CN117512033A - 一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents
一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物催化技术领域，具体公开了一种由葡萄糖同时生产D‑塔格糖和D‑阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：将金属离子、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、聚磷酸盐、葡萄糖‑6‑磷酸异构酶、D‑塔格糖1,6‑二磷酸醛缩酶和6‑磷酸塔格糖磷酸酶加入D‑葡萄糖底物的缓冲溶液中，调节溶液pH值为4‑9，进行四酶级联反应，同时生产D‑塔格糖和D‑阿洛酮糖。该方法是采用多级酶级联反应的催化路径。用该方法制备D‑塔格糖和D‑阿洛酮糖，具有成本低、产率高等优点，适合规模化同时生产D‑塔格糖和D‑阿洛酮糖。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊功能的甜味剂，是果糖的“差向异构体”，甜度是蔗糖的92％，不产生不良风味和后味，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等功能。且经过测试发现，D-塔格糖没有毒性和致癌效应，在食品工业上可以安全使用。
D-阿洛酮糖同样是果糖的“差向异构体”，具有蔗糖甜度的70％,但产生的能量仅有蔗糖的0.3％，是一种安全甜味剂。除此以外，D-阿洛酮糖还具有多种生理功能，如，能够有效用于肥胖症、糖尿病、高血脂等疾病的预防和治疗，同时还具有抗炎、抗氧化、防治神经组织退化和动脉粥样硬化等潜在功能，因此在食品、化妆品、医药等领域都具有巨大的应用价值。
自然界中的D-塔格糖主要存在于热带常青树树胶、苔藓、地衣、热可可、奶酪和酸奶中，含量及其微少。同样D-阿洛酮糖在自然界存量很少，仅有少量的D-阿洛酮糖存在于甘蔗糖蜜、小麦和鼠刺属植物中。从这些物质中直接提取D-塔格糖和D-阿洛酮糖所需原材料用量大，成本非常高，难以实现D-塔格糖和D-阿洛酮糖的大规模工业化生产。
D-塔格糖的生产目前大多为单酶法进行生物合成，L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase,L-AI)是目前生物合成D-塔格糖研究最多的一种酶，可以催化D-半乳糖为D-塔格糖。虽然转化率较高，最高可达79.7％，但D-半乳糖的成本较高，不适用工业化生产。
D-阿洛酮糖的生产同样为单酶法，以果糖为底物，通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶反应生成D-阿洛酮糖，虽然此反应底物价格便宜，但是果糖(即底物)和阿洛酮糖(即产物)之间存在一定水平的反应平衡(产物/底物＝约20％至35％)。因此，在使用单一酶反应生产高纯度的阿洛酮糖的情况下，需要从反应生成物中分离和移除高浓度果糖的附加纯化过程。
所以，D-塔格糖和D-阿洛酮糖的生产方法存在的较高的原料成本、昂贵的产物和副产物分离成本以及相对较低的产物收率而限制了其应用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法。该方法是采用多级酶级联反应的催化路径。用该方法制备D-塔格糖和D-阿洛酮糖，具有成本低、产率高等优点，适合规模化同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
一种由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：将金属离子、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(Polyphosphate glucokinase，PPGK)、聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，PGI)、D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(D-tagatose 1,6-bisphosphate aldolase，GatZ)和磷酸塔格糖磷酸酶(TPP)或6-磷酸塔格糖差向异构酶加入D-葡萄糖底物的缓冲溶液中，调节溶液pH值为4-9，进行四酶级联反应，同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖。
在以上D-塔格糖和D-阿洛酮糖的同时生产方法中，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶用于将D-葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，在该过程中，PPGK以葡萄糖与聚磷酸盐为底物，催化葡萄糖获得一分子磷酸，生成葡萄糖-6-磷酸，其中底物聚磷酸盐中的磷酸二酯键的能量相当于ATP，可以直接或间接被利用，无需再额外添加ATP帮助磷酸基团的转移，节省成本，适合工业化生产；
葡萄糖-6-磷酸异构酶用于将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；
