KR20240099262A - 인테그라제, 랜딩 패드 아키텍처 및 이를 포함하는 조작된 세포 - Google Patents
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Abstract
포유동물 세포에서 기능하는 변형된 박테리오파지 세린 인테그라제가 본 명세서에 기술된다. 랜딩 패드 아키텍처 또한 본 명세서에 기술된다. 이러한 인테그라제 및 랜딩 패드를 포함하는 조작된 세포 또한 기술되며, 이는 화물 분자의 부위-특이적 게놈 통합을 촉진한다.
Description
분야
포유동물 세포에서 기능하는 변형된 박테리오파지 세린 인테그라제(modified bacteriophage serine integrase)가 본 명세서에 기술된다. 또한 랜딩 패드 아키텍처(landing pad architecture)가 본 명세서에 기술된다. 화물 분자의 부위-특이적 게놈 통합을 촉진하는, 이러한 인테그라제 및 랜딩 패드를 포함하는 조작된 포유동물 세포 또한 기술된다.
관련 출원
본 출원은, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는, 2021년 10월 14일자로 출원된 미국 가출원 제63/255661호의 35 U.S.C. § 119에 따른 이익을 주장한다.
전자 서열 목록에 대한 참조
전자 서열 목록의 내용(A121070005WO00-SEQ-ARM.xml; 크기: 250,175바이트; 및 생성 일자: 2022년 10월 13일)은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
이 분야에서 DNA 재조합 효소(recombinase)로도 지칭되는, 인테그라제는 재조합 부위로 알려진 특정 서열 모티프에서 유전적 재조합을 매개한다. 인테그라제는 선형 염색체들 사이의 교차 사건, 원형 DNA 서열과 선형 서열 사이의 통합 사건, 같은 방향의 연속 재조합 부위들 사이의 삭제 사건 또는 반대 방향의 연속 재조합 부위들 사이의 전도(inversion) 사건을 수행할 수 있다. 재조합 효소 복합체는 전형적으로 스페이서 서열(spacer sequence)에 의해 분리되는 두 개의 쌍의 역 짧은 인식 부위 반복체(inverted short recognition site repeat)에 결합한다. 정확한 메커니즘은 다를 수 있지만, 스페이서 서열은 궁극적으로는 양쪽 가닥에서 잘리고 이들 DNA 가닥은 교환된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산으로서, 다중핵산은 5'에서 3'으로 (i) 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열; (ii) GS 링커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 핵 위치 신호(nuclear localization signal: NLS)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산으로서, 다중핵산은 5'에서 3'으로 (i) 핵 위치 신호(NLS)를 암호화하는 핵산 서열; (ii) GS 링커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, GS 링커를 암호화하는 핵산 서열은 핵산 서열 GGTTCA를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, NLS를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 인테그라제 활성이 있고 N-말단에서 C-말단으로 (i) 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; (ii) GS 링커의 아미노산 서열; 및 (iii) 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 인테그라제 활성이 있고 N-말단에서 C-말단으로 (i) 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열; (ii) GS 링커의 아미노산 서열; 및 (iii) 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, GS 링커는 gly ser이다. 일부 실시형태에서, NLS의 아미노산 서열은 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 위에 개시된 양상들과 실시형태들 중 임의의 것의 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산에 관한 것이다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 프로모터의 핵산 서열; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (iii) 랜딩 패드 마커를 암호화하며, (i)의 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (iv) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함하며, 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 형광 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (v) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 암호화하는 핵산 서열 또는 다중 A를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고, 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 WPRE를 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 5'에서 3'으로 (i) 프로모터의 핵산; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (iii) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; (iv) 제2 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (v) WPRE를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 HEK293 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리(safe harbor locus)에 통합된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 인테그라제 분자를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터(constitutive promoter)이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 키트로서, (a) 위에 기술된 바와 같은 것의 조작된 세포; 및 (b) 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 다중 클로닝 부위를 포함하는 공여체 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 키트로서, (a) 위에 기술된 바와 같은 것의 조작된 세포; (b) 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 다중 클로닝 부위를 포함하는 공여체 분자; 및 (c) (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 인테그라제 분자를 포함하고; 선택적으로 단일 다중핵산이 공여체 분자 및 인테그라제 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 분자는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포의 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고, 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치하고; 공여체 분자는, 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 및 제2 재조합 부위에 결합한다. 일부 실시형태에서, 키트는 (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제1 인테그라제 분자; 및 (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제2 인테그라제 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 단일 다중핵산이 제1 인테그라제 분자 및 제2 인테그라제 분자를 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 C12 내지 C19 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 관심 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 인테그라제 분자의 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하고; 통합 후, 관심 핵산 서열은 조작된 세포의 랜딩 패드의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고; 선택적으로는, 통합 이전에, 관심 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 C1 내지 C11 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 관심 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 인테그라제 분자는 (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계; 이에 따라 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; 통합 후, 관심 핵산 서열은 조작된 세포의 랜딩 패드의 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 통합 이전에, 관심 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않고; (a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제 분자는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 인테그라제 분자의 프리모터는 항시 발현 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포의 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고, 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치하고; 공여체 분자는, 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 및 제2 재조합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 청구항 E10의 방법을 수행하기 위한 키트로서, (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제1 인테그라제 분자; 및 (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제2 인테그라제 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 단일 다중핵산이 제1 인테그라제 분자 및 제2 인테그라제 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 상대-선택 마커의 핵산 서열을 포함하는 랜딩 패드 마커; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 랜딩 패드는 (iv) 제1 재조합 부위에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 상기 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터의 핵산 서열을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터의 핵산 서열은 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 항시 발현 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질, 형광 단백질 또는 이들 모두를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다. 일부 실시형태에서, 상대-선택 마커는 HSV-TK를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제1 인테그라제 분자를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 티로신 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제2 인테그라제 분자를 더 포함하고, 제2 인테그라제 분자는 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제 및 제2 인테그라제는 직교 재조합 부위에 결합한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 키트로서, (a) 청구항 F12 내지 F21 중 어느 하나의 조작된 세포; 및 (b) 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 키트는 (a) 청구항 F1 내지 F11 중 어느 하나의 조작된 세포; 및 (b) 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자; 및 (c) (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 인테그라제 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 다중핵산이 공여체 분자 및 인테그라제 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 공여체 분자는 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상대-선택 마커는 HSV-TK이고, 키트는 간시클로버(ganciclovir)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 F12 내지 F19 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; 및 (b) 인테그라제 분자의 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법은 (a) 청구항 F1 내지 F11 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 인테그라제 분자는 (i) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계; 이에 따라 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제 분자는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 공여체 분자는 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 더 포함한다. 일부 실시형태에서 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 상대-선택 마커는 HSV-TK이거나; (ii) 공여체 분자의 상대-선택 마커는 HSV-TK이거나; (iii) (i) 및 (ii)의 조합이다.
일부 실시형태에서, 방법은 조작된 세포를 간시클로버와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서 본 개시내용은 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 랜딩 패드는 (iv) 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 더 포함하는, 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열 및 인테그라제의 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 랜딩 패드는 (iv) 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프로모터의 핵산 서열은 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론 mRNA는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; IRES를 암호화하는 핵산 서열; 또는 이들의 조합을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리시스트론 mRNA는 5'에서 3'으로 (i) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; (ii) IRES를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (a) 제1 프로모터의 핵산 서열 및 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및 (b) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트에 대해 3'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 같은 방향으로 암호화된다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 반대 방향으로 암호화된다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (a) 제1 프로모터의 핵산 서열 및 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; (b) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트; 및 (c) 보조 유전자를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 보조 유전자는 상대-선택 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트 중 하나 또는 이들 모두에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제2 발현 카세트는 제1 발현 카세트 및 제3 발현 카세트 중 하나 또는 이들 모두에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 이들 모두에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 암호화된다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 모두가 같은 방향으로 암호화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 교대 방향(alternating orientation)으로 암호화된다.
일부 실시형태에서, 제1 프로모터는 화학적으로 유도가능한 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때 상기 화학적으로 유도가능한 프로모터에 결합하는 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (a) 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 폴리시스트론 mRNA는 (i) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (ii) 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는; 제1 발현 카세트; (b) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 제2 프로모터는, 전사 활성화 인자가 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때, (a)의 전사 활성화 인자에 의해 결합되는 화학적으로 유도가능한 프로모터인 제2 발현 카세트를 포함하고; 랜딩 패드는 (c) (a)의 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는 제1 재조합 부위; 및 (d) (b)의 제2 발현 카세트에 대해 3'에 위치하는 제2 재조합 부위를 더 포함하는, 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 제2 재조합 부위는 제1 프로모터에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열 및 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열은 바이러스 2A 펩타이드 또는 IRES를 암호화하는 핵산 서열에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 같은 방향으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 반대 방향으로 존재한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 랜딩 패드는 (a) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; (b) 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트; (c) 인테그라제의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 제3 프로모터는, 전사 활성화 인자가 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때, (b)의 전사 활성화 인자에 의해 결합되는 화학적으로 유도가능한 프로모터인 제3 발현 카세트를 포함하고; 제3 발현 카세트는 제1 발현 세트, 제2 발현 카세트 또는 이들 모두에 대해 3'에 존재하고; 랜딩 패드는 (d) 제1 재조합; 및 (e) 제2 재조합 부위를 더 포함하고; 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 제3 발현 카세트의 삭제를 초래하는, 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 또한 제1 프로모터의 삭제를 초래하며, 선택적으로는 카세트 교환은 또한 제2 프로모터의 삭제를 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 또한 제2 프로모터의 삭제를 초래하며, 선택적으로는 카세트 교환은 또한 제1 프로모터의 삭제를 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 제1 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 발현 카세트는 전사 활성화 인자의 핵산 서열 및 상대-선택 마커의 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론 mRNA는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, IRES를 암호화하는 핵산 서열 또는 이들의 조합을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 교대 방향으로 존재한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어지는 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 키트로서, (a) 청구항 I1 내지 I51 중 어느 하나의 조작된 세포; 및 (b) 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 세린 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70, 72, 75 및 76 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 I1 내지 I51 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; 및 (b) 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 세린 인테그라제이다. 일부 실시형태에서, 세린 인테그라제는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70, 72, 75 및 76 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제는 티로신 인테그라제이다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 제1 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 제1 랜딩 패드는 서열번호 79 내지 148 중 어느 하나의 것과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하며, 제2 재조합 부위는 제1 재조합 부위와 직교하는, 제1 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 것과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 제1 재조합 부위의 핵산 서열 및 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 서로 다르다. 일부 실시형태에서, 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 같은 인테그라제에 의해 인식된다. 일부 실시형태에서, 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 다른 인테그라제에 의해 인식된다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제2 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하며, 제2 랜딩 패드는 (i) 제3 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 제4 재조합 부위의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 재조합 부위, 제2 재조합 부위, 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위는 모두 서로에 대하여 직교한다. 일부 실시형태에서, 제3 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제4 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 랜딩 패드는 제1 발현 카세트를 포함하거나, 상기 제2 랜딩 패드는 제2 발현 카세트를 포함하거나, 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 HEK293 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하며, 제1 랜딩 패드 및/또는 제2 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합되고, 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩은 같은 자리에 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하며, 제1 랜딩 패드 및/또는 제2 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합되고, 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩은 같은 자리에 통합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위, 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위 또는 이들의 조합에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 서열번호 39 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 39 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 서열번호 39 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 제1 인테그라제는 GS 링커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 및 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 키트로서, (a) 청구항 L1 내지 L23 중 어느 하나의 조작된 세포; 및 (b) 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 L16 내지 L22 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 제1 관심 핵산 서열; 및 (ii) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 제1 랜딩 패드로 제1 공여체 분자의 제1 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 L23의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 제1 관심 핵산 서열; 및 (ii) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 제1 인테그라제 및 제2 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 제1 랜딩 패드로 제1 공여체 분자의 제1 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) L1 내지 L15 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 인테그라제 분자는 (i) 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계; 이에 따라 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 L1 내지 L15 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 조작된 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계로서, (i) 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 및 (ii) 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위 및 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 집합적으로 포함하는, 조작된 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 이에 따라 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서, (a) 청구항 L1 내지 L15 중 어느 하나의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) (i) 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 또는 (ii) 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위 및 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 도입하는 단계; 이에 따라 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함하고; (a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본 명세서에 나타난 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께 조합하여 이들 도면들 중 하나 이상을 참조로 하여 더 잘 이해될 수 있다. 도면에 도시된 데이터는 결코 본 개시내용의 범위를 제한하지 않음을 이해해야 한다.
도 1은 포유동물 인테그라제를 시험하기 위한 일시적 벡터의 플라스미드 개략도를 보여준다. hEF1a 프로모터 및 SV40 폴리A 터미네이터 서열은 각 인테그라제(상부 트랙) 또는 리포터 카세트(중간 트랙)의 측면에 위치한다. 코작(Kozak) 서열(GCCACC)은 포유동물 발현을 위해 모든 암호화 서열의 상류에 위치한다. 리포터 형광 단백질 EGFP는 반대 방향으로 attB 및 attP 부위의 측면에 위치한다. 재조합 시(하부 트랙), 재조합 효소는 EGFP를 hEF1a 프로모터가 있는 프레임에서 올바른 방향으로 '뒤집어', EGFP의 발현이 이루어지도록 하며 attL 및 attR 재조합 부위를 생성한다.
도 2는 포유동물 재조합 분석에서 리포터의 발현 수준을 보여준다. 34개의 신규 인테그라제들 중 31개를 대상으로 EGFP를 발현하도록 리포터 플라스미드를 재조합하는 능력에 대해 시험하였다. TagBFP 형질주입 마커에 의해 결정한 것으로, 시험한 세트 중 24개가 모든 형질주입된 세포들의 68%에서 100%에 가까운 범위에서 EGFP의 발현을 구동할 수 있었다. 이 분석법을 통해 인테그라제 Int17, Int19, Int20, Int25, Int28, Int31 및 Int33이 포유동물 세포에서 기능하지 않는 것으로 결정되었다. 인테그라제 Int24는 이 실험에서 시험하지 않았다.
