CN117482083A - 土木香内酯在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了土木香内酯在制备抗病毒药物中的应用，属于生物医药技术领域。土木香内酯通过提高宿主基于I型干扰素的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抵抗力，达到预防和治疗病毒感染性疾病的目的。本发明发现了一个可以有效激活宿主I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达的中药单体化合物。因此，本发明为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个潜在的新抗病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及土木香内酯在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
病毒感染是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程。病毒感染性疾病具有高传播力和致病性强的特点，目前大多数病毒感染性疾病均无特效药物治疗，特异性疫苗和抗病毒药物仍是临床治疗病毒感染的最有效的工具。然而随着气候变化和全球化为病毒传播创造了更有利的条件，新发病毒的暴发可能更为频繁。因此，研制有效的抗病毒药物，尤其是可以治疗不同病毒引发疾病的抗病毒药物，来对抗未来可能暴发的新发和变异病毒感染具有重大科学意义和应用前景。
目前已经研发出来的抗病毒药物可分为：1.靶向病毒本身干预病毒感染活力；2.靶向病毒复制所必需的宿主因子来调节宿主细胞防御系统抗病毒。以板蓝根为代表的中药在预防和治疗病毒感染性疾病中占有重要地位，凸显了中医药防治病毒感染性疾病的显著优势。因此，利用现代科学研究方法和技术从传统中医药中发现新的抗病毒药物必将是未来抗病毒药物研究的一大趋势，具有切实的可行性。
土木香内酯(土木香内酯Alantolactone简称ATL)是从土木香的根中提纯的倍半萜内酯化合物。土木香，是菊科旋覆花属植物土木香的干燥根，是蒙医常用清热类药，性甘、苦、辛，具清“巴达干”热、解“赫依”血相讧、温中消食、健脾开欲、止刺痛等功效。近年来研究发现，土木香内酯的药理作用非常广泛，在抗肿瘤、抗菌、抗炎、驱虫、镇痛、保肝及降糖等方面都表现出良好的生理活性。但尚未发现具有抗病毒作用。
发明内容
本发明的目的是提供土木香内酯在制备抗病毒药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种抗病毒的药物，所述药物中包括土木香内酯或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同系物、溶剂化物、前药或多晶型物。
优选的是，所述病毒包括脑心肌炎病毒、甲型流感病毒和/或水疱性口炎病毒。
本发明还提供土木香内酯在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和/或治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
优选的是，所述病毒包括脑心肌炎病毒、甲型流感病毒和/或水疱性口炎病毒。
优选的是，所述土木香内酯通过激活I型干扰素通路，诱导抗病毒免疫相关基因表达。
本发明还提供土木香内酯在制备激活I型干扰素通路的药物中的应用。
本发明还提供土木香内酯在制备诱导抗病毒免疫相关基因表达的药物中的应用。
优选的是，所述病毒免疫相关基因包括Ifna1、Ifnb1、Isg15和Ifit1。
基于上述技术特征，本发明具有以下技术效果：
本发明分别在细胞水平检测土木香内酯对多种病毒复制的抑制作用及对I型干扰素及ISGs的诱导功能。
1、细胞水平检测土木香内酯的抗病毒功能，结果显示土木香内酯的加入可显著地抑制多种病毒在细胞中的扩增。
2、土木香内酯诱导I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达：细胞水平给药土木香内酯，qPCR检测Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15，与对照组相比，仅加药就能显著上调I型干扰素及干扰素诱导基因表达。
本发明发现了一个可以有效激活宿主I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达的中药单体化合物。本发明是对抗病毒药物的补充，相较于已有广谱抗病毒药物，土木香内酯通过提高宿主基于I型干扰素的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抵抗力，达到预防和治疗病毒感染性疾病的目的。因此，本发明为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个潜在的新抗病毒药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明其中一个实施例中的土木香内酯(ATL)的结构及在A549细胞的增殖-毒性检测；其中，a为土木香内酯的结构；b为土木香内酯对A549细胞的毒性；
