剂存在下显示出的活性是相应的野生型ALS酶在不存在所述除草剂情况下的活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或与其相同。

本文所使用的术语植物对除草剂处理的“耐受的”、“耐受性”、“抗性的”或“抗性”是指植物在除草剂处理下存活。存活的耐受/抗性植物可能表现出由除草剂导致的症状的消失或减轻。在某些实施方案中，与对除草剂敏感的植物相比，对所述除草剂具有耐受性和/或抗性的植物在用所述除草剂攻击时表现出减轻的症状。例如，对除草剂具有耐受性和/或抗性的植物在施用所述除草剂后可能表现出一种或多种与除草剂效果相关的症状(包括例如叶枯、叶片或维管发黄、穗漂白等)，并且与未施用除草剂且在相同条件下生长的相应植物的产量相比，仍未表现出产量降低。

甲磺酸乙酯(EMS)诱变化学物质的应用被证明是在许多作物例如番茄[Solanumlycopersicum(Dor E等，2016.Weed Science,64:348-360)]、油菜籽[Brassica napus L.(Channaoui等，2019.Oilseeds fats Crop Lipids,26,35)]、芝麻(Kouighat等，2020.Journal of Crop Improvement.doi.org/10.1080/15427528.2020.1861155)以及更多作物中产生遗传多样性的高效方法。在本发明的工作过程中，根据芝麻的小基因组尺寸(～370Mbps)和G:C含量，开发了一个大的EMS诱变群体(～80,000株M1植物)。在拟南芥(Arabidopsis)中，Jander等人(2003.Plant Physiology,131:139-146)发现，为了在基因组中任何给定的G:C碱基对中发现突变，需要少于50,000个M1 EMS诱变品系。同样，在大豆中，Sebastian等人(1989.Crop Science,29:1403-1408)使用70,000株M1植物的群体发现了对ALS除草剂的抗性。对咪唑啉酮除草剂(IMI)的响应的田间筛选使得鉴定到单突变植物(SiRM)。

遗传分析揭示了SiALS基因中导致氨基酸Ala188改变的点突变。

在受控(高达192g a.i.ha^-1)和田间(48g a.i.ha^-1)两种条件下，所述SiRM植物对甲氧咪草烟表现出强烈抗性(图1和5)。类似地，发现了对咪唑啉酮类的其他广泛使用的成员、甲基咪草烟和咪唑乙烟酸的高抗性(图4和6)。

因此，根据某些方面，本发明提供了芝麻(Sesamumindicum L.)植物或其部分，其包含至少一个包含突变型乙酰乳酸合酶编码基因(mALS)的细胞，其中所述mALS编码与野生型芝麻ALS(SiALS)蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并且其中所述植物对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性。

根据某些实施方案，所述野生型SiALS蛋白包含与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在第188位处包含丙氨酸。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述mALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些当前示例性实施方案，所述丙氨酸被缬氨酸替换(Ala188Val)。根据这些实施方案，所述mALS蛋白在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列的第188位处包含氨基酸缬氨酸。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述野生型SiALS基因包含与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的核酸序列，其中所述序列在第562-564位处包含编码丙氨酸序列。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述丙氨酸编码序列包含SEQ ID NO：2的第562-564位的核酸。

根据某些实施方案，所述mALS多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的核酸序列的第562-564位处包含编码除丙氨酸以外的氨基酸的替换密码子。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述替换密码子编码氨基酸缬氨酸。根据这些实施方案，所述mALS多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的核酸序列的第563位处包含核苷酸胸腺嘧啶(T)。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

依赖单一类别的除草剂的杂草防治不是推荐的农业做法，因为它会导致快速的选择压力并暴露出抗性杂草(Kumar等，2018,International Journal of ChemicalStudies,6:2844-2850)。因此，为了测试新鉴定的突变是否能促进对其他四类ALS抑制剂的抗性，筛选了每种类别的代表性除草剂。总的来说，与WT植物相比，SiRM植物对测试的每种除草剂都更具抗性(即RI>2)。在施用SU、TP和SCT代表性除草剂下，SiRM植物在田间剂量下表现出耐受性，而WT植物对所有类别都敏感(图7；表3)。因此，本发明允许灵活地使用抑制ALS的除草剂类别以防治更广泛种类的杂草，并在一定程度上降低抗性杂草发展的风险。

根据某些实施方案，所述抑制ALS的除草剂选自除草有效的咪唑啉酮类(IMI)、磺酰脲类(SU)、嘧啶基硫代苯甲酸酯类(PTB)、三唑并嘧啶类(TP)和磺酰氨基羰基三唑啉酮(SCT)。

本文所使用的术语“咪唑啉酮”意指包含一种或多种咪唑啉酮类的化合物的除草组合物，其包括但不限于2-(2-咪唑啉-2-基)吡啶、2-(2-咪唑啉-2-基)喹啉和2-(2-咪唑啉-2-基)苯甲酸酯或其衍生物，包括它们的表现出除草活性的光学异构体、非对映异构体和/或互变异构体。根据某些实施方案，所述咪唑啉酮除草剂选自5-(甲氧基甲基)-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(甲氧咪草烟)、5-甲基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(甲基咪草烟)、5-乙基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(咪唑乙烟酸)、2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)吡啶-3-甲酸(灭草烟)、4-甲基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)苯甲酸(咪草酸)、4-甲基-2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)苯甲酸甲酯(咪草酸甲酯)、2-(4-甲基-5-酮基-4-丙-2-基-1H-咪唑-2-基)喹啉-3-甲酸(灭草喹)和1-(2-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)磺酰基-3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)脲(唑吡嘧磺隆)。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

本文所使用的术语“磺酰脲类”是指包含一种或多种磺酰脲类的化合物的除草组合物，所述类别通常包含连接两个芳香环或杂芳环的磺酰脲桥，即-SO2NHCONH-。根据某些实施方案，所述磺酰脲除草剂选自2-[(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨甲酰基氨磺酰基]-4-甲酰胺基-N,N-二甲基苯甲酰胺(甲酰胺磺隆)和1-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)-3-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基]磺酰脲类(三氟啶磺隆)。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂选自N-(2,6-二氟苯基)-8-氟-5-甲氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-2-磺酰胺(双氟磺草胺)和2-氯-6-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)硫烷基苯甲酸钠(嘧草硫醚)。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，所述磺酰氨基羰基三唑啉酮是2-[(4-甲基-5-酮基-3-丙氧基-1,2,4-三唑-1-羰基)氨磺酰基]苯甲酸甲酯(丙苯磺隆)。

对ALS抑制剂的已知抗性的遗传学遗传被认为由完全或部分显性等位基因防治(Yu和Powles，2014.Pest Management Science,70:1340-1350)，并且在物种和施用剂量之间存在差异(Ghanizadeh等，2019，同上)。为了评估在芝麻中的遗传模式，表征了杂交体和亲本品系(WT和SiRM)对甲氧咪草烟(48g a.i.ha^-1)的响应。在施用后的前4天观察到F₁植物的中等程度响应，以及随后完全的光合恢复。这些结果表明了一种累加效应，其中抗性等位基因的每个拷贝都促进了更高水平的抗性。基于对SU抗性×易感的鸭舌草植物的F₂群体的等位基因测试，Imaizumi等人(2008.Weed Research,48:187-196)提出，在低剂量(即25ga.i.ha^-1苄嘧磺隆)下抗性等位基因具有显性应答，而在高剂量(即225g a.i.ha^-1)下易感等位基因为显性。总之，这些发现表明，突变型ALS酶的拷贝数以及除草剂分子的数量均在抗性水平中发挥关键作用，并且可能在物种和环境条件之间发生变化。