도 3은 게놈 통합에 대해 포유동물 인테그라제를 시험하기 위한 안정한 벡터의 플라스미드 개략도를 보여준다. 같은 일시적 플라스미드를 안정한 세포주에서 인테그라제를 발현하는데 사용할 수 있으며, 이는 각 인테그라제의 측면에 위치한 hEF1a 프로모터 및 SV40 폴리A 터미네이터 서열로 이루어진다(상부 트랙). attP 통합 부위 카세트로 이루어진 랜딩 패드는 저 MOI 렌티바이러스 형질도입(두 번째 트랙)을 통해 안정적으로 통합될 수 있다. 랜딩 패드는 선택가능 마커로서 EYFP 및 푸로마이신(puromycin)을 발현한다. 화물(payload)은 각 인테그라제와 함께 공동-형질주입되어, attB 통합 부위 카세트에 이어 하이그로마이신(hygromycin) 및 TagBFP를 구성할 수 있다(연장된 카세트가 있는 세 번째 트랙). 기능하지 않는 것으로 입증된 인테그라제는 카세트에서 제거하였다(Int1, Int6, Int17, Int19, Int20, Int25, Int28, Int31 및 Int33). 재조합 시, 재조합 효소는 hEF1a 프로모터와 랜딩 패드 마커 사이에 화물 마커(및 화물의 전체 세균 백본)를 삽입하여, 랜딩 패드 마커의 발현(하부 트랙)을 크게 줄이고 화물 마커의 발현을 개시한다.
도 4는 렌티바이러스 게놈 통합을 위한 초기 랜딩 패드의 플라스미드 개략도를 보여준다. 일시적 플라스미드는 화물 재조합 시 강한 항시 발현 프로모터 hEF1a로부터 인테그라제를 발현한다(상부 트랙). 전체 랜딩 패드 서열의 측면에는 렌티바이러스의 긴 말단 반복(LTR)이 위치하고 바이러스 역가는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)에 의해 개선된다. 랜딩 패드 자신은 hEF1a 프로모터에 이어 인테그라제 재조합 부위, 발현 카세트 및 선택적으로 재조합 효소-매개 카세트 교환(RMCE)을 위한 제2 재조합 부위로 이루어진다(두 번째 트랙). 랜딩 패드 발현 카세트는, P2A 절단 부위에 의해 연결된, 선택가능 마커로서 형광 단백질 EYFP 및 푸로마이신 항생제 저항성 유전자를 생성한다. 화물은 각 인테그라제와 함께 공동-형질주입되어, 재조합 부위에 이어 프로모터-없는 발현 카세트 및 선택적으로 RMCE를 위한 제2 재조합 부위를 구성할 것이다(세 번째 트랙). 화물 자신은 프로모터를 함유하지 않지만, 일단 통합되면, 랜딩 패드 프로모터는 선택가능 마커로서 형광 단백질 TagBFP 및 하이그로마이신 항생제 저항성 유전자의 발현을 구동한다. 재조합 효소는, 단일 재조합 부위 만으로 또는 이중 재조합 부위로 설계되었을 때, 각각 전체 화물 플라스미드의 삽입(네 번째 트랙) 또는 화물 마커 카세트의 RMCE(다섯 번째 트랙)를 매개한다. 두 통합 방식 모두 화물 마커의 안정한 발현과 랜딩 패드 마커의 큰 감소 또는 비발현을 초래한다.
도 5a 내지 도 5b는 Cre 재조합 효소에 의해 매개된 TagBFP 발현 화물 마커의 안정한 삽입("단일 lox 랜딩 패드") 또는 카세트 교환("이중 lox 랜딩 패드")을 보여준다. 음성 대조군은 Cre 재조합 효소를 같은 단일-lox(도 5a의 "단일 lox-인테그라제 없음") 또는 이중-lox(도 5a의 "이중 lox-인테그라제 없음") 화물로 공동-형질주입된 불활성 플라스미드로 대체하였다. TagBFP 화물은 형질주입 4일 후 랜딩 패드 마커 EYFP를 대체하는 것으로 보였고, 이는 TagBFP 화물 마커를 발현하고 EYFP 랜딩 패드 마커의 발현을 상실한 세포의 비율이 증가하는 것을 통해 나타났다. 이러한 개체군은 총 개체군의 비율(도 5a) 및 TagBFP 화물 마커의 밝기(도 5b) 모두에서 형질주입 8일 후 안정적이었다.
도 6은 TagBFP 발현 화물 마커에 연결된 하이그로마이신 저항성 카세트 2A의 Cre 매개 안정한 삽입("단일 lox 랜딩 패드") 또는 카세트 교환("이중 lox 랜딩 패드")에 대한 하이그로마이신 선별 하에서의 세포의 생존력을 보여준다. 음성 대조군은 Cre 재조합 효소를 같은 단일-lox("단일 lox-인테그라제 없음") 또는 이중-lox("이중 lox-인테그라제 없음") 화물로 공동-형질주입된 불활성 플라스미드로 대체하였다. 재조합 효소 매개 통합 시료는 13일 후 가장 낮은 생존력에 도달하였고 19일 후에 회복되었다. 음성 대조군 시료는 19일 후 가장 낮은 생존력에 도달하였고 26일 후에 회복되었는데, 이는 아마도 무작위로 통합된 화물 때문인 것으로 보인다.
도 7은 Bxb1 인테그라제 발현 플라스미드, 랜딩 패드 플라스미드, 화물 플라스미드 및 최종 RMCE 산물의 개략도를 보여준다. Bxb1 인테그라제는 포유동물 코돈 최적화되고 hEF1a 프로모터를 사용하여 발현되었다. 랜딩 패드는 그 측면에 두 개의 서로 다른 attP 부위가 위치하며 모두 hEF1a 프로모터에 의해 구동되고 강한 폴리아데닐화 신호에 의해 종결되는 단순포진바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK) 역선택가능(counterselectable) 마커에 2A 서열을 사용하여 번역적으로 연결된 EGFP-푸로마이신 선택가능 마커의 융합 단백질을 함유한다. 화물 플라스미드는 선택을 위한 글루타민 합성 효소 유전자에 2A 서열을 사용하여 번역적으로 연결된 iRFP를 함유한다. 화물은 그 측면에 통합을 위한 랜딩 패드 내 attP 부위를 표적으로 하는 두 개의 attB 부위가 위치한다. 화물 플라스미드는 성공적인 RMCE가 이루어진 클론을 분리하는데 선택 및 역선택을 사용할 수 있도록 형광 및 선택 마커의 발현을 구동하는 프로모터가 결핍되어 있고 HSV-TK 역선택가능 마커를 화물 서열의 외부에 포함한다. 최종 산물은 통합된 서열의 측면에 위치한 attL 및 attR 서열을 함유할 것이며 화물 서열의 발현은 랜딩 패드 hEF1a 프로모터에 의해 구동될 것이다.
도 8a 내지 도 8b. 도 8a는 Bxb1 이중 att-부위 작제물의 시험을 위한 일반화한 작업 흐름을 보여준다. 도 8b는 성공적인 RMCE를 나타내는 490bp 밴드가 모든 클론에서 존재함을 나타내는 66개의 생존 클론의 PCR 스크리닝 결과를 보여준다. 모세포주 및 랜딩 패드만 있는 세포 풀(pool)의 경우 PCR 밴드가 없는데 이는 성공적인 RMCE 표적에 대한 PCR 스크리닝의 특이성을 입증한다.
도 9는 부위-특이적 게놈 통합을 위한 랜딩 패드의 플라스미드 개략도를 보여준다. 각 랜딩 패드 설계는 화물 재조합 시 공동-형질주입을 통해 인테그라제를 발현시키는 이전 설계와 유사한 버전(첫 번째 트랙)과 비교할 수 있다. 전체 랜딩 패드 서열은 그 측면에 좌측 또는 우측 상동성 암(arm)(LHA, RHA) 및 CTCF 인슐레이터(insulator)가 위치한다. 랜딩 패드 자신은 hEF1a 프로모터에 이어지는 인테그라제 재조합 부위, 발현 카세트 및 RMCE를 위한 제2 재조합 부위로 이루어진다. 랜딩 패드 발현 카세트는 2A 절단 부위를 통해 HSV-TK 역-선택가능 마커에 연결된 선택가능 마커로서 형광 단백질 TagBFP에 융합된 하이그로마이신 저항성 유전자를 생성한다. 추가로, 항시적 또는 유도성 인테그라제는 랜딩 패드에서 발현된다. 항시적 설계는 IRES 링커를 통해 선택가능 및 역-선택가능 마커로서 같은 전사체 상에 인테그라제를 발현한다(두 번째 트랙). 유도성 설계는 테트라사이클린 반응 요소(TRE) 유도성 프로모터를 위한 TetOn 역 테트라사이클린-제어 트랜스 작용인자(rtTA)를 발현하기 위해 같은 IRES 링커 배열을 구현한다. 다양한 유도성 설계들의 차이점은 적색으로 강조하였다. 인테그라제는 정방향(세 번째 트랙) 또는 역방향(네 번째 트랙)으로 발현 카세트의 하류 제2 전사 유닛의 TRE 프로모터에 의해 유도적으로 발현된다. 랜딩 패드 발현 카세트 또는 임의의 하류 전사 단위로부터의 전사 판독은 유도성 인테그라제의 기저 발현을 일으키고, 유도 전 누설성 발현을 유도하고, 인테그라제가 독성인 것으로 생각되는 경우 가능한 게놈 불안정성을 초래할 수 있다. 마지막 설계는 하이그로마이신 저항성 유전자 및 형광 마커 TagBFP 사이에 2A 링커를 재도입하는데, 이는 이러한 구성이 이전 화물 설계에서 예상대로 발현되는 것으로 확인되었기 때문이다(하부 트랙). 이 마지막 설계는, 2A 링커를 통해 HSV-TK에 연결된 TetOn rtTA를 포함하여, 발현 카세트 및 역-선택 카세트를 유도성 인테그라제의 측면에 위치하는 2개의 전사 단위로 나눈다.
도 10은 도 9의 랜딩 패드 설계를 위한 예시적인 화물을 보여준다. 화물은 재조합 부위에 이어지는 프로모터-없는 발현 카세트 및 RMCE를 위한 제2 재조합 부위를 함유한다(상부 트랙). 또한 화물은 역-선택을 위한 제2 전사 단위를 함유한다. 화물 자신은 프로모터를 함유하지 않지만, 일단 통합되면, 랜딩 패드 프로모터가 선택가능 마커로서 형광 단백질 EYFP 및 푸로마이신 항생제 저항성 유전자의 발현을 구동한다. 재조합 효소는 2개의 재조합 부위 사이의 랜딩 패드와 화물 마커 카세트의 교환을 매개하여(하부 트랙), 역-선택 후 화물 마커가 안정적으로 발현하고 랜딩 패드 마커가 발현되지 않도록 한다.
도 1은 포유동물 인테그라제를 시험하기 위한 일시적 벡터의 플라스미드 개략도를 보여준다. hEF1a 프로모터 및 SV40 폴리A 터미네이터 서열은 각 인테그라제(상부 트랙) 또는 리포터 카세트(중간 트랙)의 측면에 위치한다. 코작(Kozak) 서열(GCCACC)은 포유동물 발현을 위해 모든 암호화 서열의 상류에 위치한다. 리포터 형광 단백질 EGFP는 반대 방향으로 attB 및 attP 부위의 측면에 위치한다. 재조합 시(하부 트랙), 재조합 효소는 EGFP를 hEF1a 프로모터가 있는 프레임에서 올바른 방향으로 '뒤집어', EGFP의 발현이 이루어지도록 하며 attL 및 attR 재조합 부위를 생성한다.
도 2는 포유동물 재조합 분석에서 리포터의 발현 수준을 보여준다. 34개의 신규 인테그라제들 중 31개를 대상으로 EGFP를 발현하도록 리포터 플라스미드를 재조합하는 능력에 대해 시험하였다. TagBFP 형질주입 마커에 의해 결정한 것으로, 시험한 세트 중 24개가 모든 형질주입된 세포들의 68%에서 100%에 가까운 범위에서 EGFP의 발현을 구동할 수 있었다. 이 분석법을 통해 인테그라제 Int17, Int19, Int20, Int25, Int28, Int31 및 Int33이 포유동물 세포에서 기능하지 않는 것으로 결정되었다. 인테그라제 Int24는 이 실험에서 시험하지 않았다.
도 3은 게놈 통합에 대해 포유동물 인테그라제를 시험하기 위한 안정한 벡터의 플라스미드 개략도를 보여준다. 같은 일시적 플라스미드를 안정한 세포주에서 인테그라제를 발현하는데 사용할 수 있으며, 이는 각 인테그라제의 측면에 위치한 hEF1a 프로모터 및 SV40 폴리A 터미네이터 서열로 이루어진다(상부 트랙). attP 통합 부위 카세트로 이루어진 랜딩 패드는 저 MOI 렌티바이러스 형질도입(두 번째 트랙)을 통해 안정적으로 통합될 수 있다. 랜딩 패드는 선택가능 마커로서 EYFP 및 푸로마이신(puromycin)을 발현한다. 화물(payload)은 각 인테그라제와 함께 공동-형질주입되어, attB 통합 부위 카세트에 이어 하이그로마이신(hygromycin) 및 TagBFP를 구성할 수 있다(연장된 카세트가 있는 세 번째 트랙). 기능하지 않는 것으로 입증된 인테그라제는 카세트에서 제거하였다(Int1, Int6, Int17, Int19, Int20, Int25, Int28, Int31 및 Int33). 재조합 시, 재조합 효소는 hEF1a 프로모터와 랜딩 패드 마커 사이에 화물 마커(및 화물의 전체 세균 백본)를 삽입하여, 랜딩 패드 마커의 발현(하부 트랙)을 크게 줄이고 화물 마커의 발현을 개시한다.
도 4는 렌티바이러스 게놈 통합을 위한 초기 랜딩 패드의 플라스미드 개략도를 보여준다. 일시적 플라스미드는 화물 재조합 시 강한 항시 발현 프로모터 hEF1a로부터 인테그라제를 발현한다(상부 트랙). 전체 랜딩 패드 서열의 측면에는 렌티바이러스의 긴 말단 반복(LTR)이 위치하고 바이러스 역가는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)에 의해 개선된다. 랜딩 패드 자신은 hEF1a 프로모터에 이어 인테그라제 재조합 부위, 발현 카세트 및 선택적으로 재조합 효소-매개 카세트 교환(RMCE)을 위한 제2 재조합 부위로 이루어진다(두 번째 트랙). 랜딩 패드 발현 카세트는, P2A 절단 부위에 의해 연결된, 선택가능 마커로서 형광 단백질 EYFP 및 푸로마이신 항생제 저항성 유전자를 생성한다. 화물은 각 인테그라제와 함께 공동-형질주입되어, 재조합 부위에 이어 프로모터-없는 발현 카세트 및 선택적으로 RMCE를 위한 제2 재조합 부위를 구성할 것이다(세 번째 트랙). 화물 자신은 프로모터를 함유하지 않지만, 일단 통합되면, 랜딩 패드 프로모터는 선택가능 마커로서 형광 단백질 TagBFP 및 하이그로마이신 항생제 저항성 유전자의 발현을 구동한다. 재조합 효소는, 단일 재조합 부위 만으로 또는 이중 재조합 부위로 설계되었을 때, 각각 전체 화물 플라스미드의 삽입(네 번째 트랙) 또는 화물 마커 카세트의 RMCE(다섯 번째 트랙)를 매개한다. 두 통합 방식 모두 화물 마커의 안정한 발현과 랜딩 패드 마커의 큰 감소 또는 비발현을 초래한다.
