CN117529491A - 用于慢病毒载体产生的稳定产生系统 - Google Patents

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Abstract

本文描述的是慢病毒载体产生系统。本文还描述了包含慢病毒载体产生系统的工程化细胞和试剂盒以及使用所述工程化细胞和试剂盒进行慢病毒载体产生的方法。

Description

用于慢病毒载体产生的稳定产生系统
领域
本文描述的是慢病毒载体产生系统。本文还描述了包含慢病毒载体产生系统的工程化细胞和试剂盒，以及使用所述工程化细胞和试剂盒用于慢病毒载体产生的方法。
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119，要求2021年4月23日提交的美国临时申请序列号63/179129的权益，其整体内容通过引用并入本文。
通过EFS-Web以文本文件提交的序列表的引用
本申请包含序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式提交，并在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2022年4月22日，命名为A121070003WO00-SEQ，并且大小为45,885字节。
背景
病毒载体是有前景的用于细胞和基因疗法的基因递送模式。病毒载体可被修饰以携带治疗性基因载荷至受试者内的细胞。病毒载体的产生通常需要将含有病毒载体产生所需基因的质粒瞬时转染到细胞培养物中。然而，瞬时转染有几个缺点。必须获得大量的DNA和转染试剂用于转染过程，这是昂贵的。此外，差的转染效率可导致最小数量的“转染的”细胞量，并且增加与转染步骤和病毒产生相关的变异。
概要
本文描述的是慢病毒载体产生系统。本文还描述了包含慢病毒载体产生系统的试剂盒。最后，描述了包含慢病毒载体产生系统(或其至少一部分)的工程化细胞，以及使用工程化细胞用于慢病毒载体产生的方法。
在一些方面中，本公开涉及用于慢病毒载体产生的工程化细胞，其包含一个或多个稳定整合的异源多核酸，所述一个或多个稳定整合的异源多核酸共同包含：编码Gag的核酸序列；编码Pol的核酸序列；编码VSV-G的核酸序列；和编码Rev的核酸；其中至少一个可操作地连接至化学诱导型启动子。在一些实施方式中，工程化细胞包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码Gag的核酸序列。在一些实施方式中，Gag包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码Pol的核酸序列。在一些实施方式中，Pol包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码VSV-G的核酸序列。在一些实施方式中，VSV-G包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码Rev的核酸序列。在一些实施方式中，Rev包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含：
(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；
(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列；和
(c)第三稳定整合的异源多核酸，其包含编码Rev的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码VSV-G的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至第二表达盒的第二化学诱导型启动子。在一些实施方式中，第二化学诱导型启动子包含SEQ IDNO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码Rev的核酸序列。在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至第三表达盒的第三化学诱导型启动子。在一些实施方式中，第三化学诱导型启动子包含SEQID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含：
(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；和
(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码VSV-G的核酸序列；和所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码Rev的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含：第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码Rev的核酸序列；和所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码VSV-G的核酸序列。在一些实施方式中，第二启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；第三启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；或其组合。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的转录激活子的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点。在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
在一些方面中，本申请公开了包含本文描述的工程化细胞的试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含转移多核酸分子，所述转移多核酸分子从5’至3’包含：(i)5’慢病毒长串联重复(LTR)的核酸序列；(ii)多克隆位点；和(iii)3’慢病毒长串联重复(LTR)的核酸序列。在一些实施方式中，转移多核酸是质粒或载体。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含对应于工程化细胞的化学诱导型启动子的小分子诱导物。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含工程化细胞，所述工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含可操作地连接至编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列、编码Rev的核酸序列或其组合的SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，试剂盒包含工程化细胞，所述工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。在一些实施方式中，试剂盒包含工程化细胞，所述工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子，其中所述至少两个化学诱导型启动子中的两个或更多个是不同的。
在一些实施方式中，试剂盒包含多核酸，所述多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子，任选地其中工程化细胞包含含有转录激活子的核酸序列的多核酸。在一些实施方式中，试剂盒包含转录激活子，所述转录激活子包含SEQ ID NO:10-12中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，试剂盒包含小分子诱导物多西环素或四环素。
在一些方面中，本申请公开了一种产生慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)将转移多核酸引入本文描述的工程化细胞中；和
(b)使工程化细胞与对应于工程化细胞的化学诱导型启动子的小分子诱导物接触，从而诱导Gag、Pol、VSV-G和Rev的表达；其中所述工程化细胞包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子；其中(b)在(a)之前发生、与(a)同时发生或在(a)之后发生。
在一些实施方式中，工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含可操作地连接至编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列、编码Rev的核酸序列或其组合的SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列，其各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子，其中所述至少两个化学诱导型启动子中的两个或更多个是不同的。
在一些实施方式中，工程化细胞包含转录激活子，所述转录激活子包含SEQ IDNO:10-12中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，小分子诱导物是多西环素或四环素。
在一些方面中，本申请公开了一种产生慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)将转移多核酸引入本文描述的工程化细胞中；和
(b)使工程化细胞与对应于工程化细胞的化学诱导型启动子的小分子诱导物接触，从而诱导Gag、Pol、VSV-G和Rev的表达；
其中工程化细胞包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子；
其中(b)在(a)之前发生、与(a)同时发生或在(a)之后发生。
在一些实施方式中，工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含可操作地连接至编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列、编码Rev的核酸序列或其组合的SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，至少两个化学诱导型启动子中的两个或更多个是不同的。
在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-12中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，小分子诱导物是多西环素或四环素。
在一些方面中，本申请公开了在工程化细胞中产生慢病毒载体的方法，其中所述工程化细胞包含一个或多个稳定整合的异源多核酸，所述一个或多个稳定整合的异源多核酸共同包含：编码Gag的核酸序列；编码Pol的核酸序列；编码VSV-G的核酸序列；和编码Rev的核酸；其中至少一个可操作地连接至能够在不存在小分子阻遏物的情况下被外源转录激活子结合的外源启动子，所述方法包括：
(a)将转移多核酸引入工程化细胞中；和
(b)将外源转录激活子引入工程化细胞中；和
(c)在不存在小分子阻遏物的情况下培养细胞，从而诱导Gag、Pol、VSV-G和Rev的表达；
其中(b)在(a)之前发生、与(a)同时发生或在(a)之后发生。
在一些实施方式中，(b)中的引入是在存在小分子阻遏物的情况下进行的。
在一些实施方式中，(b)中的引入通过以下方式进行：将异源多核酸引入细胞中，其中所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸的外源转录激活子的核酸序列；和表达外源转录激活子。
在一些实施方式中，外源启动子包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的外源启动子。
在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个外源启动子。
在一些实施方式中，至少两个外源启动子中的两个或更多个是不同的。
在一些实施方式中，转录激活子是四环素控制的反式激活子(tTA)。
在一些实施方式中，tTA包含SEQ ID NO:11和27-28中的一个或多个的氨基酸序列。
附图的简要说明
下列附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步展示本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的具体实施方式的详细描述可以更好地理解本公开的某些方面。应当理解，附图中阐释的数据决不限制本公开的范围。
图1显示了用于以瞬时转染形式测试dox诱导型慢病毒载体产生的示例性质粒示意图。“TetOn”表示rtTA的变体，“GP”表示慢病毒Gag-Pol基因，“VSV-G”表示水泡性口炎病毒G蛋白，“Rev”表示慢病毒Rev基因。对于慢病毒基因，测试了dox诱导型TRE启动子或组成型CMV启动子的不同组合。
图2显示了用于半稳定慢病毒载体产生系统的稳定整合质粒的示例性质粒示意图。选择表明用于选择稳定的整合体的抗生素抗性基因。慢病毒转移质粒(图中未显示)必须在慢病毒基因诱导之前或同时转染，而其他基因则稳定地整合到基因组中。除了所描述的质粒之外，还设计并使用CMV测试了替代质粒以驱动慢病毒基因的表达。
图3显示了用于完整的稳定慢病毒载体产生系统的质粒稳定整合的示例性质粒示意图。完整的稳定系统将VSV-G和Rev基因组合在单个质粒上，并且包括含LTR的转移质粒以被稳定地整合。
图4A-4B显示了测试以瞬时转染形式驱动慢病毒基因的dox诱导型或组成型启动子的组合的结果。图4A显示了经过测试的组合。图4B显示了样品1-16的结果。向转染混合物中添加多西环素和TetOn导致慢病毒滴度略有减少。将Gag-Pol、Rev或VSV-G置于TRE启动子下导致在不存在多西环素的情况下滴度降低许多，以及在存在多西环素的情况下导致接近野生型滴度。当添加多西环素时，与野生型相比，完全诱导型系统确实具有～4.2倍减少的滴度，尽管该减少可通过下游优化步骤来补偿。
图5A-5B显示了测试以半稳定形式驱动慢病毒基因的dox诱导型或组成型启动子的组合的结果。图5A显示了在存在或不存在Dox的情况下测试的组合。图5B显示了每种组合/条件的四个重复的结果(阴性对照为三个重复)。与不存在Dox相比，所有测试的组成型或dox诱导型基因的组合在存在Dox的情况下均能够诱导慢病毒的产生。使用TRE启动子驱动三个基因中的每一个产生了最好的诱导性。如果Gag-Pol和Rev被转染而不是被基因组地整合，则可获得更大的诱导性，但该设计仍维持了与放大生长体积相关的问题。
图6显示了用于完整的、稳定整合的慢病毒载体产生系统的示例性质粒示意图。完整的稳定系统的该实施方式在单独的核酸分子上编码VSV-G、Gag-Pol(“GP”)和Rev基因，并且包括含LTR的转移质粒以被稳定地整合。VSV-G与TetOn元件一样在相同的核酸分子上编码。
图7显示了完整的、稳定整合的慢病毒载体产生系统的示例性质粒示意图。完整的稳定系统的该实施方式在单独的核酸分子上编码VSV-G、Gag-Pol(“GP”)和Rev基因，并且包括含LTR的转移质粒以被稳定整合。Rev与TetOn元件一样在相同的核酸分子上编码。
图8显示了利用包含图3中稳定整合的核酸分子的HEK293T细胞诱导慢病毒的产生。Dox以0nM至1000nM范围的浓度添加。在不存在多西环素的情况下，稳定产生细胞产生最小的感染滴度，而在存在大于20nM多西环素的情况下，滴度接近以瞬时转染所能达到的滴度。来自稳定产生滴度的滴度为传统转染样品滴度的大约86％。