D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶或6-磷酸塔格糖差向异构酶用于将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸和阿洛酮糖-6-磷酸，在实验过程中，发明人发现GatZ的底物特异性不专一，GatZ在将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸的同时，会生成阿洛酮糖-6-磷酸，利用GatZ的这一反应特性，开发一种同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的生产工艺。
磷酸塔格糖磷酸酶用于将塔格糖-6-磷酸或阿洛酮糖-6-磷酸的磷酸基团发生脱磷酸反应，转化为D-塔格糖和D-阿洛酮糖。
金属离子的加入可以促进反应的进行。
聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(Polyphosphate glucokinase，PPGK)，可以来源于Corynebacterium diphtheria，Propionibacterium shermanii，Mycococcuscoralloudes，Microlunatus phosphovorus，Arthrobacter sp，Thermobifida fusca；优选地，所述聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(PPGK)来源于Thermobifida fusca。
葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,PGI)，可以来源于Thermus thermophilus，Clostridium thermocellum，Escherichia coli，优选地，所述葡萄糖-6-磷酸异构酶(PGI)来源于Thermus thermophilus。
D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(D-tagatose 1,6-bisphosphate aldolase，GatZ)可以来源于Caldilinea sp.,Anaerolineae bacterium，Chloroflexota bacterium，优选地，所述D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(GatZ)来源于Caldilinea sp。
6-磷酸塔格糖磷酸酶(TPP)，可以来源于Archaeoglobus fμlgidus，Escherichiacoli，Sphaerobacter thermophilus，Actinomycetota bacterium，优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于Actinomycetota bacterium。
在一些实施例中，反应体系中，金属离子选自Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+或Cu2+。
优选的，所述金属离子为Mg2+。
金属离子的作用分别为：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；作为酶的活性中心的组成成分，参与构成酶的活性中心；作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来。
以T6PP为例基于TPP的晶体结构使用塔格糖作为潜在底物进行分子对接。从晶体结构分析，HAD家族磷酸酶保守区域，根据其催化机理，底物与金属Mg2+络合，有利于提高蛋白活性。
优选的，金属离子的浓度为1-50mM。
进一步优选的，金属离子的浓度为10-30mM。
在一些实施例中，反应体系中，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.2％-1％，％为质量百分数。
在一些实施例中，反应体系中，葡萄糖-6-磷酸异构酶的浓度为1％-5％，％为质量百分数。
在一些实施例中，反应体系中，D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶的浓度为1％-5％，％为质量百分数。
在一些实施例中，反应体系中，6-磷酸塔格糖磷酸酶的浓度为1％-5％，％为质量百分数。
优选的，反应体系中，葡萄糖-6-磷酸异构酶的浓度为1％-2％，6-磷酸塔格糖磷酸酶的浓度为1％-2％，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.4％-0.75％，D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶的浓度为4％-5％。
在一些实施例中，溶液的pH值为7-9。
在一些实施例中，四酶级联反应的温度为40-80℃，优选为60-80℃。
在一些实施例中，D-葡萄糖底物的浓度为50-300g/L，优选为100-200g/L。
在一些实施例中，所述聚磷酸盐为三聚磷酸盐或六偏磷酸盐。
优选的，所述六偏磷酸盐的浓度为0.01-0.5M，优选为0.05-0.3M。过高的底物浓度会抑制反应的进行。
在一些实施例中，反应体系的缓冲液为HEPPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。
优选的，所述缓冲液为HEPPS缓冲液，因为其有高的缓冲范围，且适合用于磷酸化反应，所述缓冲液浓度范围为0.02-0.5M，优选地，浓度范围为0.05-0.2M。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
