CN117517667A - 一种通过免疫共沉淀检测抗补体活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗补体活性检测技术领域，具体涉及一种通过免疫共沉淀检测抗补体活性的方法，包括如下步骤：将免疫捕获剂与人免疫球蛋白样品共同孵育，使免疫捕获剂与目标蛋白质抗补体蛋白结合，再通过离心、洗涤去除免疫捕获剂未结合的非特异性蛋白物质，得到抗补体蛋白，依据抗补体蛋白及人免疫球蛋白样品含氮量计算人免疫球蛋白样品的抗补体活性；其中，免疫捕获剂为包被豚鼠补体的琼脂糖珠。本发明利用人免疫球蛋白抗补体活性与抗补体蛋白质含量的相关性，选择适当的抗体作为免疫捕获剂替代绵羊红细胞使用，规避了绵羊红细胞的不稳定性，可对人免疫球蛋白的抗补体活性进行客观准确和稳定的检测，具备影响因素少，重复性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及抗补体活性检测技术领域，具体涉及一种通过免疫共沉淀检测抗补体活性的方法。
背景技术
补体在人体内的免疫系统中起到了重要的作用，过度的补体激活会导致人体自身正常组织的炎症和损伤，如急性肺损伤、类风湿关节炎等，所以人免疫球蛋白抗补体活性检测是其产品质量一项重要的安全指标。
人免疫球蛋白抗补体活性检测试验中，绵羊红细胞作为关键试剂，具有易被污染且不稳定的缺点，红细胞沉积面及上清液中有肉眼可见的白斑或絮状物，红细胞表面带有微生物的某些抗原成分，产生的抗原对抗补体活性的检测产生影响：人免疫球蛋白含有多种多克隆抗体，这些抗体可能与表面抗原发生结合形成抗原-抗体复合物，从而在补体数量不变的前提下增强了补体活性，而被激活的补体可溶解敏化的绵羊红细胞，同时在补体的激活过程中会产生一些裂解片段，进而通过反馈性放大机制继续放大补体的活化程度，使样品组溶血现象比加入相同数量补体的对照组更明显，剩余补体活性值（B）显著增大。而补体对照组没有检测样品，则不受影响，补体对照组的剩余补体活性值（A）不变，形成了A<B，即A-B为负值的情况会出现。
如上所述，人免疫球蛋白与抗原成分形成抗原-抗体复合物，会导致绵羊红细胞的功能发生紊乱，细胞膜通透性增加，溶血现象更加明显。绵羊红细胞的质量对测定结果会造成巨大影响，使检测试验结果不能真实反映人免疫球蛋白的抗补体活性。
发明内容
针对使用绵羊红细胞检测人免疫球蛋白抗补体活性时，检测试验结果不能真实反映人免疫球蛋白的抗补体活性的技术问题，本发明提供一种通过免疫共沉淀检测抗补体活性的方法，利用人免疫球蛋白抗补体活性与抗补体蛋白质含量的相关性，选择适当的抗体（豚鼠补体）作为免疫捕获剂替代绵羊红细胞使用，规避了绵羊红细胞的不稳定性，可对人免疫球蛋白的抗补体活性进行客观准确和稳定的检测，具备影响因素少，重复性好的特点。
本发明技术方案如下：
一种通过免疫共沉淀检测抗补体活性的方法，将免疫捕获剂与人免疫球蛋白样品共同孵育，使免疫捕获剂与目标蛋白质抗补体蛋白结合，再通过离心、洗涤去除免疫捕获剂未结合的非特异性蛋白物质，得到抗补体蛋白，依据抗补体蛋白及人免疫球蛋白样品含氮量计算人免疫球蛋白样品的抗补体活性；
其中，免疫捕获剂为包被豚鼠补体的琼脂糖珠。
进一步的，抗补体活性检测方法具体为：
（1）封闭：将包被豚鼠补体的琼脂糖珠置于离心管中，在室温下孵育，加入补体包被缓冲液在30~40℃下封闭0.5~5h；
（2）孵育：用稀释液稀释人免疫球蛋白样品后加入步骤（1）体系中，在30~40℃下孵育0.5~5h；
（3）终止、离心与洗涤：冰浴终止反应，离心取管底琼脂糖珠，并用洗涤液洗涤；
（4）裂解：将裂解液与琼脂糖珠混合，收集上清液；
（5）氮含量检测：分别检测上清液的氮含量P1与人免疫球蛋白样品的氮含量P2，按照如下公式计算抗补体活性：
抗补体活性（%）=P1/P2×100%。
进一步的，补体包被缓冲液按照如下方法配制：
称取0.12g碳酸钠、0.12g碳酸氢钠和0.5g牛血清白蛋白，溶于100mL纯化水中。
进一步的，稀释液按照如下方法配制：
称取氯化钠8.01g、磷酸氢钾0.22g、磷酸氢二钠2.89g，溶于1000mL纯化水中，调整pH值至7.4。
进一步的，洗涤液按照如下方法配制：
将1.5mL Tween-20加入1000mL稀释液中，混匀。
进一步的，裂解液按照如下方法配制：
将稀释液作为溶剂，配制1% Triton X-100缓冲液，即得。