图9显示了用于不需要多西环素添加的稳定慢病毒载体包装系统的质粒的稳定整合的示例性质粒示意图。四环素控制的反式激活子(tTA)-其不需要多西环素来激活来自TRE启动子的基因表达-被提供在瞬时转染的转移质粒上，而不是使用基因组整合的TetOn。
详细描述
病毒载体的产生通常需要将质粒瞬时转染到细胞培养物中。然而，与经由瞬时转染的传统产生相比，将产生治疗性病毒载体所需的基因稳定整合到基因组中具有几个优势。由于细胞在其自身细胞分裂期间扩增病毒基因，因此不再需要获得大量的DNA和转染试剂用于转染过程，从而降低了成本。此外，由于DNA已经在细胞核内，由于“未转染的”细胞的极小数量，并且与转染步骤相关的变异减少，病毒滴度可能更高以及更一致。更简单的产生过程还节省时间并减少实现高病毒滴度所需的优化步骤的规模和数量。
标准第三代慢病毒包装和包膜质粒含有由组成型CMV启动子传统地驱动的基因。然而，VSV-G将细胞融合在一起并停止生长的能力阻止了产生慢病毒的稳定细胞的创建。与Gag-Pol和Rev相关的潜在毒性也使产生细胞的创建复杂化。
本文描述的是慢病毒载体产生系统。本文还描述了包含慢病毒载体产生系统的试剂盒。最后，描述了包含慢病毒载体产生系统(或其至少一部分)的工程化细胞，以及使用工程化细胞用于慢病毒载体产生的方法。
I.慢病毒载体产生系统
在一些方面中，本公开涉及慢病毒载体产生系统。如本文描述的慢病毒载体产生系统包含一个或多个多核酸，所述一个或多个多核酸在重组宿主细胞(或如本文描述的“工程化细胞”)中共同编码产生慢病毒载体所需的基因产物。本文描述的慢病毒载体产生系统包含共同编码慢病毒基因产物Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)的一个或多个多核苷酸。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统(即，病毒载体组分的基因产物)在单个多核酸上编码。在其他实施方式中，多个多核酸共同构成慢病毒载体产生系统(即，病毒载体组分的至少两个基因产物在不同的多核酸上编码)。例如，慢病毒载体产生系统可包含至少2、至少3、至少4或至少5个多核酸。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含2、3、4或5个多核酸。以下提供了示例性慢病毒产生系统架构(第IC部分)。
Gag是慢病毒颗粒的前体结构蛋白，其含有基质、衣壳和核衣壳组分。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码Gag的多核酸。在一些实施方式中，Gag包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码Gag的功能变体的多核酸。Gag的功能变体包含与SEQ ID NO:17的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持Gag的功能(即其结构功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
确定两个序列(例如，两个氨基酸序列或两个多核酸)之间的同一性的程度的方法是本领域普通技术人员已知的。一种示例性方法是使用具有默认参数的Basic LocalAlignment Search Tool软件(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
Pol是含有逆转录酶和整合酶组分的前体蛋白。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码Pol的多核酸。在一些实施方式中，Pol包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码Pol的功能变体的多核酸。Pol的功能变体包括与SEQ ID NO:18至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持Pol的功能(即它作为逆转录酶和整合酶的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
在一些实施方式中，慢病毒产生系统包含编码含有Gag(或其功能变体)和Pol(或其功能变体)的融合蛋白的多核酸。
VSV-G是包膜蛋白。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码VSV-G的多核酸。在一些实施方式中，VSV-G包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码VSV-G的功能变体的多核酸。VSV-G的功能变体包含与SEQ ID NO:19的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持VSV-G的功能(即它作为包膜蛋白的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
Rev是转运蛋白，其结合转录物内的Rev反应元件以促进它们的核输出。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码Rev的多核酸。在一些实施方式中，Rev包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含编码Rev的功能变体的多核酸。Rev的功能变体包含与SEQ ID NO:20的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持Rev的功能(即，其作为转运蛋白的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
本文描述的慢病毒产生系统包含至少一个表达盒。如本文所用，术语“表达盒”是指编码启动子的核酸序列的多核酸序列，所述启动子的核酸序列可操作地连接至编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物，诸如Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)、Rev(或其功能变体)、或其任何组合)的核酸。在一些实施方式中，多个产物被编码在单个表达盒内。例如，在一些实施方式中，单个启动子驱动编码多个产物(RNA产物和/或多肽产物)的多顺反子RNA的表达。多顺反子RNA可包含内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列和/或病毒2A肽(V2A)的核酸序列。
IRES可包含SEQ ID NO:21的核酸序列：
CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATG
IRES可包含SEQ ID NO:22的核酸序列：
CCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGTTATC
病毒2A肽可包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:23)、EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:24)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:25)、或VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。
如本文描述的，当启动子相对于核酸编码序列的位置使得转录激活子与启动子的结合可诱导编码序列的表达时，启动子“可操作地连接”至核酸编码序列。表达盒的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。
启动子可以是组成型启动子(即，允许持续转录的不受调控的启动子)。本领域已知的组成型启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1α(EF1α)启动子、猿猴空泡病毒40(SV40)启动子、泛素-C(UBC)启动子、U6启动子和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。参见，例如Ferreira等人，Tuning gene expression with synthetic upstreamopen reading frames.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013Jul；110(28):11284-89；公开号：US 2014/377861 A1；Qin等人，PloS One.2010May；5(5):e10611–其整体通过引用并入本文。
可替选地，启动子可以是诱导型启动子(即，仅在特定情况下激活转录)。诱导型启动子可以是，例如，化学诱导型启动子、温度诱导型启动子或光诱导型启动子。化学诱导型启动子的实例在本领域是已知的，并且包括但不限于四环素/多西环素诱导型启动子、cumate诱导型启动子、ABA诱导型启动子、CRY2-CIB1诱导型启动子、DAPG诱导型启动子、米非司酮诱导型启动子、乳糖诱导型启动子和阿拉伯糖诱导型启动子。参见例如Stanton等人，ACS Synth.Biol.2014Dec 19；3(12):880-91；Liang等人，Sci.Signal.2011Mar 15；4(164):rs2；Das等人，Curr.Gene.Ther.2016；16(3):156-167；专利号：US 7,745,592 B2；专利号：US 7,935,788 B2–其整体通过引用并入本文。化学诱导型启动子可包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
A.可选标记
如上所述，如本文描述的慢病毒载体产生系统包含一个或多个多核酸，所述一个或多个多核酸在重组宿主细胞(或如本文描述的“工程化细胞”)中共同编码生成慢病毒载体所需的基因产物。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的一个或多个多核酸包含表达盒，所述表达盒包含：(i)启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列；和(ii)编码可选标记的核酸序列。在一些实施方式中，病毒产生系统的每个多核酸包含可选标记。在一些实施方式中，慢病毒产生系统的每个多核酸包含不同可选标记的核酸序列。
如本文所用，术语“可选标记”是指-当引入细胞中或在细胞中表达时-赋予适合选择的特征的蛋白质。
可选标记可以是荧光蛋白。荧光蛋白的实例是本领域已知的(例如，TagBFP、EBFP2、EGFP、EYFP、RFP、mKO2或Sirius)。参见例如专利号：US 5,874,304；专利号：EP0969284 A1；公开号：US2010/167394 A–其全部通过引用并入本文。
可替选地或另外地，可选标记可以是抗生素抗性蛋白。抗生素抗性蛋白的实例是本领域已知的(例如，促进嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、沙阿霉素、杀稻瘟菌素或腐草霉素选择)。参见例如，公开号：WO 1997/15668A2；公开号：WO 1997/43900A1——其全部通过引用并入本文。
B.诱导型慢病毒载体产生系统
在一些实施方式中，本文描述的慢病毒载体产生系统包含共同编码慢病毒基因产物Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)的一个或多个多核苷酸，其中至少一个可操作地连接至化学诱导型启动子。
在本节描述的任何实施方式中，化学诱导型启动子可包括四环素/多西环素诱导型启动子、cumate诱导型启动子、ABA诱导型启动子、CRY2-CIB1诱导型启动子、DAPG诱导型启动子、米非司酮诱导型启动子或其组合。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ IDNO:1的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:6的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:7的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:8的核酸序列。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:9的核酸序列。
在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；任选地其中：编码Pol(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码Rev(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)。
在一些实施方式中，编码Pol(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；任选地其中：编码Gag(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码Rev(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)。
在一些实施方式中，编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；任选地其中：编码Gag(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码Pol(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码Rev(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)。
在一些实施方式中，编码Rev(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；任选地其中：编码Gag(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码Pol(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)；和/或编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)。
在一些实施方式中，本文描述的慢病毒载体产生系统包含一个或多个多核苷酸，其共同编码慢病毒基因产物Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)；其中每个可操作地连接至化学诱导型启动子(如本文描述的)。
在一些实施方式中，本文描述的慢病毒载体产生系统包含单个化学诱导型启动子。在此类实施方式中，单个化学诱导型启动子可以可操作地连接至Gag(或其功能变体)、和/或Pol(或其功能变体)、和/或VSV-G(或其功能变体)和/或Rev(或其功能变体)。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含至少两个、至少三个、至少四个或至少五个化学诱导型启动子。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含2、3、4或5个化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，其中慢病毒载体产生系统包含至少两个化学诱导型启动子，两个或多个化学诱导型启动子包含相同的核酸序列。在一些实施方式中，其中慢病毒载体产生系统包含至少两个化学诱导型启动子，每个化学诱导型启动子包含相同的核酸序列。在一些实施方式中，其中慢病毒载体产生系统包含至少两个化学诱导型启动子，一个或多个化学诱导型启动子包含不同的核酸序列。在一些实施方式中，其中慢病毒载体产生系统包含至少两个化学诱导型启动子，每个化学诱导型启动子包含不同的核酸序列。
