CN117482245A - 抗5t4抗体-自然杀伤细胞偶联物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了抗5T4抗体‑自然杀伤细胞偶联物、包含所述偶联物的药物组合物及所述偶联物的医药学用途以及制备方法。
Description
技术领域
本申请大体涉及生物制药领域，具体而言，本申请涉及抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物、包含所述偶联物的药物组合物及所述偶联物的医药学用途、制备方法等。
背景技术
国家癌症中心于2019年1月发布的国家癌症统计数据显示，2015年全国恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。与历史数据相比，癌症负担呈持续上升态势。从发病人数看，肺癌、肝癌、上消化系统肿瘤、结直肠癌及女性乳腺癌等依然是我国主要的恶性肿瘤。国家癌症中心2022年2月发布的国家癌症统计数据显示，2016年全国恶性肿瘤发病约406.4万人，死亡约241.35万人。与2015年数据相比，恶性肿瘤新发病例与死亡病例仍呈上升趋势，其中肺癌常年都是我国发病率最高的癌症。
由于肿瘤的早期症状不明显，有些肿瘤早期发现但后期复发，肿瘤本身恶性程度高等原因，所以晚期肿瘤的病人数量占比较高。目前对于实体瘤，临床上常用的治疗方法包括手术、放疗、化疗、常规生物治疗及中医药治疗等。这些治疗方法常会出现一定的毒副作用。手术切除癌体后，可能伴有不同程度并发症，且术后存在复发风险。放疗、化疗是毒副作用最大的治疗方式，会对患者身体造成一定程度的损伤。中医药治疗虽然毒副作用小，但往往只是起到辅助的效果。常规生物治疗也存在很多难以避免的毒副作用。但对于晚期实体瘤患者，大部分已不适合手术、放疗或同步放化疗，且经系统性标准治疗失败。
因此，本领域亟需针对肿瘤探索新的治疗方式。
发明概述
第一方面，本申请提供了抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，所述抗体为抗5T4抗体或其抗原结合片段，所述抗5T4抗体或其抗原结合片段与所述NK细胞通过连接子偶联。
第二方面，本申请提供了细胞群，其包含第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物。
第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或第二方面所述的细胞群，以及药学可接受的载体。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或第二方面所述的细胞群在制备用于治疗个体的肿瘤、特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤的药物中的用途。
第五方面，本申请提供了治疗个体的肿瘤、特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或第二方面所述的细胞群或第三方面所述的药物组合物。
作为非限制性的实例，本申请提供了以下实施方案：
1.抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，所述抗体为抗5T4抗体或其抗原结合片段，所述抗5T4抗体或其抗原结合片段与所述NK细胞通过连接子偶联。
2.如实施方案1所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:5所示的或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的HCDR1，
如SEQ ID NO:6所示的或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的HCDR2，
如SEQ ID NO:7所示的或与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的HCDR3，
如SEQ ID NO:8所示的或与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的LCDR1，
如SEQ ID NO:9所示的或与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的LCDR2，和
如SEQ ID NO:10所示的或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
3.如实施方案1或2所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示或与SEQ ID NO:3所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性。
4.如实施方案1-3中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述抗5T4抗体包括SEQ ID NO:1所示的重链可变区，SEQ ID NO:2所示的重链恒定区，SEQ IDNO:3所示的轻链可变区和SEQ ID NO:4所示的轻链恒定区。
5.如实施方案1-4中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中：
所述抗5T4抗体为全抗体、单链抗体(scFv)或双特异性抗体；和/或
所述抗5T4抗体的抗原结合片段为Fab、Fab’、Fv或F(ab’)2；和/或
所述抗5T4抗体为人源化抗体或全人源抗体；和/或
所述抗5T4抗体为单克隆抗体；和/或
所述抗5T4抗体为IgG1、IgG2或IgG4同种型的；和/或
所述抗5T4抗体包含κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
6.如实施方案1-5中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述NK细胞为CD16+和/或NKG2D+，优选为CD16+NKG2D+。
7.如实施方案1-6中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述偶联物的CD16+NKG2D+NK细胞比例为至少90％，优选地，同时CD56+NK细胞比例为至少95％。
8.如实施方案1-7中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中
所述NK细胞获自外周血单核细胞(PBMC)来源的NK细胞的体外培养和扩增；或
所述NK细胞获自脐带血来源的NK细胞的体外培养和扩增；或
所述NK细胞获自NK细胞系的体外培养和扩增；或
所述NK细胞获自从诱导性多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞(ESC)的体外诱导、培养和扩增。
9.如实施方案1-8中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合片段和所述NK细胞借由连接子的点击化学反应偶联在一起。
10.如实施方案9所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合片段和所述NK细胞借由第一连接子和第二连接子偶联在一起，所述第一连接子与所述抗5T4抗体或其抗原结合片段偶联，所述第二连接子与所述NK细胞偶联，所述第一连接子和第二连接子偶联进而形成所述抗体-NK细胞偶联物。
11.如实施方案10所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第一连接子为活泼酯，能够与抗体的赖氨酸残基通过由酯键向酰胺键的反应形成偶联，例如，所述活泼酯为五氟苯酯，例如哌啶酸五氟苯酯。
12.如实施方案11所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第一连接子还包含能够与叠氮基团发生环化反应而形成三氮唑五元环的碳碳三键结构，例如，所述碳碳三键结构为辛炔基团。
13.如实施方案12所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第一连接子为二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯，结构如下所示：
其中n为0-8的整数。
14.如实施方案13所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第一连接子为二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯，结构如下所示：
15.如实施方案10所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第二连接子为叠氮乙酰化环己糖胺，例如，叠氮乙酰化环半乳糖胺或叠氮乙酰化葡萄糖胺。
16.如实施方案15所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第二连接子为1,3,4,6-氧-四乙酰-2-叠氮乙酰胺-2-去氧-a,b-D-半乳糖，结构如下所示：
17.如实施方案16所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，其中所述第二连接子的α或β单一构型的比例为至少90％。
18.细胞群，其包含实施方案1-17中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物。
19.如实施方案18所述的细胞群，其中CD3-CD56+CD16+细胞数占所述细胞群中总细胞数的至少95％，优选至少98％，和/或CD3-CD56+NKG2D+细胞数占所述细胞群中总细胞数的至少95％，优选至少98％。
20.如实施方案18或19所述的细胞群，其中：
CD3+CD56+细胞数占所述细胞群中总细胞数不超过5％；和/或
CD3-CD19+细胞数占所述细胞群中总细胞数不超过2％；和/或
CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞数占所述细胞群中总细胞数不超过2％。
21.如实施方案18-20中任一项所述的细胞群，其中以细胞数计，所述抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物占所述细胞群中总细胞数至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％。
22.药物组合物，其包含实施方案1-17中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或实施方案18-21中任一项所述的细胞群，以及药学可接受的载体。
23.如实施方案22所述的药物组合物，其包含氯化钠和/或人血清白蛋白。
24.如实施方案22或23所述的药物组合物，其包含海藻糖、蔗糖、葡聚糖、DMSO或以上任意组合。
25.如实施方案22-24中任一项所述的药物组合物，其用于治疗个体中的肿瘤，特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤。
26.如实施方案25所述的药物组合物，其中所述肿瘤为实体瘤。
27.如实施方案25所述的药物组合物，其中所述肿瘤为恶性肿瘤。
28.如实施方案25所述的药物组合物，其中所述肿瘤为癌症。
29.如实施方案28所述的药物组合物，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、尿路癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌及头颈癌以及上述癌症的转移灶。
30.如实施方案28所述的药物组合物，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和卵巢癌。
31.如实施方案28所述的药物组合物，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。
