CN106924282B

CN106924282B - 聚醚酰亚胺在制备预防流感病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN106924282B
Application number: CN201511009519.7A
Authority: CN
Inventors: 姜世勃; 陆路; 贺彪
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2035-12-29
Also published as: CN106924282A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及聚醚酰亚胺在制备预防流感病毒感染的药物中的应用。本发明中，通过流感病毒感染动物模型及在其上开展的动物保护实验，证明提前鼻道给药聚醚酰亚胺后，小鼠可抵抗致死剂量的H1N1的感染，表明聚醚酰亚胺具有预防流感病毒感染的功能；其作用机制研究结果显示，其相对其他免疫激活剂具有更显著的优势，能诱导抗病毒因子而且对可加重流感病情的IL‑17的诱导效应小。本发明所述的聚醚酰亚胺可进一步开发制备预防流感病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。

Description

聚醚酰亚胺在制备预防流感病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及聚醚酰亚胺在制备预防流感病毒感染的药物中的应用。

背景技术

流行性感冒病毒(Influenza virus)，简称流感病毒，其属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。人类流感病毒根据其核蛋白和基质蛋白的抗原性等特征可以分为A，B，C三型，也称为甲、乙、丙三型。其中A型(甲型)流感根据病毒表面血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性不同，还可进一步分为HXNX亚型，例如H5N1，H7N9。

流感病毒所引发的流行性感冒是一种严重威胁人类健康的呼吸道传染性疾病，全球每年季节性流感会造成300万～500万人产生严重症状，并可导致大约25万～50万人的死亡。每年因为流感而造成的医疗费用约为30-50亿美元，而严重的流感流行造成的直接和间接经济损失竟然高达140亿美元。20世纪曾爆发了多次世界性的流感大流行，其中1918-1919年的“西班牙”流感就导致至少2000万人的死亡3-4，超过第一次世界大战的死亡人数。21世纪首次流感大爆发(2009年的“猪流感”)对人类健康再次造成的巨大威胁，成为高度关注的全球性公共卫生事件。目前，全球还面临着高致病性禽流感的重大威胁，根据WHO的报告，高致病性禽流感H5N1的死亡率高达50％。2013年我国新发的高致病性禽流感H7N9的死亡率也超过20％。

现有技术中接种疫苗和使用抗流感病毒药物是应对流感大流行及保障人民生命安全的重要手段。但由于流感病毒易发生亚型重组及突变，而大流行之前无法准确的确定流行亚型和突变位点，因此来不及制备大量有效的疫苗。同时，现有的抗流感病毒药物方面，目前全世界仅有四种特异性抗流感药物被批准用于临床治疗，这四种药物分别来自于两大类：一类为M2蛋白离子通道阻滞剂，代表性的药物为金刚烷胺(Amantadine)，为最早用于治疗流感的药物；另一类为NA蛋白神经氨酸酶抑制剂，代表性的药物为奥司他韦(Oseltamivir，达菲)。遗憾的是，目前M2蛋白离子通道阻滞剂已产生了显著的耐药性，中国疾病控制中心已建议此类药物不再用于预防流感。对NA蛋白神经氨酸酶抑制剂的耐药性也在快速的形成，目前在H7N9上已出现了奥司他韦(Oseltamivir，达菲)的耐药株，给临床治疗提出严峻的挑战。

因此研究并开发新型的可用于预防流感病毒感染的药物对于抵抗流感感染，特别是新发高致病性流感病毒感染具有重要意义。

聚醚酰亚胺(Polyetherimide)，简称PEI(以下也简称为PEI)，化学式为(C37H2406N2)n，是琥珀色透明固体，具有很强的高温稳定性，有线性PEI和分支PEI两大类，此外PEI的多聚程度不同，其分子量也不同，常见的有22kD和25kD的PEI。由于PEI是阳离子多聚物，能与带负电荷的DNA结合，因此普遍用于细胞转染。近来国际著名杂志《NatureBiotechnology》报道PEI具有非常强的佐剂效应，其诱导产生的细胞因子偏向于Th2型细胞因子，比如IL-4，IL-5和IL-13等，但是对IL-17，IFN-γ和TNF-α的诱导作用比较弱(参考文献Polyethyleneimine is a potent mucosal adjuvant for viral glycoproteinantigens.Nat.Biotechnol.2012Sep；30(9):883-8.)。到目前为止，国内外尚未见有PEI预防流感病毒感染引起的疾病的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供聚醚酰亚胺(简称PEI)在制药中的新用途，具体涉及聚醚酰亚胺(PEI)在制备预防流感病毒感染的药物中的用途。