本文描述的诱导型慢病毒载体产生系统进一步可包含多核酸，所述多核酸包含表达盒，所述表达盒包含：(i)启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列；和(ii)编码转录激活子的核酸序列，其中转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子。在慢病毒载体产生系统包含两个或多个不同的化学诱导型启动子的实施方式中，所述系统可包含两个或多个相应转录激活子的核酸序列。
在一些实施方式中，转录激活子是Tet-On 3G。在一些实施方式中，Tet-On 3G包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是Tet-On 3G的功能变体。Tet-On 3G的功能变体包含与SEQ ID NO:10的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持Tet-On 3G的功能(即，它作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一些实施方式中，转录激活子是TetOff-Advanced。在一些实施方式中，TetOff-Advanced包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是TetOff-Advanced的功能变体。TetOff-Advanced的功能变体包含与SEQ ID NO:11的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持TetOff-Advanced的功能(即，它作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
在一些实施方式中，转录激活子是VanR-VP16。在一些实施方式中，VanR-VP16包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是VanR-VP16的功能变体。VanR-VP16的功能变体包含与SEQ ID NO:12的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持VanR-VP16的功能(即，它作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
在一些实施方式中，转录激活子是TtgR-VP16。在一些实施方式中，TtgR-VP16包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是TtgR-VP16的功能变体。TtgR-VP16的功能变体包含与SEQ ID NO:13的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持TtgR-VP16的功能(即，它作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
在一些实施方式中，转录激活子是PhlF-VP16。在一些实施方式中，PhlF-VP16包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是PhlF-VP16的功能变体。PhlF-VP16的功能变体包含与SEQ ID NO:14的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持PhlF-VP16的功能(即，它作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
在一些实施方式中，转录激活子是cTA。在一些实施方式中，cTA包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是cTA的功能变体。cTA的功能变体包含与SEQ ID NO:15的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持cTA的功能(即其作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
在一些实施方式中，转录激活子是rcTA。在一些实施方式中，rcTA包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方式中，转录激活子是rcTA的功能变体。rcTA的功能变体包含与SEQ ID NO:16的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持rcTA的功能(即其作为转录激活子的功能)的至少80％(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
C.示例性慢病毒载体产生系统架构
为了示例性的目的，下面描述了选择的慢病毒载体产生系统架构。
1.第一示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含：(a)第一多核酸，其包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列；(b)第二多核酸，其包含编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列；和(c)第三多核酸，其包含编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第二多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第三多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第三化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第三多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子、第二化学诱导型启动子和第三化学诱导型启动子包含相同的核酸序列。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统进一步包含另外的多核酸，所述另外的多核酸包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第一多核酸、第二多核酸或第三多核酸包含另外的多核酸。在其他实施方式中，另外的多核酸是慢病毒载体产生系统的第四多核酸。
2.第二示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统包含：(a)第一多核酸，其包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列；和(b)第二多核酸，其包含编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一多核酸包含第一表达盒，其包含：(i)第一化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二多核酸包含：第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列；和所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；第三启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；或其组合。在一些实施方式中，第二多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统进一步包含另外的多核酸，所述多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的一个或多个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第一多核酸或第二多核酸包含另外的多核酸。在其他实施方式中，另外的多核酸是慢病毒载体产生系统的第三多核酸。
3.第三示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统架构如图1所描绘的。
4.第四示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统架构如图2所描绘的。
5.第五示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统架构如图3所描绘的。
6.第六示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统架构如图6所描绘的。
7.第七示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统架构如图7所描绘的。
8.第八示例性架构
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统架构如图9所描绘的。
II.工程化细胞
在一些方面中，本公开涉及包含第I部分中描述的慢病毒载体产生系统的一个或多个多核酸的工程化细胞。在工程化细胞的背景下，此类多核酸被认为是异源多核酸(即，在细胞中天然发现的多核酸序列)。在一些实施方式中，工程化细胞包含第I部分中描述的慢病毒产生系统的每个多核酸。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的多核酸瞬时存在于工程化细胞中。
在其他实施方式中，慢病毒载体产生系统的多核酸稳定地整合到工程化细胞的基因组中。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的每个多核酸稳定地整合到工程化细胞的基因组中。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的每个多核酸稳定地整合在工程化细胞的基因组内的不同位置。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的多核酸以至少5个(例如至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125、至少150、至少175或至少200个)拷贝的拷贝数稳定地整合到工程化细胞的基因组中。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的多核酸以10-20、10-50、25-50、25-75、25-100、25-150、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合到工程化细胞的基因组中。在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的多核酸以50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合到工程化细胞的基因组中。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以至少5个(例如至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125、至少150、至少175或至少200个)拷贝的拷贝数稳定地整合。在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-20、10-50、25-50、25-75、25-100、25-150、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HeLa细胞。
在一些实施方式中，工程化细胞源自BHK细胞。
在一些实施方式中，工程化细胞源自Sf9细胞。
A.着陆点(landing pad)
如本文描述的工程化细胞可进一步包含着陆点。如本文所用，术语“着陆点”是指异源多核酸序列，其促进将“载荷”序列靶向插入细胞的基因组的特定基因座(或多个基因座)。因此，着陆点被整合到细胞的基因组中。固定的整合点对于减少可能由位置表观基因效应或近端调控元件引起的实验之间的可变性是期望的。控制载荷拷贝数的能力对于在不改变任何基因组分的情况下调节载荷的表达水平也是期望的。
在一些实施方式中，着陆点在工程化细胞的基因组中的安全港位点。如本文所用，术语“安全港位点”是指基因组中的位置，其中基因或基因元件可以在不破坏相邻基因的表达或调控的情况下被引入，和/或相邻基因组元件不破坏所引入的基因或基因元件的表达或调控。安全港位点的实例是具有本领域技术的人员已知的，并且包括但不限于AAVS1、ROSA26、COSMIC、H11、CCR5和LiPS-A3S。参见，例如Gaidukov等人，Nucleic AcidsRes.2018May 4；46(8):4072-4086；专利号：US 8,980,579 B2；专利号：US10,017,786B2；专利号：US 9,932,607 B2；公开号：US2013/280222 A；公开号：WO 2017/180669 A1–其整体并入本文。在一些实施方式中，安全港位点是已知位点。在其他实施方式中，安全港位点是先前未公开的位点。参见本文“鉴定高表达基因座的方法及其用途”。在一些实施方式中，如本文描述的工程化细胞包含整合在选自由AAVS1、ROSA26、COSMIC、H11、CCR5和LiPS-A3S组成的组的安全港位点处的着陆点。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞。在一些实施方式中，工程化HEK293细胞包含着陆点，所述着陆点整合在选自由AAVS1、ROSA26、CCR5和LiPS-A3S组成的组的安全港位点处。
在一些实施方式中，工程化细胞源自CHO细胞。在一些实施方式中，工程化CHO细胞包含着陆点，所述着陆点整合在选自由ROSA26、COSMIC和H11组成的组的安全港位点处。
如本文描述的每个着陆点包含至少一个重组位点。各种整合酶的重组位点先前已被鉴定。例如，着陆点可包含对应Bxb1整合酶、λ-整合酶、Cre重组酶、Flp重组酶、γ-δ分解酶、Tn3分解酶、整合酶或R4整合酶的重组位点。示例性重组位点序列是本领域已知的(例如，attP、attB、attR、attL、Lox和Frt)。
如本文描述的着陆点可包含一个或多个表达盒。
在一些实施方式中，载荷序列包含编码第一反向末端重复(ITR)、第二ITR和可操作地连接至启动子的基因的核酸分子(如本文描述的)。在一些实施方式中，载荷包含编码5’–ITR-启动子-基因-ITR–3’的核酸分子，其中基因是用于AAV递送的基因。在一些实施方式中，基因是荧光蛋白。在一些实施方式中，基因是绿色荧光蛋白。在一些实施方式中，载荷序列包含多克隆位点。
B.示例性工程化细胞
为了示例性的目的，下面描述了选择的工程化细胞。
1.第一示例性工程化细胞