32.实施方案1-17中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或实施方案18-21中任一项所述的细胞群在制备用于治疗个体的肿瘤、特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤的药物中的用途。
33.如实施方案32所述的用途，其中所述肿瘤为实体瘤。
34.如实施方案32所述的用途，其中所述肿瘤为恶性肿瘤。
35.如实施方案32所述的用途，其中所述肿瘤为癌症。
36.如实施方案35所述的用途，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、尿路癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌及头颈癌以及上述癌症的转移灶。
37.如实施方案35所述的用途，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和卵巢癌。
38.如实施方案35所述的用途，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。
39.治疗个体的肿瘤、特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案1-17中任一项所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或实施方案18-21中任一项所述的细胞群或实施方案22-31中任一项所述的药物组合物。
40.如实施方案39所述的方法，其中所述肿瘤为实体瘤。
41.如实施方案39所述的方法，其中所述肿瘤为恶性肿瘤。
42.如实施方案39所述的方法，其中所述肿瘤为癌症。
43.如实施方案42所述的方法，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、尿路癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌及头颈癌以及上述癌症的转移灶。
44.如实施方案42所述的方法，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和卵巢癌。
45.如实施方案42所述的方法，其中所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。
附图简要描述
图1显示了本申请的示例性抗5T4抗体的序列以及结构解析。
图2显示了本申请的示例性抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物的结构示意图。
图3显示了IBR854原液(批号DSE20220711)的流式分析结果：CD56+、CD3-、CD16+、NKG2D+、CD19-。
图4显示了IBR854制剂(批号FE20220717)的流式分析结果：CD56+、CD3-、CD16+、NKG2D+、CD19-。
图5显示了UNK、IBR854原液和IBR854制剂关于偶联阳性率和偶联几何平均值的流式分析结果。
图6显示了L2连接子的制备工艺流程示意图。
图7显示了L2连接子的结构式，中文命名：(Z)-19-(1’-氮杂-2’-酮-二苯并[b,f]环-7’-辛炔基)-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂-16,20-二酮-二十酰哌啶-4-酸五氟苯酯；英文命名：pentafluorophenyl(Z)-20-(1’-aza-2’-oxo-dibenzo[b,f]cyclo-7’-octynyl)-3,6,9,12-tetraoxa-15-aza-16,20-dioxodecanoyl piperidine-4-carboxylate。
图8显示了N1连接子的制备工艺流程示意图。
图9显示了N1连接子的结构式，中文命名：1,3,4,6-氧-四乙酰-2-叠氮乙酰胺-2-去氧-a,b-D-半乳糖；英文命名：1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-azidoacetylamido-2-deoxy-a,b-D-mannopyanose。
图10显示了L2连接子与抗5T4抗体的偶联机制示意图。
图11显示了N1连接子与NK细胞的偶联机制示意图。
图12显示了连接有N1连接子的UNK结构示意图。
图13显示了UNK与L2偶联抗体的偶联机制示意图。
图14显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于H1975细胞杀伤效果比较。
图15显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于NCI-H292细胞杀伤效果比较。
图16显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于NCI-H226细胞杀伤效果比较。
图17显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于HCC827细胞杀伤效果比较。
图18显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于Panc-1细胞杀伤效果比较。
图19显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于BxPC3细胞杀伤效果比较。
图20显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于MDA-MB-231细胞杀伤效果比较。
图21显示了IBR854、UNK细胞和NK细胞对于MDA-MB-468细胞杀伤效果比较。
图22显示了IBR854与H292肿瘤细胞作用后TraiL的水平，其中A图和B图为10:1效靶比的随时间变化，C图显示了不同效靶比的随时间变化。
图23显示了IBR854与H292肿瘤细胞作用后FasL的水平，其中A图和B图为10:1效靶比的随时间变化，C图显示了不同效靶比的随时间变化。
图24显示了人肺癌细胞NCI-H292 M-NSG移植瘤小鼠测试中，各组动物肿瘤体积曲线。与溶媒对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图25显示了人乳腺癌细胞MDA-MB-468移植瘤小鼠测试中，各组动物肿瘤体积曲线。与溶媒对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图26显示了人乳腺癌细胞MDA-MB-468移植瘤小鼠测试中，各组动物肿瘤重量在第20天的比较。与溶媒对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图27显示了具有不同L连接子的抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物、UNK细胞和NK细胞对于H292细胞杀伤效果比较，其中每一效靶比的柱形图由左至右为L3、L2、NK、UNK。
图28显示了IBR854、NK细胞、UNK细胞+抗5T4偶联抗体混合物对LOVO细胞的杀伤效果的随时间变化图。
图29显示了IBR854、NK细胞、UNK细胞+抗5T4偶联抗体混合物对LOVO细胞的55小时作用的杀伤效果。
图30显示了IBR854、NK细胞、UNK细胞+抗5T4偶联抗体混合物对N87细胞的杀伤效果的随时间变化图。
图31显示了IBR854、NK细胞、UNK细胞+抗5T4偶联抗体混合物对N87细胞的24小时作用的杀伤效果。
发明详细描述
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本申请的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
本文所使用的术语“个体”或“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物，家畜或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。
本文所使用的术语“抗原”是抗体可选择性与之结合的预定的靶标。抗原的实例包括但不限于多肽、糖、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的化合物或合成化合物。
广义而言，“抗体”可以指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子，因此涵盖完整抗体/全长抗体、抗体单链或抗体的任何抗原结合片段(也称为“抗原结合部分”)。当“抗体”和“抗原结合片段/抗原结合部分”出现在同一语境下时，“抗体”可以理解为相对于“抗原结合片段/抗原结合部分”的完整体，二者共同对应于广义的抗体概念。
术语“激动剂抗体”是引发反应的抗体，例如，模拟目标多肽的至少一种功能活性的抗体。激动剂抗体包括是配体模拟物的抗体，例如，其中配体与细胞表面受体结合，所述结合通过胞内细胞信号转导途径诱导细胞信号转导或活性，且其中抗体诱导类似的细胞信号转导或活化。
“全长抗体”系指包含通过二硫键而互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白。每条重链包含一重链可变区(缩写为VH)和一重链恒定区。该重链恒定区包含三个域(domain)，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含一轻链可变区(缩写为VL)和一轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个域，CL。VH和VL区域还可再细分为具有高可变性的多个区，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为框架区(FR)的多个区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的这些可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。全长抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。嵌合或人源化抗体也涵盖在根据本申请的抗体中。本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR氨基酸序列有多种常见的定义方式，例如Kabat定义，IMGT定义，Chothia定义等。对于给定抗体的可变区氨基酸序列，通常可以根据不同定义方式来确定VH和VL氨基酸序列中的CDR氨基酸序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR氨基酸序列。对于给定抗体的可变区氨基酸序列，可以通过多种方式分析可变区氨基酸序列的中CDR氨基酸序列。
术语“人源化抗体”意指将源自另一哺乳动物物种，诸如小鼠种系的CDR序列嫁接到人框架序列上获得的抗体。为了保留结合亲和力，可以修饰骨架(称为FR)区段的一些残基。通过本领域技术人员已知的技术可以制备根据本申请的人源化抗体或其片段；
术语“嵌合抗体”系指以下抗体，其中的可变区序列来自一物种而恒定区序列来自另一物种，例如可变区序列来自小鼠抗体而恒定区序列来自人抗体的抗体。通过使用基因重组技术可以制备根据本申请的嵌合抗体或其片段。例如，所述嵌合抗体可以通过克隆重组DNA来生产，所述重组DNA包含启动子和编码根据本申请的非人尤其是鼠单克隆抗体可变区的序列、以及编码人抗体恒定区的序列。由这种重组基因编码的本申请嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由来源于鼠DNA的可变区确定，并且其同种型由来源于人DNA的恒定区来确定。
术语“部分人源化抗体”指含有来自人的恒定区和来自非人(如鼠)的可变区(包括CDR)的抗体。
术语“半人源化抗体”是人源化抗体的一种，是指其中一个抗体链包含鼠可变区，并且另一抗体链包含人源化可变区的抗体，即半人源化抗体。
术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。