本发明现在表明，在田间条件下，在萌发后用抑制ALS的除草剂甲氧咪草烟处理的SiRM植物与相应的无杂草UTC相比，表现出两倍高的产量(图5D)。不希望受任何特定理论或作用机制约束，这种现象可能是ALS除草剂主要向顶端分生组织的韧皮部迁移的结果(Russell等，2002.Pestic Outlook,13:166-173)。

因此，根据某些实施方案，所述对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性的植物在暴露于使用所述抑制ALS的除草剂的处理后，与所述植物在机械/人工杂草防治的条件下生长时获得的产量相比产生更高的种子产量，其中所述抑制ALS的除草剂在萌发后施用。

在施用甲氧咪草烟后的前两天中，所述突变植物表现出轻微的顶端发黄，这可能导致顶端分生组织优势的破坏，并改变源库关系。同样，已显示芝麻的顶端芽切除可以增加侧枝的形成并提高种子产量(Vasanthan等，2019.International Journal of ChemicalStudies,7:4180-4183)。出人意料的是，在上文提到的恢复后，杂交植物表现出紧凑和茂密的表型(即较短的节)(图3)，这进一步支持了顶端分生组织优势的部分破坏。在萌发前使用抑制ALS的除草剂甲基咪草烟的田间试验中，观察到第一朵花(＝蒴果)的高度降低(图9)。从农学的角度来看，植物结构的这种改变可以促进第一节间上枝条的更早发育，降低倒伏的风险，最大化产量潜力，并支持本发明的突变植物的机械收获。因此，这种现象给农民提供了双重效果，不仅有效地防治杂草(图7)，而且提高产量。

根据某些实施方案，本发明的以对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性为特征的芝麻植物的另一个特征在于蒴果不开裂。

根据某些实施方案，本发明的芝麻植物包含至少一个包含突变型乙酰乳酸合酶(mALS)基因的细胞，所述基因编码与对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的野生型芝麻的ALS(SiALS)蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并被进一步表征为蒴果不开裂，具有芝麻(Sesamum indicum)S-91植物的遗传背景，其种子已在登记号43877下保藏在作为国际保藏机构的NCIMB Ltd.。

本发明的对抑制ALS的除草剂有抗性的植物可以通过本领域技术人员已知或将会知道的任何方法来产生。

根据某些实施方案，所述编码突变型乙酰乳酸合酶的突变型多核苷酸是芝麻植物内源的编码ALS的基因的突变体(mSiALS)。

可以将任何突变插入到编码ALS的多核苷酸中，包括缺失、插入、位点特异性突变(包括核苷酸替换)等，只要所述突变导致编码的蛋白质对抑制ALS的除草剂的亲和性降低即可。

根据某些示例性实施方案，芝麻植物的内源编码ALS的基因的突变通过定点诱变来进行。根据某些实施方案，定点诱变通过基因编辑方法来进行。

基因组编辑是一种反向遗传学方法，其使用人造工程化核酸酶在基因组中的所需位置处切割并产生特定的双链断裂，然后通过细胞的内源性方法例如同源性定向修复(HDR)和非同源末端连接(NFfEJ)将其修复。NFfEJ直接连接双链断裂中的DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板在断点处再生缺失的DNA序列。为了将特定核苷酸修饰引入基因组DNA，在HDR过程中必须存在包含所需序列的DNA修复模板。基因组编辑不能使用传统的限制性核酸酶内切进行，因为大多数限制性酶识别DNA上的几个碱基对作为它们的靶，并且所识别的碱基对组合存在于整个基因组上的许多位置中的概率非常高，导致不限于所需位置的多个切口。为了克服这一挑战并产生位点特异性单链或双链断裂，迄今为止已经发现了几种不同类别的核酸酶并进行了生物工程化改造。它们包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。

根据某些实施方案，本发明的植物通过使用CRISPR/Cas系统、CRISPR/Cas同源和CRISPR/Cas改良系统在芝麻的内源性ALS基因中插入突变来产生。

用于基因组编辑的CRISPR/Cas系统含有两个不同组分：gRNA(引导RNA)和核酸内切酶例如Cas9。

gRNA通常是编码靶同源序列(crRNA)和内源性细菌RNA的组合的20个核苷酸的序列，所述内源性细菌RNA在单个嵌合转录本中将crRNA与Cas9核酸酶(tracrRNA)相连。gRNA/Cas9复合物通过gRNA序列与互补的基因组DNA之间的碱基配对被召集到靶序列。为了与Cas9成功结合，基因组靶序列还必须在紧接靶序列之后包含正确的前间区邻近基序(PAM)序列。gRNA/Cas9复合物的结合将Cas9定位到基因组靶序列，使得Cas9可以切割DNA的两条链，导致双链断裂。与其他基因组编辑核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)相比，由CRISPR/Cas产生的双链断裂可以经历同源重组或非同源末端连接(NHEJ)。Cas9核酸酶有两个功能结构域：RuvC和HNH，每个功能结构域切割不同的DNA链。当这两个结构域都具有活性时，Cas9导致基因组DNA中的双链断裂。

由于与转基因植物相比，大多数基因组编辑技术可以留下在少量核苷酸中显现的最少DNA变化痕迹，因此通过基因编辑产生的作物可以避免通常与遗传修饰(GM)作物开发相关的严格管控程序。

根据某些实施方案，所述编码的ALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。根据某些示例性实施方案，所述编码的蛋白质在第188位处包含氨基酸缬氨酸。

根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的核酸序列的第562-564位处包含编码除丙氨酸以外的氨基酸的替换密码子。

根据某些示例性实施方案，所述分离的多核苷酸在第562-564位处包含编码缬氨酸的密码子。根据某些当前示例性实施方案，所述分离的多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的核酸序列的第563位处包含核苷酸胸腺嘧啶(T)。

根据其他当前示例性的实施方案，所述分离的多核苷酸在SEQ ID NO：2的第563位处包含核苷酸胸腺嘧啶(T)，以形成SEQ ID NO：4。

根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸被包含在进一步包含至少一个调控元件的DNA构建体中。根据某些实施方案，所述调控元件选自启动子、增强子、终止序列及其任何组合。根据某些实施方案，所述分离的多核苷酸或包含它的DNA构建体被包含在植物细胞相容性表达载体中。

根据本发明的其他方面，本发明的对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物是转基因植物，其包含至少一个细胞，该细胞包含编码如上所述的突变型ALS蛋白的至少一个外源多核苷酸。

根据本发明的教导，可以使用本领域中已知或将会知道的用于将分离的多核苷酸引入到芝麻植物或其部分中的任何方法。

根据某些实施方案，将分离的多核苷酸引入到对抑制ALS的除草剂敏感的芝麻植物的至少一个细胞中，通过如上所述的基因编辑方法来进行。

根据某些实施方案，将分离的多核苷酸引入到对抑制ALS的除草剂敏感的芝麻植物的至少一个细胞中，包括用所述分离的多核苷酸转化所述至少一个细胞。

本文所使用的术语“转化”描述了外来核酸序列例如载体进入受体细胞并将其改变成转化的、遗传修饰的或转基因的细胞的过程。转化可以是稳定的，其中将所述核酸序列整合到植物基因组中并因此代表了稳定和遗传的性状，或者可以是瞬时的，其中所述核酸序列由转化的细胞表达但未整合到基因组中，并且因此代表了瞬时性状。根据典型实施方案，本发明的核酸序列被稳定地转化到植物细胞中。