在本发明中，通过流感病毒感染动物模型“攻毒-保护”的实验，证明了提前鼻道给药PEI后，小鼠可抵抗致死剂量的H1N1的感染，即PEI具有预防流感病毒感染的功能。同时，本发明对其作用机制进行了研究，结果显示，其相对其他免疫激活剂具有更显著的优势，能诱导抗病毒因子而且对可加重流感病情的IL-17的诱导效应小。因此，本发明所述的PEI可进一步开发制备预防流感病毒感染的药物。

本发明与现有的技术相比，具有以下优点和效果：

1.在动物模型上证明PEI具有预防流感病毒感染的效果，并且证实其抗病毒机制与广泛使用的现有临床药物达菲等神经氨酸酶抑制剂不同，有利于开发新型不同作用机制的、对现有临床药物耐药病毒仍有效的抗病毒药物。

2.与之前报道的能通过诱导抗病毒因子来预防流感病毒感染的双链多核苷酸(polyIC)和霍乱毒素B亚基(CTB)相比，PEI具有更强的保护效果，以及更低的副作用。

3.PEI目前作为佐剂已开展大量动物试验，此外PEI已广泛用于DNA转染的临床试验，说明其具有较好的生物体内安全性，具有很大的开发潜力。

附图说明

图1H1N1攻毒后的体重丢失图和存活率，

其中：10周左右的SPF级Balb/c雌性小鼠在H1N1攻毒前48小时和24小时在麻醉的条件下鼻道给药PEI(20μg),polyIC(20μg),CTB(2.5μg)和PBS，体积为50μl；H1N1攻毒剂量为5LD50；P值小于0.05视为有显著性差异。

图2H1N1攻毒后第2天和第4天的肺部病毒滴度，

其中：攻毒后第2天和第4天收集各组小鼠的肺灌洗液，于MDCK细胞上检测病毒滴度；*表示PEI组与PBS组相比有显著性差异，*表示polyIC组与PBS组相比有显著性差异；P值小于0.05视为有显著性差异。

图3H1N1攻毒后的肺部HE染色，

其中：A图为小鼠肺部切片HE染色后的图片，B图为HE染色后通过光显微镜扫描得到的统计学数据；*表示PEI组与PBS组相比有显著性差异，*表示polyIC组与PBS组相比有显著性差异，*表示CTB组与PBS组相比有显著性差异。

图4第二次给药后24小时的肺部细胞因子的变化，

其中，匀质处理后的小鼠肺用于RNA提取以及qRT-PCR检测；a表示与PBS组相比有显著性差异，b表示与PEI组相比有显著性差异。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步的说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

目前，流感病毒预防保护效果的研究主要采用小鼠攻毒模型，常用小鼠为Balb/C雌性小鼠，流感病毒H1N1(A/PR8/34)广泛应用于流感疫苗和药物的研究，通过滴鼻途径感染小鼠，当小鼠体重丢失大于25％或者自然死亡判定为已死(参考文献The putativesuppressing effect of IgG Fc-conjugated hemagglutinin(HA)stalk of influenzavirus H7N9on the neutralizing immunogenicity of Fc-conjugated HA head:implication for rational design of HA-based influenza vaccines.J GenVirol.2015Dec 9.doi:10.1099/jgv.0.000365)。本发明采用该动物攻毒模型，检测PEI对流感病毒感染的保护效果，评估其用于流感病毒感染预防的活性和作用机制。

实施例1：PEI动物体内抗流感病毒活性的评价

1.实验材料

Balb/C雌性小鼠(10周左右)，PEI(线性25kD,sigma),polyIC(invivogen)，CTB(sigma),H1N1(A/PR/8/34)，PEI、polyIC和CTB均溶于PBS中。

2.实验方法与结果

将Balb/C雌性小鼠使用戊巴比妥钠麻醉后，滴鼻给药PEI(20μg)、polyIC(20μg)、CTB(2.5ug)和PBS，体积50μl，给药两次，间隔24小时，第二次给药后24小时对小鼠使用5LD₅₀剂量的H1N1流感病毒感染小鼠，连续14天记录攻毒后小鼠的体重丢失和存活率。此外，在第2天和第4天每组取4只小鼠的肺用于肺部病毒滴度的检测和在第0天，第2天和第4天每组取4只小鼠的肺用于免疫组化的检测(参考文献Mucosal pre-exposure to Th17-inducingadjuvants exacerbates pathology after influenza infection.Am JPathol.2014Jan；184(1):55-63.)。从体重丢失率来看，H1N1攻毒后的第1天到第5天，PEI组和polyIC组的体重基本保持不变，但是CTB组和PBS组体重下降非常明显。各组最终存活率为6/10(60％)、3/9(33.3％)、0/7(0％)和0/8(0％)，PEI组与PBS组相比有显著性差异。从第2天的肺部病毒滴度来看，PEI组和polyIC组的肺部病毒滴度比CTB组和PBS组要低，具有显著性差异，但是第4天的肺部病毒滴度4组相当。从免疫组化的结果来看，PEI能显著的降低小鼠攻毒后的炎症反应，比polyIC、CTB和PBS组要好，具有显著性差异。因此提前给药PEI对致死量的H1N1流感病毒有一定的保护效果。