本文所使用的术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”或“抗原结合区”可互换使用，是指包含与抗原相互作用并赋予结合剂其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的部分，尤其是指抗体片段如Fv、Fab、F(ab’)2或Fab’，或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)。优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重链或轻链可变链的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段。
术语“单链抗体(scFv)指是由VH域和VL域经由肽连接子连接的单一多肽链。(scFv)2包含两个由肽连接子连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。
术语“Fc片段”、“Fc区”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、恒定区的CH2片段和CH3片段。可以对抗体的Fc区进行工程化改造或修饰，包括效应功能相关的改造，以例如降低或消除抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)，这可通过在抗体的Fc区引入一个或更多个氨基酸取代/突变来实现。
如本文所用术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体与抗原表位的结合。
术语“双特异性抗体”是指同时具有两种抗原表位结合能力的抗体。两种抗原表位可以在不同抗原上，也可是在同一抗原上。双特异性抗体可以具有多种结构构型。例如，双特异性抗体可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个抗原结合部分组成(与天然抗体相似，区别在于两个臂结合不同的抗原靶标或表位)，抗原结合部分可以为单链抗体(scfv)的形式或者Fab片段的形式。双特异性抗体的两个不同的结合部各自与一个Fc片段的N端结合，两个臂的抗原结合部配置可以具有四种组合方式:scfv+Fab片段、Fab片段+scfv、scfv+scfv、Fab片段+Fab片段。Fc片段可以包含能够确保重链异聚化的突变，KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。
通常，为了制备单克隆抗体或其功能片段，尤其是鼠源的单克隆抗体或其功能片段，可以参考尤其描述在手册“Antibodies”中的技术(Harlow and Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726，1988)或者参考Kohler和Milstein描述的从杂交瘤细胞制备的技术(Nature，256：495-497，1975)。
术语“保守变体”或“保守氨基酸置换”是基本上不影响或降低蛋白的亲和力的那些替换。例如，抗体可包括至多约1、至多约2、至多约5、至多约10或至多约15个保守替换，并且特异性结合目标抗原。术语“保守变体”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，只要抗体特异性结合目标抗原。
术语“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器)已经与所述组分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物组分(即，其他染色体和额外染色体DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本分离或被纯化。已经被“分离”的核酸和蛋白质包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
本文使用的术语“药物组合物”其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本申请的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本申请的抗体-细胞偶联物)可以以整体施用于个体，或者分开施用于个体。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于个体时，所述成分可以同时或依次施用于个体。根据本申请的药物组合物可以包括细胞培养、特别是NK细胞培养的常规组分，以保持偶联物中NK细胞的活性。可药用载体还可以包括水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。根据本申请的药物组合物或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如静脉内施用、皮内、皮下、肌内注射等。根据本申请的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
本文使用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用个体益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
EC50值主要是指：指在特定暴露时间后，能达到50％最大生物效应对应的药物、抗体或者毒素等的浓度。药学中除了用于表征体外实验中(in vitro)激动剂(agonist)的激活能力外，还可用于表示达到体内(in vivo)最大生物效应一半时所需的血药浓度。在一些文献中，EC50也用于表征某化合物在细胞水平的效力(包括激动和拮抗)，可以通过ELISA等方法测定EC50值。
关于氨基酸或核酸序列的术语“同一性/同源性/一致性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同一性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。
本文所用术语“肿瘤”是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。
本文所用术语“恶性肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理条件，其典型的特征在于不受调控的细胞生长。示例性恶性肿瘤包括：癌、实体瘤、黑素瘤肉瘤、血液肿瘤、生殖细胞瘤和胚细胞瘤。恶性肿瘤的更多具体实例包括：多发性骨髓瘤、肾癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌，膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，肝癌(hepaticcarcinoma)，包括胃肠癌的胃癌，前列腺癌，胰腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，成胶质细胞瘤，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，尿路癌，肝细胞瘤，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，外阴癌，甲状腺癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤和B细胞淋巴瘤，脑癌及头颈癌以及相关转移灶。
本文所用术语“血液肿瘤”是指由于异常细胞的生长增殖不受控制引起的，在多数情况下这些不正常的细胞的起源部位是骨髓，这也正是血液细胞产生的地方。示例性血液肿瘤包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。血液肿瘤的更多具体实例包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、赛谢综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指型外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。
本文所用术语“实体瘤”是指可通过临床检查如X线摄片、CT扫描、B超或触诊扪及到的有形肿块。临床上诊治过的实体瘤分恶性和良性两种。恶性实体瘤包括：儿童霍奇金淋巴瘤：淋巴细胞为主型、结节硬化型、混合细胞型、淋巴细胞消减型；儿童非霍奇金淋巴瘤：前淋巴母细胞淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤(伯基特/非伯基特淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤等；儿童肾脏肿瘤：肾母细胞瘤(Wilms瘤)、肾透明细胞癌、肾横纹肌样瘤、肾透明细胞肉瘤、肾原始神经外胚叶瘤等；儿童神经母细胞瘤：神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、节细胞神经瘤；儿童颅外生殖细胞瘤：成熟畸胎瘤、未成熟畸胎瘤、内胚窦瘤(卵黄囊瘤)、精原细胞瘤、无性细胞瘤、绒毛膜上皮癌、胚胎癌等；骨肉瘤及软骨肉瘤；儿童横纹肌肉瘤：胚胎型、腺泡型、多形型等；儿童软组织肉瘤：纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、恶性神经鞘瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、恶性黑色素瘤、滑膜肉瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤等；尤文氏家族肉瘤：尤文氏肉瘤、原始神经外胚叶瘤；儿童肝脏肿瘤：肝母细胞瘤(胚胎型、胎儿型、未分化型)、肝细胞癌；视网膜母细胞瘤；其他肿瘤：后颅窝髓母细胞瘤、鼻咽癌、甲状腺乳头状癌、胸腺瘤、肺母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰岛细胞瘤、回盲部类癌、间皮瘤等。良性实体瘤包括：淋巴管瘤、血管瘤、甲状舌管囊肿等。
对于肿瘤的治疗，过继性细胞免疫治疗成为国内外研究的热点，已经在肿瘤临床试验中取得较好的效果。过继性细胞免疫治疗是将自体或异体的免疫细胞分离，经体外激活或基因修饰后，扩增出足够量的具有抗肿瘤活性的免疫细胞，输注给肿瘤患者，放大患者体内的细胞免疫功能以提高抗肿瘤效果的治疗方法。目前有多种类型的细胞免疫治疗正在研究之中，包括嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)、T细胞受体基因修饰的T细胞(TCR-T)、树突状细胞(DC)疫苗、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。虽然CAR-T细胞疗法近年来发展迅速，但在临床应用中仍存在诸多不足和挑战，如不同程度的神经毒性和细胞因子风暴风险，以及在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效。此外，大多数的CAR-T细胞免疫疗法需要自体过继细胞移植，因为除非处理HLA屏障，否则异基因T细胞可能导致移植物抗宿主病(GVHD)；另外，CAR-T细胞免疫治疗可能会产生一些副作用，对患者的生命造成危害，如细胞因子释放综合征。
相比之下，NK细胞疗法已在治疗血液肿瘤方面显示出了良好的临床效果，其较CAR-T细胞疗法具有更多优势：1)NK细胞不会像T细胞一样产生移植物抗宿主反应(GVHD)，有望成为通用型细胞治疗手段；2)成熟的NK细胞寿命相对较短(约7～10天)，可在有效杀伤肿瘤细胞的同时降低长期不良事件的发生概率；3)NK细胞不受抗原特异性主要组织相容性复合体(MHC)限制，具有更强的杀伤能力；4)NK细胞治疗不分泌炎症因子(IL-1，IL-6等)，发生细胞因子风暴和神经毒性反应的风险较低；5)NK细胞表面CD16低亲和力分子可与靶细胞表面IgG抗体复合物结合介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用，也可通过Fas/FasL途径介导细胞凋亡。此外，NK细胞分泌的程序性死亡受体1(PD-1)水平较低，几乎不会诱导免疫抑制，因此使得NK细胞在治疗实体瘤中具有良好的应用前景。