图2为本发明其中一个实施例中的ATL在A549细胞中抑制EMCV病毒复制qPCR结果图；
图3为本发明其中一个实施例中ATL在A549细胞中抑制H1N1病毒复制的qPCR结果图(a)和Western Blot结果图(b)；
图4为本发明其中一个实施例中的ATL在A549细胞中抑制VSV病毒复制的流式细胞术检测结果图和Western Blot结果图，其中，a为加药(5、10、20和40μM)检测病毒复制的流式细胞术检测结果，b为a图的柱状统计图，c为蛋白水平上检测ATL浓度梯度抑制VSV病毒复制的Western Blot结果图；
图5为本发明其中一个实施例中ATL在细胞水平激活I型干扰素信号通路的活性检测，ATL在MEF细胞中激活Ifna1(a)、Ifnb1(b)、Isg15(c)和Ifit1(d)mRNA的表达qPCR结果图；
图6为本发明其中一个实施例中ATL在野生型细胞(A549细胞)和IFNAR1敲除A549细胞(Ifnar1-/-A549)中对H1N1病毒的抑制qPCR结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1ATL在细胞水平的增殖-毒性检测
土木香内酯结构如图1中a所示，将不同浓度(0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μM)的土木香内酯加入培养于96孔板的肺癌人类肺泡基底上皮细胞A549细胞(细胞量3万/孔，每孔100μL)中，每个浓度3个复孔，孵育24h后，加入CCK8试剂，37℃孵育30min后，酶标仪检测450nm吸光度。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示。如图1结果所示，土木香内酯在A549细胞中孵育24h的IC50为79.63μM。
实施例2ATL在细胞水平抑制脑心肌炎病毒(EMCV)的复制
为了探究ATL抗EMCV病毒的活性，发明人使用RNA病毒EMCV(脑心肌炎病毒)感染A549细胞，检测ATL对病毒复制的影响。具体如下：A549细胞中同时加入EMCV病毒(MOI＝3)和不同浓度(5、10、20μM)的土木香内酯，共孵育8h后，收细胞提取RNA，qPCR检测细胞中EMCV病毒载量变化。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001。
图2为ATL在细胞水平抑制EMCV病毒的qPCR结果示意图。如图2结果发现，对照组中EMCV病毒扩增明显，而加入土木香内酯的实验组以剂量依赖的方式显著抑制病毒基因表达，其中20μM时抑制最为显著。土木香内酯处理细胞后，EMCV病毒基因表达受抑制，说明ATL可有效抵抗EMCV病毒感染，具有潜在的抗EMCV病毒的功能。
实施例3ATL在细胞水平抑制甲型流感病毒(H1N1)病毒的复制
为了探究ATL抗H1N1病毒的活性，发明人使用RNA病毒H1N1感染A549细胞，检测ATL对病毒复制的影响。具体如下：A549细胞中同时加入H1N1病毒和不同浓度(5、10、20μM)的土木香内酯，共孵育12h后，收细胞提取RNA，qPCR检测细胞中H1N1病毒载量变化。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001。
不同浓度的ATL(5、10、20μM)加入培养于12孔板的A549细胞(细胞量30万/孔)，同时感染H1N1病毒(MOI＝0.1)，16h后收集细胞，提取蛋白后进行Western Blot检测H1N1-NP蛋白的表达情况。
图3为ATL在细胞水平抑制H1N1病毒的结果示意图。qPCR结果发现(图3-a)，对照组中H1N1病毒扩增明显，而加入土木香内酯的实验组以剂量依赖的方式显著抑制病毒基因表达，其中20μM时抑制最为显著。土木香内酯处理细胞后，H1N1病毒基因表达受抑制，说明ATL可有效抵抗H1N1病毒感染，具有潜在的抗H1N1病毒的功能。Western Blot结果显示(图3-b)，随着ATL浓度的增加，H1N1-NP蛋白的表达逐渐减弱甚至完全消失。这些结果表明，土木香内酯可有效抑制H1N1病毒复制。
实施例4ATL在细胞水平抑制水疱性口炎病毒(VSV)复制
将带有GFP标签的水疱性口炎病毒VSV病毒(MOI＝0.05)和不同浓度(5、10、20μM)的土木香内酯(ATL)加入培养于24孔板的肺癌人类肺泡基底上皮细胞A549细胞(细胞量15万/孔)，一起孵育12h后，收集细胞进行流式细胞术检测含有GFP阳性细胞的百分率。实验独立重复3次，结果采用平均值±标准误表示，与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001。
不同浓度的ATL(5、10、20μM)加入培养于12孔板的A549细胞(细胞量30万/孔)，同时感染VSV病毒(MOI＝0.1)，16h后收集细胞，提取蛋白后进行Western Blot检测VSV-G蛋白的表达情况。
