CN117491524A

CN117491524A - 一种谷物细胞松弛素e的检测方法

Info

Publication number: CN117491524A
Application number: CN202311458790.3A
Authority: CN
Inventors: 黄紫燕; 杨智; 彭日旺; 韩永红; 陈文超; 刘淑霞
Original assignee: Yuehai Yongshuntai Guangzhou Co ltd
Current assignee: Yuehai Yongshuntai Guangzhou Co ltd
Priority date: 2023-11-03
Filing date: 2023-11-03
Publication date: 2024-02-02

Abstract

本发明公开了一种谷物细胞松弛素E的检测方法，包括以下步骤：S1：将待测谷物样品进行前处理：依次将待测谷物样品进行磨粉、提取、净化洗脱或浓缩处理；提取时所用的提取液为甲醇或乙醇的水溶液；S2：采用液相色谱串联质谱检测，将待测谷物样品峰面积与标准品峰面积进行比较，计算待测谷物细胞松弛素E含量。相比于现有技术，本发明的检测方法通过前处理步骤有效提高了提取率，降低基质干扰，且操作步骤简单。且该检测方法对细胞松弛素E具有较广的检测范围(0.2～100μg/L)，测定回收率为85～95％，灵敏度和准确性高，实用性强。

Description

一种谷物细胞松弛素E的检测方法

技术领域

本发明涉及啤酒酿造技术领域，尤其涉及一种谷物细胞松弛素E的检测方法。

背景技术

细胞松弛素是一类提取自真菌，由氨基酸与聚酮缩合而成的天然产物。该家族天然产物数量庞大，目前已发现的该家族天然产物已超过300多种，具有丰富的结构和生物活性多样性，吸引了众多生物学家以及化学家的研究兴趣。其除了可作为生物学实验的工具分子外，还具有广泛的生物学活性，如：抗肿瘤、抗菌、抗寄生虫以及抗病毒等活性，是潜在的药物先导化合物。

细胞松弛素E是庞大的细胞松弛素家族的一员，其为来自真菌棒曲霉的次级代谢产物，同样具有很强的抗血管生成和细胞毒活性。但有研究表明，在啤酒大麦制麦过程，较高制麦温度下，大麦中存在的棒曲霉快速生长，产生较高浓度的细胞松弛素E，而一定浓度的细胞松弛素E有毒，可能会影响酿酒酵母的生长。随着生活水平的提高，人们对高端啤酒的需求逐渐提高，因此为了提高啤酒的品质，高端啤酒制造商开始关注啤酒麦芽中细胞松弛素E的含量。

目前，细胞松弛素E的检测方法为酶联免疫双抗夹心法，该方法具检测速度快、方法灵敏度高、特异性强等优点。但该方法需要尽可能保留住样本的酶活，对样本处理、保存要求较高，存在以下问题：①为保持样本的等渗环境，提取溶剂为缓冲盐溶剂，该溶剂对细胞松弛素E的提取率有较大提升空间；②由于蛋白、淀粉等基质干扰，需要有较高稀释倍数(＞100倍)，导致样品定量限较高(＞2ppb)，不能满足谷物等细胞松弛素E含量低的样品检测要求；③该方法对样本一致性要求高，样本因浓度较高或较低、需要稀释或浓缩时，检测结果不呈比例关系，一定程度影响结果准确性；④由于双抗夹心法特异性强、结果假阳性率高。该酶联免疫双抗夹心法仅作为定量检测辅助手段，需要建立一种更灵敏、准确的检测方法。

发明内容

基于此，为解决上述问题，本发明提供一种谷物细胞松弛素E的检测方法，其包含样品的前处理和液质联用含量测定两部分。前处理有效去除杂质，步骤简便、环保，可根据样品实际情况进行稀释/浓缩处理，达到较广检测范围。