用分离的核酸序列转化植物通常涉及构建将在植物细胞中起作用的表达载体。根据本发明的教导，这样的载体包含编码对至少一种抑制ALS的除草剂具有降低的亲和性的突变型ALS蛋白的分离的多核苷酸。通常，载体包含在调控元件控制下的或可操作地连接到调控元件的多核苷酸。根据某些实施方案，所述调节元件选自启动子、增强子、翻译终止序列及其任何组合。载体可以采取质粒的形式，并且可以单独或与其他质粒组合用于生产对抑制ALS的除草剂有耐受性和/或抗性的转基因芝麻植物的方法中。

土壤杆菌介导的基因转移：土壤杆菌介导的系统包括使用质粒载体，所述载体包含整合到植物基因组DNA中的特定DNA区段。植物组织的接种方法随着植物物种和土壤杆菌递送系统而变。一种广泛使用的方法是叶盘程序，它可以用任何组织外植体进行，这些组织外植体为全植物分化的启动提供了良好来源(Horsch等，1988，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)A5,1-9,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht)。一种补充方法采用土壤杆菌递送系统与真空渗透相结合。土壤杆菌介导的番茄植物的转化方案对本领域技术人员来说是已知的。

直接核酸转移：存在各种将核酸直接转移到植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露到强电场中，打开小孔，允许DNA进入。在微注射中，使用微量移液器将核酸机械地直接注射到细胞中。在微粒轰击中，将核酸吸附在诸如硫酸镁晶体或钨粒子的微弹上，并将微弹物理加速进入细胞或植物组织。将核酸引入植物的另一种方法是通过靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已被用于将表达载体引入到植物中。

表达载体可以包括至少一种标志物(报告)基因，其可操作地连接到调控元件(例如启动子)，所述调控元件允许含有所述标志物的转化细胞通过负选择(通过抑制不含所述选择性标志物基因的细胞的生长)或通过正选择(通过筛选由所述标志物基因编码的产物)来回收。用于植物转化的许多常用选择性标志物基因在本领域中是已知的，并包括例如编码将选择性化学试剂(其可以是抗生素或除草剂)代谢脱毒的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的改变的靶的基因。若干种正选择方法是本领域已知的，例如甘露糖选择。

或者，本发明的转基因和非转基因芝麻植物可以使用对突变型ALS蛋白特异的标志物来鉴定。

根据其他某些方面，本发明提供了一种鉴定对至少一种类型的抑制ALS的除草剂具有增强的耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在从所述植物获得的遗传材料中检测通过包含SEQ ID NO：5(CAGGTTCCCCGTCGTATG)和SEQ ID NO：6(TCCTTGACAACCCGAGGA)中阐述的核酸序列的一对引物进行扩增的核酸标志物的存在。根据某些实施方案，所述扩增的标志物包含SEQ ID NO：7中阐述的核酸序列。SEQ ID NO：7在第14位处包含核苷碱基胸腺嘧啶(T)。

根据某些实施方案，所述方法包括在种植有多种根据本发明的教导的对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性的植物的田地中防治杂草。根据这些实施方案，所述方法包括向所述田地施用至少一种抑制ALS的除草剂。

根据某些实施方案，所述抑制ALS的除草剂的量导致对所述除草剂有抗性的芝麻植物的种子产量与在通过替代性杂草防治方法获得的无杂草环境中生长的对所述除草剂有抗性的相应芝麻植物的产量相比提高，其中所述除草剂在萌发后施用。

为了更全面地说明本发明的某些实施方案，提供了下述实施例。然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。在不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以容易地设计出本文公开的原理的许多变化和修改。

实施例

材料和方法

突变体群体的开发

选择野生型(WT)芝麻品系S-416用于本研究。这种适应机械收获的品系由本发明的发明人及其同事先前为地中海气候而开发的(Sabag等，2021.BMC Plant Biology,21:549)。植物经过6代自交，以获得纯合的均匀种子。将约80,000粒WT种子清洗并在水中浸泡6小时。将种子分到5个容器中，所述容器含有ddH₂O和浓度为0.2、0.4、0.6、0.8或1％(v/v)的诱变剂甲磺酸乙酯(EMS,Merck KGaA,USA)。16小时后，将种子在流水下清洗4小时，以除去残留的诱变剂。将M₁种子播种在种植托盘中，并在1个月后移植到田地中。在成熟时，将M₂种子散装收获并系统性混合，以随机分配任何给定M₁植物的后代。

抗性植物的田间筛选

将散装的M₂种子播种在具有黏土土壤的田间(Moshav Revaha；31°38'41.30"N,34°45'51.72"E)，播种率为6,000,000粒种子ha^-1(～4.2百万粒种子)。在两片真叶阶段，使用商业喷雾器(Degania Industries Ltd.,Israel)向植物喷洒甲氧咪草烟(Pulsar,BSAF,48g活性成分(a.i.)ha^-1)。为了防止可能的植物逃逸，在三周后施用第二剂。每周进行一次观察，以鉴定不受除草剂影响的植物。收获鉴定到的候选植物用于在实验室中进行进一步检查。将芝麻抗体突变体(下文简称SiRM)植物自交至M₅代。

SiALS基因测序

从SiRM M₃植物和易感的WT(S-416)的2周龄植物获取叶片样品(～2mg)。向植物喷洒甲氧咪草烟(48g a.i.ha^-1)进行抗性验证(在DNA采样后)。使用如以前所述为芝麻改良的CTAB方案(Teboul等，2020.Genes,11,1221)提取基因组DNA。为了测试SiALS基因中可能的突变，使用根据已测序的芝麻基因组(Zhongzhi No.13；Wang等，2014.Genome Biology,15:1-13)覆盖整个基因序列的四个引物对(表1)进行定向测序。对基因进行扩增，对PCR产物进行测序(HUJI genome center,Israel)。使用Clustal Omega工具进行序列比对(Madeira等，2019.Nucleic Acids Research,47:636-641)。

表1：用于芝麻SiALS基因区段的测序的引物表

突变型等位基因构型的确定

基于dsDNA熔解温度，开发了一种高分辨率熔解(HRM)方案来确定SiALS突变的等位基因构型。将1μl被设计用于扩增含有所述SNP的DNA区段的正向(CAGGTTCCCCGTCGTATG，SEQ ID NO：5)和反向(TCCTTGACAACCCGAGGA，SEQ ID NO：6)引物与2μl基因组DNA(20ng/μl)、4μl HRM混合物(HOT FIREPol EvaGreen HRM混合物，Solis BioDyne,Tartu,Estonia)和13μl ddH₂O混合。将每种混合物转移到板(96孔Piko PCR板，Thermo FisherScientific,Massachusetts,USA)内单独的孔中，并置于实时PCR系统(PikoReal 96,Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)中。根据提供的方案确定反应设置(即循环、温度和持续时间)。

除草剂剂量响应测定

将WT和SiRM的种子播种在含有来自Newe Yaar研究站的黏土土壤(57％黏土，23％淤泥，20％沙)的9×9×10cm盆中。在两片真叶阶段，将植物暴露于比率逐渐提高的(0、1/8X、1/4X、1/2X、X、2X、4X、8X)来自所有ALS亚组的代表性除草剂(表2)。使用第4代ResearchTrack喷雾器(DeVries Manufacturing,Inc.,USA)将除草剂以200L ha^-1的喷雾体积喷洒在植物上。在处理后16天(16DAT)测量植物高度，收获地上材料并烘干(在80℃下48h)，以获得芽干重(DW)。

表2：使用的除草剂名单

F₁杂交植物的生理特征

在SiRM(♂)与WT(♀)之间进行杂交以产生F1种子。将均匀的F₁种子与两个亲本品系(WT和SiRM)一起播种在含有黏土土壤的9×9×10cm盆中。将盆放置在长日照条件下的生长室(16/8光/暗和32/25℃)中。在两片真叶阶段，向一半的植物喷洒甲氧咪草烟(48ga.i.h^-1)。在接下来的11天内，每天对植物的冠层覆盖率(Canopeo软件，Oklahoma StateUniversity,USA；Patrignani和Ochsner,2015.Agronomy Journal,107:2312-2320)和气体交换(IRGA 6800；Li-Cor,Lincoln,Nebraska,USA)进行表征。在21DAT实验结束时，收获地上材料，烘干(80℃，48h)并称重，以获得芽DW。