本申请的发明人在细胞免疫治疗领域进行了深入研究，特别是针对肿瘤治疗开发出了抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物。图2显示了本申请的示例性抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物的结构示意图。
自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)属于粒状淋巴细胞，是人体免疫系统的组成部分。NK细胞识别靶抗原无主要组织相容性复合体(MHC)限制性，同种异体NK细胞引起移植物抗宿主病(GvHD)风险极低。因此，临床上可进行同源异体NK细胞治疗。此外，NK细胞引起细胞因子释放综合征(CRS)的风险也极低。2020年Liu E等在新英格兰医学杂志上发表一项CAR-NK细胞治疗淋巴瘤的I/II期临床试验结果显示，入组的11例受试者在接受CAR-NK细胞输注后，8例受试者病情得到缓解，其中7例受试者达到完全缓解，且无一例发生CRS、神经毒性或GvHD。可见应用CAR-NK细胞治疗的安全性较高。另外，正是基于NK细胞识别靶抗原无MHC限制性的特点，使得NK细胞可以不受自体细胞的限制被制备成通用型的产品，从而使这一疗法的NK细胞来源非常广泛，比如异体外周血、脐带血、胚胎干细胞、人类诱导多能干细胞和NK-92细胞系。
NK细胞的杀伤活性主要通过：
1)直接裂解靶细胞：NK细胞通过胞吐作用释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒，活化半胱天冬酶(Caspase)途径诱导靶细胞坏死或凋亡；
2)分泌细胞因子：细胞因子介导的杀伤作用，NK细胞能合成和分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-5、IL-8、IL-10和G-CSF等，诱导靶细胞凋亡；
3)诱导凋亡：活化NK细胞表达Fas(CD95)配体和肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)分子，诱导CD95+靶细胞和TRAIL受体阳性的靶细胞通过内源酶的级联反应发生凋亡；
4)ADCC：抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用；
5)免疫检查点途径：表达程序性死亡受体1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)等，通过抑制免疫检查点发挥作用。
上述多重作用机制以及作为通用型产品应用的潜力和可靠的安全性使得NK细胞治疗成为了一个有吸引力的免疫疗法。
本申请选择的抗原靶点为胚胎滋养层糖蛋白5T4(5T4 oncofetal trophoblastglycoprotein，本申请中简称“5T4”)，5T4是一种N-糖基化跨膜蛋白，分子量72kDa，高表达于胚胎滋养层细胞，以及多种实体瘤(非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌等)和肿瘤干细胞表面，成人正常组织表达量低或不表达。5T4蛋白胞外区包含多个亮氨酸重复序列，与蛋白质结合有关，能促进细胞-间质，即细胞-细胞的相互作用。
第一方面，本申请提供了抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，所述抗体为抗5T4抗体或其抗原结合片段，所述抗5T4抗体或其抗原结合片段与所述NK细胞通过连接子偶联。
在一些实施方案中，抗5T4抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:5所示的或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的HCDR1，
如SEQ ID NO:6所示的或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的HCDR2，
如SEQ ID NO:7所示的或与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的HCDR3，
如SEQ ID NO:8所示的或与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的LCDR1，
如SEQ ID NO:9所示的或与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的LCDR2，和
如SEQ ID NO:10所示的或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的LCDR3；
其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，抗5T4抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或与SEQ ID NO:3所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方案中，抗5T4抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的C端或N端区域可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。在一些实施方案中，可以在SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
在一些实施方案中，抗5T4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。在一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。在一些实施方案中，还可以在SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
在一些实施方案中，抗5T4抗体包括SEQ ID NO:1所示的重链可变区，SEQ ID NO:2所示的重链恒定区，SEQ ID NO:3所示的轻链可变区和SEQ ID NO:4所示的轻链恒定区。
图1显示了示例性抗5T4抗体的序列以及结构解析。
在一些实施方案中，抗5T4抗体为全抗体、单链抗体(scFv)或双特异性抗体。
在一些实施方案中，抗5T4抗体的抗原结合片段为Fab、Fab’、Fv或F(ab’)2。
在一些实施方案中，抗5T4抗体为人源化抗体或全人源抗体。
在一些实施方案中，抗5T4抗体为单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗5T4抗体为IgG1、IgG2或IgG4同种型的。在一些实施方案中，抗5T4抗体为IgG1同种型的。
在一些实施方案中，抗5T4抗体包含κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
在给定抗体结构/序列的情况下，制备相应的抗体的技术是本领域技术人员所掌握的。
作为非限制性实例，抗5T4单克隆抗体的序列可以来自于噬菌体文库筛选，通过5T4和表达5T4的细胞的结合活性筛选，亲和力研究确认后得到，选择得到抗5T4单克隆抗体，其中抗5T4单克隆抗体包括SEQ ID NO:1所示的重链可变区(HCDR1-3分别为SEQ ID NO:5、6、7)、SEQ ID NO:2所示的重链恒定区、SEQ ID NO:3所示的轻链可变区(LCDR1-3分别为SEQ ID NO:8、9、10)、SEQ ID NO:4所示的轻链恒定区。确定抗5T4单克隆抗体的DNA序列，构建表达抗5T4单克隆抗体的重组质粒(IB12)。单克隆细胞株的构建是基于已知技术，其中将IB12质粒通过电转转染至CHO细胞中，经过对minipool的一轮筛选，以及单克隆铺板后得两轮筛选，并通过初步传代稳定性培养确认，得到可稳定表达抗5T4单克隆抗体的细胞株。抗5T4单克隆抗体基于本领域已知的生产方案，包括细胞培养和蛋白纯化。取工作细胞，经过复苏、3～5轮扩增、中试规模培养，然后收集未处理细胞悬液(UPB)，经过澄清过滤得到细胞培养上清液。然后，通过蛋白纯化工艺，经过Protein A亲和、阴离子交换和阳离子交换的三步层析法，得到抗5T4单克隆抗体。
在一些实施方案中，NK细胞为CD16+和/或NKG2D+。在一些实施方案中，NK细胞为CD16+NKG2D+。
在一些实施方案中，偶联物的CD16+NKG2D+NK细胞比例为至少90％，例如，至少95％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，偶联物的CD16+NKG2D+NK细胞比例为至少90％，并且CD56+NK细胞比例为至少95％(例如，至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。
体外培养、扩增和获得NK细胞的技术有多种，并且其大体原理和方法学是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，NK细胞获自外周血单核细胞(PBMC)来源的NK细胞的体外培养和扩增，这也是本申请的实施例中的示例性方法。PBMC是NK细胞的主要来源之一，具有采集相对容易、易于体外扩增、无毒副作用等优点。然而，NK细胞在PBMC中的比例只有10％-15％，扩增PBMC来源的NK细胞的方法包括使用细胞因子、饲养层细胞或膜颗粒的组合来刺激NK细胞的体外扩增，这些不同的扩增系统显示出不同的NK细胞扩增效率水平。在一些实施方案中，对PBMC的HLA、KIR进行筛选。在一些实施方案中，对PBMC的CD16a的变体，即176V、176F进行筛选。在一些实施方案中，使用一种或几种细胞因子维持或激活培养期间自然杀伤细胞的活性。在一些实施方案中，使用一种或几种免疫球蛋白或融合蛋白，抑制B细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞的增殖。
PBMC可来自同种异体健康供者的单采外周血淋巴细胞。在分离T细胞和红细胞后，将细胞转移至原代细胞冻存液中，按照活细胞总数≥6.0×107个细胞/支的规格分装，即得到PBMC。PBMC在≤-175℃液氮中长期保存。将冻存于液氮的PBMC取出，在适应的培养基中复苏，通过扩大培养规模(即，增加培养基扩增)，加入NK细胞相关的细胞因子，包括但不不限于IL2、IL15，维持其分裂增殖能力和活性。示例性的制备方法可参见本申请的实施例1。
在一些实施方案中，NK细胞获自脐带血来源的NK细胞的体外培养和扩增。一般有两种不同的方法可以从脐带血中获得大量的NK细胞。一种方法是在脐带血中扩增NK细胞，另一种方法是诱导脐带血CD34+造血干/祖细胞分化为NK细胞，然后再扩增。
在一些实施方案中，NK细胞获自NK细胞系的体外培养和扩增。作为实例，NK-92是第一个获得FDA批准用于临床试验的基于NK细胞的免疫疗法，是一种同质的永生化NK淋巴瘤细胞。
在一些实施方案中，NK细胞获自从诱导性多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞(ESC)的体外诱导、培养和扩增。
在一些实施方案中，抗5T4抗体或其抗原结合片段和NK细胞借由连接子的点击化学反应偶联在一起。
点击化学(Click chemistry)，又称为“链接化学”、“速配接合组合式化学”，是由化学家巴里·夏普莱斯在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。点击化学反应主要有4种类型：环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。
在一些实施方案中，抗5T4抗体或其抗原结合片段和NK细胞借由第一连接子和第二连接子偶联在一起，所述第一连接子与所述抗5T4抗体或其抗原结合片段偶联，所述第二连接子与所述NK细胞偶联，所述第一连接子和第二连接子偶联进而形成所述抗体-NK细胞偶联物。
在一些实施方案中，第一连接子为活泼酯，能够与抗体的赖氨酸残基通过由酯键向酰胺键的反应形成偶联，例如，所述活泼酯为五氟苯酯，例如哌啶酸五氟苯酯。活泼酯可以是一种水相稳定的分子，能特异性共价结合至抗体的赖氨酸残基。在一些实施方案中，活泼酯为带有四聚乙二醇链结构，其在水中会发生缓慢水解。在一些实施方案中，活泼酯与蛋白质亲水界面上的氨基反应，将酯键反应为酰胺键，从而建立偶联机制。