도 5a 내지 도 5b는 Cre 재조합 효소에 의해 매개된 TagBFP 발현 화물 마커의 안정한 삽입("단일 lox 랜딩 패드") 또는 카세트 교환("이중 lox 랜딩 패드")을 보여준다. 음성 대조군은 Cre 재조합 효소를 같은 단일-lox(도 5a의 "단일 lox-인테그라제 없음") 또는 이중-lox(도 5a의 "이중 lox-인테그라제 없음") 화물로 공동-형질주입된 불활성 플라스미드로 대체하였다. TagBFP 화물은 형질주입 4일 후 랜딩 패드 마커 EYFP를 대체하는 것으로 보였고, 이는 TagBFP 화물 마커를 발현하고 EYFP 랜딩 패드 마커의 발현을 상실한 세포의 비율이 증가하는 것을 통해 나타났다. 이러한 개체군은 총 개체군의 비율(도 5a) 및 TagBFP 화물 마커의 밝기(도 5b) 모두에서 형질주입 8일 후 안정적이었다.
도 6은 TagBFP 발현 화물 마커에 연결된 하이그로마이신 저항성 카세트 2A의 Cre 매개 안정한 삽입("단일 lox 랜딩 패드") 또는 카세트 교환("이중 lox 랜딩 패드")에 대한 하이그로마이신 선별 하에서의 세포의 생존력을 보여준다. 음성 대조군은 Cre 재조합 효소를 같은 단일-lox("단일 lox-인테그라제 없음") 또는 이중-lox("이중 lox-인테그라제 없음") 화물로 공동-형질주입된 불활성 플라스미드로 대체하였다. 재조합 효소 매개 통합 시료는 13일 후 가장 낮은 생존력에 도달하였고 19일 후에 회복되었다. 음성 대조군 시료는 19일 후 가장 낮은 생존력에 도달하였고 26일 후에 회복되었는데, 이는 아마도 무작위로 통합된 화물 때문인 것으로 보인다.
도 7은 Bxb1 인테그라제 발현 플라스미드, 랜딩 패드 플라스미드, 화물 플라스미드 및 최종 RMCE 산물의 개략도를 보여준다. Bxb1 인테그라제는 포유동물 코돈 최적화되고 hEF1a 프로모터를 사용하여 발현되었다. 랜딩 패드는 그 측면에 두 개의 서로 다른 attP 부위가 위치하며 모두 hEF1a 프로모터에 의해 구동되고 강한 폴리아데닐화 신호에 의해 종결되는 단순포진바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK) 역선택가능(counterselectable) 마커에 2A 서열을 사용하여 번역적으로 연결된 EGFP-푸로마이신 선택가능 마커의 융합 단백질을 함유한다. 화물 플라스미드는 선택을 위한 글루타민 합성 효소 유전자에 2A 서열을 사용하여 번역적으로 연결된 iRFP를 함유한다. 화물은 그 측면에 통합을 위한 랜딩 패드 내 attP 부위를 표적으로 하는 두 개의 attB 부위가 위치한다. 화물 플라스미드는 성공적인 RMCE가 이루어진 클론을 분리하는데 선택 및 역선택을 사용할 수 있도록 형광 및 선택 마커의 발현을 구동하는 프로모터가 결핍되어 있고 HSV-TK 역선택가능 마커를 화물 서열의 외부에 포함한다. 최종 산물은 통합된 서열의 측면에 위치한 attL 및 attR 서열을 함유할 것이며 화물 서열의 발현은 랜딩 패드 hEF1a 프로모터에 의해 구동될 것이다.
도 8a 내지 도 8b. 도 8a는 Bxb1 이중 att-부위 작제물의 시험을 위한 일반화한 작업 흐름을 보여준다. 도 8b는 성공적인 RMCE를 나타내는 490bp 밴드가 모든 클론에서 존재함을 나타내는 66개의 생존 클론의 PCR 스크리닝 결과를 보여준다. 모세포주 및 랜딩 패드만 있는 세포 풀(pool)의 경우 PCR 밴드가 없는데 이는 성공적인 RMCE 표적에 대한 PCR 스크리닝의 특이성을 입증한다.
도 9는 부위-특이적 게놈 통합을 위한 랜딩 패드의 플라스미드 개략도를 보여준다. 각 랜딩 패드 설계는 화물 재조합 시 공동-형질주입을 통해 인테그라제를 발현시키는 이전 설계와 유사한 버전(첫 번째 트랙)과 비교할 수 있다. 전체 랜딩 패드 서열은 그 측면에 좌측 또는 우측 상동성 암(arm)(LHA, RHA) 및 CTCF 인슐레이터(insulator)가 위치한다. 랜딩 패드 자신은 hEF1a 프로모터에 이어지는 인테그라제 재조합 부위, 발현 카세트 및 RMCE를 위한 제2 재조합 부위로 이루어진다. 랜딩 패드 발현 카세트는 2A 절단 부위를 통해 HSV-TK 역-선택가능 마커에 연결된 선택가능 마커로서 형광 단백질 TagBFP에 융합된 하이그로마이신 저항성 유전자를 생성한다. 추가로, 항시적 또는 유도성 인테그라제는 랜딩 패드에서 발현된다. 항시적 설계는 IRES 링커를 통해 선택가능 및 역-선택가능 마커로서 같은 전사체 상에 인테그라제를 발현한다(두 번째 트랙). 유도성 설계는 테트라사이클린 반응 요소(TRE) 유도성 프로모터를 위한 TetOn 역 테트라사이클린-제어 트랜스 작용인자(rtTA)를 발현하기 위해 같은 IRES 링커 배열을 구현한다. 다양한 유도성 설계들의 차이점은 적색으로 강조하였다. 인테그라제는 정방향(세 번째 트랙) 또는 역방향(네 번째 트랙)으로 발현 카세트의 하류 제2 전사 유닛의 TRE 프로모터에 의해 유도적으로 발현된다. 랜딩 패드 발현 카세트 또는 임의의 하류 전사 단위로부터의 전사 판독은 유도성 인테그라제의 기저 발현을 일으키고, 유도 전 누설성 발현을 유도하고, 인테그라제가 독성인 것으로 생각되는 경우 가능한 게놈 불안정성을 초래할 수 있다. 마지막 설계는 하이그로마이신 저항성 유전자 및 형광 마커 TagBFP 사이에 2A 링커를 재도입하는데, 이는 이러한 구성이 이전 화물 설계에서 예상대로 발현되는 것으로 확인되었기 때문이다(하부 트랙). 이 마지막 설계는, 2A 링커를 통해 HSV-TK에 연결된 TetOn rtTA를 포함하여, 발현 카세트 및 역-선택 카세트를 유도성 인테그라제의 측면에 위치하는 2개의 전사 단위로 나눈다.
도 10은 도 9의 랜딩 패드 설계를 위한 예시적인 화물을 보여준다. 화물은 재조합 부위에 이어지는 프로모터-없는 발현 카세트 및 RMCE를 위한 제2 재조합 부위를 함유한다(상부 트랙). 또한 화물은 역-선택을 위한 제2 전사 단위를 함유한다. 화물 자신은 프로모터를 함유하지 않지만, 일단 통합되면, 랜딩 패드 프로모터가 선택가능 마커로서 형광 단백질 EYFP 및 푸로마이신 항생제 저항성 유전자의 발현을 구동한다. 재조합 효소는 2개의 재조합 부위 사이의 랜딩 패드와 화물 마커 카세트의 교환을 매개하여(하부 트랙), 역-선택 후 화물 마커가 안정적으로 발현하고 랜딩 패드 마커가 발현되지 않도록 한다.
세린 및 티로신 재조합 효소는 포유동물 시스템에서 기능하는 것으로 나타났다. 이러한 재조합 효소의 하나의 이러한 용도는 포유동물 게놈의 특정 자리(또는 여러 자리)에 "화물" 서열을 보유하는 "랜딩 패드" 서열을 생성하는 것이다. 고정된 통합 부위는 위치 후성 유전적 영향 또는 근위 조절 요소에 의해 발생할 수 있는 실험들 사이의 가변성을 줄이는데 바람직하다. 또한 화물 카피수를 제어하는 능력은 임의의 유전적 구성 요소의 변화없이 화물의 발현 수준을 조절하는데 바람직하다.
게놈 통합 이외에, 재조합 효소의 역전 및 삭제 활성은 숙주 세포 내에서 프로그래밍 가능한 유전적 회로를 달성하기 위한 전환, 논리 게이트, 기억 및 이들의 조합과 같은 합성 논리 기능을 매개하는데 사용될 수도 있다.
인테그라제 및 이를 암호화하는 다중핵산이 본 명세서에 기술된다. 또한 랜딩 패드 아키텍처가 본 명세서에 기술된다. 이러한 인테그라제 및 랜딩 패드를 포함하는 조작된 포유동물 세포 또한 기술되며, 이는 화물 분자의 위치-특이적 게놈 통합을 촉진한다.
I. 인테그라제 및 이를 암호화하는 다중핵산
일부 양상에서, 본 개시내용은 인테그라제 및 이를 암호화하는 다중핵산에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "인테그라제"는 제2 다중핵산(예를 들어, 숙주 세포의 염색체)으로의 제1 다중핵산(예를 들어, 공여체 다중핵산)의 통합을 촉매하는 효소를 의미한다. 통합은 "재조합 부위" 또는 한 쌍의 재조합 부위에서 발생한다. 재조합 부위는 역전, 통합/삭제 또는 카세트 교환을 매개할 수 있다. 재조합된 부위는 재조합 발생 후에 존재한다. 인테그라제는 세린 재조합 효소 또는 티로신 재조합 효소의 패밀리로 분류될 수 있다. Stark, W. Marshall. "Making serine integrases work for us." Current opinion in microbiology 38 (2017): 130-136.
티로신 재조합 효소는 두 개의 동일한 재조합 부위 사이의 재조합을 매개하며, 이는 재조합 발생 후 같은 재조합 모티프를 생성한다. 모티프는 변하지 않기 때문에, 가닥 교환은 후속 재조합을 통해 본래 방향으로 역전될 수 있다. 티로신 재조합 효소의 가역적 특성은, 한 부위에서의 짝수 재조합의 결과물이 전혀 재조합이 발생하지 않은 경우와 같기 때문에, 역전 및 교차에 대한 효율을 낮추는 것으로 생각될 수 있다. 그러나, 재조합 효소가 두 위치 모두에 근접해 있는 것을 필요로 하기 때문에 삭제는 덜 빈번하게 뒤집힌다. 티로신 재조합 효소의 가역성은 재조합 이전에 허용되지만 재조합 발생 후 재조합 효소에 의해 인식될 수 없는 하나 또는 둘 모두의 인식 부위에 비대칭적 돌연변이를 도입하여 완화시킬 수 있다.
세린 재조합 효소는 선천적으로, 세균성 재조합 부위(attB) 및 파지(phage) 재조합 부위(attP)의 이름을 따서 명명한, 비대칭 인식 부위 사이의 DNA 가닥의 교환을 매개한다. 재조합 발생 후, 이 부위들은 추가적인 숙주 인자없이는 더 이상 재조합 효소에 의해 인식되지 않도록 재조합된다. 인식할 수 없는 부위들은 통합된 파지 게놈의 좌측(attL) 및 우측(attR)에 있는 이름을 따서 명명한다. 세린 재조합 효소의 천연 방향성 및 고효율성은 이들을 합성 생물학을 위한 도구로서 특별히 유용하게 만든다.
이전에 다양한 인테그라제가 확인되었으며 여기에는 Bxb1 인테그라제, 람다(lambda)-인테그라제, Cre 재조합 효소, Flp 재조합 효소, 감마(gamma)-델타(delta) 레솔바제(resolvase), Tn3 레솔바제, φC31 인테그라제 또는 R4 인테그라제가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 다음 문헌들을 참고한다: [Xu et al., BMC Biotechnol. 2013 Oct 20; 13: 87]; [Innis et al., Biotechnol. Bioeng. 2017 Aug; 114(8): 1837-46]; [Yang et al., Nat. Methods. 2014 Dec; 11(12): 1261-66]; 미국 특허 제6,746,870 B1호; 미국 특허 제6,632,672 B2호; 미국 특허 제10,081,817 B2호; 미국 특허 제7,282,326 B2호; 미국 공개 특허 제2017/211061 A1호; 미국 공개 특허 제2011/0136237A1호; 미국 공개 특허 제2015/275232A1호 - 이의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 본 명세서에 기술된 실시형태들 중 일부에서, 인테그라제는 Bxb1 인테그라제, 람다-인테그라제, Cre 재조합 효소, Flp 재조합 효소, 감마-델타 레솔바제, Tn3 레솔바제, φC31 인테그라제 및 R4 인테그라제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
A. 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드
일부 양상에서, 본 개시내용은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드는 서열번호 39 내지 76 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 39 내지 76 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드는 서열번호 39 내지 76 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 두 개의 서열(예를 들어, 두 개의 아미노산 서열 또는 두 개의 다중핵산) 사이의 동일성 정도를 결정하는 방법들이 이 분야의 통상의 기술자들에게 알려져 있다. 하나의 예시적인 방법은 기본 매개변수로 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST®) 소프트웨어를 사용하는 것이다(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 포유동물 세포의 인테그라제 활성을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 내지 76 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 내지 76 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드는 서열번호 40 내지 43, 45 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 내지 76 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)를 더 포함한다. 예시적인 NLS 서열들이 이 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 일부 실시형태에서, NLS의 아미노산 서열은 CCAAAGAAAAAGCGGAAAGTG(SV40, 서열번호 77), PKKKRKV(서열번호 78), SV40: PKKKRKV(서열번호 168), Pho: PYLNKRKGKP(서열번호 169), c-Myc: PAAKRVKLD(서열번호 170), 뉴클레오플라스민(Nucleoplasmin): KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 171), 뉴클레오플라스민 유도체: PAAKKKKLD(서열번호 172), ERK5: RKPVTAQERQREREEKRRRR(서열번호 173), H2B: GKKRSKV(서열번호 175) 및 v-Jun: KSRKRKL(서열번호 174) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인테그라제는 아미노산 링커(예를 들어, NLS의 아미노산 서열로부터 인테그라제의 아미노산 서열을 분리하는 아미노산 링커)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 링커는 GS 링커이다. 예시적인 GS 링커들이 이 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, GS 링커는 아미노산 서열 GS(또는 이의 1회 이상의 반복, 예를 들어 이의 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회의 반복)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, GS 링커는 아미노산 서열 GGGS(서열번호 176)(또는 이의 1회 이상의 반복, 예를 들어 이의 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회의 반복)를 포함한다. 일부 실시형태에서, GS 링커는 아미노산 서열 GGGGS(서열번호 177)(또는 이의 1회 이상의 반복, 예를 들어 이의 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회의 반복)을 포함한다. 일부 실시형태에서, GS 링커는 아미노산 서열 SGGGGS(서열번호 178)(또는 이의 1회 이상의 반복, 예를 들어 이의 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회의 반복)를 포함한다. 일부 실시형태에서, GS 링커는 아미노산 서열 GGSGGGGS(서열번호 179)(또는 이의 1회 이상의 반복, 예를 들어 이의 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회의 반복)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단으로 (i) 인테그라제의 아미노산 서열; (ii) 아미노산 링커; 및 (iii) NLS를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단으로 (i) NLS; (ii) 인테그라제의 아미노산 서열; 및 (iii) 아미노산 링커를 포함한다.