在一些实施方式中，工程化细胞包含一个或多个稳定整合的异源多核酸，所述一个或多个稳定整合的异源多核酸共同包含：编码Gag(或其功能变体)的核酸序列；编码Pol(或其功能变体)的核酸序列；编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列；和编码Rev(或其功能变体)的核酸；其中至少一个可操作地连接至化学诱导型启动子(如，例如第I部分中描述的)。在一些实施方式中，化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子(如，例如第I部分中描述的)的编码Gag(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，Gag包含SEQID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子(如，例如第I部分中描述的)的编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，Pol(或其功能变体)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子(如，例如第I部分中描述的)的编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，VSV-G包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子(如，例如I部分中描述的)的编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，Rev包含SEQID NO:20的氨基酸序列。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点(如本文描述的)。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
2.第二示例性工程化细胞
在一些实施方式中，工程化细胞包含：(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列；和(c)第三稳定整合的异源多核酸，其包含编码Rev的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第三化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子、第二化学诱导型启动子和第三化学诱导型启动子包含相同的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含另外的多核酸，所述另外的多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的多核酸、第二稳定整合的多核酸或第三稳定整合的多核酸包含另外的多核酸。在其他实施方式中，另外的多核酸是工程化细胞的第四稳定整合的异源多核酸。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点(如本文描述的)。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
3.第三示例性工程化细胞
在一些实施方式中，工程化细胞包含：(a)第一稳定整合的多核酸，其包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列；和(b)第二稳定整合的多核酸，其包含编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的多核酸包含：第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列；和所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；第三启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；或其组合。在一些实施方式中，第二稳定整合的多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含另外的多核酸，所述另外的多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的一个或多个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的多核酸或第二稳定整合的多核酸包含另外的多核酸。在其他实施方式中，另外的多核酸是慢病毒载体产生系统的第三稳定整合的多核酸。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点(如本文描述的)。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
4.第四示例性工程化细胞
在一些实施方式中，工程化细胞包含：(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列；和(c)第三稳定整合的异源多核酸，其包含编码Rev的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，其包含：(i)第一化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第三化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子、第二化学诱导型启动子和第三化学诱导型启动子包含相同的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的多核酸、第二稳定整合的多核酸或第三稳定整合的多核酸包含另外的多核酸。在其他实施方式中，另外的多核酸是工程化细胞的第四稳定整合的异源多核酸。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点(如本文描述的)。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
5.第五示例性工程化细胞
在一些实施方式中，工程化细胞包含：(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码Rev的核酸序列；和(c)第三稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导启动子。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第三化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一化学诱导型启动子、第二化学诱导型启动子和第三化学诱导型启动子包含相同的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的多核酸、第二稳定整合的多核酸或第三稳定整合的多核酸包含另外的多核酸。在其他实施方式中，另外的多核酸是工程化细胞的第四稳定整合的异源多核酸。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点(如本文描述的)。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
6.第六示例性工程化细胞
在一些实施方式中，工程化细胞包含：(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码Rev的核酸序列；和(c)第三稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列。
在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一外源启动子的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag(或其功能变体)的核酸序列和编码Pol(或其功能变体)的核酸序列。本领域技术人员将理解，上述化学诱导型启动子和外源启动子可具有相同的序列。例如，tet控制的反式激活子(tTA)在不存在小分子诱导物的情况下可结合至启动子(例如外源启动子或化学诱导型启动子)。引入小分子阻遏物可降低tTA与启动子的结合。
在一些实施方式中，第一外源启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二外源启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码Rev(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第二外源启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三外源启动子(如本文描述的)的核酸序列；和(ii)编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列。在一些实施方式中，第三外源启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。在一些实施方式中，第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的核酸序列的选择标记(如本文描述的)的核酸序列。
在一些实施方式中，第一外源启动子、第二外源启动子和第三化学外源启动子包含相同的核酸序列。
在一些实施方式中，另外的多核酸被瞬时转染到工程化细胞中。在一些实施方式中，另外的多核酸没有被稳定地整合到工程化细胞中。在一些实施方式中，另外的多核酸在工程化细胞中的质粒或载体上编码。在一些实施方式中，另外的多核酸包含编码四环素控制的反式激活子(tTA)的测序(sequencing)，其不需要小分子结合来结合外源启动子，例如，如Gossen等人，Proceedings of the National Academy of Sciences 89.12(1992):5547-5551(其通过引用以其整体并入)中所述。在一些实施方式中，另外的多核酸包含编码四环素控制的反式激活子(tTA)或其功能变体的测序。tTA的功能变体包含与SEQ ID NO:11和27-28中的任一个的至少80％同一性(至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，并且维持tTA的功能(例如，tTA-1(即，其作为转录激活子的功能)的至少80％(功能的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。在一些实施方式中，tTA选自由SEQ ID NO:11和27-28组成的组。
在一些实施方式中，稳定地整合到工程化细胞的基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，工程化细胞进一步包含稳定的着陆点(如本文描述的)。
在一些实施方式中，工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
III.试剂盒
在一些方面中，本公开涉及包含本文第I部分中描述的慢病毒载体产生系统的试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒包含共同构成慢病毒载体产生系统的一个或多个多核酸。
在一些实施方式中，试剂盒包含第II部分中描述的工程化细胞。
在一些实施方式中，试剂盒包含转移多核酸。本文描述的转移多核酸包含中心核酸序列，在5’端和3’端上侧翼为慢病毒长串联重复(LTR)的核酸序列。示例性慢病毒LTR是本领域普通技术人员已知的。
转移多核酸的中心核酸可包含多克隆位点的核酸序列。示例性多克隆位点对于具有本领域普通技术的人员是已知的。多克隆位点可用于在宿主细胞中生成病毒载体之前，将载荷分子(或感兴趣的基因)–或编码载荷分子的表达盒-克隆到转移多核酸中。
在一些实施方式中，试剂盒包含编码能够稳定地整合到工程化细胞中的着陆点(如第II(A)节中描述的)的核酸序列。在一些实施方式中，着陆点包含在载体内。在一些实施方式中，转移核酸可以整合到着陆点中。
在一些实施方式中，试剂盒包含可操作地连接至启动子(如本文描述的组成型或诱导型)的编码整合酶的核酸序列。在一些实施方式中，试剂盒包含编码整合酶的mRNA。在一些实施方式中，试剂盒包含整合酶蛋白。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包含对应于慢病毒载体产生的化学诱导型启动子的小分子诱导物。在一些实施方式中，小分子诱导物是四环素、多西环素、cumate、ABA、CRY2-CIB1、DAPG、米非司酮、乳糖或阿拉伯糖。在一些实施方式中，试剂盒包含多核酸(例如载体或质粒)，所述多核酸包含编码四环素控制的反式激活子(tTA)或其变体的核酸序列，如本文描述的。
在一些实施方式中，试剂盒包含工程化细胞，其中所述工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列，所述SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列可操作地连接至编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列、编码Rev(或其功能变体)的核酸序列或其组合。在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。在一些实施方式中，至少两个化学诱导型启动子中的两个或多个是不同的。
在一些实施方式中，试剂盒包含工程化细胞，其中所述工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列，所述SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列可操作地连接至编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列或其组合。在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。在一些实施方式中，至少两个化学诱导型启动子中的两个或多个是不同的。
在一些实施方式中，试剂盒包含含有着陆点(如第II(A)节中描述的)的工程化细胞。在一些实施方式中，转移核酸可整合到着陆点中。
在一些实施方式中，试剂盒包含多核酸，所述多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导型启动子，任选地，其中工程化细胞包含含有转录激活子的核酸序列的多核酸。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，试剂盒包含小分子诱导物多西环素、四环素、DAPG、cumate、乳糖或阿拉伯糖。
在一些实施方式中，试剂盒包含多核酸，所述多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至慢病毒载体产生系统的化学诱导型启动子，任选地其中工程化细胞包含多核酸，所述多核酸包含转录激活子的核酸序列。在一些实施方式中，转录激活子包含SEQID NO:10-12中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，试剂盒包含小分子诱导物多西环素或四环素。
在一些实施方式中，试剂盒包含多核酸，所述多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子结合至慢病毒载体产生系统的外源启动子，任选地其中工程化细胞包含多核酸，所述多核酸包含转录激活子(例如，编码四环素控制的反式激活子(tTA))的核酸序列。
IV.方法
在一些方面中，本公开内容涉及在工程化细胞(例如，如本文描述的工程化细胞)中产生慢病毒载体的方法。在一些实施方式中，方法包括在工程化细胞中表达Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)。