在一些实施方案中，第一连接子还包含能够与叠氮基团发生环化反应而形成三氮唑五元环的碳碳三键结构，例如，所述碳碳三键结构为辛炔基团。
在一些实施方案中，第一连接子为二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯，结构如下所示：
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其中n为0-8的整数。
在一些实施方案中，第一连接子为二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯，结构如下所示：
二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯在本申请中也称为L2连接子，L2连接子的合成路线图参见图6，结构式参见图7，包括三个主要合成步骤：酰胺缩合、水解反应和合成活泼酯。
步骤1-酰胺缩合
二苯并氮杂辛炔戊二酸(L2-1)和氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸甲酯(L2-2)可作为商品获得，按照化学缩合反应，得到中间体二苯并氮杂辛炔戊二酰氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸甲酯(L2-3)。L2-3是稳定化合物。
具体而言，将化合物L2-1和化合物L2-2(1:1.1，L2-2过量)溶解在二氯甲烷(DCM)溶液中，分别加入羟基苯并三唑(HOBt)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCI)后，最后加入三乙醇胺(TEA)。混合液在室温下搅拌4～12小时，用水淬灭，二氯甲烷(DCM)提取两次，用硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化，得黄色油状物化合物L2-3。
步骤2-水解反应
通过步骤1得到的中间体L2-3经水解反应，得到中间体二苯并氮杂辛炔戊二酰氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸(L2-4)。水解反应通常是定量反应，不进行进一步纯化直接用于下一步合成。
具体而言，化合物L2-3溶于甲醇和水混合溶液，冷却至0℃后加入1mol/L氢氧化锂(LiOH)水溶液。混合液在0℃至室温下搅拌4-12小时，用1mol/L HCl酸化使pH在2-3之间，乙酸乙酯(EA)萃取3次，干燥，得黄色油状物，即中间体二苯并氮杂辛炔戊二酰氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸(L2-4)。
步骤3-合成活泼酯
通过步骤2得到的中间体L2-4(不经纯化)，与五氟苯酚、二环己基碳二亚胺(DCC)缩合，得到L2，即，二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯。
具体而言，化合物L2-4溶于四氢呋喃(THF)，冷却至0℃后加入2五氟苯酚、羟基苯并三唑(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)。混合液在0℃至室温下搅拌4～12小时，用乙酸乙酯(EA)萃取3次，干燥，经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化得黄色油状物，二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯(L2)，结构式参见图7。
随后，可以将L2连接子与抗5T4单克隆抗体在PBS pH 7.2～7.4的体系中(优选HEPES pH7.2)可发生定点偶联反应(示意图参见图10)。通常一个抗5T4单克隆抗体可偶联1-4个(优选1-2个)L2连接子。可通过调节pH到5.0左右终止反应，得到L2偶联抗体。
在一些实施方案中，第二连接子为叠氮乙酰化环己糖胺，例如，叠氮乙酰化环半乳糖胺或叠氮乙酰化葡萄糖胺。在一些实施方案中，第二连接子为一种水相稳定的分子，其能特异性共价结合至唾液酸修饰的膜蛋白。在一些实施方案中，第二连接子在细胞培养阶段，通过细胞自身的代谢途径转移到唾液酸修饰的膜蛋白上。在一些实施方案中，第二连接子的叠氮乙酰基团可以与第一连接子的碳碳三键发生环化反应，形成稳定的三氮唑五元环。
在一些实施方案中，第二连接子为1,3,4,6-氧-四乙酰-2-叠氮乙酰胺-2-去氧-a,b-D-半乳糖，结构如下所示：
在一些实施方案中，1,3,4,6-氧-四乙酰-2-叠氮乙酰胺-2-去氧-a,b-D-半乳糖的α或β单一构型的比例为至少90％，例如，至少95％、至少98％或至少99％。
1,3,4,6-氧-四乙酰-2-叠氮乙酰胺-2-去氧-a,b-D-半乳糖在本申请中也称为N1连接子，N1连接子的合成路线图参见图8，结构式参见图9，包括两个主要合成步骤：氨基叠氮乙酰化、羟基乙酰酯化。
步骤1-氨基叠氮乙酰化
1.2倍的a-叠氮乙酸(化合物1)、2倍的羟基苯并三唑(HOBt)和三乙胺(Et3N)，加入到D-半乳糖胺盐酸盐(化合物2)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入少量甲醇(MeOH)助溶，室温下反应12小时，将反应混合液倒入二氯甲烷(DCM)/甲醇(MeOH)中振荡混匀，加乙醚析出油状产物(化合物3)，倾出乙醚层，如此反复两次，真空干燥。未经进一步纯化，直接进行下一步反应。
步骤2-羟基乙酰酯化
将上述得到的化合物3加入无水吡啶(Pyr.)和乙酸酐(Ac2O)，在室温下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化剂，反应12小时，HPLC检测反应几乎完全，浓缩，得到四乙酰-N-叠氮乙酰-a,b-D-半乳糖胺的消旋体混合物。通过乙酸乙酯/石油醚中析出固体，主要为b-构型产物，纯度>85％。硅胶柱进一步纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到单一旋光异构体纯度大于90％的N1产物。a,b-两种异构体在细胞内可以互相异构化，经过多步代谢、合成，转为N-叠氮乙酰唾液酸，并最终在NK细胞表面糖蛋白上表达。N1连接子的结构式参见图9。
待NK细胞培养至15～16天时，向培养基中加入N1连接子，孵育12～18小时，得到N1连接子修饰的NK细胞(本申请的实施例中称为“UNK”)(N1连接子与NK细胞的连接机制和UNK的结构示意图参见图11和12)。
最后，为了获得抗体-NK细胞偶联物，可以使UNK与L2偶联抗体在培养基中发生偶联反应(反应机制参见图13)，得到抗体-NK细胞偶联物。
后续工艺还包括制备抗体-NK细胞偶联物制剂，使抗体-NK细胞偶联物的稳定性有效延长。制剂配方中可以含有氯化钠、人血清白蛋白等维持等渗的成分，也可以含有海藻糖、蔗糖、葡聚糖、DMSO等维持细胞的耐低温能力、蛋白和酶的活性的成分。
第二方面，本申请提供了细胞群，其包含第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物。
在一些实施方案中，CD3-CD56+CD16+细胞数占所述细胞群中总细胞数的至少95％。在一些实施方案中，CD3-CD56+CD16+细胞数占所述细胞群中总细胞数的至少98％。在一些实施方案中，CD3-CD56+NKG2D+细胞数占所述细胞群中总细胞数的至少95％。在一些实施方案中，CD3-CD56+NKG2D+细胞数占所述细胞群中总细胞数的至少98％。
在一些实施方案中，CD3+CD56+细胞数占所述细胞群中总细胞数不超过5％。
在一些实施方案中，CD3-CD19+细胞数占所述细胞群中总细胞数不超过2％。
在一些实施方案中，CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞数占所述细胞群中总细胞数不超过2％。
在一些实施方案中，以细胞数计，所述抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物占所述细胞群中总细胞数至少90％。在一些实施方案中，以细胞数计，所述抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物占所述细胞群中总细胞数至少95％。在一些实施方案中，以细胞数计，所述抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物占所述细胞群中总细胞数至少98％。在一些实施方案中，以细胞数计，所述抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物占所述细胞群中总细胞数至少99％。
第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或第二方面所述的细胞群，以及药学可接受的载体。
在一些实施方案中，药物组合物包含氯化钠和/或人血清白蛋白。
在一些实施方案中，药物组合物包含海藻糖、蔗糖、葡聚糖、DMSO或以上任意组合。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗个体中的肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为高表达5T4(5T4+)的肿瘤。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少60％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少70％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少80％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少90％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少95％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少98％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少99％的肿瘤细胞表达5T4。
在一些实施方案中，肿瘤为实体瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为血液肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为恶性肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为癌症。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、尿路癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌及头颈癌以及上述癌症的转移灶。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和卵巢癌。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或第二方面所述的细胞群在制备用于治疗个体的肿瘤的药物中的用途。
在一些实施方案中，肿瘤为高表达5T4(5T4+)的肿瘤。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少60％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少70％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少80％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少90％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少95％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少98％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少99％的肿瘤细胞表达5T4。