B. 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산
일부 양상에서, 본 개시내용은 파트 IA에 기술된 바와 같은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 다중핵산은 서열번호 1 내지 38 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 1 내지 38 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중핵산은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하며, 여기서 다중핵산은 서열번호 1 내지 38 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 다중핵산은 포유동물 세포의 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 다중핵산은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하며, 여기서 다중핵산은 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 내지 38 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 내지 38 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중핵산은 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하며, 여기서 다중핵산은 서열번호 2 내지 5, 7 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 내지 38 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NLS를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 77의 핵산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 인테그라제는 아미노산 링커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 링커는 GS 링커이다. 이러한 GS 링커는 핵산 서열 GGTTCA를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산은 5'에서 3'으로 (i) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; (ii) 아미노산 링커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) NLS를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
II. 조작된 세포
일부 양상에서, 본 개시내용은 하나 이상의 게놈 랜딩 패드를 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "랜딩 패드"는 세포 게놈의 특정 자리(또는 여러 자리)에 "화물"(payload) 서열의 표적화 삽입을 촉진하는 이종 다중핵산 서열(즉, 자연적으로는 세포에서 발견되지 않는 다중핵산 서열)을 의미한다. 따라서, 랜딩 패드는 세포의 게놈으로 통합된다. 고정된 통합 부위는 위치 후성 유전적 영향 또는 근위 조절 요소에 의해 발생할 수 있는 실험들 사이의 가변성을 줄이는데 바람직하다. 또한 화물 카피수를 제어하는 능력은 임의의 유전적 구성 요소의 변화없이 화물의 발현 수준을 조절하는데 바람직하다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 조작된 세포의 게놈 내 안전 항만 부위에 위치한다. 본 명세서에 사용된 용어 "안전 항만 부위"(safe harbor site)는 유전자들 또는 유전적 요소들이 인접한 유전자들의 발현 또는 조절을 방해하지 않고 도입될 수 있고/있거나 인접한 유전적 요소들이 도입된 유전자들 또는 유전적 요소들의 발현 또는 조절을 방해하지 않는 게놈 내 위치를 의미한다. 안전 항만 부위의 예시는 이 분야의 기술자들에게 알려져 있으며 AAVS1, ROSA26, COSMIC, H11, CCR5 및 LiPS-A3S가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 다음 문헌들을 참고할 수 있다: [Gaidukov et al., Nucleic Acids Res. 2018 May 4; 46(8): 4072-4086]; 미국 특허 제8,980,579 B2호; 미국 특허 제10,017,786 B2호; 미국 특허 제9,932,607 B2호; 미국 공개 특허 제2013/280222 A; 국제 공개 특허 제WO 2017/180669 A1호 - 이의 전체가 본 명세서에 원용된다. 일부 실시형태에서, 안전 항만 부위는 알려진 부위이다. 다른 실시형태에서, 안전 항만 부위는 이전에 개시되지 않은 부위이다. 본 명세서의 "고-발현 게놈 자리를 확인하는 방법 및 이의 용도"를 참고할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 AAVS1, ROSA26, COSMIC, H11, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된 랜딩 패드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 조작된 HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된 랜딩 패드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 조작된 CHO 세포는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된 랜딩 패드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 랜딩 패드를 포함한다.
본 명세서에 기술된 각 랜딩 패드는 적어도 하나의 재조합 부위를 포함한다. 다양한 인테그라제에 대한 재조합 부위가 이전에 확인되었다. 예를 들어, 랜딩 패드는 Bxb1 인테그라제, 람다-인테그라제, Cre 재조합 효소, Flp 재조합 효소, 감마-델타 레솔바제, Tn3 레솔바제, φC31 인테그라제 또는 R4 인테그라제에 상응하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 재조합 부위 서열들이 이 분야에 알려져 있다(예를 들어, attP, attB, attR, attL, Lox 및 Frt). 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 서열번호 79 내지 159 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 재조합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 재조합 부위를 포함한다.
적절한 인테그라제에 노출될 때, 재조합 부위는 "동족의", "상보적인", 또는 "상응하는" 재조합 부위(예를 들어, 공여체 다중핵산의 재조합 부위)와 재조합될 것이다. 예시적인 다양한 인테그라제에 대한 동족 재조합 부위를 표 2(각 인테그라제에 대한 attB 및 attP 부위를 제공함; 예를 들어, 서열번호 79 및 서열번호 80이 동족 재조합 부위임) 및 표 3에 제공한다. 재조합 부위는 비-동족 또는 "직교 재조합 부위"(orthogonal recombination site)와 재조합되지 않을 것이다.
직교 재조합 부위는 동시에 여러 재조합 효소를 사용하는데 중요하다. 랜딩 패드는 재조합 효소 매개 카세트 교환(RMCE)로 알려진 랜딩 패드의 재조합 부위에 상보적인 재조합 부위가 측면에 위치한 정의된 화물 서열과 정의된 게놈 서열을 완전하게 교환하기 위해 직교 재조합 부위를 사용할 수 있다. 이러한 RMCE 랜딩 패드는 동시에 발현되어야 하는 2개의 서로 다른 재조합 효소의 직교 재조합 부위를 구현하기 위해 처음 설계되었다. 보다 최근에는, 같은 재조합 효소에 대한 2쌍의 직교 재조합 부위를 한 쌍의 부위에 대한 스페이서 서열을 돌연변이시키는 것을 통해 달성할 수 있다. 재조합 효소가 이의 동족 재조합 부위의 인식의 측면에서 불규칙적인 경우, 동족 부위에 대한 일부 서열 동일성을 갖는 부위로 통합되어 원치않는 표적-외 재조합을 초래할 수 있다. 이러한 표적-외 "유사"(pseudo) 인식 부위는 다르게는 직교한다고 생각되는 인식 부위에 대해 의도하지 않은 재조합 산물을 생성할 수 있다. 또한, 유사 인식 부위는 숙주 게놈의 불안정성을 유발하여, 장기간 발현 후 재조합 효소에 의한 독성을 초래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 둘 이상의 직교 재조합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 같은 핵산 서열을 갖는 두 개의 직교 재조합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 서로 다른 핵산 서열을 갖는 두 개의 직교 재조합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서로 다른 핵산 서열을 갖는 직교 재조합 부위는 서로 다른 인테그라제에 의해 인식된다. 일부 실시형태에서, 서로 다른 핵산 서열을 갖는 직교 재조합 부위는 같은 인테그라제에 의해 인식된다. 예를 들어, 랜딩 패드는 Bxb1-GA attP 재조합 부위(서열번호 147) 및 Bxb1-GT attP 재조합 부위(서열번호 166)를 포함한다.
예시적인 직교 재조합 부위를 아래에 제공한다(파트 IIA).
본 명세서에 기술된 랜딩 패드는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 산물(들)(RNA 산물(들) 및/또는 폴리펩타이드 산물(들))을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 여러 산물이 단일 발현 카세트 내에 암호화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단일 프로모터가 여러 산물(RNA 산물(들) 및/또는 폴리펩타이드 산물(들))을 암호화하는 폴리시스트론 RNA의 발현을 구동한다. 폴리시스트론 RNA는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 핵산 서열 및/또는 바이러스 2A 펩타이드(V2A 또는 2A)의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
IRES는 다음의 서열번호 160의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
IRES는 다음의 서열번호 161의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
바이러스 2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 162) 또는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 163)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 단 하나의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 발현 카세트를 포함한다. 랜딩 패드가 여러 발현 카세트를 포함하는 경우, 카세트는 다양한 방향으로 배치될 수 있다. 예시적인 여러 발현 카세트를 갖는 랜딩 패드가 아래에 제공된다(파트 IIE 참조).
본 명세서에 기술된 바와 같이, 핵산 암호화 서열에 대한 프로모터의 위치가 프로모터에 대한 전사 활성화 인자의 결합이 암호화 서열의 발현을 유도할 수 있도록 하는 경우 프로모터는 핵산 암호화 서열에 "작동 가능하게 연결"된다. 발현 카세트의 프로모터는 항시 발현 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
프로모터는 항시 발현 프로모터(즉, 지속적인 전사를 가능하게 하는 비조절 프로모터)일 수 있다. 항시 발현 프로모터의 예시들이 이 분야에 알려져 있으며 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 연장 인자 1α(EF1α) 프로모터, 원숭이 발포성 바이러스 40(SV40) 프로모터, 유비퀴틴-C(UBC) 프로모터, U6 프로모터 및 포스포글리세르산 키나제(PGK) 프로모터가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 다음의 문헌을 참고할 수 있다: [Ferreira et al., Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013 Jul; 110(28): 11284-89]; 미국 공개 특허 제US 2014/377861 A1호; [Qin, Jane Yuxia, et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS One 5.5 (2010): e10611] - 이의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
대안적으로, 프로모터는 유도성 프로모터(즉, 특정 상황 하에서만 전사를 활성화하는 프로모터)일 수 있다. 유도성 프로모터는 화학적 유도성 프로모터, 온도 유도성 프로모터 또는 광 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 예시가 이 분야에 알려져 있으며 테트라사이클린(tetracycline)/독시사이클린(doxycycline) 유도성 프로모터, 큐민산(cumate) 유도성 프로모터, ABA 유도성 프로모터, CRY2-CIB1 유도성 프로모터, DAPG 유도성 프로모터 및 미페프리스톤(mifepristone) 유도성 프로모터가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 다음의 문헌을 참고할 수 있다: [Stanton et al., ACS Synth. Biol. 2014 Dec 19; 3(12): 880-91]; [Liang et al., Sci. Signal. 2011 Mar 15; 4(164): rs2]; 미국 특허 제7,745,592 B2호; 미국 특허 제7,935,788 B2호 - 이의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "랜딩 패드 마커"(landing pad marker)는 랜딩 패드를 포함하는 조작된 세포를 선택하는데 사용될 수 있는 유전자 산물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질을 포함한다. 항생제 저항성 단백질의 예시가 이 분야에 알려져 있다(예를 들어, 푸로마이신(puromycin), 하이그로마이신(hygromycin), 네오마이신(neomycin), 제오신(zeocin), 블라스티시딘(blasticidin) 또는 플레오마이신(phleomycin) 선택을 촉진함). 예를 들어, 다음의 문헌을 참고할 수 있다: 국제 공개 특허 제WO 1997/15668호; 국제 공개 특허 제WO 1997/43900 A1호 - 이의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 형광 단백질을 포함한다. 형광 단백질의 예시가 이 분야에 알려져 있다(예를 들어, TagBFP, EBFP2, EGFP, EYFP, mKO2 또는 시리우스(Sirius)). 예를 들어, 다음의 문헌을 참고할 수 있다: 미국 특허 제5,874,304호; 유럽 특허 제0969284 A1호; 미국 공개 특허 제2010/167394 A호 - 이의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 HSV-TK를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 상대-선택 마커를 더 포함한다(파트 IIC 참조).
HSV-TK는 다음의 서열번호 164의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
HSV-TK는 다음의 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 다음을 포함하는 랜딩 패드를 포함한다: 지속 프로모터 및/또는 지속 WPRE(파트 IIB 참조); 상대-선택 마커(파트 IIC 참조); 인테그라제를 암호화하는 발현 카세트(파트 IID 참조); 또는 이들의 조합.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 조작된 세포의 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(본 명세서에 기술된 바와 같은, 항시 발현 또는 유도성 프로모터)의 핵산 서열을 포함하는 인테그라제 분자를 더 포함한다. 이러한 인테그라제는 위의 파트 I에 기술되어 있는 것일 수 있다. 이러한 인테그라제 분자는 조작된 세포에서 일시적으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 이러한 인테그라제 분자는 조작된 세포의 게놈 내에 안정하게 통합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 제1 인테그라제를 암호화하는 제1 인테그라제 분자 및 제2 인테그라제를 암호화하는 제2 인테그라제 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 인테그라제 및 제2 인테그라제는 직교 재조합 부위를 표적으로 한다.