田间实验

甲氧咪草烟萌发后实验

实验在Rehovot,Israel的Hebrew University of Jerusalem的实验农场(34°47′N,31°54′E；海拔54m)进行。这个位置的土壤为棕红色、降解性沙质土壤(Rhodoxelf)，由76％的沙、8％的淤泥和16％的黏土组成。应用两种基因型(WT和SiRM)和两种处理的成对样品实验设计：未处理对照(UTC)和甲氧咪草烟施用(40g a.i.h^-1)。每个地块由5米长的行组成，播种密度为7株植物m^-1(n＝6)。在季节结束时，分析存活率(每个地块的植物数量)，并收获地块中的植物。使用实验室脱粒机(Wintersteiger AG LD 350,Austria)对样品进行脱粒，并在筛选后对种子进行称重以获得种子产量。

为了测试甲氧咪草烟对杂草的防治效果，将长芒苋(Amaranthus palmeri)用作模型。将长芒苋的种子(20个种子m^-1)与上述两个芝麻品系一起播种作为竞争杂草。作为阴性对照，使用未处理的地块。在实验结束时，对每个地块的长芒苋植物数量进行计数。

甲基咪草烟萌发前实验

将WT和SiRM以及两种杂草长芒苋和白苞猩猩草(Euphorbia heterophylla)的种子播种在含有黏土土壤(Newe Yaar研究站)的盆(9×9×10cm)中，每盆5颗种子，但长芒苋使用20颗种子。用甲基咪草烟(144g a.i.h^-1)喷洒来自每种植物的五个盆。施用除草剂后进行相当于200毫米ha^-1的灌溉。将盆放置在长日照条件下的生长室(16/8光/暗和32/25℃)中，并在14DAT测量冠层覆盖率(Canopeo)。

2021年夏，在Rehovot,Israel的Hebrew University of Jerusalem实验农场进行了另一项田间实验。采用了具有六个平行样的分地块随机区块设计。处理包括：无杂草地块(即手动除草)、未处理对照(即无除草剂处理)和发芽前施用甲基咪草烟(48g a.i.ha^-1)。地块大小为3.6m×0.8m(植株间10cm)，每个地块两行。为了评估杂草防治的效果，在芝麻播种线上播种两种杂草(长芒苋，每个地块500颗种子，以及苘麻(Abtilon Theoprastus)，每个地块70颗种子)。在生长季节对开花日期、每株植物的枝条数和到到第一个蒴果的高度进行物候学表征。在生长季节结束时，计数每个地块的杂草数量，并收获杂草进行干重测量。在距地块中间1m处收获芝麻植物，使用实验室脱粒机(Wintersteiger AG LD 350,Austria)对样品进行脱粒，并在筛选后对种子进行称重以获得种子产量。

在剂量逐渐增加的甲基咪草烟下根系发育的特征

将三颗SiRM种子播种在装有沙质土壤(由76％沙、8％淤泥和16％黏土组成)的塑料柱(30cm长)中(n＝5)，并用剂量逐渐增加的甲基咪草烟(24、48、96和192g a.i.ha^-1)喷洒。在施用除草剂后，进行相当于200毫米ha^-1的灌溉，并将其放置在长日照条件下的生长室(16/8光/暗和32/25℃)中。14DAT时，将根清洗并用平板扫描仪(Epson 12000XL,SeikoEPSON,Japan)进行扫描，使用WinRHIZO Pro软件(Regent Instruments Ltd.,Ontario,Canada)分析根体系结构。

统计分析

所有统计分析均使用(15版)统计软件包(SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)。描述性统计量以图形呈现在箱形图中：中位数值(水平短线)、四分位距(25％和75％)和数据范围(垂直长线)。通过将来自不同评估的16DAT芽DW数据作为未处理对照(UTC)的百分数作图来构建剂量响应曲线。对非线性曲线模型(指数双参数)进行调整，以分析不同实验中测试除草剂的效果。

Y＝a×Exp(b×d)；

其中Y是芽DW，a＝规模，b＝生长速率，并且d表示除草剂剂量。计算ED₅₀的抗性/易感比率，以确定抗性植物与易感植物的抗性指数(RI)的比较。

实施例1：SiALS基因中诱导的突变提供对甲氧咪草烟的高抗性

为了鉴定编码ALS的基因中可能的突变，在田间筛选了超过4000000株M₂植物。在连续两次施用甲氧咪草烟(48g a.i.ha^-1)后对植物进行目测表征，得到没有任何目测症状(即没有可见的生长减少和分生组织损伤)的单一候选植物。从该候选植物收获种子，并用相似剂量的甲氧咪草烟喷洒M₃植物。喷洒后7天，WT植物(S-416)表现出生长减少和分生组织损伤，而突变体植物(SiRM)没有表现出任何目测症状。值得注意的是，与未处理对照相比，SiRM植物在甲氧咪草烟处理下表现出更高的活力(图1D)。为了测试SiALS基因中靶位点突变的可能性，对基因区段进行测序，并鉴定到第563位中的单个点突变。该突变使胞嘧啶被替换为胸腺嘧啶(C→T)以及ALS酶中第188位的氨基酸从丙氨酸被替换为缬氨酸(图1A)。为了能够快速筛选这种突变，开发了一种高分辨率熔解(HRM)标志物。这种新的标志物导致WT、SiRM和F₁杂交体之间的明显分离(图1B)。为了评估抗性水平，从亚致死(3g a.i.ha^-1)到16倍田间剂量(即364g a.i.ha^-1)的剂量进行了响应测定。WT植物在6g a.i.ha^-1的低剂量下已经表现出目测症状和芽DW的降低，并在18g a.i.ha^-1下达到ED₅₀(即芽DW减少50％)。相反，SiRM植物在高达推荐剂量的8倍(192g a.i.ha^-1)时没有表现出任何目测症状。因此，突变品系的计算ED₅₀为823g a.i.ha^-1的高比率(其高于测试比率)(图1C-D)。值得注意的是，在3、6和直至推荐田间剂量的一半的12g a.i.h^-1的低剂量下，与相应的未处理对照植物相比，SiRM植物表现出芽DW增加50％。

实施例2：杂交植物的中等程度响应表现出植物结构和气体交换的改变

为了测试突变型ALS基因的遗传学遗传性，分析了杂交(F₁)植物及其亲本品系(WT和SiRM)对ALS抑制剂的时间响应。总的来说，尽管SiRM(纯合)植物与UTC植物没有差异并维持正常生长模式，但WT和杂交植物两者在最初的4DAT期间都表现出显著的生长减少。杂交植物能够恢复，并且在7DAT后它们看起来已经像SiRM植物。在14DAT后，杂交植株将其生长模式从茎伸长转变为产生更多的侧枝分生组织，表现为植株高度较短。在实验结束时，WT植物被完全根除，而SiRM植物没有表现出甲氧咪草烟处理的效果(图2F和3A)。杂交植物表现出中等程度响应，表现为植株高度降低～40％，芽DW降低～35％(图3D)。杂交植物的形态特征表明，直立形态归因于到第一朵花的节数更多(处理的和UTC分别为11.4和5.6个节)但节更短(2.4和8.0厘米)，因此导致第一个花蕾更低(27.6和44.6厘米)(图3B-C)。