在一些实施方案中，肿瘤为实体瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为血液肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为恶性肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为癌症。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、尿路癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌及头颈癌以及上述癌症的转移灶。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和卵巢癌。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。
第五方面，本申请提供了治疗个体的肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的第一方面所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或第二方面所述的细胞群或第三方面所述的药物组合物。
在一些实施方案中，肿瘤为高表达5T4(5T4+)的肿瘤。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少60％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少70％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少80％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少90％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少95％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少98％的肿瘤细胞表达5T4。在一些实施方案中，高表达5T4(5T4+)的肿瘤是指肿瘤细胞群体中至少99％的肿瘤细胞表达5T4。
在一些实施方案中，肿瘤为实体瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为血液肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为恶性肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为癌症。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、尿路癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌及头颈癌以及上述癌症的转移灶。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和卵巢癌。
在一些实施方案中，癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
实施例1-抗5T4抗体-NK细胞偶联物的制备
本实施例的抗体-NK细胞偶联物的制备大体可以分为以下几个步骤：
(1)抗5T4单克隆抗体的制备；
(2)NK细胞的制备；
(3)抗体连接子(本实施例中称为L2连接子)的制备；
(4)NK细胞连接子(本实施例中称为N1连接子)的制备；
(5)抗体连接子(L2连接子)施加于抗体；
(6)将NK细胞连接子(N1连接子)施加于NK细胞；以及
(7)使分别带有连接子的抗体和NK细胞偶联。
(1)抗5T4单克隆抗体的制备
简单而言，抗5T4单克隆抗体的序列来自于噬菌体文库筛选，通过5T4和表达5T4的细胞的结合活性筛选，亲和力研究确认后得到，选择得到抗5T4单克隆抗体，其中抗5T4单克隆抗体包括SEQ ID NO:1所示的重链可变区(HCDR1-3分别为SEQ ID NO:5、6、7)、SEQ IDNO:2所示的重链恒定区、SEQ ID NO:3所示的轻链可变区(LCDR1-3分别为SEQ ID NO:8、9、10)、SEQ ID NO:4所示的轻链恒定区。确定抗5T4单克隆抗体的DNA序列，构建表达抗5T4单克隆抗体的重组质粒(IB12)。
单克隆细胞株的构建是基于已知技术，其中将IB12质粒通过电转转染至CHO细胞中，经过对minipool的一轮筛选，以及单克隆铺板后得两轮筛选，并通过初步传代稳定性培养确认，得到可稳定表达抗5T4单克隆抗体的细胞株。
抗5T4单克隆抗体基于本领域已知的生产方案，包括细胞培养和蛋白纯化。取工作细胞，经过复苏、3～5轮扩增、中试规模培养，然后收集未处理细胞悬液(UPB)，经过澄清过滤得到细胞培养上清液。然后，通过蛋白纯化工艺，经过Protein A亲和、阴离子交换和阳离子交换的三步层析法，得到抗5T4单克隆抗体。
(2)NK细胞的制备
PBMC来自同种异体健康供者的单采外周血淋巴细胞。在分离T细胞和红细胞后，将细胞转移至原代细胞冻存液中，按照活细胞总数≥6.0×107个细胞/支的规格分装，即得到PBMC。PBMC在≤-175℃液氮中长期保存。
将冻存于液氮的PBMC取出，在适应的培养基中复苏，通过扩大培养规模(即，增加培养基扩增)，加入NK细胞相关的细胞因子，包括但不不限于IL2、IL15，维持其分裂增殖能力和活性。示例性的NK细胞培养阶段、工艺参数和过程控制指标如下表1所示。
表1
/>
/>
NK细胞的最终细胞纯度质量控制满足下文表2中的要求(其余的细胞密度、生物安全性等要求遵从行业标准)：
表2.
图3和4展示了最终制备的抗体-NK细胞偶联物的原液和制剂的上述免疫学标志物的流式细胞术检测结果。
(3)抗体连接子(本实施例中称为L2连接子)的制备
L2连接子的合成路线图参见图6，结构式参见图7，包括三个主要合成步骤：酰胺缩合、水解反应和合成活泼酯。
步骤1-酰胺缩合
二苯并氮杂辛炔戊二酸(L2-1)和氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸甲酯(L2-2)可作为商品获得，按照化学缩合反应，得到中间体二苯并氮杂辛炔戊二酰氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸甲酯(L2-3)。L2-3是稳定化合物。
具体而言，将化合物L2-1和化合物L2-2(1:1.1，L2-2过量)溶解在二氯甲烷(DCM)溶液中，分别加入羟基苯并三唑(HOBt)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCI)后，最后加入三乙醇胺(TEA)。混合液在室温下搅拌4～12小时，用水淬灭，二氯甲烷(DCM)提取两次，用硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化，得黄色油状物化合物L2-3。
步骤2-水解反应
通过步骤1得到的中间体L2-3经水解反应，得到中间体二苯并氮杂辛炔戊二酰氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸(L2-4)。水解反应通常是定量反应，不进行进一步纯化直接用于下一步合成。
具体而言，化合物L2-3溶于甲醇和水混合溶液，冷却至0℃后加入1mol/L氢氧化锂(LiOH)水溶液。混合液在0℃至室温下搅拌4-12小时，用1mol/L HCl酸化使pH在2-3之间，乙酸乙酯(EA)萃取3次，干燥，得黄色油状物，即中间体二苯并氮杂辛炔戊二酰氨基缩四乙二醇乙酰哌啶酸(L2-4)。
步骤3-合成活泼酯
通过步骤2得到的中间体L2-4(不经纯化)，与五氟苯酚、二环己基碳二亚胺(DCC)缩合，得到L2，即，二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯。
具体而言，化合物L2-4溶于四氢呋喃(THF)，冷却至0℃后加入2五氟苯酚、羟基苯并三唑(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)。混合液在0℃至室温下搅拌4～12小时，用乙酸乙酯(EA)萃取3次，干燥，经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化得黄色油状物，二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩四乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯(L2)，结构式参见图7。
(4)NK细胞连接子(本实施例中称为N1连接子)的制备
N1连接子的合成路线图参见图8，结构式参见图9，包括两个主要合成步骤：氨基叠氮乙酰化、羟基乙酰酯化。
步骤1-氨基叠氮乙酰化
1.2倍的a-叠氮乙酸(化合物1)、2倍的羟基苯并三唑(HOBt)和三乙胺(Et3N)，加入到D-半乳糖胺盐酸盐(化合物2)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入少量甲醇(MeOH)助溶，室温下反应12小时，将反应混合液倒入二氯甲烷(DCM)/甲醇(MeOH)中振荡混匀，加乙醚析出油状产物(化合物3)，倾出乙醚层，如此反复两次，真空干燥。未经进一步纯化，直接进行下一步反应。
步骤2-羟基乙酰酯化
将上述得到的化合物3加入无水吡啶(Pyr.)和乙酸酐(Ac2O)，在室温下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化剂，反应12小时，HPLC检测反应几乎完全，浓缩，得到四乙酰-N-叠氮乙酰-a,b-D-半乳糖胺的消旋体混合物。通过乙酸乙酯/石油醚中析出固体，主要为b-构型产物，纯度>85％。硅胶柱进一步纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到单一旋光异构体纯度大于90％的N1产物。a,b-两种异构体在细胞内可以互相异构化，经过多步代谢、合成，转为N-叠氮乙酰唾液酸，并最终在NK细胞表面糖蛋白上表达。N1连接子的结构式参见图9。
(5)将抗体连接子(L2连接子)施加于抗体
L2连接子与抗5T4单克隆抗体在PBS pH 7.2～7.4的体系中(优选HEPES pH7.2)可发生定点偶联反应(示意图参见图10)。通常一个抗5T4单克隆抗体可偶联1-4个(优选1-2个)L2连接子。可通过调节pH到5.0左右终止反应，得到L2偶联抗体。
(6)将NK细胞连接子(N1连接子)施加于NK细胞
待NK细胞培养至15～16天时，向培养基中加入N1连接子，孵育12～18小时，得到N1连接子修饰的NK细胞(本申请的实施例中称为“UNK”)(N1连接子与NK细胞的连接机制和UNK的结构示意图参见图11和12)。
(7)使分别带有连接子的抗体和NK细胞偶联
使UNK与L2偶联抗体在培养基中发生偶联反应(反应机制参见图13)，得到抗体-NK细胞偶联物的原液(DS)。该抗5T4单克隆抗体-NK细胞偶联物被命名为“IBR854”，后续实施例中使用此命名代表抗5T4抗体-NK细胞偶联物。
后续工艺还包括制备抗体-NK细胞偶联物制剂，使抗体-NK细胞偶联物的稳定性有效延长。制剂配方中可以含有氯化钠、人血清白蛋白等维持等渗的成分，也可以含有海藻糖、蔗糖、葡聚糖、DMSO等维持细胞的耐低温能力、蛋白和酶的活性的成分。
利用流式细胞术对抗体-NK细胞偶联物原液(图3)和制剂(图4)的NK细胞纯度进行检测，结果达到98％以上，超过标准要求的95％。此外，还利用流式细胞术对抗体-NK细胞偶联物原液和制剂的偶联阳性率进行了检测，并以UNK作为对照，结果表明，原液和制剂的偶联阳性率超过了98％(图5)，通常标准要求为90％。
实施例2-偶联物IBR854与抗5T4单克隆抗体的基本抗体性质比较
在本实施例中，将实施例1制备的偶联物IBR854与实施例1的步骤(1)制备的抗5T4单克隆抗体的多项基本抗体性质进行了比较，结果如下文表3所示，其中各个测试项目的方法学均遵循本领域中的常规测试方法。
表3.