在一些实施方式中，工程化细胞包含诱导型慢病毒载体产生系统(如本文描述的)。例如，在一些实施方式中，工程化细胞包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至编码Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)、Rev(或其功能变体)或其组合的核酸序列的化学诱导型启动子(如本文描述的)的核酸序列。在一些实施方式中，方法包括表达结合至化学诱导型启动子的转录激活子，并使工程化细胞与对应于化学诱导型启动子的小分子诱导物接触。在一些实施方式中，诱导工程化细胞摄取包含转录激活子的核酸序列的异源多核酸。
在一些实施方式中，工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含可操作地连接至编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列、编码Rev(或其功能变体)的核酸序列或其组合的SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。在一些实施方式中，至少两个化学诱导型启动子中的两个或多个是不同的。
在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，小分子诱导物是多西环素、四环素、DAPG、cumate、乳糖或阿拉伯糖。
在一些实施方式中，转录激活子包含SEQ ID NO:10-12中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，小分子诱导物是多西环素或四环素。
在一些实施方式中，工程化细胞包含诱导型慢病毒载体产生系统，其中当包含转录激活子(例如，在不存在小分子阻遏物的情况下能够结合外源启动子的转录激活子)的多核酸被引入到工程化细胞中时，发生诱导。例如，在一些实施方式中，工程化细胞包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至编码Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)、Rev(或其功能变体)或其组合的核酸序列的外源启动子(如本文描述的)的核酸序列。在一些实施方式中，方法包括表达结合至外源启动子的转录激活子，例如诱导工程化细胞摄取包含转录激活子的核酸序列的异源多核酸。
在一些实施方式中，工程化细胞包含外源启动子，所述外源启动子包含可操作地连接至编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列、编码Rev(或其功能变体)的核酸序列或其组合的SEQ IDNO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列的外源启动子。
在一些实施方式中，编码Gag(或其功能变体)的核酸序列、编码Pol(或其功能变体)的核酸序列、编码VSV-G(或其功能变体)的核酸序列和编码Rev(或其功能变体)的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的外源启动子。
在一些实施方式中，工程化细胞包含至少两个外源启动子。在一些实施方式中，至少两个外源启动子中的两个或多个是不同的。
在一些实施方式中，转录激活子是tet控制的反式激活子(tTA)(其不需要小分子诱导物来结合至外源启动子)或其功能变体(如上所述)。
在一些实施方式中，慢病毒载体产生系统的多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合到基因组中。在一些实施方式中，稳定地整合到基因组中的慢病毒载体产生系统的每个多核酸以10-25、25-50、25-100、50-75、50-100、50-125、50-150、50-200、75-100、75-125、75-150、75-175、75-200、100-125、100-150、100-175、或100-200个拷贝的拷贝数稳定地整合。
在一些实施方式中，方法进一步包括将转移多核酸引入到工程化细胞中。在一些实施方式中，在诱导Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)的表达之前引入转移多核酸。在一些实施方式中，在诱导Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)的表达的同时引入转移多核酸。在一些实施方式中，在诱导Gag(或其功能变体)、Pol(或其功能变体)、VSV-G(或其功能变体)和Rev(或其功能变体)的表达之后引入转移多核酸。
实施例
实施例1.对慢病毒载体产生的诱导控制。
假设用诱导型启动子(例如四环素反应元件(TRE))替换驱动VSV-G、Gag-Pol和Rev表达的组成型启动子(例如CMV)，将允许在存在小分子诱导物(例如多西环素和逆四环素反式激活子(rtTA)变体)的情况下对慢病毒强劲诱导表达，同时在不存在小分子诱导物的情况下最小化慢病毒产生和相关毒性(图1-3、6-7)。在示例性系统中，每个基因存在于单独的质粒上，由TRE驱动，并且侧翼为SB100X IR/DR(图2-3)。将病毒基因分离为单独的质粒导致整合到基因组的单独部分中，通过降低形成活性慢病毒颗粒的能力来提高安全性。与随机整合相比，SB100X IR/DR允许更有效地整合到基因组中，其减少所需的整合和选择步骤的数量，因为可同时进行多个整合/选择。
TetOn变体使用Das等人，Curr.Gene Ther.2016；16(3):156-67.doi:10.2174/1566523216666160524144041中描述的突变。合成了TRE启动子。睡美人IR/DR和转座酶如Mates等人，Nat.Genet.2009Jun；41(6):753-61.doi:10.1038/ng.343中所述。
将质粒如转染表(图4A)中列出的组合共转染到HEK293FT细胞中，在转染后48小时和/或72小时收获慢病毒，并通过转导到HEK293FT细胞上并在转导后72小时测定表达EYFP的细胞的百分比来滴定慢病毒(图4B)。
通过共转染编码慢病毒基因和抗生素抗性基因二者的质粒，然后使用抗生素进行选择，生成了几个其中慢病毒基因整合到基因组中的稳定的贴壁HEK293T细胞系。选择和恢复后，仅用含LTR的慢病毒转移质粒转染细胞，并且提供或不提供(withheld)多西环素(图5A-5B)。
通过共转染和抗生素选择生成完全稳定的贴壁HEK293T细胞，其含有基因组整合的含LTR的转移序列以及基因组整合的慢病毒基因。这些完全稳定的产生细胞在产生慢病毒之前不需要添加任何进一步的外源DNA，添加多西环素产生用于产生慢病毒的所有所需的病毒组分。选择约三周后，通过以相同密度铺板、添加不同浓度的多西环素、诱导后72小时收获慢病毒、以及转导HEK293FT细胞来测试细胞(图8)。使用流式细胞术以测定表达EYFP的细胞的百分比来测量转导效率。将滴度与使用HEK293FT细胞和未转染的阴性对照细胞的传统转染产生方法进行比较。在不存在多西环素的情况下，稳定产生细胞产生最小的感染滴度，而在存在大于100nM多西环素的情况下，获得的滴度接近以瞬时转染可达到的滴度。稳定产生滴度的滴度为传统转染样品的滴度的大约86％。
表1：示例性化学诱导型启动子/操纵子。
表2：示例性转录激活子。
表3：示例性慢病毒载体产生组分。
其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可被用作相同、等同或类似目的的替代特征所代替。因此，除非另有明确说明，公开的每个特征仅是一系列等同或类似特征的实例。
从以上描述中，本领域技术人员可容易地确定本公开的基本特征，并且在不偏离其精神和范围的情况下，可对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用法和条件。因此，其他实施方式也在权利要求内。
等同形式
虽然本文已经描述和说明了几个发明实施方式，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行如本文描述的功能和/或获得如本文描述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中每一个都被认为在如本文描述的发明实施方式的范围内。更一般地说，本领域技术人员将容易理解，如本文描述的所有参数、尺寸、材料和构型都旨在是示例性，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明的教义的一个或多个特定应用。本领域技术人员使用不超过常规实验将认识到或能够确定如本文描述的具体发明实施方式的许多等同形式。因此，应理解，前述实施方式仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同形式的范围内，可以以不同于具体描述和所要求保护的方式实施发明实施方式。本公开的发明实施方式涉及如本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不是相互不一致的，两个或多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包含在本公开的发明范围内。
本文限定和使用的所有定义应被理解为优先于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请通过参考有关每个所引用的主题而并入，其在一些情况下可涵盖整个文件。
本申请在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一/一个/一种(a/an)”，除非明确指出相反，应理解为“至少一个/至少一种(at least one)”。
本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为如此连接的元素的“其中之一或两者”，即，元素在一些情况下是联合呈现的，并且在其他情况下是分开呈现的。以“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即：“一个或多个/一种或多种”如此连接的元素。除了由“和/或”从句具体标识的元素之外，可任选地存在与具体标识的那些元素相关或不相关的其他元素。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包含/包括/含有”的开放式语言一起使用时，对“A和/或B”的提及可在一个实施方式中仅指A(任选地包含除B以外的元素)；在另一个实施方式中，仅指B(任选地包含除A以外的元素)；在又另一个实施方式中，指A和B两者(任选地包含其他元素)；等。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应理解为与如上所述定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含，即，包含许多元素或元素列表中至少一个，但也包含多于一个，以及任选地其他未列出的项。只有明确相反指出的术语，诸如“只有一个/只有一种/仅一个/仅一种/仅……一个/仅……一种(only one of)”或“正好一个/正好一种/恰好一个/恰好一种(exactly one of)”，或者当在权利要求书中使用时，“由……组成”将指包含许多元素或元素列表中的正好一个元素。一般而言，本文使用的术语“或”仅当前面有排他性术语，诸如“任一/二者其一(either)”、“一个/一种/其中之一(one of)”、“只有一个/只有一种/仅一个/仅一种/仅……一个/仅……一种(only one of)”或“正好一个/正好一种/恰好一个/恰好一种(exactly oneof)”等时，应被解释为表示排他性替代物(即“一个或另一个，但不是两者都有”)。在权利要求书中使用的“基本上由……组成”，应与专利法领域中使用的通常含义相同。
如本文在说明书和权利要求书中使用的，提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个/至少一种(at least one)”应被理解为是指从元素列表中任一个或多个元素中选择至少一个元素，但不一定包含元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许，除了在短语“至少一个/至少一种(at leastone)”所指的元素列表中具体标识的元素之外，元素可任选地存在，无论与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施方式中，“A和B中至少一个”(或等同地“A或B中至少一个”，或等同地“A和/或B中至少一个”)可指至少一个A、任选包含多于一个A，不存在B(并且任选地包含除B以外的元素)；在另一个实施方式中，可指至少一个B、任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选包含除A以外的元素)；在又一个实施方式中，指至少一个A、任选地包含多于一个A，和至少一个B、任选包含多于一个B(并且任选地包含其他元素)；等。
还应理解，除非明确相反地指出，在本文所要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于所叙述的方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求中，以及在以上说明书中，所有过渡性短语，诸如“包含/包括/含有(comprising/including/containing)”、“携带”、“具有/含有(having)”、“涉及”、“持有”、“包含/包括/含有(composed of)”等，应理解为是开放式的，即，意指包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述。应理解的是，在本文件中使用开放式过渡短语(例如，包含/包括/含有)描述的实施方式在替代实施方式中也被考虑为“由开放式过渡短语所描述的特征组成”和“基本上由开放式过渡短语所描述的特征组成”。例如，如果本公开描述“包含A和B的组合物”，则本公开还考虑到“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”的替代实施方式。
序列表
<110> 阿西莫夫公司
<120> 用于慢病毒载体产生的稳定产生系统
<130> A1210.70003WO00
<140> 还未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/179,129
<151> 2021-04-23
<160> 28
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ctcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc ctatcagtga 60
tagagaacga tgtcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc 120
cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg 180
tcgagtttat ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata 240
gagaacgtat gtcgaggtag gcgtgtacgg tgggaggcct atataagcag agctcgttta 300
gtgaaccgtc agatcgcctg gagaattcga gctcggtacc cgggga 346
<210> 2