本发明提供了一种谷物细胞松弛素E的检测方法，包括以下步骤：

S1：将待测谷物样品进行前处理：依次将待测谷物样品进行磨粉、提取、净化洗脱或浓缩处理；提取时所用的提取液为甲醇或乙醇的水溶液；

S2：采用液相色谱串联质谱检测，将待测谷物样品峰面积与标准品峰面积进行比较，计算待测谷物细胞松弛素E含量。

相比于现有技术，本发明提出了一种谷物细胞松弛素E的检测方法，通过前处理有效去除杂质，提取步骤可有效提高细胞松弛素E的提取率，净化步骤可有效减少蛋白质、淀粉等基质的干扰，操作步骤简单，相比现有的检测方法前处理要求大幅降低。前处理后样品通过液相色谱分离后，目标物质细胞松弛素E被离子化，且离子碎片被按质量分开，实现对复杂样品的高分离、高分辨能力。本发明的谷物细胞松弛素E的检测方法对细胞松弛素E具有较广的检测范围(0.2～100μg/L)，测定回收率为85～105％，准确性高，实用性强。

优选的，步骤S1中，所述待测谷物样品与所述提取液的质量体积比为1g:(5～20)mL，确保较佳的提取效果。更为优选的，所述待测谷物样品与所述提取液的质量体积比为1g:10mL，该比例提取效果最佳。

进一步地，步骤S1包括以下步骤：

S11：磨粉：将待测谷物样品磨粉后过筛；

S12：提取：用提取液提取1～3h后，6000rpm离心5min；

S13：净化洗脱或浓缩：若待测谷物样品基质干扰较大，则取上清液加入水或PBS缓冲液混匀后，过C18-SPE柱净化，然后用乙腈洗脱；若待测谷物样品基质干扰小，则无需过柱净化，取上清液用氮气吹至近干，加入乙腈或甲醇复溶即可得到浓缩液；

S14：将洗脱液或浓缩液经0.22μm尼龙微孔滤膜过滤后备用。

本发明前处理过程中选用一定比例有机溶剂提取样品中的细胞松弛素E，提取率相比现有的酶联免疫双抗夹心法提高5倍以上；当样品中蛋白质、淀粉等基质较多时，通过C18-SPE柱净化后可有效减少蛋白质、淀粉等基质的干扰，且后续洗脱的同时也是浓缩过程，操作简单，还可以根据样品细胞松弛素E含量的不同，适当调整、选择合适的稀释倍数。

优选地，步骤S2中的液相条件为：色谱柱为UPLC C₁₈色谱柱，或同等性能的色谱柱；流速：0.2～0.4mL/min；柱温：30～40℃；进样量：1～10μL；流动相A：水，或水和有机溶剂的混合溶液；流动相B：乙腈。流动相A可视出峰情况适当加入2mM有机溶剂，如甲酸铵、乙酸铵、甲酸溶液。

表1流动相及洗脱条件

优选地，步骤S2中的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描模式；检测方式：多反应监测MRM检测模式；锥孔电压：3V；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：500℃；脱气流量：1000L/hr；定性离子对：513/416，定量离子对：513/434，碰撞能量：8～12eV，去簇电压：12～16V。

优选地，步骤S13中，净化时上清液与水或PBS缓冲液的体积比为1:(3～5)。

优选地，步骤S1中，所述提取液为浓度为80％的甲醇或乙醇的水溶液。

优选地，所述标准品的色谱图和标准曲线通过以下步骤测得：

将细胞松弛素E标准品用甲醇或乙腈逐级稀释，分别设置浓度为0.2、0.5、1、5、10、50、100μg/L的标准采用液相色谱串联质谱检测进样分析，以细胞松弛素E标准浓度为纵坐标，对应的定量离子对峰面积为横坐标，绘制标准曲线，并求标准曲线的线性回归方程Y＝aX+b。需确保线性相关系数R²≥0.99，否则需重新绘制标准曲线。

相比于现有技术，本发明的检测方法通过前处理步骤有效提高了提取率，降低基质干扰，且操作步骤简单。且该检测方法对细胞松弛素E具有较广的检测范围(0.2～100μg/L)，测定回收率为85～105％，灵敏度和准确性高，实用性强。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

图1是细胞松弛素E标准工作曲线；

图2是实施例1测得的细胞松弛素E的总离子流图；

图3是实施例1测得的细胞松弛素E的定量离子对的色谱图；

图4是实施例1测得的细胞松弛素E的定性离子对的色谱图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包含多数形式，除非上下文清楚地表示其含义。还应当理解，本发明中使用的术语“和/或”是指包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能的组合。