由表3的结果可以看出，抗5T4单克隆抗体与NK细胞偶联未显著地影响抗体自身的性质，使得抗体的希望性质得以保留。
实施例3-偶联物IBR854对肺癌、乳腺癌和胰腺癌细胞的体外杀伤活性评价
在本实施例的细胞杀伤活性评价中，选择了8个表达5T4的肿瘤细胞系，包括肺癌细胞系H1975、NCI-H292、NCI-H226和HCC827，乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468，以及胰腺癌细胞系Panc-1和BxPC3，它们预先测定的5T4表达水平(流式细胞术测定)如下文表4所示：
表4.
| 细胞系 | 5T4表达率 |
| H1975 | 82.1％ |
| NCI-H292 | 68.3％ |
| NCI-H226 | 98.1％ |
| MDA-MB-231 | 78.0％ |
| MDA-MB-468 | 73.5％ |
| Panc-1 | 87.7％ |
| BxPC3 | 71.7％ |
| HCC827 | 82.1％ |
首先，利用实时无标记细胞分析技术检测偶联物IBR854以及作为参照的NK细胞(实施例1的步骤(2)获得)、UNK细胞(实施例1的步骤(6)获得)对8个肿瘤细胞系的细胞杀伤活性。实验中设置一个肿瘤细胞单独对照组。NK细胞、UNK细胞和偶联物IBR854分别设置3个浓度，每个浓度3个复孔。肿瘤细胞接种到检测板中，并加入NK细胞、UNK细胞和IBR854，RTCA仪器设置每隔15min监测并记录细胞指数(cell index，CI)值，根据细胞指数变化计算细胞杀伤率，结果示于图14至图21。结果显示，IBR854对肺癌、乳腺癌和胰腺癌细胞共8株细胞系的细胞杀伤率达到85％以上，杀伤活性高于NK细胞和UNK细胞。
接下来，采用Calcein AM释放法检测IBR854杀伤8个肿瘤细胞系的剂量效应关系。IBR854设置8个浓度，每个浓度6个复孔。用酶标仪检测荧光强度变化并计算细胞杀伤率和EC50值，结果显示于下文的表5中。
结果显示，IBR854对8个肿瘤细胞系均具有显著的杀伤作用，EC50(效靶比)值在0.86-5.06之间，最大抑制率达到75％以上。
表5.
实施例4-偶联物IBR854的因子释放功能评价
本实施例对偶联物IBR854导致的细胞因子分泌进行功能性研究，研究的细胞因子包括：IL-2(白细胞介素-2)、IL-6(白细胞介素-6)、IL-15(白细胞介素-15)、IL-1β(白细胞介素-1β)、TNFα(肿瘤坏死因子α)、IFNγ(γ干扰素)、IL-8(白细胞介素-8)、CCL2(趋化因子2)、CCL3(趋化因子3)、CCL5(趋化因子5)等。对于细胞因子的测量采用商业化ELISA试剂盒，对各种细胞培养物上清按照生产商的操作指南进行测定。
(1)使偶联物IBR854与三种肿瘤的效应细胞(H1975、BxPC-3、BxPC-3)按不同效靶比(1:1、3:1、10:1、30:1)共孵育后，ELISA法测定细胞培养上清的IL-2、IL-6、IL-15、IL-1β的分泌水平，结果如表6至表9所示。
结果显示，IL-2、IL-6、IL-15、IL-1β各因子分泌水平均低于健康人平均水平。IL-2因子水平均小于2.0pg/ml，呈剂量依赖性，低于健康人血清中IL-2水平9.40±2.31ng/ml；IL-6因子水平均小于0.3pg/ml，低于健康人血清中IL-6水平60.32±3.24pg/ml；IL-15因子水平均小于0.5pg/ml，低于健康人血清中IL-15水平13.38±4.41pg/ml；IL-1β分泌水平均小于0.5pg/ml。
表6.
表7.
表8.
表9.
(2)使偶联物IBR854与NCI-H292和MDA-MB-231肿瘤细胞在10:1、3:1、1:1的效靶比条件下共孵育(同时，以相同效靶比量的偶联物IBR854、但无肿瘤细胞的情况作为对照)，ELISA法测定细胞培养上清的TNFα和IFNγ的分泌水平。如表10和表11的结果所示，IBR854与NCI-H292、MDA-MB-231肿瘤细胞共孵育后，TNFα、IFNγ的分泌水平与剂量呈正相关，TNFα水平低于健康人平均水平22.75±6.28μg/ml，与肿瘤细胞共孵育后TNFα、IFNγ的分泌水平均显著上调，与肿瘤的杀伤作用存在一定的相关性。
表10.
表11.
(3)使偶联物IBR854与肿瘤细胞H1975、BXPC-3、Panc-1按照不同效靶比(1:1、3:1、10:1、30:1)共孵育后，ELISA法测定细胞培养上清的CCL2、CCL3、CCL5和IL-8(CXCL8)的分泌水平。如表12-14的结果所示，CCL3、CCL5和IL-8(CXCL8)的因子水平与IBR854暴露剂量呈正相关性。CCL3、CCL5和IL-8(CXCL8)是偶联物IBR854杀伤肿瘤细胞的一种可能贡献方式，通过对巨噬细胞、白细胞等相关免疫细胞的趋化能力来实现。CCL2的因子分泌水平与IBR854暴露剂量呈负相关，原因可能在于肿瘤细胞可以通过分泌CCL2来实现迁移和侵袭，而NK细胞抑制了肿瘤细胞的趋化能力，体现在CCL浓度随着与NK的效靶比升高而下降。
表12.
表13.
表14.
(4)使偶联物IBR854与NCI-H292和MDA-MB-231肿瘤细胞在10:1、3:1、1:1不同效靶比条件下共孵育(同时，以相同效靶比量的偶联物IBR854、但无肿瘤细胞的情况作为对照)，取细胞培养上清用ELISA法检测颗粒酶B和穿孔素的分泌水平。如表15和表16的结果所示，单独的IBR854会分泌一定量的颗粒酶B和穿孔素，分泌量呈剂量依赖性，当IBR854与NCI-H292和MDA-MB-231肿瘤细胞共孵育，肿瘤刺激前后颗粒酶B的表达量上调、穿孔素的分泌量变化不显著。
表15.
表16.
(5)采用流式细胞术，检测IBR854与H292肿瘤细胞共孵育后FasL/TRAIL因子分泌水平的变化。将IBR854与H292肿瘤细胞分别共孵育1h、2h、3h、4h后，分别加入TRAIL和FasL流式抗体染色后，使用流式方法分析IBR854细胞表面的TRAIL和FasL的表达变化。IBR854在杀伤H292肿瘤细胞时，NK细胞表面FasL和TRAIL表达随时间发生变化，先增加后降低，与剂量没有显著相关性。结果如图22和图23所示。
实施例5-偶联物IBR854的NCI-H292荷瘤鼠模型药效研究
70只M-NSG小鼠每只腋下接种5.0×106个NCI-H292细胞，待肿瘤平均体积达50mm3左右时，根据肿瘤体积对动物随机分组给药。实验共分7组，每组10只：
组1-溶媒对照(制剂缓冲液)，
组2-抗体对照(实施例1中的抗5T4抗体，0.75mg/kg)，
组3-IL-15，
组4-IL-15+IBR854低剂量(2.5×108细胞/kg)，
组5-IL-15+IBR854中剂量(5.0×108细胞/kg)，
组6-IL-15+IBR854高剂量(1.0×109细胞/kg)，
组7-IBR854中剂量(5.0×108细胞/kg)。
在体内药效试验中外源性增加IL-15，提高IBR854在动物体内的存续时间。IL-15(90μg/kg)腹腔注射给药，每周一次，共3次。其余组别尾静脉注射给药，每周两次，间隔一天，共6次。每周称量体重和测量肿瘤体积2次，第28天处死M-NSG小鼠取瘤块称重。
人肺癌细胞NCI-H292移植瘤小鼠模型药效实验设计如表17所示。
表17.