尽管所有三个品系在施用后的前48小时内都表现出同化和蒸腾减少的相似趋势，但WT植物的响应严重程度明显更强，杂交植物表现出中等程度的响应。48h后，WT的同化率低于20％，SiRM植物完全恢复，并且与UTC植物没有差异。杂交植物表现出较慢的恢复，尽管在六天后它们完全恢复(图2E)。

实施例3：田间验证证实了高抗性和提高的产量

为了评估田间抗性水平及其在芝麻杂草防治中的有效性，使用两个品系(WT和SiRM)在长芒苋侵扰和甲氧咪草烟(40g a.i.h^-1)施用下进行了田间试验(图5A)。总的来说，与田间条件(未处理对照)(～12株长芒苋植物m^-1)相比，甲氧咪草烟处理在防治长芒苋方面非常有效(每米地块～0株长芒苋植物)(图5C)。施用甲氧咪草烟导致WT芝麻群丛由于严重的植物死亡显著减少(75％，P<0.0001)(图5B)。相反，对SiRM地块群丛没有显著影响。在实验结束时，收获用甲氧咪草烟处理的地块和无杂草地块(对照)。尽管WT植物表现出显著的产量下降(甲氧咪草烟和无杂草对照分别为0.93和3.6g/植株，P＝0.0015)，但SiRM植物表现出相反的趋势。与人工铲除杂草的无杂草地块中生长的植物相比，突变体植物在甲氧咪草烟处理下的单株产量加倍(分别为6.05和2.88g/植株，P＝0.011)。值得注意的是，地块群丛的差异可能会影响所获得的结果。因此，为了消除这一因素，还对每个地块的产量进行了分析；在地块水平上获得了类似的模式(图5D)。与无杂草(对照)地块相比，在甲氧咪草烟处理下的WT地块显示出显著的产量下降(分别为1.6和19g，P＝0.0002)。令人吃惊的是，与对照组相比，甲氧咪草烟处理下的突变体地块的产量明显更高(分别为31.5和16.7g，P＝0.02)(图5D)。

实施例4：所述突变提供了对咪唑啉酮除草剂的高抗性

为了测试SiALS基因中的点突变是否也促进对同一类咪唑啉酮中的其他除草剂的抗性，使用了甲基咪草烟和咪唑乙烟酸。选择这些除草剂是基于它们在大田作物中的广泛使用。剂量响应分析显示出类似的趋势，各品系之间存在明显差异。在甲基咪草烟施用下，WT在6g a.i.h^-1时已表现出显著的生长减少(18％，P＝0.0055)，这随着甲基咪草烟剂量的增加在视觉上更加显著。SiRM植物在高达推荐剂量的2倍(96g a.i.h^-1)时不受影响，并且仅在16X的高比率下表现出严重的损伤症状(768g a.i.h^-1；图4A-B)。在施用咪唑乙烟酸后也观察到了相同的趋势。对WT植物施用的所有剂量都导致芽DW的显著降低，并且田间推荐剂量(20ga.i.h^-1)对所述植物是致死的。另一方面，SiRM植物在高达推荐剂量的4倍(80ga.i.h^-1)时不受影响，并且即使在160g a.i.h^-1的最高剂量下植物也可存活的并完全恢复(图4C-D)。在施用甲基咪草烟推荐剂量(48g a.i.h^-1)后，对WT与SiRM的田间观察产生了明显的差异。尽管所有WT植物(和杂草)在10DAT已经死亡，但SiRM植物只受到轻微影响，并在芽发育和开花时间上延迟了5天。

实施例5：SiRM对不同ALS类别表现出轻度抗性

为了测试SiALS基因中的点突变是否影响芝麻植物对ALS类别的其他除草剂的响应，对其他类别进行了剂量响应测定。总的来说，对于所有施用的除草剂来说，与WT植物相比SiRM植物表现出更好的性能，这反映在它们在田间剂量水平下更高的ED₅₀和更高的生长速率上(表3)。两种磺酰脲类(SU)除草剂甲酰胺磺隆和三氟啶磺隆的施用揭示出SiRM植物与WT植物相比的轻度抗性。在推荐剂量下，与SiRM相比，WT植物在芽DW(三氟啶磺隆和甲酰胺磺隆分别为63％相比于18％和25％相比于8％)和芽长度(74％相比于7％和64％相比于58％)方面表现出显著降低(图7A-B)。施用剂量逐渐增加的丙苯磺隆导致WT植物在1/8X的低剂量下已经产生严重响应，而SiRM植物能够在直至推荐剂量下维持生长(并发育花蕾)(图7C)。双氟磺草胺(三唑并嘧啶类)的施用显示，两个品系在低剂量下的响应相似，在较高剂量下SiRM品系具有轻微优势，这也反映在RI＝2中(表3；图7D)。嘧草硫醚的施用对两个品系都是致命的，突变体能够在直至推荐剂量下存活(然而芽长度严重减少66％)(表3；图7E)。

表3：以田间比率施用的不同ALS抑制剂对野生型(S-416)和SiRM植物的影响

表3：呈现了芽干重(DW)和芽长度占未处理对照(UTC)的百分数和ED₅₀值(使植物生长减少50％除草剂比率)。值为平均值(n＝5)。

实施例6：SiRM植物对萌发前甲基咪草烟施用表现出高抗性

为了评估SiRM植物对甲基咪草烟萌发前施用的响应，在逐渐增加的剂量(48、96和144g a.i.h^-1)下进行了响应性测定。总的来说，在所有测试的剂量下，SiRM植物表现出正常的生长和发育(100％的存活率；图6A)。为了测试在萌发前使用甲基咪草烟的潜力，使用目测和基于图像的表型组学方法，在最高剂量(144g a.i.h^-1)下对WT和SiRM植物以及两种杂草长芒苋和白苞猩猩草进行了比较(图6B)。尽管WT植物得到完全防治，并且没有发育到子叶生长之后，但与未处理的对照相比SiRM植物发育正常，没有任何目测差异。这些差异也在地下表现，此时WT植物没有根发育(在对照和甲基咪草烟处理下分别为82和5mm)，而SiRM保持相似的根长(分别为72和85mm，P＝0.106)(图6B)。在播种后14天，WT植物的冠层覆盖率显著降低(覆盖率为2.23％相比于0.27％，P＝0.0008)，而SiRM植物维持相近的值(图6C)。

已知ALS除草剂对根的发育有强烈影响，因为它们会通过韧皮部向分生组织(汇器官)运输(图6B)。在处理过的SiRM幼苗中发现的较高的根长度促使我们研究了根毒物兴奋效应响应的可能性。然而，在萌发前以逐渐增加的剂量施用甲基咪草烟未显示出根体积的任何显著差异(图6C)。

实施例7：ALS突变对构型的影响

图8示出了在除草剂结合位点处将丙氨酸替换为缬氨酸改变了蛋白质构型，并降低了除草剂对ALS酶的亲和性。

实施例8：2021年田间试验-甲基咪草烟对杂草防治和芝麻性能的影响

如目测所示，在对照处理(无除草剂)下长芒苋是主要杂草(每个地块98株)，没有其他杂草或芝麻植物能够发育(图9A-C)。甲基咪草烟的预先施用产生无杂草地块。长芒苋没有萌发(完全防治)，并且萌发的长芒苋植物没有发育到子叶之后。正如在图9D-E中清楚地显示的,预先施用甲基咪草烟对本发明的抗性植物没有有害影响，显示出与在无杂草对照中获得的生长相似的生长。甲基咪草烟的预先施用也导致到第一个蒴果的高度降低，这表明顶端分生组织优势降低(图9E-G)。