A. 예시적인 직교 재조합 부위
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 한 쌍의 직교 재조합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 79의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 79의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 81 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 80의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 80의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 80의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 81 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 81의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 81의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 81의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 80, 83 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 82의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 82의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 82의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 80, 83 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 83의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 83의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 83의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 82, 85 내지 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 84의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 84의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 84의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 82, 85 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 85의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 85의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 85의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 84, 87 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 86의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 86의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 86의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 84, 87 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 87의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 87의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 87의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 86, 89 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 88의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 88의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 88의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 86, 89 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 89의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 89의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 89의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 88, 91 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 90의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 90의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 90의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 88, 91 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 91의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 91의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 91의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 90, 93 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 92의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 92의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 92의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 90, 93 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 93의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 93의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 93의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 92, 95 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 94의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 94의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 94의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 92, 95 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 95의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 95의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 95의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 94, 97 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 96의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 96의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 96의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 94, 97 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 97의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 97의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 97의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 96, 99 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 98의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 98의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 98의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 96, 99 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 99의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 99의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 99의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 98, 101 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 100의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 100의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 100의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 98, 101 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 101의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 101의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 101의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 100, 103 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 102의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 102의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 102의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 100, 103 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 103의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 103의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 103의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 102, 105 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 104의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 104의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 104의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 102, 105 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 105의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 105의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 105의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 104, 107 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 106의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 106의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 106의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 104, 107 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 107의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 107의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 107의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 106, 109 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 108의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 108의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 108의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 106, 109 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 109의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 109의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 109의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 108, 111 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 110의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 110의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 110의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 108, 111 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 111의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 111의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 111의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 110, 113 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 112의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 112의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 112의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 110, 113 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 113의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 113의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 113의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 112, 115 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 114의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 114의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 114의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 112, 115 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 115의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 115의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 115의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 114, 117 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 116의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 116의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 116의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 114, 117 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 117의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 117의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 117의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 116, 119 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 118의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 118의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 118의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 116, 119 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 119의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 119의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 119의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 118, 121 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 120의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 120의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 120의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 118, 121 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 121의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 121의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 121의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 120, 123 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 122의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 122의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 122의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 120, 123 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 123의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 123의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 123의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 122, 125 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 124의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 124의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 124의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 122, 125 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 125의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 125의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 125의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 124, 127 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 126의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 126의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 126의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 124, 127 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 127의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 127의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 127의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 126, 129 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 128의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 128의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 128의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 126, 129 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 129의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 129의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 129의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 128, 131 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 130의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 130의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 130의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 128, 131 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 131의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 131의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 131의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 130, 133 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 132의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 132의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 132의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 130, 133 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 133의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 133의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 133의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 132, 135 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 134의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 134의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 134의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 132, 135 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 135의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 135의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 135의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 134, 137 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 136의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 136의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 136의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 134, 137 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 137의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 137의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 137의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 136, 139 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 138의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 138의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 138의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 136, 139 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 139의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 139의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 139의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 138, 141 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 140의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 140의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 140의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 138, 141 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 141의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 141의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 141의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 140, 143 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 142의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 142의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 142의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 140, 143 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 143의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 143의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 143의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 142, 145 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 144의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 144의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 144의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 142, 145 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 145의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 145의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 145의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 144, 147 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 146의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 146의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 146의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 144, 147 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 147의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 147의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 147의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 146, 149 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 148의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 148의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 148의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 146, 149 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 149의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 149의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 149의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 148, 150 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 150의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 150의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 150의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 149, 151 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 151의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 151의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 151의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 150, 152 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 152의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 152의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 152의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 151, 153 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 153의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 153의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 153의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 152, 154 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 154의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 154의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 154의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 153, 155 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 155의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 155의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 155의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 154, 156 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 156의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 156의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 156의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 155, 157 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 157의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 157의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 157의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 156, 158 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 158의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 158의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 158의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 157, 159 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 159의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 159의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 159의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 158, 160 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 166의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 166의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 166의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 167의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 167의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하며, 여기서 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 직교하고, 여기서 (i) 제1 재조합 부위는 서열번호 167의 핵산 서열을 포함하고; (ii) 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
B. 지속 프로모터 및/또는 지속 WPRE가 있는 랜딩 패드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 지속 프로모터(본 명세서에 기술된 바와 같은, 항시 발현 또는 유도성 프로모터) 및/또는 지속 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 포함하는 랜딩 패드를 갖는다. 본 명세서에 사용된 용어 "지속 프로모터"(persistent promoter)는 랜딩 패드의 재조합 부위에 대해 5'에 위치하고 프로모터-없는 화물의 발현을 구동할 수 있는 랜딩 패드 프로모터를 의미한다. 이러한 실시형태에서, 랜딩 패드에 통합하려고 하는 화물은, 일단 통합되면, 랜딩 패드 지속 프로모터가 화물의 발현을 구동할 수 있기 때문에, 특정 프로모터를 함유할 필요가 없다. 유사하게, 본 명세서에 사용된 용어 "지속 WPRE"는 랜딩 패드의 재조합 부위에 대해 3'에 위치하고 랜딩 패드에 통합될 때 화물에 작동 가능하게 연결될 수 있는 WPRE를 의미한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 단 하나의 재조합 부위(예를 들어, 서열번호 79 내지 159 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 79 내지 159 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 재조합 부위)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 한 쌍의 직교 재조합 부위(예를 들어, 파트 IIA에 기술된 바와 같은 것)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 지속 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 지속 프로모터의 핵산 서열; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (iii) 산물(예를 들어, RNA 산물 또는 폴리펩타이드 산물)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (iv) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함하며, 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 산물을 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 랜딩 패드 마커(예를 들어, 항생제 마커 또는 형광 마커)를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 지속 WPRE를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 지속 WPRE를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (iii) 지속 WPRE를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지속 폴리A 서열은 WPRE 대신하여 사용된다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 지속 프로모터 및 지속 WPRE를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 지속 프로모터의 핵산 서열; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (iii) 지속 WPRE의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 지속 프로모터의 핵산 서열; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (iv) 지속 WPRE의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 지속 프로모터의 핵산 서열; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (iii) (i)의 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 제2 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (v) 지속 WPRE의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 아키텍처는 도 4에 도시된 바와 같다(세 번째 트랙).
C. 상대-선택 마커가 있는 랜딩 패드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는 상대-선택 마커 및 한 쌍의 재조합 부위(예를 들어, 파트 IIA에 기술된 바와 같은 직교 재조합 부위)가 있는 랜딩 패드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "상대-선택 마커"(counter-selection marker)는 공여체 분자와 공유되는 랜딩 패드 마커(본 명세서에 기술된 바와 같은 것)를 의미한다. 이러한 상대선택 마커는 성공적인 RMCE가 이루어진 클론을 분리하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상대-선택 마커는 항생제 저항성 단백질, 형광 단백질, HSV-TK 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상대-선택 마커는, 이의 전체가 참조에 의해 원용되는, 문헌[Black, Margaret E., et al. "Creation of drug-specific herpes simplex virus type 1 thymidine kinase mutants for gene therapy." Proceedings of the National Academy of Sciences 93.8 (1996): 3525-3529]에서 논의된 바와 같은 HSV-TK 야생형 또는 HSV-TK 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 상대-선택 마커의 핵산 서열을 포함하는 랜딩 패드 마커; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 랜딩 패드를 포함하며; 여기서 랜딩 패드는 (iv) 제1 재조합 부위에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(본 명세서에 기술된 바와 같은 항시 발현 또는 유도성 프로모터)의 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터의 핵산 서열은 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 항생제 저항성 단백질, 형광 단백질 또는 이들 모두를 암호화하는 핵산 서열과 같은 상대-선택 마커가 아닌(즉, 해당 공여체 분자와 공유하지 않는) 선택가능한 마커를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드 또는 IRES를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 아키텍처는 도 7에 도시된 바와 같다(두 번째 트랙).
D. 인테그라제를 암호화하는 카세트가 있는 랜딩 패드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 세포는, 파트 1에 기술된 바와 같은 인테그라제와 같은, 인테그라제를 암호화하는 발현 카세트가 있는 랜딩 패드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 랜딩 패드를 포함하며, 여기서 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 여기서 랜딩 패드는 (iv) 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 인테그라제의 핵산 서열 및 랜딩 패드 마커(본 명세서에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하며; 여기서 랜딩 패드는 (iv) 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 프로모터의 핵산 서열은 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 상대-선택 마커이다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론 mRNA는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; IRES를 암호화하는 핵산 서열; 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론 mRNA는 5'에서 3'으로 (i) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; (ii) IRES를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 아키텍처는 도 9에 도시된 바와 같다(두 번째 트랙).
E. 여러 발현 카세트가 있는 랜딩 패드
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 여러 발현 카세트를 포함한다.
1. 2개의 발현 카세트를 포함하는 랜딩 패드
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 2개의 발현 카세트(제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 같은 방향으로 위치한다(즉, 발현이 같은 DNA 가닥으로부터 이루어짐). 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 수렴 방향(convergent orientation)으로 위치한다(즉, 발현이 반대 DNA 가닥으로부터 이루어지고 한 곳으로 모임, →←). 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 발산 방향(divergent orientation)으로 위치한다(즉, 발현이 반대 DNA 가닥으로부터 이루어지고 한 곳에서 산개함, ←→).
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (a) 제1 프로모터의 핵산 서열 및 인테그라제(예를 들어, 본 명세서, 예를 들어 파트 I에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및 (b) 랜딩 패드 마커(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 다른 실시형태에서, 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 3'에 존재한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (a) 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 폴리시스트론 mRNA는 (i) 랜딩 패드 마커(본 명세서에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열; 및 (ii) 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 제1 발현 카세트; (b) 인테그라제(본 명세서, 예를 들어 파트 I에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제2 프로모터는, 전사 활성화 인자가 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때, (a)의 전사 활성화 인자에 의해 결합되는 화학적으로 유도가능한 프로모터인, 제2 발현 카세트를 포함하고; 랜딩 패드는 (c) (a)의 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는 제1 재조합 부위; 및 (d) (b)의 제2 발현 카세트에 대해 3'에 위치하는 제2 재조합 부위를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 재조합 부위는 제1 프로모터에 대해 3'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 상대-선택 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열 및 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열은 바이러스 2A 펩타이드 또는 IRES를 암호화하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 아키텍처는 도 9에 도시된 바와 같다(세 번째 또는 네 번째 트랙).
2. 3개의 발현 카세트를 포함하는 랜딩 패드
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 3개의 발현 카세트(제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 카세트는 같은 방향으로 위치한다(즉, 각 카세트의 발현이 같은 DNA 가닥으로부터 이루어짐). 일부 실시형태에서, 3개의 카세트 중 하나는 반대 방향으로 위치한다(즉, 3개의 카세트 중 하나의 발현이 반대 DNA 가닥으로부터 이루어짐). 3개의 카세트의 예시적인 방향은 다음과 같다: →→→; ←→→; →←→; 및 →→←, 여기서 3개의 각 화살표는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 또는 제3 발현 카세트일 수 있다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (a) 제1 프로모터의 핵산 서열 및 인테그라제(예를 들어, 본 명세서, 예를 들어 파트 I에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; (b) 랜딩 패드 마커(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트; 및 (c) 보조 유전자를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 보조 유전자는 상대-선택 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트는 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두에 대해 5'에 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 발현 카세트는 제1 발현 카세트 및 제3 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두에 대해 5'에 존재한다.
일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두에 대해 5'에 존재한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 암호화된다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 모두 같은 방향으로 암호화되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 교대 방향(alternating orientation)으로 암호화된다.
일부 실시형태에서, 제1 프로모터는 화학적으로 유도가능한 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때 화학적으로 유도가능한 프로모터에 결합하는 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드는 (a) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; (b) 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트; (c) 인테그라제의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제3 프로모터는, 전사 활성화 인자가 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때, (b)의 전사 활성화 인자에 의해 결합되는 화학적으로 유도가능한 프로모터인, 제3 발현 카세트를 포함하며; 여기서 제3 발현 카세트는 제1 발현 세트, 제2 발현 카세트 또는 이들 모두에 대해 3'에 존재하고; 여기서 랜딩 패드는 (d) 제1 재조합; 및 (e) 제2 재조합 부위를 더 포함하고; 여기서 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 제3 발현 카세트의 삭제를 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 또한 제1 프로모터의 삭제를 초래하며, 선택적으로는 카세트 교환은 또한 제2 프로모터의 삭제를 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 또한 제2 프로모터의 삭제를 초래하며, 선택적으로는 카세트 교환은 또한 제1 프로모터의 삭제를 초래한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 제2 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 제1 발현 카세트에 대해 5'에 존재한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 상대-선택 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화된다.
일부 실시형태에서, 제2 발현 카세트는 인테그라제의 핵산 서열을 포함하는 mRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제3 발현 카세트는 전사 활성화 인자의 핵산 서열 및 상대-선택 마커의 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론 mRNA는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, IRES를 암호화하는 핵산 서열 또는 이들의 조합을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 교대 방향으로 존재한다.
일부 실시형태에서, 랜딩 패드 아키텍처는 도 9에 도시된 바와 같다(다섯 번째 트랙).
III. 키트
일부 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 조작된 세포(파트 I 참조)를 포함하는 키트에 관한 것이다.
일부 실시형태에서 키트는 공여체 분자를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 다중 클로닝 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함한다. 예시적인 다중 클로닝 부위가 이 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 공여체 분자는 상대-선택 마커에 작동 가능하게 연결된 프로모터(본 명세서에 기술된 바와 같은 항시 발현 또는 유도성 프로모터)를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상대 선택 마커는 HSV-TK이다. 일부 실시형태에서, 키트는 간시클로버를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 인테그라제 분자를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 분자는 조작된 세포의 랜딩 패드의 재조합 부위 및 공여체 분자의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제(예를 들어, 파트 I에 기술된 바와 같은 인테그라제)를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(본 명세서에 기술된 바와 같은 항시 발현 또는 유도성 프로모터)의 핵산 서열을 포함하는 인테그라제를 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 다중핵산은 공여체 분자 및 인테그라제 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인테그라제 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인테그라제를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그라제 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인테그라제 단백질을 포함한다.
실시형태에서 - 여기서 조작된 세포, 유도성 프로모터 및/또는 인테그라제 분자는 화학적 유도성 프로모터를 포함함 - 키트는 해당 소분자 유도 인자를 더 포함할 수 있다.
IV. 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법
일부 양상에서, 본 개시내용은 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 방법은 (a) 본 명세서에 기술된 조작된 세포(파트 I 참조)에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 여기서 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 재조합 부위에 해당하는 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 관심 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; 및 (b) 랜딩 패드의 재조합 부위 및 공여체 분자의 재조합 부위를 인식하는 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, (b) 단계는 (a) 단계 이전에 발생한다. 일부 실시형태에서, (b) 단계는 (a) 단계와 동시에 발생한다. 일부 실시형태에서 (b) 단계는 (a) 단계 이후에 발생한다.