在本发明中，所采用的原料及试剂如表2所示。除特别说明之外，本发明用到的试剂和原料也均为市面上有售，纯度均为分析纯。

表2原料及试剂

细胞松弛素E标准工作曲线测定

首先，采用以下步骤测得细胞松弛素E的标准工作曲线：

S1：将细胞松弛素E标准品用甲醇或乙腈逐级稀释，分别设置浓度为0.2、0.5、1、5、10、50、100μg/L的标准用液相色谱-串联质谱联用仪(美国，沃特世，Acquity UPLC H-CLASSXevo TQ-S Micro)测定样品的标准工作图谱，以色谱峰面积按外标法定量。如表3所示。

表3标准工作液浓度和峰面积

浓度μg/L	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	50.0	100.0
								定量离子对(513/434)峰面积	11	26	47	274	547	2755	5416

液相条件为：

色谱柱为：UPLC C₁₈(50mm×2.1mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；流速：0.3mL/min；流动相A：水(加入2mM甲酸铵)，流动相B：乙腈；洗脱梯度：0～0.5min、2.6～5.0min：90％A，10％B；1.5～2.5min：10％A，90％B。

质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描模式；检测方式：多反应监测MRM检测模式；锥孔电压：3V；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：500℃；脱气流量：1000L/hr；离子对：513/416，513/434，碰撞能量：12eV，去簇电压：16V。

S2：以细胞松弛素E标准浓度为纵坐标，对应的定量离子对(513/434)峰面积为横坐标，绘制标准曲线，求得标准曲线的线性回归方程为：Y＝0.0184X-0.0585。线性相关系数R²＝0.9999，如图1所示。

实施例1

本实施例提供了一种小麦样品中谷物细胞松弛素E的检测方法，包括以下步骤：

S1：前处理：EBC粉碎磨为0.2mm细粉。取1.0g细粉于50mL离心管中，加入20mL甲醇，超声波提取1hr，6000rpm离心5min过滤，收集上清液。取18mL上清液，6000rpm离心5min，取18mL上清液，加入90mL水混匀后，过C18-SPE柱净化，用1mL乙腈全部洗脱，洗脱液经过0.22μm微孔滤膜过滤后，即为待进样分析供试品溶液。

S2：采用美国沃特世，Acquity UPLC H-CLASS Xevo TQ-S Micro液相色谱-串联质谱仪检测待测样品中的细胞松弛素E；

液相条件为：

质谱条件为：

经检测，如图1～3所示，该小麦样品1中细胞松弛素E的含量为6.2μg/kg。

实施例2

本实施例提供了一种大麦样品中谷物细胞松弛素E的检测方法，包括以下步骤：

S1：前处理：EBC粉碎磨为0.2mm细粉。取1.0g细粉于50mL离心管中，加入5mL乙醇，超声波提取3hr，6000rpm离心5min过滤，收集上清液。取3mL上清液加入9mLPBS中混匀后，过C18-SPE柱净化，用1mL乙腈全部洗脱，洗脱液经过0.22μm微孔滤膜过滤后，即为待进样分析供试品溶液。

液相条件为：

色谱柱为：UPLC C₁₈(50mm×2.1mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；流速：0.3mL/min；流动相A：水(加入0.05％甲酸)，流动相B：乙腈；洗脱梯度：0～0.5min、2.6～5.0min：90％A，10％B；1.5～2.5min：10％A，90％B。

质谱条件为：

经检测，该大麦样品2中细胞松弛素E的含量为1.6μg/kg。

实施例3

本实施例提供了一种大麦芽样品中谷物细胞松弛素E的检测方法，包括以下步骤：

S1：前处理：EBC粉碎磨为0.2mm细粉。取2.0g细粉于50mL离心管中，加入20mL甲醇，超声波提取3hr，6000rpm离心5min过滤，收集上清液。采用氮气吹至近干，加入1mL乙腈复溶得到浓缩液，即为待进样分析供试品溶液。

液相条件为：

色谱柱为：UPLC C₁₈(50mm×2.1mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；流速：0.3mL/min；流动相A：水，流动相B：乙腈；洗脱梯度：0～0.5min、2.6～5.0min：95％A，5％B；1.5～2.5min：5％A，95％B。