-：不适用；
BIW：每周两次；QW：每周一次；W：周；iv：静脉注射；ip：腹腔注射。
结果表明：
1)实验结束时，各组未见小鼠死亡；与溶媒对照组相比，IBR854各剂量组小鼠体重未见明显下降提示IBR854的安全性和耐受性良好。
2)第8天起，IL-15+IBR854各剂量组小鼠肿瘤体积较溶媒对照组有不同程度下降；第28天时，IL-15+IBR854高剂量组较溶媒对照组的肿瘤体积、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率(T/C)均呈统计学显著性降低，结果参见图24和表18。
表18.
-：不适用。
与溶媒对照组相比，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001；与IL-15组相比，##：p<0.01；
肿瘤体积V＝1/2×a×b2，a和b分别为肿瘤的长径和短径；
相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/V1，V1为分组给药时(即D1)所测得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积；
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％，其中TRTV为给药组的RTV，CRTV为溶媒对照组的RTV；
IR(％)＝(1-TWt/TWc)×100％，其中TWt为给药组的瘤重，TWc为溶媒对照组的瘤重。
因此，在本实施例的实验条件下，接受2.5×108～10.0×108细胞/kg范围的IB854处理的动物耐受良好。IL-15+IBR854高剂量尾静脉给药(每周两次，共6次)能显著性地抑制人肺癌细胞NCI-H292移植瘤小鼠肿瘤的生长。
实施例6-偶联物IBR854的MDA-MB-468荷瘤鼠模型药效研究
50只NCG小鼠每只接种4×106个MDA-MB-468细胞后，待肿瘤体积达30-80mm3左右时，根据肿瘤体积对动物随机分组给药。实验共分5组，每组10只：
组1-溶媒对照(制剂缓冲液)，
组2-IL-15，
组3-IL-15+IBR854低剂量(5.0×108细胞/kg)，
组4-IL-15+IBR854中剂量(1.0×109细胞/kg)，
组5-IL-15+IBR854高剂量(1.5×109细胞/kg)组。
在体内药效试验中外源性增加IL-15，提高IBR854在动物体内的存续时间。IL-15(0.18mg/kg)腹腔注射给药，每周一次，共3次。其余组别尾静脉注射给药，给药频率均为每周两次，共6次。每周称量体重和测量肿瘤体积2次，第20天处死NCG小鼠取瘤块称重。
人乳腺癌细胞MDA-MB-468移植瘤小鼠模型药效实验设计如表19所示。
表19.
-：不适用；分组给药当天为第0天；
BIW：每周两次；W：周；iv：静脉注射；ip：腹腔注射。
结果表明：
1)体重及临床观察：本实施例中，所有小鼠均未出现明显的体重下降和行为异常，表明小鼠在该实验条件下，对IBR854注射液具有较好的耐受性；
2)肿瘤体积：给药第20天，组1(溶媒对照组)的肿瘤平均体积161.44±6.46mm3；与溶媒对照组相比，组2(IL-15组)，组3(IL-15+IBR854低剂量组)，组4(IL-15+IBR854中剂量组)，组5(IL-15+IBR854高剂量组)的肿瘤平均体积分别为160.18±11.36mm3、134.94±5.11mm3(p<0.05)、124.02±6.91mm3(p<0.001)和114.19±3.50mm3(p<0.001)，IL-15+IBR854低、中、高三个剂量组肿瘤体积逐渐降低，肿瘤体积具有显著的剂量依赖性的抑瘤效果；
3)肿瘤生长抑制率(TGI)：与溶媒对照组相比，IL-15组、IL-15+IBR854低剂量组、IL-15+IBR854中剂量组和IL-15+IBR854低剂量组的肿瘤生长抑制率(TGI)分别为0.74％、31.49％、44.11％和56.66％；
4)肿瘤重量：肿瘤重量降低率分别为-6.00％、16.85％、22.97％和32.97％。与溶媒对照组相比，IBR854各给药组的肿瘤体积与重量均显著减小(p<0.05)，具有非常显著的剂量依赖性抑瘤效果。
具体结果参见图25、图26和表20。
表20.
与溶媒对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
肿瘤体积V＝0.5×a×b2，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径；
肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-T/C)×100％。T/C％为肿瘤相对增殖率，T/C％＝(Ti-T0)/(Vi-V0)×100％，即在某一时间点，Ti为给药组开始给药后的平均肿瘤体积，T0为给药组首次给药时的平均肿瘤体积，V0为溶媒对照组首次给药时的平均肿瘤体积，Vi为溶媒对照组开始给药后的平均肿瘤体积；T/C＝TRTV/CRTV×100％，其中TRTV为给药组的RTV，CRTV为溶媒对照组的RTV。
因此，在本实施例的实验条件下，接受5.0×108～1.5×109细胞/kg范围的IB854处理的动物耐受良好。IL-15+IBR854尾静脉给药(每周两次，共6次)能剂量依赖地显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-468移植瘤小鼠肿瘤的生长。
实施例7-具有不同L连接子的抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物的体外杀伤活性评价
本申请的抗5T4抗体-自然杀伤细胞偶联物中与抗体部分偶联的连接子的实例为二苯并氮杂辛炔-戊二酰-氨基缩乙二醇-乙酰哌啶酸五氟苯酯，结构如下所示：
其中n为0-8的整数。
本实施例测试了具有L2(n＝3)、L3(n＝1)这两种抗体部分连接子的偶联物的体外杀伤活性。
L2连接子即上文实施例1中制备的IBR854中的连接子。具有L3连接子的偶联物的制备过程与实施例1中制备IBR854的过程相似，不同之处在于制备L3连接子时选取不同的L2-2底物，相应的底物也是可商购的。
体外杀伤活性测试方法与实施例3相似，测试细胞系为H292，同样选取NK细胞(实施例1的步骤(2)获得)、UNK细胞(实施例1的步骤(6)获得)作为参照。
如图27的结果所示，具有L2和L3连接子的偶联物对H292细胞的杀伤活性均优于NK和UNK细胞，其中具有L2(即，IBR854)和L3连接子的偶联物的杀伤活性相当。
实施例8-偶联物IBR854对结直肠癌和胃癌细胞的体外抑制活性评价LOVO是一种结直肠癌癌细胞。将LOVO细胞按照10000个细胞/孔在96孔板中培养并完成贴壁，用IBR854进行细胞抑制活性研究(效靶比为2:1)，并使用xCELLigence系统监测肿瘤细胞增殖，以及效应细胞(IBR854以及作为参照的NK细胞和UNK细胞+抗体混合物)抑制效果随时间的变化趋势(图28)。在作用55小时后，NK细胞的抑制率为43.6％，UNK+抗5T4偶联抗体(10μg/ml)的抑制率为64.3％，IBR854的细胞抑制率为86.8％。对照组不含效应细胞(图29)。
N87是一种胃腺癌细胞。将N87细胞按照80000个细胞/孔在8孔板中培养并完成贴壁。用IBR854进行细胞抑制活性研究(效靶比为2:1，作用时间为24小时)，并使用xCELLigence系统监测肿瘤细胞增殖，以及效应细胞(IBR854以及作为参照的NK细胞和UNK细胞+抗体混合物)抑制效果随时间的变化趋势(图30)。在作用24小时后，NK细胞的抑制率为30.5％，UNK+抗5T4偶联抗体(10μg/ml)的抑制率为56.9％，IBR854的细胞抑制率为63.5％(图31)。
对照组不含效应细胞。
本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本申请，而不对本申请的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元件对于实施本申请是必要的。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本申请的理解，并且不意图以任何方式将本申请限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本申请，但是本申请应当被认为是说明性的而不是限制性的。
Claims (5)
1.抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物，所述抗体为抗5T4抗体或其抗原结合片段，所述抗5T4抗体或其抗原结合片段与所述NK细胞通过连接子偶联。
2.细胞群，其包含权利要求1所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物。
3.药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或权利要求2所述的细胞群，以及药学可接受的载体。
4.权利要求1所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或权利要求2所述的细胞群在制备用于治疗个体的肿瘤、特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤的药物中的用途。
5.治疗个体的肿瘤、特别是肿瘤细胞高表达5T4(5T4+)的肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1所述的抗体-自然杀伤细胞(NK细胞)偶联物或权利要求2所述的细胞群或权利要求3所述的药物组合物。
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