本发明利用多酶催化体系，使用一锅法由D-葡萄糖同时制备D-塔格糖和D-阿洛酮糖，具有成本低、产率高等优点，适合规模化生产的优点。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明的技术路线图，PPGK：聚磷酸依赖型葡萄糖激酶；PGI：葡萄糖-6-磷酸异构酶；GatZ：D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶；TPP：6-磷酸塔格糖磷酸酶；
图2是本D-葡萄糖反应生成D-塔格糖和D-阿洛酮糖的高效液相图(HPLC)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例中涉及的菌株及表达载体：大肠杆菌菌株BL21-Trxb(DE3)，pET32a表达质粒，以下实施例中用到的酶，均由以上菌株和载体表达。
以下实施例中涉及的培养基：LB液体培养基，其组成为：酵母粉5.0g·L-1、蛋白胨10.0g·L-1和NaCl 10.0g·L-1。
以下实施例中涉及的检测方法如下：高效液相色谱(HPLC)检测：Ca2+色谱柱；流动相为纯水，流动相流速为0.5mL/min；色谱柱温度为80℃；检测器为示差折光检测器。
实施例1
重组菌株的构建
将由金唯智公司合成的质粒pET32a-PPGK(UniProtKB/Swiss-Prot:Q47NX5)，pET32a-PGI(NCBI Reference Sequence:WP_011227825.1)，pET32a-GatZ(NCBI ReferenceSequence:WP_287482843.1)，pET32a-TPP(GenBank:NLE75028.1)，分别转化至大肠杆菌BL21-Trxb(DE3)感受态细胞中，转化产物涂布于氨苄抗性的LB固体培养基平板上，于37℃过夜培养(约16h)。在LB固体培养基上挑取转化子即获得含有重组质粒的重组大肠杆菌BL21-Trxb(DE3)/pET32a-PPGK、BL21-Trxb(DE3)/pET32a-PGI，BL21-Trxb(DE3)/pET32a-GatZ，BL21-Trxb(DE3)/pET32a-TPP。
实施例2酶的制备
从平板中挑取重组大肠杆菌BL21-Trxb(DE3)/pET32a-PPGK、BL21-Trxb(DE3)/pET32a-PGI，BL21-Trxb(DE3)/pET32a-GatZ，BL21-Trxb(DE3)/pET32a-TPP单克隆，接种(将枪头直接打入试管)至含5mL带抗性的LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm培养过夜(约16h)。
取5mL过夜培养的种子菌液，转接至含500ml带抗性的LB液体培养基的摇瓶中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.4-0.6左右(约3h)，向试管中加5μL 1M的IPTG溶液，使IPTG终浓度达到0.1mM，25℃，180rpm过夜诱导。
将过夜培养的菌体，用离心机离心，收集菌体，按照0.1g菌体用1mL的反应缓冲液的比例称取菌泥并重悬，用超声破碎仪器将菌悬液破碎，超声3s，暂停2s，时间3min(时间可根据超声体积的大小进行调整)，将超声体系离心后，得到的上清即为重组菌株的粗酶液。
实施例3六偏磷酸钠的浓度优化
实施例中涉及的反应体系为D-葡萄糖终浓度为100g/L，Mg2+的终浓度为20mM，六偏磷酸钠的终浓度分别为20/30/40/50/60/100/200/300/400mM，PPGK，PGI，GatZ，TPP为上述实施例2中所制备得到的粗酶液，分别加入100μl，加入HEPPS 7.0缓冲液将反应体系补至1ml。
将上述实施例中所述的反应体系，放置于70℃的恒温反应器中进行反应，转速设置为200rpm，反应18h后，取样，进行HPLC检测，结果见表1，结果发现D-塔格糖和D-阿洛酮糖的生成随着六偏磷酸钠浓度的增大而减小，底物对反应有抑制。
表1六偏磷酸钠的不同浓度对应的反应结果
实施例4Mg2+浓度的优化
实施例中涉及的反应体系为D-葡萄糖终浓度为100g/L，Mg2+的终浓度为1/5/10/20/30mM，六偏磷酸钠的终浓度分别为20mM，PPGK，PGI，GatZ，TPP为上述实施例2中所制备得到的粗酶液，分别加入100μl，加入HEPPS 7.0缓冲液将反应体系补至1ml。
将上述实施例中所述的反应体系，放置于70℃的恒温反应器中进行反应，转速设置为200rpm，反应18h后，取样，进行HPLC检测，结果见表2。
表2Mg2+的不同浓度对应的反应结果
实施例5确定反应过程的限速酶
实施例中涉及的反应体系为D-葡萄糖终浓度为100g/L，Mg2+的终浓度为20mM，六偏磷酸钠的终浓度分别为20mM，PPGK，PGI，GatZ，TPP为上述实施例2中所制备得到的粗酶液，分别加入100μl，选择其中的某一种酶多加入200μl，加入HEPPS 7.0缓冲液将反应体系补至1ml。
将上述实施例中所述的反应体系，放置于70℃的恒温反应器中进行反应，转速设置为200rpm，反应18h后，取样，进行HPLC检测，结果见表3，发现GatZ酶量增多时，D-塔格糖与D-阿洛酮糖的生成率增加。
表3不同加酶量对应的反应结果
实施例6反应pH的优化
在本反应过程中发现六偏磷酸钠呈酸性，加入量越多，对反应的pH影响越大，反应体系加酶前，先调整pH。
实施例中涉及的反应体系为D-葡萄糖终浓度为100g/L，Mg2+的终浓度为20mM，六偏磷酸钠的终浓度分别为100mM，PPGK，PGI，GatZ，TPP为上述实施例2中所制备得到的粗酶液，分别加入100μl，将上述反应体系调整pH至6.5/7.0/7.5/8.0/8.5，加入HEPPS缓冲液将反应体系补至1ml。