일부 실시형태에서, 통합 후, 관심 핵산 서열은 조작된 세포의 랜딩 패드의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 통합 이전에, 관심 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 방법은 (a) 본 명세서에 기술된 조작된 세포(파트 I 참조)에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 여기서 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 조작된 세포의 랜딩 패드의 재조합 부위에 해당하는 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 관심 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; (b) 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 여기서 인테그라제 분자는 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제(예를 들어, 파트 I에 기술된 바와 같은 것)를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(본 명세서에 기술된 바와 같은 항시 발현 또는 유도성 프로모터)의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계; 및 (c) 인테그라제 분자의 인테그라제를 발현시켜, 조작된 세포의 랜딩 패드로 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, (c) 단계는 (a) 단계 이전에 발생한다. 일부 실시형태에서, (c) 단계는 (a) 단계와 동시에 발생한다. 일부 실시형태에서, (c) 단계는 (a) 단계 이후에 발생한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포의 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 공여체 분자는 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함하며; 여기서 인테그라제는 랜딩 패드 및 공여체 분자의 제1 및 제2 재조합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 통합 후, 관심 핵산 서열은 조작된 세포의 랜딩 패드의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 통합 이전에, 관심 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 공여체 분자는 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포의 랜딩 패드의 상대-선택 마커는 HSV-TK이고 공여체 분자의 상대-선택 마커는 HSV-TK이다. 이러한 경우에, 방법은 조작된 세포를 간시클로버와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 화학적 유도성 프로모터가 있는 랜딩 패드를 포함하고/하거나 공여체 분자는 유도성 프로모터를 포함하고/하거나 인테그라제는 유도성 프로모터를 포함한다. 이러한 경우에, 방법은 조작된 세포를 화학적 유도성 프로모터에 상응하는 소분자와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1. 포유동물 세포에서 프로파지 인테그라제의 기능성
먼저, 세균성 프로파지(prophage)에서 세린 인테그라제를 탐색하여 관련 인식 부위가 있는 34개의 신규 인테그라제를 식별하였다(Yang et al. Nat Methods. 2014 Dec; 11(12): 1261-6). 이러한 인테그라제들 중 11개를 대장균에서 시험하였고 서로에 대해 그리고 FimE 및 HbiF에 대해 직교하는 것을 발견하였다. 2개의 인테그라제(Int1 및 Int6)는 대장균에서 기능하지 않았다. 이후 기능하는 것으로 나타난 인테그라제를 유전 회로의 구성 요소로 사용하였다.
이러한 앞서 확인된 프로파지 인테그라제가 포유동물 세포에서 기능하는지를 시험하기 위해, 각 인테그라제를 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화하였다(표 1). 그 다음, SV40 핵 위치 신호(NLS)를, GS 링커(전체 핵산 서열: GGTTCA, 전체 아미노산 서열: GS)에 의해 분리된, 각 인테그라제의 C-말단 끝에 첨부하였다(전체 핵산 서열: CCAAAGAAAAAGCGGAAAGTG, 서열번호 77; 전체 아미노산 서열: PKKKRKV, 서열번호 78). 본 발명자들은 hEF1a 프로모터 및 SV40 폴리A를 함유하는, pTwist-EF1-Alpha(Twist Biosciences)에서 각 포유동물 인테그라제를 발현시켰다(도 1, 상부 트랙). Int1과 Int6은 대장균에서 기능하는 것으로 나타나지 않았기 때문에(Yang et al. Nat Methods. 2014 Dec; 11(12): 1261-6), 본 발명자들은 이들을 합성하거나 시험하지 않았다.
본 발명자들은 기능적 인테그라제의 존재 하에서 EGFP를 발현하는 리포터 플라스미드를 설계하였다(도 1, 중간 트랙). 리포터는 pTwist-EF1-Alpha에서 hEF1a 프로모터의 하류에 역-상보화된 EGFP 암호화 서열을 함유한다. 역전화된 EGFP의 측면에 attB 및 attP 부위가 반대 방향으로 위치하므로, 해당 인테그라제에 의한 재조합은 올바른 발현 프레임으로 EGFP 유전자를 '뒤집는' 스위치의 역할을 할 것이다(도 1, 하부 트랙). 각 인테그라제의 활성은 Bxb1 인테그라제의 활성에 대해 정규화한 EGFP 리포터의 중간 형광을 TagBFP 형질주입 마커에 비교하여 결정하였다(표 5).
일시적 시험에서, 시험한 인테그라제 31개 중 24개가 포유동물 세포에서 리포터 플라스미드 상의 재조합을 수행할 수 있었다(도 2). 이러한 시험을 위해, 부착성 HEK293FT 세포를 인테그라제 발현 플라스미드, EGFP 리포터 플라스미드 및 구성적(constitutive) TagBFP를 발현하는 형질주입 마커 플라스미드의 1:1:1몰비의 DNA 혼합물 600ng으로 공동-형질주입하였다. Bxb1 포유동물 인테그라제 및 해당 EGFP 리포터를 구현하는 대조군 시료 또한 양성 대조군으로 준비하였고, TagBFP 마커 플라스미드 만으로 형질주입한 세포를 음성 대조군으로 준비하였다. 형질주입 48시간 후, 모든 시료를 트립신 처리하고 유세포 분석을 사용하여 TagBFP 양성 출입구를 통과한 EGFP 양성 세포의 비율을 결정(%GFP+로 결정)하였다. 시료 Int2 내지 Int13 및 Int14 내지 Int34를 이틀에 나누어 일괄 시험하였다. 검량 비드(calibration bead) 및 이중 양성 및 음성 대조군을 각 날에 실행하였고, 정규화없이 서로 비교가능한 것으로 간주하였다. 인테그라제 Int24는 본 실험에서 시험하지 않았다.
포유동물 세포에서 기능하는 것으로 나타난 24개의 인테그라제는 낮은 독성, 높은 특이성 및 높은 안정성을 갖는 고효율 게놈 재조합 스크리닝을 위한 랜딩 패드 시스템에 사용될 수 있다. 모든 후보 attP 재조합 부위의 카세트와 함께 안정하게 통합된 랜딩 패드를 함유하는 단일 세포주를 저 MOI 렌티바이러스 감염을 사용하여 제작할 수 있다. 단일 통합 카세트를 각 재조합 효소에 대한 24개의 개별 세포주를 생성하는 것을 통해 유발될 수 있는 가변성을 줄이는데 사용할 수 있다(도 3).
이러한 단일-카피 랜딩 패드 세포의 안정한 풀을 각 포유동물 인테그라제 및 모든 상응하는 attB 재조합 부위의 카세트를 함유하는 리포터 화물로 형질주입할 수 있다(표 2 및 표 3). 성공적인 재조합 시 화물(및 세균 백본)을 hEF1a 프로모터와 랜딩 패드 형광 단백질 사이에 삽입할 수 있다. 티로신 재조합 효소 랜딩 패드를 사용한 초기 시험에서, 화물 형광 단백질의 발현 이외에도, 랜딩 패드 형광 단백질 발현 수준의 큰 감소를 통해 성공적인 재조합을 확인할 수 있는 것으로 나타났다. 통합의 효율 및 안정성은 많은 계대에 걸쳐 통합된 화물을 갖는 세포의 비율을 모니터링하여 결정할 수 있다. 각 포유동물 인테그라제의 독성은 형질주입 후 각 풀의 생존력을 측정하여 예측할 수 있다. 화물이 포유동물의 게놈 내 유사-부위에 통합되는 경우 포유동물 인테그라제는 낮은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있으며, 이는 화물의 높은 카피수의 통합을 통해 확인할 수 있다. 또한, 화물 및 랜딩 패드 형광 단백질 모두의 안정한 동시 발현은 원하는 재조합 부위 이외의 다른 부위에 화물이 통합됨을 나타낼 것이다.
실시예 2. 랜딩 패드 아키텍처.
Bxb1과 유사하거나 이보다 더 나은 기능을 하는 것으로 확인된 새로운 포유동물 인테그라제를 위한 랜딩 패드를 구축할 수 있다. 이들 신규 인테그라제는 항체의 부위-특이적 통합, 안정한 바이러스 벡터 화물, 대규모 병렬 리포터 분석(MPRA), 유전적 부분의 특성화 및 유전자 카피수 및 자리의 특정한 제어가 필요한 기타 응용 분야를 위해 설계된 랜딩 패드에 사용할 수 있다. 현재의 설계는 렌티바이러스 및 무작위 통합에 의해 무작위로 삽입된 Bxb1, Cre 및 Flp 인테그라제 랜딩 패드, 뿐만 아니라 HEK293 안전 항만 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S, 뿐만 아니라 CHO 안전 항만 ROSA26, COSMIC 및 H11에의 CRISPR 매개 삽입을 포함한다.
단일 및 이중 부위 랜딩 패드
시험한 첫 번째 랜딩 패드 세트는 Bxb1 세린 인테그라제로 매개하였고, 이후 같은 아키텍처를 사용하여 Cre 및 Flp 티로신 인테그라제에 대해 설계하였다(도 4). 랜딩 패드를 게놈에 무작위로 삽입하거나 렌티바이러스 형질도입을 통해 통합하였다. 이들 랜딩 패드를 Cre 티로신 재조합 효소를 사용하여 시험한 다음 안정적인 통합을 위해 저 MOI 렌티바이러스 형질도입을 통해 통합하였다. 아래에 자세히 설명된 바와 같이, Cre 재조합 효소와 화물 플라스미드의 공동-형질주입은, 단일 lox 부위 또는 이중 lox 부위가 랜딩 패드 및 해당 화물에 존재하는지의 여부에 따라, 게놈 삽입 또는 전체 RMCE를 매개하였다. 공동-형질주입 풀을 계대하고 21일 후, 인정적인 화물 통합이 있는 최종 세포 개체군은 개체군의 약 2%였다.
1e6 현탁 CHO 세포 함유 웰을 Cre 단일-lox 또는 이중-lox 랜딩 패드를 함유하는 생 렌티바이러스의 5배 희석 연속물로 형질도입하였다(6-웰 플레이트에 대략적으로 500㎕, 125㎕, 31㎕, 8㎕, 2㎕ 또는 0.5㎕ 렌티바이러스 형질도입, 웰 당 2㎖의 총 부피로 수행). 형질도입 72시간 후, 세포를 유세포 분석기에 적용하여 희석하지 않은 생 바이러스 역가 및 각 희석의 MOI를 계산하였다. 대략적으로 8㎕의 형질도입이 단일-lox 및 이중-lox 부위 랜딩 패드 바이러스 모두에 대해 0.01을 초과하지 않는 MOI를 달성하는 것으로 결정되었다. 이 희석의 세포를, 10㎍/㎖ 푸로마이신 함유 새로운 배지로 2 내지 3일마다 배지를 교체하여, 생존력이 완전히 회복될 때까지 20일 동안 푸로마이신 선별하였다.
1e6 세포의 각 Cre 랜딩 패드 세포주를 함유하는 웰을 1:1 몰비의 Cre 재조합 효소 발현 플라스미드 및 화물 플라스미드의 1㎍ DNA 혼합물로 공동-형질주입하였다(24-웰 플레이트에서, 웰 당 0.5㎖의 총 부피로 수행). 음성 대조군으로서, 세포를 화물 플라스미드와 Cre 재조합 효소를 대체한 비활성 플라스미드로 공동-형질주입하였다. 형질주입 48시간 후에 시작하여, 세포를 정례적으로 계대하고 유세포 분석기 상에서 랜딩 패드 형광 단백질 EYFP 및 화물 형광 단백질 TagBFP의 발현에 대해 측정하였다(도 5a 내지 도 5b). 세포 밀도는 2e5 내지 5e6 생존 세포/㎖로 유지하였다. 세포 계대 21일 후, 안정적으로 통합된 화물의 개체군이 총 개체군의 대략적으로 2%인 것으로 결정되었으며, 이는 랜딩 패드 EYFP 발현의 손실과 화물 TagBFP 발현의 증가를 통해 확인되었다(표 4). 화물 TagBFP 마커를 발현하는 세포의 하위 개체군은 랜딩 패드 EYFP 마커도 발현하였는데, 이는 이들 세포가 초기에 여러 카피의 랜딩 패드를 갖거나 화물이 무작위 통합에 의해 통합되었음을 나타낸다. 이러한 EYFP 및 TagBFP 양성 세포의 하위 개체군은 화물 통합 세포의 3% 내지 6% 범위였다(표 4). 화물 플라스미드 자체는 기능적 프로모터를 갖고 있지 않고, 무작위 통합에서 관찰된 임의의 형광은 통합 부위의 상류 프로모터에 의해 구동되어야 하므로, 이러한 하위 개체군은 주로 여러 카피의 랜딩 패드로 인해 발생할 수 있다.
동시에, 공동-형질주입된 세포를 계대한지 6일째에, 세포의 일부를 세포가 완전하게 회복될 때까지 하이그로마이신 선별 하에 두었다. 항생제 선별은 형질주입 후 19일째가 되는 날까지 2 내지 3일 마다 배지를 400㎍/㎖ 하이그로마이신 함유 새로운 배지로 교체한 다음, 26일째가 되는 날까지 500㎍/㎖ 하이그로마이신 함유 새로운 배지로 교체하는 방법으로 수행하였다. 화물 및 Cre 재조합 효소 플라스미드로 공동-형질주입한 세포는 19일 후 90%를 초과하는 생존력으로 회복되었다(도 6). 재조합 효소 없이 적합한 화물로 공동-형질주입한 세포는 26일 후에 회복되었는데, 이는 화물의 무작위 통합 때문인 것으로 보인다. TagBFP 화물 마커가 음성 대조군 시료에서 배경 수준을 초과하여 보이는 것으로 관찰되지 않았지만, 프로모터 없는 화물 플라스미드의 통합이 여전히 약한 프로모터의 하류에 삽입될 수 있었기 때문에, 무작위 통합이 회복을 매개하는 것으로 추정되었다.
Cre 재조합 효소에 의해 통합된 화물은 항생제 선별없는 총 개체군의 대략 2%에서 그리고 선별 후 살아남은 세포의 99%에서 관찰되었으며, 살아남은 세포 중 0.8% 또는 2.6%는 각각 단일-lox 또는 이중-lox 랜딩 패드의 랜딩 패드 EYFP 마커를 여전히 발현하였다(표 4). 화물 마커 TagBFP는 Cre 재조합 효소의 부재 하에서 하이그로마이신 선별에서 생존한 세포에서 거의 검출되지 않았으며, 단일-lox 세포에서 0.23%가 발현하였고 이중-lox 랜딩 패드 세포에서 0.87%가 발현하였으며, 이들 중 거의 모두가 랜딩 패드 EYFP 마커를 여전히 발현하였다.