上述特定实施方案的描述将充分地揭示本发明的总体性质，使得其他人可以通过应用当前知识，在不进行过度实验且不偏离一般概念的情况下容易地修改和/或改编以适应于各种应用，因此，这样的改编和修改应当并且旨在被理解为在所公开的实施方案的等同物的含义和范围之内。应当理解，本文中使用的短语或术语是用于描述而非限制的目的。在不偏离本发明的情况下，用于执行各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采用各种替代形式。

序列表

<110> 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司

<120> 对抑制乙酰乳酸合酶的除草剂有抗性的芝麻植物、组合物及其生产方法

<130> YISSUM/0174 PCT

<150> 63/208,077

<151> 2021-06-08

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 656

<212> PRT

<213> 芝麻

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Pro Ala Ser Ser Ser Ser Thr Val Trp Lys Arg

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ser Asn Ser Ser Lys Leu Leu Ser Arg Phe Thr Val Pro

20 25 30

Phe Pro His Asn Pro Gln Lys Pro Thr Ala Gly Val Ile Ser Gln Arg

35 40 45

Arg Pro Leu Gln Ile Ser Asn Val Leu Ser Ala Pro Arg Glu Gln Val

50 55 60

His Pro Glu Glu Ala Phe Val Ser Arg Phe Ala Ala Asp Glu Pro Arg

65 70 75 80

Lys Gly Cys Asp Val Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr

85 90 95

Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala

100 105 110

Leu Thr Arg Ser Lys Ile Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln

115 120 125

Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Leu Pro

130 135 140

Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser

145 150 155 160

Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr

165 170 175

Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr

180 185 190

Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val

195 200 205

Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val Val Lys Glu Ala Phe Phe Ile

210 215 220

Ala Arg Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Lys Asp

225 230 235 240

Ile Gln Gln Gln Met Val Val Pro Asn Trp Asn Gln Pro Met Arg Leu

245 250 255

Ala Gly Tyr Leu Ser Arg Leu Pro Arg Pro Pro Ser Ala Met Leu Leu

260 265 270

Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr

275 280 285

Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val

290 295 300

Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser

305 310 315 320

Tyr Pro Cys Ser Asp Glu Glu Phe Ala Leu Gln Met Leu Gly Met His

325 330 335

Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ser Asp Leu Leu Leu

340 345 350

Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala

355 360 365

Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu

370 375 380

Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Met Lys

385 390 395 400

Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Leu Ile Leu Glu Asp Met Leu Lys Glu

405 410 415

Gly Lys Asn Asn Val Asp Phe Ser Ala Trp Arg Gln Glu Leu Lys Glu

420 425 430

Gln Lys Met Asn Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Glu Asp Ala Ile

435 440 445

Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gly Gly Asn

450 455 460

Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln

465 470 475 480

Phe Tyr Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu

485 490 495

Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala

500 505 510

Arg Pro Asp Ala Val Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile

515 520 525

Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val

530 535 540

Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp

545 550 555 560

Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn

565 570 575

Pro Ser Lys Glu Ser Glu Ile Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu

580 585 590

Ala Cys Asp Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Asp Asp Leu Arg

595 600 605

Ala Ala Ile Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp

610 615 620

Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly

625 630 635 640

Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr

645 650 655

<210> 2

<211> 2394

<212> DNA

<213> 芝麻

<400> 2

aagggcaatt ccgacatttc cctctgctgc ctcctgaata agttccgcct tccaaatcaa 60

acgtgcttcc cttttcctcg ccacagaaaa ccctaaggag ctacagaccc gccgtcgccg 120

ccgatttgca ttctctaacg tccgtcggaa atggcggccg ctactcctgc ctccagctcg 180

tccactgtgt ggaaacgctc ttctttctct aattcgtcga agcttctttc tagatttacc 240

gtcccgttcc ctcacaatcc tcagaagccc acagctggcg tcatttcgca acgccgtccg 300

ctgcaaatct caaatgtgct gtctgctccc agggaacaag tgcatcctga ggaggcgttt 360

gtttcccgat ttgccgctga cgaacctcgg aagggctgcg acgttttagt ggaggcgctt 420

gaacgagaag gggtcaccga cgtctttgct taccccggag gcgcgtctat ggagatccat 480

caagcgctta cccgctccaa aatcatccgg aacgtgctcc cgcgccacga gcagggaggc 540

gtcttcgctg ccgaggggta cgcccgcgct tccggtcttc ccggcgtctg catcgcgaca 600

tctggccctg gtgccaccaa tttggtctct ggcctcgccg atgctcttct cgatagcgta 660

ccgcttgtgg ctatcacagg ccaggttccc cgtcgtatga tcggcactga tgctttccaa 720

gaaaccccta ttgttgaggt aactaggtcg attaccaagc ataattatct tgttttagat 780

gttgaggata ttcctcgggt tgtcaaggaa gctttcttta tcgctcggtc gggaaggcct 840

ggcccagttt tgattgacgt tccaaaagat attcaacagc aaatggtggt accaaattgg 900

aatcagccaa tgaggttggc tggttacttg tctagattgc ctaggccgcc tagtgcgatg 960

ttgttggagc agatagttag gctgatatcc gagtccaaaa agccggtact ttatgtcggt 1020

ggtgggtgtt tgaattcaag tgaggagttg aggaggtttg tggagctcac aggaattccg 1080

gttgctagca cgcttatggg tcttggttct tatccttgtt ctgatgagga atttgcgctg 1140

caaatgctgg gtatgcatgg gactgtttat gcaaattatg cagtggacaa gagtgatttg 1200

ttgcttgctt ttggagtcag gtttgatgac cgtgtgacgg gtaagctgga ggcatttgcc 1260

agtcgagcaa agattgtcca cattgacatt gattctgctg agattggaaa gaataagcaa 1320

cctcatgtgt ccatttgtgc cgatatgaag ttagctttgc agggtttgaa cttgatattg 1380

gaagacatgc tgaaagaggg taagaacaat gttgactttt cagcctggag gcaagagtta 1440

aaagagcaga agatgaactt tcctttgagt ttcaagacat ttgaagatgc cattccacct 1500

cagtatgcaa ttcaagttct tgatgaactg acaggaggga atgcaatcat tagtactggt 1560

gttgggcagc atcagatgtg ggctgcacaa ttttataagt ataataagcc acgacagtgg 1620

ttgacatcag gtggtttagg ggcaatgggt ttcggacttc ctgcagcaat tggagctgct 1680

gttgcaagac cagatgcagt tgtagtggat attgatggtg atggaagttt tataatgaac 1740

gtgcaggagt tggccactat ccgggtagag aaccttcctg ttaagattat gttgttaaat 1800

aatcagcact tgggtatggt tgtccagtgg gaagaccgct tctataagtc caacagggca 1860

cacacttatc tcggaaatcc ttccaaagag tcagagattt ttccagatat gttgaagttt 1920

gcagaggctt gtgatatacc tgcagctcgt gtgacaaaga aggatgatct cagggcagca 1980

atacaaaaga tgttggatac tcctgggcca tatttgttgg atgtcattgt accccatcaa 2040

gagcatgtct tgcccatgat tcccagtgga ggagccttta aagacgtgat cacagagggt 2100

gatggaagaa ttaagtattg atgtgaagta cggcagagcg gccatttggt tgtgaaaatt 2160

aggtcgcagc taaagggggt ccaagtttat agttttggct tgtaagttgt gttgtgttct 2220

gacatttgca aggtctgatt gtagtacgtc tgctctttat gcttattggt attcagtgat 2280

acctatgttc atttatcaca ttctgtttaa tctattataa taacggttgg atgctcggct 2340

ctattcatgt attttgataa ttatgtagag aaacgcatcc acctaatttg ttaa 2394

<210> 3

<211> 656

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变型乙酰乳酸合酶蛋白

<400> 3

Met Ala Ala Ala Thr Pro Ala Ser Ser Ser Ser Thr Val Trp Lys Arg

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ser Asn Ser Ser Lys Leu Leu Ser Arg Phe Thr Val Pro