进一步的，步骤（3）中的离心条件为2~8℃下500~1000g离心1~5min。
进一步的，步骤（5）采用凯氏定氮法测定步骤（4）上清液的氮含量与供试品的氮含量。
进一步的，抗补体蛋白包括但不限于多聚体形式的IgG分子。IgG分子的多聚体形式可能会增加它们与补体成分结合的亲和力，从而更有效地影响补体系统的激活。
本发明的有益效果在于：
本发明在不使用绵羊红细胞的情况下，建立了一种影响因素少、重复性好、客观准确、稳定的人免疫球蛋白抗补体活性检测方法。选择适当的抗体（豚鼠补体）将其结合到固相支持物上（琼脂糖珠），作为免疫捕获剂，将免疫捕获剂与人免疫球蛋白共同孵育，使其与目标蛋白质（抗补体蛋白）结合，再通过离心、洗涤去除琼脂糖珠未结合的非特异性蛋白物质，最终通过裂解得到抗补体蛋白，检测抗补体蛋白与样品的含氮量，进而计算抗补体活性。本发明方法具有高度特异性、高灵敏度、简便易行、高通量等优点，可以结合到目标分子表面，形成一个免疫复合物，免疫复合物可以被进一步处理。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中免疫共沉淀反应过程的示意图。
图2为本发明实施例1中洗涤分离非特异性蛋白的示意图。
图3为本发明实施例1中抗补体蛋白与免疫捕获剂分离示意图。
图中，1-免疫捕获剂，2-非特异性蛋白A，3-非特异性蛋白B，4-非特异性蛋白C，5-抗补体蛋白。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
具体实施方式中使用的试剂配制方法或组分如下：
①补体包被缓冲液配制方法：
称取0.12g碳酸钠、0.12g碳酸氢钠和0.5g牛血清白蛋白，溶于100mL纯化水中。
②稀释液配制方法：
称取氯化钠8.01g、磷酸氢钾0.22g、磷酸氢二钠2.89g，溶于1000mL纯化水中，调整pH值至7.4。
③洗涤液配制方法：
将1.5mL Tween-20加入1000mL稀释液中，混匀。
④裂解液配制方法：
将稀释液作为溶剂，配制1% Triton X-100缓冲液，即得。
⑤包被豚鼠补体的琼脂糖珠配制方法：
收集豚鼠血清，确保在低温下工作，以防止蛋白质降解；通过离心将细胞碎片沉淀，然后将上清液收集到新的离心管中；用稀释液洗涤琼脂糖珠，之后添加稀释液使琼脂糖珠悬浮，将悬浮的琼脂糖珠与豚鼠血清混合，放置2h，使补体与琼脂糖珠结合，豚鼠血清与琼脂糖珠质量比为1：10。
实施例1
对人免疫球蛋白样品中抗补体活性进行检测，具体步骤如下：
（1）封闭：将包被豚鼠补体的琼脂糖珠置于离心管中，加入补体包被缓冲液，在37℃水浴条件下封闭2h；
（2）孵育：取5mL人免疫球蛋白样品平衡至室温，用稀释液稀释样品后加入步骤（1）体系中，在37℃下孵育1.5h；
（3）终止、离心与洗涤：冰浴5min以终止反应，在2~8℃条件下700g离心3min，将琼脂糖珠离心至管底，小心吸去上清液，用洗涤液洗涤琼脂糖珠3次；
（4）量取裂解液3mL，加入步骤（3）装有琼脂糖珠的容器中，混匀30min后收集上清液；
（5）采用凯氏定氮法，分别测定步骤（4）上清液的氮含量P1与5mL人免疫球蛋白样品的氮含量P2，并计算抗补体活性。计算公式如下：
抗补体活性（%）=P1/P2×100%。
验证例1 方法学验证
（一）专属性确认
将牛血清白蛋白加入稀释液中，配制含5%牛血清白蛋白的稀释液。分别使用两种稀释液（稀释液与含有5%牛血清白蛋白的稀释液）分别稀释三份同批次人免疫球蛋白供试品，并使用实施例1抗补体活性检测方法进行检测。抗补体活性检测结果如下：
使用常规稀释液稀释处理的样品抗补体活性检测结果为8%、9%、9%。含有5%牛血清白蛋白的稀释液稀释处理的样品抗补体活性检测结果为7%、9%、8%。经t检验，两者检测数据P值为0.3739，差异不显著。
（二）耐用性确认
1、使用实施例1抗补体活性检测方法对同批次人免疫球蛋白供试品进行三次检测，封闭时间分别设置为80min、90min、100min，抗补体活性检测结果分别为9%、9%、8%；变异系数为7%。
2、使用实施例1抗补体活性检测方法对同批次人免疫球蛋白供试品进行三次检测，孵育时间分别设置为80min、90min、100min，抗补体活性检测结果分别为8%、8%、9%；变异系数为7%。
（三）重复性确认
使用实施例1抗补体活性检测方法由同一检测人员对同批次人免疫球蛋白供试品进行六次检测，抗补体活性检测结果分别为8%、9%、10%、10%、8%、9%；变异系数为10%。