상대-선택 기능이 있는 이중 부위 랜딩 패드
RMCE에서 이중 att-부위를 사용하는 능력을 시험하기 위해, 랜딩 패드가 Bxb1 att 부위 사이에 형광 마커, 항생제 선택 및 상대선택을 함유하는 랜딩 패드 시스템을 개발하였다(도 7). 이러한 아키텍처는 att-부위 사이의 유전 물질을 교환하는 동안 프로모터, 이 경우 hEF1a의 유지를 가능하게 한다. 이러한 설계는 해로울 수 있는 세균 유래 플라스미드 서열의 도입을 최소화하는 att-부위 사이의 유전 화물로 RMCE를 제한한다.
무작위로 통합된 랜딩 패드를 갖는 안정한 세포주를 사용한 예비 시험에서(아래에서 자세하게 설명됨), 클론의 100%가 성공적인 RMCE에 대해 양성인 것으로 관찰되었다. 성공적인 RMCE의 최종 산물을 표적으로 하는 PCR 및 간시클로버 상대-선택에서 생존한 클론의 PCR 산물의 서열분석 검증에 의한 특성화를 통해 스크리닝한 모든 클론들이 성공적으로 RMCE가 이루어진 것으로 나타났다.
CHO 글루타민 합성 효소(GS)-녹아웃 세포주로의 무작위 통합을 사용하여 안정한 세포주를 생성하였다. Bxb1 이중 att-부위 랜딩 패드를 전기천공법으로 세포에 도입하고 푸로마이신을 사용하여 안정한 클론을 선별함으로써 랜딩 패드 함유 세포 풀을 생성하였다. Bxb1 이중 att-부위 랜딩 패드를 시험하기 위해, Bxb1 및 화물 플라스미드를 안정한 세포에 전기천공법으로 도입하고 3일의 회복 기간 이후 재조합 양성 세포의 선별을 위해 세포를 L-글루타민이 없는 배지로 옮겼다(GS-선별). GS-선별 후 제한 희석을 사용하여 세포를 단일 세포 클론화하고 간시클로버의 사용을 통한 음성 선별을 사용하여 비-표적화 통합체를 제거하였다(도 8a). 랜딩 패드 hEF1a 프로모터 및 화물 iRFP에 걸친 PCR을 사용하여 살아남은 클론을 스크리닝하였다. PCR을 사용하여 66개의 생존 클론을 스크리닝하였으며 모두가 성공적인 RMCE에 대해 양성이었다(도 8b). 선택된 28개의 클론에 대한 PCR 밴드를 서열분석하여 성공적인 RMCE가 이루어졌음을 확인하였다. 모든 28개 클론의 서열들은 Bxb1 이중 att-부위 랜딩 패드에서 성공적인 재조합을 나타내는 예측된 RMCE 서열로 정렬된다(데이터는 표시하지 않음).
이중 부위, 상대-선별가능, 인테그라제 발현 랜딩 패드
이전 설계를 기반으로, 인테그라제가 유도적으로 또는 항시적으로 랜딩 패드로부터 발현되는 시스템은 RMCE의 효율을 증가시킬 수 있다(도 9). 이러한 설계는 형질주입되는 플라스미드의 수를 최소화하며, 유도가능한 설계는 인테그라제 발현에 대한 일시적인 조정을 가능하게 한다. 두 경우에서, 화물의 형질주입 전 인테그라제의 발현이 효율을 증가시킬 것으로 기대된다.
인테그라제는 EMCV 바이러스로부터의 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site: IRES) 링커(Genbank: MN542793.1, 서열번호 160)에 의해 랜딩 패드에서 항시적으로 발현된다. 좌측 상동성 팔(left homology arm: LHA) 또는 우측 상동성 팔(right homology arm: RHA) 및 CTCF 인슐레이터는 랜딩 패드의 측면에 위치하여 게놈 상의 통합 부위 위치를 제어하고 또한 랜딩 패드의 침묵을 방지한다. 상동성 팔은 안전 항만 부위로 알려진 자리에 대해, 또한 침묵을 위해 본질적으로 격리되는 것으로 알려진 자리에 대해 선택될 수 있다. CHO에서 주목할 만한 부위는 생쥐의 이종상동성 ROSA26 자리, H11 및 COSMIC이다. HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서, 주목할 만한 부위는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S이다. 화물은 항시 발현 또는 유도성 인테그라제가 있는 랜딩 패드를 발현하는 안정한 세포주에 형질주입될 수 있다(도 10).
화물 벡터를 사용한 랜딩 패드로의 직교 재조합 부위의 통합
일부 실시형태에서, 시스템의 추가 확장은 화물을 사용하여 목표 자리로의 수회의 통합에 사용하기 위한 새로운 재조합 효소 부위(예를 들어, attB)를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 직교 재조합 부위를 이용하는 단일 또는 이중 세린 또는 티로신 재조합 효소와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화물 플라스미드는 랜딩 패드에 대한 동족 재조합 부위를 함유하고 추가 직교 재조합 부위가 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 화물 플라스미드는 랜딩 패드에 존재하는 동족 재조합 부위를 통해 랜딩 패드에 통합되고 다른 회의 표적화 통합에 사용하기 위한 2차 재조합 부위를 제공한다. 세린 인테그라제의 경우에서, 통합 후 본래의 attP 및 attB 부위는 재조합되며 추가 인자없이는 재조합에 참여할 수 없다. 이러한 방식에서 직교 재조합 효소 부위의 수를 재조합하여 여러 유전자들을 같은 표적 자리에 통합할 수 있다.
기타 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 같거나, 동등하거나 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 계열의 예시일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 이 분야의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 쉽게 알아낼 수 있으며, 이의 사상 및 범위를 벗어남 없이, 다양한 용도와 조건에 따라 조정하기 위해 본 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 기타 실시형태 또한 청구범위에 포함된다.
등가물
본 명세서에 여러 가지 발명적 실시형태가 기술되고 예시되었지만, 이 분야의 통상의 기술자들은 본 명세서에 기술된 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 떠올릴 것이며, 각각의 이러한 변화 및/또는 변형은 본 명세서에 기술된 발명적 실시형태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로는, 이 분야의 기술자들은 본 명세서에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 의미이며 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성은 특정 응용 분야 또는 발명적 교시가 사용되는 응용 분야에 따라 달라질 것임을 쉽게 이해할 것이다. 이 분야의 기술자들은 단지 일상적인 실험을 사용하는 것만으로도 본 명세서에 기술된 특정 발명적 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시형태는 단지 예시로 제공되며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 등가물의 범위 내에서, 발명적 실시형태가 구체적으로 기술되고 청구된 바와 다르게 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용의 발명적 실시형태는 본 명세서에 기술된 각각의 개별적 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 추가로, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 모순되지 않는 경우, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 둘 이상의 임의의 조합이 본 개시내용의 발명적 범위 내에 포함된다.
본 명세서에서 정의되고 사용된 모든 정의는 사전적 정의, 참조에 의해 원용된 문헌에서의 정의 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미를 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 언급하는 주제와 관련하여 참조에 의해 원용되며, 일부의 경우 문헌의 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 단수적 표현은, 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 "및/또는"은 결합된 요소들 중 "둘 중 하나 또는 둘 모두", 즉 일부의 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 나열된 여러 요소들은 같은 방식으로, 즉 결합된 요소들 중 "하나 이상"으로 이해되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지 없는지와 상관없이, "및/또는"으로 구체적으로 식별된 요소 이외에 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예시로서, "A 및/또는 B"에 대한 참조는, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 결합하여 사용되는 경우, 일 실시형태에서, 오직 A 만(선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 실시형태에서, 오직 B 만(선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A 및 B 모두(선택적으로 다른 요소를 포함함); 등을 의미할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 "또는"은 위에서 정의한 바와 같은 "및/또는"과 같은 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로서, 즉 다수의 요소 또는 요소 목록 중 적어도 하나의 포함이지만, 하나 초과 또한 포함하고, 선택적으로는, 나열되지 않은 추가 항목을 포함하는 것으로서 이해되어야 한다. 반대로 명시적으로 나타낸 용어, 예를 들어 "~ 중 단 하나" 또는 "~ 중 정확히 하나", 또는 청구항에 사용되는 경우 "~로 이루어지는"의 용어 만이 다수의 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 의미할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 사용된 용어 "또는"은 배타성 용어, 예를 들어 "둘 중 하나", "~ 중 하나", "~ 중 단 하나" 또는 "~ 중 정확히 하나"가 따르는 경우 배타적 대안을 나타내는 것(즉, "하나 또는 다른 것이지만 둘 다는 아님")으로만 이해되어야 한다. "~으로 본질적으로 이루어지는"은 청구항에 사용되는 경우 특허법의 분야에서 사용되는 바와 같은 통상적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 것으로서, 하나 이상의 요소들의 목록에 관한 "적어도 하나"는 요소 목록 내 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소 목록 내에 구체적으로 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며 요소 목록 내 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 식별되는 요소들과 연관되든 연관되지 않든, "적어도 하나"가 의미하는 요소 목록 내에서 구체적으로 식별되는 요소들 이외에 요소들이 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비-제한적 예시로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게는 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서, 적어도 하나의, 선택적으로 하나 초과를 포함하는, B가 존재하지 않는, A(및 선택적으로는 B 이외의 요소들을 포함함); 다른 실시형태에서, 적어도 하나의, 선택적으로 하나 초과를 포함하는, A가 존재하지 않는, B(및 선택적으로는 A 이외의 요소들을 포함함); 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의, 선택적으로 하나 초과를 포함하는, A 및 적어도 하나의, 선택적으로 하나 초과를 포함하는, B(및 선택적으로는 다른 요소들을 포함함); 등을 의미할 수 있다.
또한, 반대로 명시적으로 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 언급된 순서로 제한되는 것은 아님을 이해해야 한다.
청구범위에서 뿐만 아니라 위의 명세서에서, "포함하는", "수반하는", "갖는", "함유하는", "보유하는", "~로 이루어져 있는" 등과 같은 표현은 개방형, 즉 포함하지만 이로 제한되지 않는 의미로 이해되어야 한다. 미국 특허청의 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이, "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는" 만이 각각 폐쇄적 또는 반-폐쇄적인 의미가 된다. 개방형 표현(예를 들어, "포함하는")을 사용하여 본 문헌에 기술된 실시형태는, 대안적인 실시형태에서, 개방형 표현에 의해 기술된 특징으로 "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는"으로서도 고려됨을 이해해야 한다. 예를 들어, 개시내용이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기술하는 경우, 개시내용은 대안적인 실시형태 "A 및 B로 이루어지는 조성물" 및 "A 및 B로 본질적으로 이루어지는 조성물" 또한 고려한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (188)
- 인테그라제 활성이 있고 N-말단에서 C-말단으로 (i) 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; (ii) GS 링커의 아미노산 서열; 및 (iii) 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 인테그라제 활성이 있고 N-말단에서 C-말단으로 (i) 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열; (ii) GS 링커의 아미노산 서열; 및 (iii) 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GS 링커는 gly ser인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS의 아미노산 서열은 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산.
- 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산으로서, 상기 다중핵산은 5'에서 3'으로 (i) 서열번호 10, 2 내지 5, 7 내지 9, 11 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 10, 2 내지 5, 7 내지 9, 11 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열; (ii) GS 링커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 핵 위치 신호(NLS)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 다중핵산.
- 인테그라제 활성이 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산으로서, 상기 다중핵산은 5'에서 3'으로 (i) 핵 위치 신호(NLS)를 암호화하는 핵산 서열; (ii) GS 링커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 서열번호 10, 2 내지 5, 7 내지 9, 11 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 서열번호 10, 2 내지 5, 7 내지 9, 11 내지 16, 18, 21 내지 23, 26, 27, 29, 30, 32 및 34 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 다중핵산.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 GS 링커를 암호화하는 핵산 서열은 핵산 서열 GGTTCA를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 다중핵산.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 다중핵산.
- 랜딩 패드(landing pad)의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 프로모터의 핵산 서열; (ii) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (iii) 랜딩 패드 마커를 암호화하며, 상기 (i)의 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 조작된 세포.
- 제10항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 (iv) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치하는, 조작된 세포.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질을 포함하는, 조작된 세포.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 형광 단백질을 포함하는, 조작된 세포.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 (v) 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 암호화하는 핵산 서열 또는 다중 A를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제14항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 상기 WPRE를 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는, 조작된 세포.
- 제15항에 있어서, 상기 발현 카세트는 5'에서 3'으로 (i) 상기 프로모터의 핵산; (ii) 상기 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (iii) 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; (iv) 제2 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (v) 상기 WPRE를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 HEK293 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리(safe harbor locus)에 통합된, 조작된 세포.
- 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제19항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된, 조작된 세포.
- 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 인테그라제 분자를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제21항에 있어서, 상기 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터(constitutive promoter)인, 조작된 세포.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 조작된 세포.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 조작된 세포.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제25항에 있어서, 상기 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제26항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 조작된 세포.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 키트로서,
(a) 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조작된 세포; 및
(b) 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 다중 클로닝 부위를 포함하는 공여체 분자
를 포함하는, 키트. - 키트로서,
(a) 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조작된 세포;
(b) 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 다중 클로닝 부위를 포함하는 공여체 분자; 및
(c) (i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 인테그라제 분자
를 포함하고;
선택적으로 단일 다중핵산이 상기 공여체 분자 및 상기 인테그라제 분자를 포함하는, 키트. - 제30항에 있어서, 상기 인테그라제 분자는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 상기 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터인, 키트.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 키트.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 키트.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키트.
- 제34항에 있어서, 상기 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함하는, 키트.
- 제35항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 키트.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치하고; 상기 공여체 분자는, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함하는, 키트.
- 제38항에 있어서, 상기 인테그라제는 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 및 제2 재조합 부위에 결합하는, 키트.