实施例2：PEI体内抗流感病毒作用机制的研究

1.实验材料

RNA提取试剂盒(康为试剂)，逆转录试剂盒(康为试剂)，qPCR试剂盒(vazyme)

2.实验方法与结果

在第0天、第2天和第4天每组取4只小鼠的肺用于细胞因子的检测。细胞因子检测的方法为qRT-PCR(参考文献Intranasal treatment with poly(I·C)protects agedmice from lethal respiratory virus infections.J Virol.2012Nov；86(21):11416-24.)。之前报道显示干扰素(参考文献Protection from pulmonary tissue damageassociated with infection of cynomolgus macaques by highly pathogenic avianinfluenza virus(H5N1)by low dose natural human IFN-αadministered to thebuccal mucosa.Antiviral Res.2014Oct；110:175-80)，GM-CSF(参考文献Delivery ofGM-CSF to Protect against Influenza Pneumonia.PLoS One.2015Apr29；10(4):e0124593)和IFITM3(参考文献IFITM3restricts the morbidity and mortalityassociated with influenza.Nature.2012Mar25；484(7395):519-23)具有抗流感的作用，实验结果显示PEI能显著的诱导产生IFN-α4、GM-CSF和IFITM3，polyIC能显著的诱导产生IFN-α4、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF和IFITM3，CTB能显著的诱导产生GM-CSF和IFITM3。此外本发明中检测了促炎症因子IL-17，结果显示，PEI、polyIC和CTB都能诱导产生IL-17，但是三组产生IL-17的能力具有显著性差异，CTB>polyIC>PEI，而之前报道IL-17能加剧流感感染后的病情(参考文献Mucosal pre-exposure to Th17-inducing adjuvants exacerbatespathology after influenza infection.Am J Pathol.2014Jan；184(1):55-63.)。因此PEI能够诱导产生抗流感因子IFN-α4、GM-CSF和IFITM3，但是对促炎症因子IL-17的诱导能力比polyIC和CTB要低。

表1为qRT-PCR用到的特异性引物序列。

表1

	Forward primer(5’-3’)	Reverse primer(5’-3’)
			IFN-α4	TCCATCAGCAGCTCAATGAC	AGGAAGAGAGGGCTCTCCAG
IFN-β	CCCTATGGAGATGACGGAGA	TCCCACGTCAATCTTTCCTC
			IFN-γ	TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA	TGGCTCTGCAGGATTTTCATG
GM-CSF	GCCATCAAAGAAGCCCTGAA	GCGGGTCTGCACACATGTTA
			IFITM3	GCCCCCAACTACGAAAGA	ATTGAACAGGGACCAGACCAC
IL-17	GGCTGACCCCTAAGAAACC	CTGAAAATCAATAGCACGAAC
			HPRT	GCGTCGTGATTAGCGATGATG	CTCGAGCAAGTCTTTCAGTCC

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 聚醚酰亚胺在制备预防流感病毒感染的药物中的应用

<130> 20151229

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> IFN-α4 Forward primer (5'-3')

<400> 1

tccatcagca gctcaatgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> IFN-α4 Reverse primer (5'-3')

<400> 2

aggaagagag ggctctccag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> IFN-β Forward primer (5'-3')

<400> 3

ccctatggag atgacggaga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> IFN-β Reverse primer (5'-3')

<400> 4

tcccacgtca atctttcctc 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> IFN-γ Forward primer (5'-3')

<400> 5

tcaagtggca tagatgtgga agaa 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> IFN-γ Reverse primer (5'-3')

<400> 6

tggctctgca ggattttcat g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> GM-CSF Forward primer (5'-3')

<400> 7

gccatcaaag aagccctgaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> GM-CSF Reverse primer (5'-3')

<400> 8

gcgggtctgc acacatgtta 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> IFITM3 Forward primer (5'-3')

<400> 9

gcccccaact acgaaaga 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> IFITM3 Reverse primer (5'-3')

<400> 10

attgaacagg gaccagacca c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> IL-17 Forward primer (5'-3')

<400> 11

ggctgacccc taagaaacc 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> IL-17 Reverse primer (5'-3')

<400> 12

ctgaaaatca atagcacgaa c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> HPRT Forward primer (5'-3')

<400> 13

gcgtcgtgat tagcgatgat g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> HPRT Reverse primer (5'-3')

<400> 14

ctcgagcaag tctttcagtc c 21

Claims

1.聚醚酰亚胺(PEI)在制备预防流感病毒感染的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以聚醚酰亚胺作为药物活性成分，制成药学上可接受的剂型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述剂型为喷雾剂、片剂、胶囊剂、缓释制剂或纳米制剂。