（四）中间精密度确认
使用实施例1抗补体活性检测方法由两名检测人员于不同时间分别对同批次人免疫球蛋白供试品进行六次检测，抗补体活性检测结果如下：
检测人员A于不同时间进行六次检测结果为8%、9%、7%、7%、8%、9%，变异系数为12%。检测人员B于不同时间进行六次检测结果为10%、9%、8%、7%、8%、8%，变异系数为13%。经t检验，两者检测数据P值为0.5634，差异不显著。
试验结果表明，本发明方法在专属性、耐用性与精确度方面具备优势。
比较例1
分别使用实施例1抗补体活性检测方法和经典方法对同一批人免疫球蛋白在绵羊红细胞离体7天、14天、21天和30天后进行抗补体活性检测。经典方法按照《中国药典》2020年版三部通则3410中提供的抗补体活性检测方法进行。抗补体活性检测结果如下：
本发明方法在四个时间节点的检测结果分别为10%、10%、9%、9%，变异系数为7%。经典方法在四个时间节点的检测结果分别为15%、10%、9%、6%，变异系数为38%。
试验结果表明，本发明方法相较于经典抗补体活性检测方法更为稳定。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种通过免疫共沉淀检测抗补体活性的方法，其特征在于，将免疫捕获剂与人免疫球蛋白样品共同孵育，使免疫捕获剂与目标蛋白质抗补体蛋白结合，再通过离心、洗涤去除免疫捕获剂未结合的非特异性蛋白物质，得到抗补体蛋白，依据抗补体蛋白及人免疫球蛋白样品含氮量计算人免疫球蛋白样品的抗补体活性；
其中，免疫捕获剂为包被豚鼠补体的琼脂糖珠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抗补体活性检测方法具体为：
（1）封闭：将包被豚鼠补体的琼脂糖珠置于离心管中，在室温下孵育，加入补体包被缓冲液在30~40℃下封闭0.5~5h；
（2）孵育：用稀释液稀释人免疫球蛋白样品后加入步骤（1）体系中，在30~40℃下孵育0.5~5h；
（3）终止、离心与洗涤：冰浴终止反应，离心取管底琼脂糖珠，并用洗涤液洗涤；
（4）裂解：将裂解液与琼脂糖珠混合，收集上清液；
（5）氮含量检测：分别检测上清液的氮含量P1与人免疫球蛋白样品的氮含量P2，按照如下公式计算抗补体活性：
抗补体活性=P1/P2×100%。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，补体包被缓冲液按照如下方法配制：
称取0.12g碳酸钠、0.12g碳酸氢钠和0.5g牛血清白蛋白，溶于100mL纯化水中。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，稀释液按照如下方法配制：
称取氯化钠8.01g、磷酸氢钾0.22g、磷酸氢二钠2.89g，溶于1000mL纯化水中，调整pH值至7.4。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，洗涤液按照如下方法配制：
将1.5mL Tween-20加入1000mL稀释液中，混匀。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，裂解液按照如下方法配制：
将稀释液作为溶剂，配制1% Triton X-100缓冲液，即得。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用稀释液洗涤琼脂糖珠，之后添加稀释液使琼脂糖珠悬浮，将悬浮的琼脂糖珠与豚鼠血清混合，放置2h，使补体与琼脂糖珠结合，豚鼠血清与琼脂糖珠质量比为1：10。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的离心条件为2~8℃下500~1000g离心1~5min。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（5）采用凯氏定氮法测定步骤（4）上清液的氮含量与供试品的氮含量。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抗补体蛋白包括但不限于多聚体形式的IgG分子。
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