质谱条件为：

经检测，该大麦芽样品3中细胞松弛素E的含量为1.8μg/kg。

测试结果分析

根据细胞松弛素E标准工作曲线，计算该检测方法的检出限为0.50μg/kg，如表4所示。

表4检测方法相关参数

对样品进行加标实验，具体为在实施例的检测方法中步骤S1样品磨粉结束取样于离心管中、未进一步处理时，按表5所列数据加入定量的细胞松弛素E标准物质，后续按样品的处理步骤进行分析，进样结束后计算回收率，结果如表5所示。

表5加标试验数据

以实施例1为例说明样品中细胞松弛素E的计算方式：

样品中细胞松弛素E含量计算公式为：

C＝(aX+b)*[(V₁/V₂)*(V/m)]

式中：

C为样品中细胞松弛素E含量，单位：μg/kg。

(aX+b)为标准曲线计算公式，单位为μg/kg；其中X为峰面积，细胞松弛素E标准工作曲线测定，a为0.0184，b为-0.0585。

[(V₁/V₂)*(V/m)]为样品前处理稀释倍数，单位为1。其中，m为取样量，实施例1为1g；V₁为加入提取液体积，本实施例为20mL；V₂为用于净化的上清液体积，实施例1为18mL；V为净化后添加的乙腈洗脱液量，实施例1为1mL。

加标回收率计算公式为：

P＝(C₂-C₁)/C*100

式中：

P为加标回收率，单位为％；C₂为加标试样测定值，C₁为未加标试样测定值，C为加标量，单位均为μg/kg。

综上，如表4和表5所示，本发明的检测方法测定回收率在85～95％，准确性高，应用前景良好。

另外作为对比例，采用酶联免疫双抗夹心法对系列大麦、小麦和大麦芽样品(样本数＞40)进行检测。酶联免疫双抗夹心法标准溶液制备标准曲线检测范围为：0.015μg/L～0.24μg/L，因受基质影响大，样品需稀释100～200倍，即该稀释倍数范围内，该标准曲线可定量样品范围理论值为：1.5μg/kg～48μg/kg；样本因浓度较高或较低、需要稀释或浓缩时，即超出该稀释倍数范围时，因该方法对样本一致性要求高，检测结果不呈比例关系(如表6所示，表格为其中部分例子，该方法检测的其它样品均出现同样趋势检测结果)，检测结果受前处理稀释倍数影响较大，可能在一定稀释范围内存在假阳性结果，但无法确定真实值。

表6本发明的检测方法(LC-MS/MS)与酶联免疫双抗夹心法检测数据对比

综上，相比于现有的酶联免疫双抗夹心法，本发明提出的检测方法样品前处理步骤要求较低，且可以有效去除杂质，操作简便、环保；同时该检测方法具有灵敏度高、准确性高等优点，有望在啤酒麦芽中细胞松弛素E的检测中得到广泛应用。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims

1.一种谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测谷物样品与所述提取液的质量体积比为1g:(5～20)mL。

3.根据权利要求1所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：

S11：磨粉：将待测谷物样品磨粉后过筛；

S12：提取：用提取液提取1～3h后，6000rpm离心5min；

S14：将洗脱液或浓缩液经0.22μm尼龙微孔滤膜过滤后备用。

4.根据权利要求1所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，步骤S2中的液相条件为：色谱柱为UPLC C₁₈色谱柱，或同等性能的色谱柱；流速：0.2～0.4mL/min；柱温：30～40℃；进样量：1～10μL；流动相A：水，或水和有机溶剂的混合溶液；流动相B：乙腈。

5.根据权利要求1所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，步骤S2中的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描模式；检测方式：多反应监测MRM检测模式；锥孔电压：3V；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：500℃；脱气流量：1000L/hr；定性离子对：513/416，定量离子对：513/434，碰撞能量：8～12eV，去簇电压：12～16V。

6.根据权利要求3所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，步骤S13中，净化时上清液与水或PBS缓冲液的体积比为1:(3～5)。

7.根据权利要求1所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取液为浓度为80％的甲醇或乙醇的水溶液。

8.根据权利要求1所述的谷物细胞松弛素E的检测方法，其特征在于，所述标准品的色谱图和标准曲线通过以下步骤测得：

将细胞松弛素E标准品用甲醇或乙腈逐级稀释，分别设置浓度为0.2、0.5、1、5、10、50、100μg/L的标准采用液相色谱串联质谱检测进样分析，以细胞松弛素E标准浓度为纵坐标，对应的定量离子对峰面积为横坐标，绘制标准曲线。