- 제38항에 있어서,
(i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제1 인테그라제 분자; 및
(i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제2 인테그라제 분자
를 포함하고;
선택적으로는 단일 다중핵산이 상기 제1 인테그라제 분자 및 상기 제2 인테그라제 분자를 포함하는, 키트. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 관심 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 인테그라제 분자의 인테그라제를 발현시켜, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하고;
통합 후, 상기 관심 핵산 서열은 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고;
선택적으로는, 통합 이전에, 상기 관심 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 관심 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 상기 인테그라제 분자는 (i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계;
이에 따라 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
통합 후, 상기 관심 핵산 서열은 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고;
선택적으로는, 통합 이전에, 상기 관심 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않고;
(a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 제42항에 있어서, 상기 인테그라제 분자는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 상기 인테그라제 분자의 프리모터는 항시 발현 프로모터인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치하고; 상기 공여체 분자는, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 인테그라제는 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 및 제2 재조합 부위에 결합하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제50항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
(i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제1 인테그라제 분자; 및
(i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 제2 인테그라제 분자
를 포함하고;
선택적으로는 단일 다중핵산이 상기 제1 인테그라제 분자 및 상기 제2 인테그라제 분자를 포함하는, 키트. - 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 상대-선택 마커의 핵산 서열을 포함하는 랜딩 패드 마커; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 상기 랜딩 패드는 (iv) 상기 제1 재조합 부위에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 상기 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터의 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제53항에 있어서, 상기 프로모터의 핵산 서열은 상기 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는, 조작된 세포.
- 제54항에 있어서, 상기 프로모터는 항시 발현 프로모터인, 조작된 세포.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질, 형광 단백질 또는 이들 모두를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제56항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제57항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화되는, 조작된 세포.
- 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상대-선택 마커는 HSV-TK를 포함하는, 조작된 세포.
- 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제61항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된, 조작된 세포.
- 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제62항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된, 조작된 세포.
- 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제1 인테그라제 분자를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제64항에 있어서, 상기 제1 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터인, 조작된 세포.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 세린 인테그라제인, 조작된 세포.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 조작된 세포.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제68항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제69항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 조작된 세포.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인테그라제 분자를 더 포함하고, 상기 제2 인테그라제 분자는 상기 랜딩 패드의 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제72항에 있어서, 상기 제1 인테그라제 및 제2 인테그라제는 직교 재조합 부위에 결합하는, 조작된 세포.
- 키트로서,
(a) 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항의 조작된 세포; 및
(b) 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자
를 포함하는, 키트. - 키트로서,
(a) 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항의 조작된 세포;
(b) 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자; 및
(c) (i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 인테그라제 분자
를 포함하고;
선택적으로 단일 다중핵산이 상기 공여체 분자 및 상기 인테그라제 분자를 포함하는, 키트. - 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 공여체 분자는 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 더 포함하는, 키트.
- 제76항에 있어서, 상기 상대-선택 마커는 HSV-TK이고, 상기 키트는 간시클로버(ganciclovir)를 더 포함하는, 키트.
- 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터인, 키트.
- 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 키트.
- 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 키트.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키트.
- 제81항에 있어서, 상기 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함하는, 키트.
- 제82항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 키트.
- 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 키트.
- 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; 및
(b) 상기 인테그라제 분자의 인테그라제를 발현시켜, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 상기 인테그라제 분자는 (i) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 랜딩 패드 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계;
이에 따라 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 제86항에 있어서, 상기 인테그라제 분자는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 상기 인테그라제 분자의 프로모터는 항시 발현 프로모터인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제90항에 있어서, 상기 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 분자는 상대-선택 마커의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제94항에 있어서,
(i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 상대-선택 마커는 HSV-TK이거나;
(ii) 상기 공여체 분자의 상대-선택 마커는 HSV-TK이거나;
(iii) (i) 및 (ii)의 조합인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 제94항에 있어서, 상기 조작된 세포를 간시클로버와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 상기 랜딩 패드는 (iv) 상기 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 상기 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제97항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 5'에서 3'으로 (i) 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 인테그라제의 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하고; 상기 랜딩 패드는 (iv) 상기 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 상기 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제98항에 있어서, 상기 제1 프로모터의 핵산 서열은 상기 제1 재조합 부위의 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는, 조작된 세포.
- 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
- 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
- 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리시스트론 mRNA는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; IRES를 암호화하는 핵산 서열; 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제102항에 있어서, 상기 폴리시스트론 mRNA는 5'에서 3'으로 (i) 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; (ii) IRES를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 상기 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제97항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 (a) 상기 제1 프로모터의 핵산 서열 및 상기 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및 (b) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는, 조작된 세포.
- 제104항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
- 제105항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트에 대해 3'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 같은 방향으로 암호화되는, 조작된 세포.
- 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 반대 방향으로 암호화되는, 조작된 세포.
- 제97항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 (a) 상기 제1 프로모터의 핵산 서열 및 상기 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; (b) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트; 및 (c) 보조 유전자를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 포함하는, 조작된 세포.
- 제111항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
- 제112항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 유전자는 상대-선택 마커를 포함하는, 조작된 세포.
- 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트 중 하나 또는 이들 모두에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 발현 카세트는 상기 제1 발현 카세트 및 제3 발현 카세트 중 하나 또는 이들 모두에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 발현 카세트는 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 이들 모두에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 암호화되는, 조작된 세포.
- 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 모두 같은 방향으로 암호화되지는 않는, 조작된 세포.
- 제119항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 교대 방향(alternating orientation)으로 암호화되는, 조작된 세포.
- 제97항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 화학적으로 유도가능한 프로모터인, 조작된 세포.
- 제121항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때 상기 화학적으로 유도가능한 프로모터에 결합하는 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 랜딩 패드는 5'에서 3'으로
(a) 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 상기 폴리시스트론 mRNA는 (i) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; 및 (ii) 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 제1 발현 카세트;
(b) 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 상기 제2 프로모터는, 상기 (a)의 전사 활성화 인자가 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때, 상기 전사 활성화 인자에 의해 결합되는 화학적으로 유도가능한 프로모터인, 제2 발현 카세트
를 포함하고;
상기 랜딩 패드는
(c) 상기 (a)의 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는 제1 재조합 부위; 및
(d) 상기 (b)의 제2 발현 카세트에 대해 3'에 위치하는 제2 재조합 부위
를 더 포함하는, 조작된 세포. - 제123항에 있어서, 상기 제2 재조합 부위는 상기 제1 프로모터에 대해 3'에 위치하는, 조작된 세포.
- 제123항 또는 제124항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커; 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
- 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제126항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열 및 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열은 바이러스 2A 펩타이드 또는 IRES를 암호화하는 핵산 서열에 의해 분리되는, 조작된 세포.
- 제123항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 같은 방향으로 존재하는, 조작된 세포.
- 제123항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 반대 방향으로 존재하는, 조작된 세포.
- 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 랜딩 패드는
(a) 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 카세트;
(b) 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트;
(c) 인테그라제의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터의 핵산 서열을 포함하며, 상기 제3 프로모터는, 상기 (b)의 전사 활성화 인자가 소분자 유도 인자의 존재 하에서 발현될 때, 상기 전사 활성화 인자에 의해 결합되는 화학적으로 유도가능한 프로모터인 제3 발현 카세트
를 포함하고;
상기 제3 발현 카세트는 상기 제1 발현 세트, 제2 발현 카세트 또는 이들 모두에 대해 3'에 존재하고;
상기 랜딩 패드는
(d) 제1 재조합; 및
(e) 제2 재조합 부위
를 더 포함하고;
상기 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 상기 랜딩 패드 마커를 암호화하는 핵산 서열; 전사 활성화 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 제3 발현 카세트의 삭제를 초래하는, 조작된 세포. - 제130항에 있어서, 상기 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 또한 상기 제1 프로모터의 삭제를 초래하며, 선택적으로는 카세트 교환은 또한 상기 제2 프로모터의 삭제를 초래하는, 조작된 세포.
- 제130항에 있어서, 상기 제1 및 제2 재조합 부위에서의 카세트 교환은 또한 상기 제2 프로모터의 삭제를 초래하며, 선택적으로는 카세트 교환은 또한 상기 제1 프로모터의 삭제를 초래하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 상기 발현 카세트에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 발현 카세트는 상기 제2 발현 카세트에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 발현 카세트는 상기 제1 발현 카세트에 대해 5'에 존재하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 항생제 저항성 단백질; 형광 단백질; 상대-선택 마커 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
- 제136항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 바이러스 2A 펩타이드; IRES; 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 발현 카세트는 상기 전사 활성화 인자의 핵산 서열 및 상대-선택 마커의 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제138항에 있어서, 상기 폴리시스트론 mRNA는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, IRES를 암호화하는 핵산 서열 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 존재하는, 조작된 세포.
- 제130항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 같은 방향으로 존재하지 않는, 조작된 세포.
- 제141항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트는 교대 방향으로 존재하는, 조작된 세포.
- 제97항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 조작된 세포.
- 제97항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 조작된 세포.
- 제97항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상기 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화되는, 조작된 세포.
- 제97항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 HEK293 세포, HeLa S3 세포, T-세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 자연 살해(NK) 세포 또는 인간 배아 줄기 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제146항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어지는 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된, 조작된 세포.
- 제97항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제148항에 있어서, 상기 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합된, 조작된 세포.
- 키트로서,
(a) 제97항 내지 제149항 중 어느 한 항의 조작된 세포; 및
(b) 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자
를 포함하는, 키트. - 제150항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 키트.
- 제151항에 있어서, 상기 세린 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70, 72, 75 및 76 중 어느 하나를 포함하는, 키트.
- 제150항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 키트.
- 제150항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상기 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화되는, 키트.
- 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제I1항 내지 제I51항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계; 및
(b) 상기 인테그라제를 발현시켜, 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 제155항에 있어서, 상기 인테그라제는 세린 인테그라제인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제156항에 있어서, 상기 세린 인테그라제는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70, 72, 75 및 76 중 어느 하나를 포함하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제155항에 있어서, 상기 인테그라제는 티로신 인테그라제인, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제155항에 있어서, 상기 랜딩 패드 마커는 5'에서 3'으로 (i) 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 항생제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (iii) 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) 상기 상대-선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리시스트론 mRNA 상에 암호화되는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
- 제1 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하는 조작된 세포로서, 상기 제1 랜딩 패드는 서열번호 79 내지 148 중 어느 하나의 것과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하며, 상기 제2 재조합 부위는 상기 제1 재조합 부위와 직교하는, 조작된 세포.
- 제160항에 있어서, 상기 제2 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 것과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 조작된 세포.
- 제160항 또는 제161항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 공유하는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 재조합 부위의 핵산 서열 및 제2 재조합 부위의 핵산 서열은 서로 다른, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 같은 인테그라제에 의해 인식되는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위는 서로 다른 인테그라제에 의해 인식되는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 랜딩 패드의 염색체 통합을 포함하며, 상기 제2 랜딩 패드는 (i) 제3 재조합 부위의 핵산 서열; 및 (ii) 제4 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제166항에 있어서, 상기 제1 재조합 부위, 제2 재조합 부위, 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위는 모두 서로에 대하여 직교하는, 조작된 세포.
- 제166항 또는 제167항에 있어서, 상기 제3 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산을 포함하는, 조작된 세포.
- 제166항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 재조합 부위는 서열번호 79 내지 159, 166 및 167 중 어느 하나의 핵산을 포함하는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 랜딩 패드는 제1 발현 카세트를 포함하거나, 상기 제2 랜딩 패드는 제2 발현 카세트를 포함하거나, 이들의 조합인, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 HEK293 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제171항에 있어서, 상기 조작된 세포는 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하며, 상기 제1 랜딩 패드 및/또는 제2 랜딩 패드는 AAVS1, ROSA26, CCR5 및 LiPS-A3S로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합되고, 상기 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩은 같은 자리에 통합되지 않는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 CHO 세포에서 유래된, 조작된 세포.
- 제173항에 있어서, 조작된 세포는 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하며, 상기 제1 랜딩 패드 및/또는 제2 랜딩 패드는 ROSA26, COSMIC 및 H11로 이루어진 군으로부터 선택된 안전 항만 자리에 통합되고, 상기 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩은 같은 자리에 통합되지 않는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위, 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위 또는 이들의 조합에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제175항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위에 결합하는, 조작된 세포.
- 제175항 또는 제176항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 서열번호 48, 39 내지 47 및 49 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 39 내지 47 및 49 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 서열번호 48, 39 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 48, 40 내지 43, 45 내지 47, 49 내지 54, 56, 59 내지 61, 64, 65, 67, 68, 70 및 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 핵 위치 신호(NLS)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포.
- 제179항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 77 내지 78 및 168 내지 174 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는, 조작된 세포.
- 제179항 또는 제180항에 있어서, 상기 제1 인테그라제는 GS 링커를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 및 상기 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 조작된 세포.
- 키트로서,
(a) 제160항 내지 제182항 중 어느 한 항의 조작된 세포; 및
(b) 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는, 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 다중 클로닝 부위; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는, 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는 공여체 분자
를 포함하는, 키트. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제175항 내지 제181항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 제1 관심 핵산 서열; 및 (ii) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 제1 인테그라제를 발현시켜, 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드로 상기 제1 공여체 분자의 상기 제1 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제182항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 제1 관심 핵산 서열; 및 (ii) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 제1 인테그라제 및 제2 인테그라제를 발현시켜, 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드로 상기 제1 공여체 분자의 상기 제1 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(b)는 (a)의 이전에, (a)와 동시에 또는 (a)의 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계로서, 상기 인테그라제 분자는 (i) 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위에 결합하는 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 또는 (ii) 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위에 결합하는 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 인테그라제 분자를 도입하는 단계;
이에 따라 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) 상기 조작된 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계로서, (i) 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열; 및 (ii) 상기 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위 및 상기 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열을 집합적으로 포함하는, 조작된 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
이에 따라 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법. - 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법으로서,
(a) 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항의 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계로서, 상기 공여체 분자는 5'에서 3'으로 (i) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위에 해당하는 제1 재조합 부위의 핵산 서열; (ii) 관심 핵산 서열; 및 (iii) 상기 조작된 세포의 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위에 해당하는 제2 재조합 부위의 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포에 공여체 분자를 도입하는 단계;
(b) (i) 상기 제1 랜딩 패드의 제1 재조합 부위 및 상기 공여체 분자의 제1 재조합 부위에 결합하는 제1 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 또는 (ii) 상기 제1 랜딩 패드의 제2 재조합 부위 및 상기 공여체 분자의 제2 재조합 부위에 결합하는 제2 인테그라제의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 도입하는 단계;
이에 따라 상기 조작된 세포의 랜딩 패드로 상기 공여체 분자의 관심 핵산 서열의 통합을 유도하는 단계
를 포함하고;
(a)는 (b) 이전에, (b)와 동시에 또는 (b) 이후에 발생하는, 세포 게놈으로의 관심 핵산 서열의 통합 방법.
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