20 25 30

Phe Pro His Asn Pro Gln Lys Pro Thr Ala Gly Val Ile Ser Gln Arg

35 40 45

Arg Pro Leu Gln Ile Ser Asn Val Leu Ser Ala Pro Arg Glu Gln Val

50 55 60

His Pro Glu Glu Ala Phe Val Ser Arg Phe Ala Ala Asp Glu Pro Arg

65 70 75 80

Lys Gly Cys Asp Val Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr

85 90 95

Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala

100 105 110

Leu Thr Arg Ser Lys Ile Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln

115 120 125

Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Leu Pro

130 135 140

Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser

145 150 155 160

Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr

165 170 175

Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Val Phe Gln Glu Thr

180 185 190

Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val

195 200 205

Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val Val Lys Glu Ala Phe Phe Ile

210 215 220

Ala Arg Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Lys Asp

225 230 235 240

Ile Gln Gln Gln Met Val Val Pro Asn Trp Asn Gln Pro Met Arg Leu

245 250 255

Ala Gly Tyr Leu Ser Arg Leu Pro Arg Pro Pro Ser Ala Met Leu Leu

260 265 270

Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr

275 280 285

Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val

290 295 300

Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser

305 310 315 320

Tyr Pro Cys Ser Asp Glu Glu Phe Ala Leu Gln Met Leu Gly Met His

325 330 335

Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ser Asp Leu Leu Leu

340 345 350

Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala

355 360 365

Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu

370 375 380

Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Met Lys

385 390 395 400

Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Leu Ile Leu Glu Asp Met Leu Lys Glu

405 410 415

Gly Lys Asn Asn Val Asp Phe Ser Ala Trp Arg Gln Glu Leu Lys Glu

420 425 430

Gln Lys Met Asn Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Glu Asp Ala Ile

435 440 445

Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gly Gly Asn

450 455 460

Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln

465 470 475 480

Phe Tyr Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu

485 490 495

Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala

500 505 510

Arg Pro Asp Ala Val Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile

515 520 525

Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val

530 535 540

Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp

545 550 555 560

Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn

565 570 575

Pro Ser Lys Glu Ser Glu Ile Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu

580 585 590

Ala Cys Asp Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Asp Asp Leu Arg

595 600 605

Ala Ala Ile Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp

610 615 620

Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly

625 630 635 640

Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr

645 650 655

<210> 4

<211> 2394

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码突变型ALS蛋白的多核苷酸

<400> 4

aagggcaatt ccgacatttc cctctgctgc ctcctgaata agttccgcct tccaaatcaa 60

acgtgcttcc cttttcctcg ccacagaaaa ccctaaggag ctacagaccc gccgtcgccg 120

ccgatttgca ttctctaacg tccgtcggaa atggcggccg ctactcctgc ctccagctcg 180

tccactgtgt ggaaacgctc ttctttctct aattcgtcga agcttctttc tagatttacc 240

gtcccgttcc ctcacaatcc tcagaagccc acagctggcg tcatttcgca acgccgtccg 300

ctgcaaatct caaatgtgct gtctgctccc agggaacaag tgcatcctga ggaggcgttt 360

gtttcccgat ttgccgctga cgaacctcgg aagggctgcg acgttttagt ggaggcgctt 420

gaacgagaag gggtcaccga cgtctttgct taccccggag gcgcgtctat ggagatccat 480

caagcgctta cccgctccaa aatcatccgg aacgtgctcc cgcgccacga gcagggaggc 540

gtcttcgctg ccgaggggta cgcccgcgct tccggtcttc ccggcgtctg catcgcgaca 600

tctggccctg gtgccaccaa tttggtctct ggcctcgccg atgctcttct cgatagcgta 660

ccgcttgtgg ctatcacagg ccaggttccc cgtcgtatga tcggcactga tgttttccaa 720

gaaaccccta ttgttgaggt aactaggtcg attaccaagc ataattatct tgttttagat 780

gttgaggata ttcctcgggt tgtcaaggaa gctttcttta tcgctcggtc gggaaggcct 840

ggcccagttt tgattgacgt tccaaaagat attcaacagc aaatggtggt accaaattgg 900

aatcagccaa tgaggttggc tggttacttg tctagattgc ctaggccgcc tagtgcgatg 960

ttgttggagc agatagttag gctgatatcc gagtccaaaa agccggtact ttatgtcggt 1020

ggtgggtgtt tgaattcaag tgaggagttg aggaggtttg tggagctcac aggaattccg 1080

gttgctagca cgcttatggg tcttggttct tatccttgtt ctgatgagga atttgcgctg 1140

caaatgctgg gtatgcatgg gactgtttat gcaaattatg cagtggacaa gagtgatttg 1200

ttgcttgctt ttggagtcag gtttgatgac cgtgtgacgg gtaagctgga ggcatttgcc 1260

agtcgagcaa agattgtcca cattgacatt gattctgctg agattggaaa gaataagcaa 1320

cctcatgtgt ccatttgtgc cgatatgaag ttagctttgc agggtttgaa cttgatattg 1380

gaagacatgc tgaaagaggg taagaacaat gttgactttt cagcctggag gcaagagtta 1440

aaagagcaga agatgaactt tcctttgagt ttcaagacat ttgaagatgc cattccacct 1500

cagtatgcaa ttcaagttct tgatgaactg acaggaggga atgcaatcat tagtactggt 1560

gttgggcagc atcagatgtg ggctgcacaa ttttataagt ataataagcc acgacagtgg 1620

ttgacatcag gtggtttagg ggcaatgggt ttcggacttc ctgcagcaat tggagctgct 1680

gttgcaagac cagatgcagt tgtagtggat attgatggtg atggaagttt tataatgaac 1740

gtgcaggagt tggccactat ccgggtagag aaccttcctg ttaagattat gttgttaaat 1800

aatcagcact tgggtatggt tgtccagtgg gaagaccgct tctataagtc caacagggca 1860

cacacttatc tcggaaatcc ttccaaagag tcagagattt ttccagatat gttgaagttt 1920

gcagaggctt gtgatatacc tgcagctcgt gtgacaaaga aggatgatct cagggcagca 1980

atacaaaaga tgttggatac tcctgggcca tatttgttgg atgtcattgt accccatcaa 2040

gagcatgtct tgcccatgat tcccagtgga ggagccttta aagacgtgat cacagagggt 2100

gatggaagaa ttaagtattg atgtgaagta cggcagagcg gccatttggt tgtgaaaatt 2160

aggtcgcagc taaagggggt ccaagtttat agttttggct tgtaagttgt gttgtgttct 2220

gacatttgca aggtctgatt gtagtacgtc tgctctttat gcttattggt attcagtgat 2280

acctatgttc atttatcaca ttctgtttaa tctattataa taacggttgg atgctcggct 2340

ctattcatgt attttgataa ttatgtagag aaacgcatcc acctaatttg ttaa 2394

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

caggttcccc gtcgtatg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tccttgacaa cccgagga 18

<210> 7

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核酸标记物

<400> 7

atcggcactg atgttttcca agaaacccct attgttgagg taactaggtc gattaccaag 60

cataattatc ttgttttaga tgttgaggat at 92

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

cccactcagc tgcctcat 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gcgaggccag agaccaaa 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

agggaggtgt cttcgctg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

cctccagctt acccgtca 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gctgggtatg catgggac 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ttgtcacacg agctgcag 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

cagcacttgg gtatggttgt 20

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ttcgagtggg atgtgcc 17

Claims

1.一种芝麻(Sesamumindicum L.)植物或其部分，其包含至少一个包含编码突变型乙酰乳酸合酶的多核苷酸(mALS)的细胞，其中所述mALS编码与野生型芝麻ALS(SiALS)蛋白相比对至少一种抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并且其中所述植物对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性。