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tgaagagttt actccctatc agtgatagag 60
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tcagtgatag agaacgtatg accagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtatctaca 180
gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tatccagttt actccctatc agtgatagag 240
aacgtataag ctttaggcgt gtacggtggg cgcctataaa agcagagctc gtttagtgaa 300
ccgtcagatc gcctggagca attccacaac acttttgtct tataccaact ttccgtacca 360
cttcctaccc tcgtaaagtc gacaccgggg cccagatcta tcgatcggcc ggataacgcc 420
acc 423
<210> 3
<211> 496
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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gaacgtataa ggagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgaccag tttactccct 240
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<220>
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<400> 9
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<210> 10
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
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1 5 10 15
Leu Asn Gly Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Ser Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Tyr Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Leu
100 105 110
Thr Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu
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130 135 140
Cys Val Leu Glu Glu Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu
145 150 155 160
Thr Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Lys Gln Ala Ile Glu
165 170 175
Leu Phe Asp Arg Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu
180 185 190
Leu Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly
195 200 205
Pro Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
210 215 220
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp
225 230 235 240
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
245
<210> 11
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
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50 55 60
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100 105 110
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Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
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Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
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Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
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Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
225 230 235 240
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
245
<210> 12
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Met Asp Met Pro Arg Ile Lys Pro Gly Gln Arg Val Met Met Ala Leu
1 5 10 15
Arg Lys Met Ile Ala Ser Gly Glu Ile Lys Ser Gly Glu Arg Ile Ala
20 25 30
Glu Ile Pro Thr Ala Ala Ala Leu Gly Val Ser Arg Met Pro Val Arg
35 40 45
Ile Ala Leu Arg Ser Leu Glu Gln Glu Gly Leu Val Val Arg Leu Gly
50 55 60
Ala Arg Gly Tyr Ala Ala Arg Gly Val Ser Ser Asp Gln Ile Arg Asp
65 70 75 80
Ala Ile Glu Val Arg Gly Val Leu Glu Gly Phe Ala Ala Arg Arg Leu
85 90 95
Ala Glu Arg Gly Met Thr Ala Glu Thr His Ala Arg Phe Val Val Leu
100 105 110
Ile Ala Glu Gly Glu Ala Leu Phe Ala Ala Gly Arg Leu Asn Gly Glu
115 120 125
Asp Leu Asp Arg Tyr Ala Ala Tyr Asn Gln Ala Phe His Asp Thr Leu
130 135 140
Val Ser Ala Ala Gly Asn Gly Ala Val Glu Ser Ala Leu Ala Arg Asn
145 150 155 160
Gly Phe Glu Pro Phe Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ala Leu Asp Leu Met
165 170 175
Asp Leu Ser Ala Glu Tyr Glu His Leu Leu Ala Ala His Arg Gln His
180 185 190
Gln Ala Val Leu Asp Ala Val Ser Cys Gly Asp Ala Glu Gly Ala Glu
195 200 205
Arg Ile Met Arg Asp His Ala Leu Ala Ala Ile Arg Asn Ala Lys Val
210 215 220
Phe Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Trp Ser
225 230 235 240
Ile Arg Ala Asp Ser Gly Gly Gly Gly Pro Thr Asp Ala Leu Asp Asp
245 250 255
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
260 265 270
Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
275 280 285
Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
290 295
<210> 13
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Met Val Arg Arg Thr Lys Glu Glu Ala Gln Glu Thr Arg Ala Gln Ile
1 5 10 15
Ile Glu Ala Ala Glu Arg Ala Phe Tyr Lys Arg Gly Val Ala Arg Thr
20 25 30
Thr Leu Ala Asp Ile Ala Glu Leu Ala Gly Val Thr Arg Gly Ala Ile
35 40 45
Tyr Trp His Phe Asn Asn Lys Ala Glu Leu Val Gln Ala Leu Leu Asp
50 55 60
Ser Leu His Glu Thr His Asp His Leu Ala Arg Ala Ser Glu Ser Glu
65 70 75 80
Asp Glu Val Asp Pro Leu Gly Cys Met Arg Lys Leu Leu Leu Gln Val
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100 105 110
Leu His His Lys Cys Glu Phe Thr Asp Asp Met Cys Glu Ile Arg Gln
115 120 125
Gln His Gln Ser Ala Val Leu Asp Cys His Lys Gly Ile Thr Leu Thr
130 135 140
Leu Ala Asn Val Val Arg Arg Gly Gln Leu Pro Gly Glu Leu Asp Ala
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Glu Arg Ala Ala Val Ala Met Phe Ala Tyr Val Asp Gly Leu Ile Arg
165 170 175
Arg Trp Leu Leu Leu Pro Asp Ser Val Asp Leu Leu Gly Asp Val Glu
180 185 190
Lys Trp Val Asp Thr Gly Leu Asp Met Leu Arg Leu Ser Pro Ala Leu
195 200 205
Arg Lys Ser Gly Gly Gly Gly Pro Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
210 215 220
Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
225 230 235 240
Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
245 250 255
Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
260
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<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Met Ala Arg Thr Pro Ser Arg Ser Ser Ile Gly Ser Leu Arg Ser Pro
1 5 10 15
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Cys Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Ile Glu Ser Val Ala Arg Arg Ala Gly
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50 55 60
Ile Ala Glu Val Tyr Glu Asn Glu Ile Glu Gln Val Arg Lys Phe Pro
65 70 75 80
Asp Leu Gly Ser Phe Lys Ala Asp Leu Asp Phe Leu Leu His Asn Leu
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Trp Lys Val Trp Arg Glu Thr Ile Cys Gly Glu Ala Phe Arg Cys Val
100 105 110
Ile Ala Glu Ala Gln Leu Asp Pro Val Thr Leu Thr Gln Leu Lys Asp
115 120 125
Gln Phe Met Glu Arg Arg Arg Glu Ile Pro Lys Lys Leu Val Glu Asp
130 135 140
Ala Ile Ser Asn Gly Glu Leu Pro Lys Asp Ile Asn Arg Glu Leu Leu
145 150 155 160
Leu Asp Met Ile Phe Gly Phe Cys Trp Tyr Arg Leu Leu Thr Glu Gln
165 170 175
Leu Thr Val Glu Gln Asp Ile Glu Glu Phe Thr Phe Leu Leu Ile Asn
180 185 190
Gly Val Cys Pro Gly Thr Gln Cys Ser Gly Gly Gly Gly Pro Thr Asp
195 200 205
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp
210 215 220
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
225 230 235 240
Leu Asp Met Leu Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
245 250
<210> 15
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Met Ser Pro Lys Arg Arg Thr Gln Ala Glu Arg Ala Met Glu Thr Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu Lys Gly Tyr