如图4所示，流式细胞术显示，土木香内酯可剂量依赖性(5、10、20μM)降低GFP阳性细胞百分率(a)，柱形图统计了GFP阳性细胞的百分比(b)。GFP阳性比例越高，表明VSV病毒复制越强，加入土木香内酯后，阳性率下降。Western Blot结果显示，随着ATL浓度的增加，VSV-G蛋白的表达逐渐减弱甚至完全消失(c)。这些结果表明，土木香内酯可有效抑制VSV病毒复制。
实施例5土木香内酯激活I型干扰素通路
抗病毒天然免疫是抵御病原体入侵的第一道防线，I型干扰素信号通路的激活在抗病毒免疫应答中具有重要作用。为了探究土木香内酯对I型干扰素信号通路是否有调控作用，用不同浓度(5、10、20μM)的ATL孵育小鼠原代胚胎成纤维细胞MEF，12h后收集细胞，提取RNA后进行qPCR，检测Ifna1和Ifnb1和干扰素诱导基因(Isg15/Ifit1)的表达情况。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，***P＜0.001。
如图5中qPCR结果显示，单独加ATL处理细胞显著诱导Ifna1和Ifnb1表达，与此同时，干扰素诱导基因(Isg15和Ifit1)也上调表达。这些结果表明，土木香内酯可有效激活I型干扰素通路，诱导抗病毒免疫相关基因表达。
实施例6土木香内酯的抗病毒功能部分依赖IFN-I信号通路
IFNAR1是细胞表面IFN的重要受体，其与IFN结合后可激活下游JAK-STAT信号通路。因此，发明人利用IFNAR1敲除A549细胞(Ifnar1-/-A549)探究土木香内酯发挥抗病毒作用与IFN-I信号通路的依赖关系。具体如下：A549细胞中和Ifnar1-/-A549细胞中同时加入H1N1病毒(PR8)和5、10μM的土木香内酯，共孵育12h后，收细胞提取RNA，qPCR检测细胞中H1N1病毒载量变化。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值±标准误表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
如图6中qPCR结果显示，与野生型细胞(A549细胞)相比，在Ifnar1-/-A549细胞中土木香内酯抗病毒功能被显著削弱。上述结果表明，土木香内酯的抗病毒功能部分依赖IFN-I信号通路。
综上，本发明分别在细胞水平检测土木香内酯对多种病毒复制的抑制作用及对I型干扰素及ISGs的诱导功能。
1、细胞水平检测土木香内酯的抗病毒功能：选用抗病毒免疫应答常用细胞株肺癌人类肺泡基底上皮细胞A549、小鼠原代胚胎成纤维细胞MEF开展药理药效研究。实验用多种病毒包括RNA病毒VSV(水疱性口炎病毒)、EMCV(脑心肌炎病毒)、H1N1(甲型流感病毒)感染细胞，土木香内酯的加入可显著地抑制上述多种病毒在细胞中的扩增。
2、土木香内酯诱导I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达：细胞水平给药土木香内酯，qPCR检测Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15，与对照组相比，仅加药就能显著上调I型干扰素及干扰素诱导基因表达。
本发明是对抗病毒药物的补充。相较于已有广谱抗病毒药物，土木香内酯通过提高宿主基于I型干扰素的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抵抗力，达到预防和治疗病毒感染性疾病的目的。目前，国内基于增强I型干扰素表达发挥广抗病毒功能的药物不多，本发明发现了一个可以有效激活宿主I型干扰素及干扰素诱导基因(ISGs)表达的中药单体化合物。因此，本发明为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个潜在的新抗病毒药物。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种抗病毒的药物，其特征在于，所述药物中包括土木香内酯或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同系物、溶剂化物、前药或多晶型物。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述病毒包括脑心肌炎病毒、甲型流感病毒和/或水疱性口炎病毒。
3.土木香内酯在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和/或治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒包括脑心肌炎病毒、甲型流感病毒和/或水疱性口炎病毒。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述土木香内酯通过激活I型干扰素通路，诱导抗病毒免疫相关基因表达。
6.土木香内酯在制备激活I型干扰素通路的药物中的应用。
7.土木香内酯在制备诱导抗病毒免疫相关基因表达的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒免疫相关基因包括Ifna1、Ifnb1、Isg15和Ifit1。
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