将上述实施例中所述的反应体系，放置于70℃的恒温反应器中进行反应，转速设置为200rpm，反应18h后，取样，进行HPLC检测，结果见表4，结果发现pH越高反应产物越多。
表4不同pH值对应的反应结果
实施例7
在本反应过程中发现，反应过程中pH会随着反应的进行下降，且反应的pH对酶活影响很大，分析原因，认为是六偏磷酸钠的水溶液呈酸性，即使在反应开始前调pH至7.5，在以下反应过程中六偏磷酸钠与葡萄糖反应会脱磷酸根，因此整个的反应体系的pH会降低至6以下，初步怀疑是GatZ酶活受PH的影响较大。
反应式如下：
(phosphate)n+D-glucose＝(phosphate)n-1+D-glucose 6-phosphate；
根据反应式计算，100mM的六偏磷酸钠不能使0.1g的葡萄糖完全转化为6-磷酸葡萄糖，如果提高塔格糖的转化率需要提高六偏磷酸钠的量，提高六偏磷酸钠的同时，pH的影响就会增大，所以要优化反应体系中酶的比例。
PPGK反应酶量低使葡萄糖反应太慢，酶量高使PH的变化太快，影响对GatZ产生的影响较快，需要优化PPGK的酶量。
实施例中涉及的反应体系为D-葡萄糖终浓度为100g/L，Mg2+的终浓度为20mM，六偏磷酸钠的终浓度分别为100mM，PGI，GatZ，TPP为上述实施例2中所制备得到的粗酶液，分别加入100μl，PPGK分别加入10/25/50/75/100μl，将上述反应体系调整pH至7.5，加入HEPPS缓冲液将反应体系补至1ml。
将上述实施例中所述的反应体系，放置于70℃的恒温反应器中进行反应，转速设置为200rpm，反应18h后，取样，进行HPLC检测，结果见表5，根据下表所示PPGK的酶量在35μl-75μl之间较为合适。
表5
实施例中涉及的反应体系为D-葡萄糖终浓度为100g/L，Mg2+的终浓度为20mM，六偏磷酸钠的终浓度分别为100mM，PPGK，PGI，GatZ，TPP为上述实施例2中所制备得到的粗酶液，分别按照下表加入，将上述反应体系调整pH至7.5，加入HEPPS缓冲液将反应体系补至1ml。
将上述实施例中所述的反应体系，放置于70℃的恒温反应器中进行反应，转速设置为200rpm，反应18h后，取样，进行HPLC检测，反应结果见表6，PPGK 50μl，GatZ 450μl反应生成的D-塔格糖和D-阿洛酮糖的产量最高。
表6不同反应体系的反应结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：将金属离子、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸异构酶、D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶或6-磷酸塔格糖差向异构酶加入D-葡萄糖底物的缓冲溶液中，调节溶液pH值为4-9，进行四酶级联反应，同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖。
2.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，金属离子选自Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+或Cu2+，金属离子的浓度为1-50mM。
3.根据权利要求2所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述金属离子为Mg2+。
4.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.2％-1％，％为质量百分数；
或，葡萄糖-6-磷酸异构酶的浓度为1％-5％，％为质量百分数；
或，反应体系中，D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶的浓度为1％-5％，％为质量百分数；
或，反应体系中，6-磷酸塔格糖磷酸酶的浓度为1％-5％，％为质量百分数。
5.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，葡萄糖-6-磷酸异构酶的浓度为1％-2％，6-磷酸塔格糖磷酸酶的浓度为1％-2％，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.4％-0.75％，D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶的浓度为4％-5％。
6.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：溶液的pH值为7-9。
7.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：四酶级联反应的温度为40-80℃。
8.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：D-葡萄糖底物的浓度为50-300g/L。
9.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述聚磷酸盐为三聚磷酸盐或六偏磷酸盐，所述六偏磷酸盐的浓度为0.01-0.5M。
10.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系的缓冲液为HEPPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117512033B (zh) | 2024-04-19 |
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