2.根据权利要求1所述的芝麻植物，其中所述突变型ALS(mALS)蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。

3.根据权利要求2所述的芝麻植物，其中所述丙氨酸被缬氨酸替换(Ala188Val)。

4.根据权利要求3所述的芝麻植物，其中所述mALS蛋白包含SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的芝麻植物，其中所述mALS蛋白由在第562-564位处包含编码除丙氨酸以外的氨基酸的替换密码子的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。

6.根据权利要求5所述的芝麻植物，其中所述替换密码子编码氨基酸缬氨酸。

7.根据权利要求6所述的芝麻植物，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的第563位处包含核苷酸胸腺嘧啶(T)。

8.根据权利要求7所述的芝麻植物，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：4中阐述的核酸序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的芝麻植物，其中所述野生型SiALS由具有SEQ IDNO：2中阐述的核酸序列的多核苷酸编码，并包含SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的芝麻植物，其中所述植物当在通过施用抑制ALS的除草剂获得的无杂草条件下生长时，与在通过替代的杂草防治方法获得的无杂草条件下生长时相比，产生更高的种子产量，其中所述除草剂在萌发后施用。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的芝麻植物，其中所述编码mALS的多核苷酸是所述植物内源的编码ALS的基因的突变体。

12.根据权利要求11所述的芝麻植物，所述植物是非转基因植物。

13.根据权利要求11-12中任一项所述的芝麻植物，其中所述植物通过在所述植物的编码ALS的基因内产生位点特异性突变来产生。

14.根据权利要求13所述的芝麻植物，其中所述位点特异性突变通过基因编辑方法使用至少一种人造工程化核酸酶进行插入。

15.根据权利要求1-10中任一项所述的芝麻植物，其中所述编码mALS的多核苷酸是外源多核苷酸。

16.根据权利要求15所述的芝麻植物，其中所述植物是用所述编码突变型ALS(mALS)蛋白的外源多核苷酸转化的转基因植物。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的芝麻植物，其中所述植物就所述mALS多核苷酸而言是纯合的。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的芝麻植物，其中所述植物就所述mALS多核苷酸而言是杂合的。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的芝麻植物，其中所述抑制ALS的除草剂是选自除草有效的咪唑啉酮类(IMI)、磺酰脲类(SU)、嘧啶基硫代苯甲酸酯类(PTB)、三唑并嘧啶类(TP)和磺酰氨基羰基三唑啉酮(SCT)的类型。

20.根据权利要求19所述的芝麻植物，其中所述咪唑啉酮除草剂选自甲氧咪草烟、甲基咪草烟、咪唑乙烟酸、灭草烟、咪草酸、咪草酸甲酯、灭草喹和唑吡嘧磺隆。

21.根据权利要求19所述的芝麻植物，其中所述磺酰脲除草剂选自甲酰胺磺隆和三氟啶磺隆。

22.根据权利要求19所述的芝麻植物，其中所述嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂选自双氟磺草胺和嘧草硫醚。

23.根据权利要求19所述的芝麻植物，其中所述磺酰氨基羰基三唑啉酮是2-[(4-甲基-5-酮基-3-丙氧基-1,2,4-三唑-1-羰基)氨磺酰基]苯甲酸甲酯(丙苯磺隆)。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的芝麻植物，其中所述植物部分选自种子、花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎和芽。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的芝麻植物的种子，其中从所述种子生长的芝麻植物包含至少一个包含突变型乙酰乳酸合酶编码基因(mALS)的细胞，其中所述mALS编码与野生型芝麻ALS(SiALS)蛋白相比，对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并且其中所述植物对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的芝麻植物或其部分的分离的细胞或组织培养物，其中从所述细胞或组织培养物再生的芝麻植物包含至少一个包含突变型乙酰乳酸合酶编码基因(mALS)的细胞，其中所述mALS编码与野生型芝麻ALS(SiALS)蛋白相比，对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的突变型乙酰乳酸合酶(mALS)蛋白，并且其中所述植物对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性。

27.一种产生对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在所述植物内源的编码ALS的基因的至少一个等位基因中引入至少一个突变，其中所述至少一个突变导致编码的ALS蛋白与由非突变基因编码的ALS蛋白相比，对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低，由此产生对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述编码的突变型ALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述丙氨酸被缬氨酸替换(Ala188Val)。

30.一种分离的多核苷酸，其编码与野生型芝麻ALS蛋白相比对至少一种抑制ALS的除草剂的亲和性降低的乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白。

31.根据权利要求30所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的ALS蛋白在与SEQ ID NO：1中阐述的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质的第188位处包含除丙氨酸以外的氨基酸。

32.根据权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的蛋白质在第188位处包含氨基酸缬氨酸。

33.根据权利要求32所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的蛋白质包含SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列。

34.根据权利要求32所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的核酸序列的第562-564位处包含编码缬氨酸的密码子。

35.根据权利要求34所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列的第563位处包含核苷酸胸腺嘧啶(T)。

36.根据权利要求35所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：4中阐述的核酸序列。

37.一种DNA构建体，其包含根据权利要求30-36中任一项所述的分离的多核苷酸。

38.根据权利要求37所述的DNA构建体，其中所述构建体包含至少一个调控元件。

39.一种植物细胞相容性表达载体，其包含根据权利要求30-36中任一项所述的分离的多核苷酸或根据权利要求37-38中任一项所述的DNA构建体。

40.一种宿主芝麻植物细胞，其包含根据权利要求30-36中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求37-38中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求39所述的表达载体。

41.一种转基因芝麻植物，其包含至少一个包含根据权利要求30-36中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求37-38中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求39所述的表达载体的细胞，其中所述转基因芝麻植物对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性。

42.一种产生对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在对抑制ALS的除草剂敏感的芝麻植物的至少一个细胞中引入至少一个根据权利要求30-36中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求37-38中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求39所述的表达载体，由此产生对至少一种抑制ALS的除草剂具有耐受性和/或抗性的芝麻植物。

43.一种转基因芝麻植物，其通过根据权利要求42所述的方法来产生。

44.一种鉴定对至少一种类型的抑制ALS的除草剂具有增强的耐受性和/或抗性的芝麻植物的方法，所述方法包括在从所述植物获得的遗传材料中检测通过包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中阐述的核酸序列的一对引物进行扩增的核酸标志物的存在。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述扩增的标志物包含SEQ ID NO：7中阐述的核酸序列。

46.一种在根据权利要求1-24中任一项所述的对至少一种抑制ALS的除草剂有抗性的至少一种芝麻植物附近防治杂草的方法，所述方法包括向所述杂草和所述至少一种芝麻植物以足以抑制所述杂草生长的量施用至少一种抑制ALS的除草剂。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述抑制ALS的除草剂的量不显著抑制所述至少一种芝麻植物的生长。

48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，其中所述抑制ALS的除草剂的量抑制对所述除草剂敏感的相应芝麻植物的生长。

49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述抑制ALS的除草剂的量导致对所述除草剂有抗性的芝麻植物的种子产量与在通过替代杂草防治方法获得的无杂草环境中生长的对所述除草剂有抗性的相应芝麻植物的产量相比提高，其中所述抑制ALS的除草剂在萌发后施用。

50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述抑制ALS的除草剂是选自除草有效的咪唑啉酮类(IMI)、磺酰脲类(SU)、嘧啶基硫代苯甲酸酯类(PTB)、三唑并嘧啶类(TP)和磺酰氨基羰基三唑啉酮(SCT)的类型。