20 25 30
Ala Gly Phe Arg Ile Ala Asp Val Pro Gly Ala Ala Gly Val Ser Arg
35 40 45
Gly Ala Gln Ser His His Phe Pro Thr Lys Leu Glu Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Phe Glu Trp Leu Tyr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Ser Arg Ala Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Leu Lys Pro Glu Asp Asp Val Ile Gln Gln Met Leu Asp
85 90 95
Asp Ala Ala Glu Phe Phe Leu Asp Asp Asp Phe Ser Ile Gly Leu Asp
100 105 110
Leu Ile Val Ala Ala Asp Arg Asp Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Arg Thr Val Glu Arg Asn Arg Phe Val Val Glu Asp Met Trp Leu Gly
130 135 140
Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Ser Arg Asp Asp Ala Glu Asp Ile Leu
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Trp Leu Ile Phe Asn Ser Val Arg Gly Leu Val Val Arg Ser Leu Trp
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Glu Arg Phe Glu Arg Val Arg Asn Ser Thr Leu Glu
180 185 190
Ile Ala Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Phe Lys Arg Ser Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Pro Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
210 215 220
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp
225 230 235 240
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys
245 250 255
Val
<210> 16
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Met Val Ile Met Ser Pro Lys Arg Arg Thr Gln Ala Glu Arg Ala Met
1 5 10 15
Glu Thr Gln Gly Lys Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu
20 25 30
Lys Gly Tyr Ala Gly Phe Arg Ile Ala Asp Val Pro Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Val Ser Arg Gly Ala Gln Ser His His Phe Pro Thr Lys Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Leu Ala Thr Phe Glu Trp Leu Tyr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Ser
65 70 75 80
Arg Ala Arg Leu Ala Lys Leu Lys Pro Glu Asp Asp Val Ile Gln Gln
85 90 95
Met Leu Asp Asp Ala Ala Glu Phe Phe Leu Asp Asp Asp Phe Ser Ile
100 105 110
Gly Leu Asp Leu Ile Val Ala Ala Asp Arg Asp Pro Val Leu Arg Glu
115 120 125
Gly Ile Gln Arg Thr Val Glu Arg Asn Arg Phe Val Val Gly Asp Ile
130 135 140
Trp Leu Gly Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Ser Arg Asp Asp Ala Glu
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Asp Ile Leu Trp Leu Ile Phe Asn Ser Val Arg Gly Leu Val Val Arg
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Ser Leu Trp Gln Lys Asp Lys Glu Arg Phe Glu Arg Val Arg Asn Ser
180 185 190
Thr Leu Glu Ile Ala Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Phe Lys Arg Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Pro Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
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Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
225 230 235 240
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly Pro Pro Lys Lys
245 250 255
Lys Arg Lys Val
260
<210> 17
<211> 432
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 慢病毒
<400> 17
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp
1 5 10 15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
20 25 30
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
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Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His
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Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
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Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
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<213> 未知的
<220>
<223> 慢病毒
<400> 18
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Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln
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Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys
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Gln Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser
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340 345 350
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370 375 380
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450 455 460
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485 490 495
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Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr
645 650 655
Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala Gln Pro Asp Lys Ser Glu Ser Glu Leu
660 665 670
Val Ser Gln Ile Ile Glu Gln Leu Ile Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu
675 680 685
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Lys Leu Val Ser Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile
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755 760 765
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Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala Ser Gly Tyr Ile Glu
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<211> 511
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 慢病毒
<400> 19
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115 120 125
Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln
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Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val
145 150 155 160
Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr
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180 185 190
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Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys
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Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly
260 265 270
Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile
275 280 285
Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp
290 295 300
Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn
325 330 335
Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala
340 345 350
Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr
355 360 365
Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile
370 375 380
Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu
385 390 395 400
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450 455 460
Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu
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<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 慢病毒
<400> 20
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115
<210> 21
<211> 578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatg 578
<210> 22
<211> 571
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct 60
atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc 120
ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc 180
tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg 240
tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa 300
agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt 360
ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg 420
atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta 480
catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt 540
tcctttgaaa aacacgatga taatagttat c 571
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
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1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
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20
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<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Pro
195 200 205
Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Ala
210 215 220
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu
225 230 235 240
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe
245 250 255
Asp Leu Asp Met Leu
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<210> 28
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
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1 5 10 15
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50 55 60
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305 310 315 320
Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
325 330 335

Claims (62)

1.一种用于慢病毒载体产生的工程化细胞，其包含一个或多个稳定整合的异源多核酸，所述一个或多个稳定整合的异源多核酸共同包含：编码Gag的核酸序列；编码Pol的核酸序列；编码VSV-G的核酸序列；以及编码Rev的核酸；其中至少一个可操作地连接至化学诱导型启动子。
2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化细胞，其中工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码Gag的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的工程化细胞，其中Gag包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码Pol的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的工程化细胞，其中Pol包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码VSV-G的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的工程化细胞，其中VSV-G包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞包含可操作地连接至化学诱导型启动子的编码Rev的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的工程化细胞，其中Rev包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞包含：
(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；
(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列；和
(c)第三稳定整合的异源多核酸，其包含编码Rev的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的异源多核酸包含第二表达盒，所述第二表达盒包含：(i)第二化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码VSV-G的核酸序列。
16.根据权利要求15所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至第二表达盒的第二化学诱导型启动子。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的工程化细胞，其中第二化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的工程化细胞，其中第三稳定整合的异源多核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含：(i)第三化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码Rev的核酸序列。
20.根据权利要求19所述的工程化细胞，其中第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至第三表达盒的第三化学诱导型启动子。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的工程化细胞，其中第三化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
22.根据权利要求11-21中任一项所述的工程化细胞，其中第三稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
23.根据权利要求11-22中任一项所述的工程化细胞，进一步包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子。
24.根据权利要求23所述的工程化细胞，其中转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-10中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞包含：
(a)第一稳定整合的异源多核酸，其包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列；和
(b)第二稳定整合的异源多核酸，其包含编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列。
26.根据权利要求25所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的异源多核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含：(i)第一化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码多顺反子RNA的核酸序列，其中所述多顺反子RNA包含编码Gag的核酸序列和编码Pol的核酸序列。
27.根据权利要求26所述的工程化细胞，其中第一化学诱导型启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的异源多核酸包含：
第二表达盒，其包含：(i)第二化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码VSV-G的核酸序列；以及
第三表达盒，其包含：(i)第三化学诱导型启动子的核酸序列；和(ii)编码Rev的核酸序列。
30.根据权利要求29所述的工程化细胞，其中：第二启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；第三启动子包含SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列；或其组合。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的异源多核酸进一步包含可操作地连接至启动子的核酸序列的选择标记的核酸序列。
32.根据权利要求24-30中任一项所述的工程化细胞，其进一步包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子。
33.根据权利要求32所述的工程化细胞，其中转录激活子包含SEQ ID NO:10-16中任一个的氨基酸序列。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的工程化细胞，其进一步包含稳定的着陆点。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞源自HEK293细胞、HeLa细胞、BHK细胞或Sf9细胞。
36.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-35中任一项所述的工程化细胞。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其进一步包含转移多核酸分子，所述转移多核酸分子从5’至3’包含：(i)5’慢病毒长串联重复(LTR)的核酸序列；(ii)多克隆位点；和(iii)3’慢病毒长串联重复(LTR)的核酸序列。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中转移多核酸是质粒或载体。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的试剂盒，其中试剂盒进一步包含对应于工程化细胞的化学诱导型启动子的小分子诱导物。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的试剂盒，其中工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含可操作地连接至编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列、编码Rev的核酸序列或其组合的SEQ ID NO:1-9中的一个或多个的核酸序列。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的试剂盒，其中编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ IDNO:1-9中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中至少两个化学诱导型启动子中的两个或多个是不同的。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的试剂盒，其中试剂盒包含多核酸，所述多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子，任选地其中工程化细胞包含多核酸，所述多核酸包含转录激活子的核酸序列。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中转录激活子包含SEQ ID NO:10-12中任一个的氨基酸序列。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的试剂盒，其中试剂盒包含小分子诱导物多西环素或四环素。
47.一种产生慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)将转移多核酸引入根据权利要求1-35中任一项所述的工程化细胞中；和
(b)使工程化细胞与对应于工程化细胞的化学诱导型启动子的小分子诱导物接触，从而诱导Gag、Pol、VSV-G和Rev的表达；
其中工程化细胞包含异源多核酸，所述异源多核酸包含可操作地连接至启动子的核酸序列的转录激活子的核酸序列，其中所述转录激活子当在存在小分子诱导物的情况下表达时，结合至工程化细胞的化学诱导型启动子；
其中(b)在(a)之前发生、与(a)同时发生或在(a)之后发生。
48.根据权利要求47所述的方法，其中工程化细胞包含化学诱导型启动子，所述化学诱导型启动子包含可操作地连接至编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列、编码Rev的核酸序列或其组合的SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的化学诱导型启动子。
50.根据权利要求49所述的方法，其中工程化细胞包含至少两个化学诱导型启动子。
51.根据权利要求50所述的方法，其中至少两个化学诱导型启动子中的两个或多个是不同的。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中转录激活子包含SEQ ID NO:10-12中任一个的氨基酸序列。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的方法，其中小分子诱导物是多西环素或四环素。
54.一种在工程化细胞中产生慢病毒载体的方法，其中所述工程化细胞包含一个或多个稳定整合的异源多核酸，所述异源多核酸共同包含：编码Gag的核酸序列；编码Pol的核酸序列；编码VSV-G的核酸序列；和编码Rev的核酸；其中至少一个可操作地连接至外源启动子，所述外源启动子能够在不存在小分子阻遏物的情况下被外源转录激活子结合，所述方法包括：
(a)将转移多核酸引入工程化细胞中；和
(b)将外源转录激活子引入工程化细胞中；和
(c)在不存在小分子阻遏物的情况下培养细胞，从而诱导Gag、Pol、VSV-G和Rev的表达；
其中(b)在(a)之前发生、与(a)同时发生或在(a)之后发生。
55.根据权利要求54所述的方法，其中(b)中的引入是在小分子阻遏物的存在下进行的。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，其中(b)中的引入通过以下进行：将异源多核酸引入细胞中，其中，异源多核酸包括可操作连接至启动子的核酸的外源转录激活子的核酸序列；和表达外源转录激活子。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中外源启动子包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的方法，其中编码Gag的核酸序列、编码Pol的核酸序列、编码VSV-G的核酸序列和编码Rev的核酸序列各自可操作地连接至包含SEQ ID NO:1-3中的一个或多个的核酸序列的外源启动子。
59.根据权利要求58所述的方法，其中工程化细胞包含至少两个外源启动子。
60.根据权利要求59所述的方法，其中至少两个外源启动子中的两个或多个是不同的。
61.根据权利要求54-60中任一项所述的方法，其中转录激活子是四环素控制的反式激活子(tTA)。
62.根据权利要求61所述的方法，其中tTA包含SEQ ID NO:11和27-28中的一个或多个的氨基酸序列。
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