CN117471101B - 基于多通道拉曼探针肿瘤msi错配修复蛋白的检测方法 - Google Patents
基于多通道拉曼探针肿瘤msi错配修复蛋白的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117471101B CN117471101B CN202311837005.5A CN202311837005A CN117471101B CN 117471101 B CN117471101 B CN 117471101B CN 202311837005 A CN202311837005 A CN 202311837005A CN 117471101 B CN117471101 B CN 117471101B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gets
- solution
- deionized water
- mismatch repair
- mdbm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 title abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 102100021147 DNA mismatch repair protein Msh6 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 102100028843 DNA mismatch repair protein Mlh1 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 101000968658 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh6 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108010074346 Mismatch Repair Endonuclease PMS2 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102100037480 Mismatch repair endonuclease PMS2 Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010026664 MutL Protein Homolog 1 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 72
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 42
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 42
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 24
- YHMYGUUIMTVXNW-RHQRLBAQSA-N 4,5,6,7-tetradeuterio-1,3-dihydrobenzimidazole-2-thione Chemical compound [2H]C1=C([2H])C([2H])=C2NC(=S)NC2=C1[2H] YHMYGUUIMTVXNW-RHQRLBAQSA-N 0.000 claims description 23
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 6
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 claims description 5
- -1 S- (4- ((trimethylsilyl) ethynyl) phenyl) ethanethiol Chemical compound 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 3
- IKRKPQKLWKQUGP-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-4-ethylsulfanylbenzene Chemical compound CCSC1=CC=C(CC)C=C1 IKRKPQKLWKQUGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 10
- 102000008071 Mismatch Repair Endonuclease PMS2 Human genes 0.000 description 7
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 4
- 208000032818 Microsatellite Instability Diseases 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101000800505 Drosophila melanogaster Muscle-specific homeobox protein tinman Proteins 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700031745 MutS Homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,属于蛋白检测技术领域。该检测方法包括以下步骤:(1)将多通道拉曼分子SEE、STE、SPE和MDBM组装成O‑GERTs;(2)选取针对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2靶向的单克隆抗体对O‑GERTs进行修饰;(3)用抗体修饰后的拉曼探针对错配修复蛋白进行正交缝隙增强拉曼检测。本发明的有益之处在于:本发明提供的检测方法通过使用一组多通道O‑GERTs,可以实现单次对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2四种错配修复蛋白同时进行检测,极大提升了检测效率和精度。
Description
技术领域
本发明涉及错配修复蛋白的检测方法,具体涉及一种基于多通道正交缝隙增强拉曼探针(Orthogonal gap-enhanced Raman tags,O-GERTs)的肿瘤微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI)错配修复蛋白的检测方法,属于蛋白检测技术领域。
背景技术
微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI)在肿瘤检测中具有重要的意义。微卫星是基因组中的短重复序列,在正常细胞中具有稳定的遗传特征。然而,在某些情况下,由于DNA 错配修复(mismatch repair,MMR)系统的缺陷或功能异常,微卫星区域的DNA复制和修复会出现错误,导致MSI的发生。MSI在多种肿瘤类型中被广泛观察到,其中最为突出的是结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)。约15-20%的结直肠癌患者表现出高等级MSI(MSI-H),这与DNA MMR系统的缺陷有关。相比之下,大多数结直肠癌患者(约80-85%)属于微卫星稳定型(Microsatellite Stable,MSS)。结直肠癌MSI的错配修复蛋白主要有四种:MutL同源物1(MLH1)、MutS 同源物2(MSH2)、MutS 同源物6(MSH6)和减数分裂后分离增强蛋白2(PMS2)。在这些错配修复蛋白中, MLH1与PMS2互为分子伴侣、MSH2与MSH6互为分子伴侣,这些错配修复蛋白之间相互关联,密不可分。因此,同时检测上述错配修复蛋白(而非分开检测)对于检测MSI的表型非常必要。
目前,经典免疫组织化学(IHC)是常用的评估错配修复蛋白表达水平的方法。然而,这种方法一次只能检测一种错配修复蛋白,耗时长且操作繁琐。此外,由于IHC不能做到并行检测四种错配修复蛋白,所以其检测精度与特异性受到一定限制。因此,开发一种多通道且高亮度、能够对四种错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)同时进行检测的方法具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供一种基于正交缝隙增强拉曼探针、具有高信号强度、可对肿瘤MSI的四种错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)同时进行检测的方法。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,所述肿瘤为结直肠癌,所述错配修复蛋白为MLH1、MSH2、MSH6和PMS2,该检测方法包括以下步骤:
步骤1、将多通道拉曼分子组装成O-GERTs:
(1)将多通道拉曼分子SEE、STE、SPE和MDBM单层附着在金核上,分别得到SEE改性的金核溶液、STE改性的金核溶液、SPE改性的金核溶液和MDBM改性的金核溶液;
(2)将金壳生长到改性的金核上形成核壳结构O-GERTs,分别得到SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs;
步骤2、用抗体修饰O-GERTs:
选取针对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2靶向的单克隆抗体对SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs进行修饰,分别得到SEE O-GERTs@MLH1、STE O-GERTs@MSH2、SPE O-GERTs@MSH6 和 MDBM O-GERTs@PMS2;
步骤3、用抗体修饰后的拉曼探针对错配修复蛋白进行检测:
将SEE O-GERTs@MLH1、STE O-GERTs@MSH2、SPE O-GERTs@MSH6 和 MDBM O-GERTs@PMS2混合,得到混合O-GERTs,用混合O-GERTs在室温下对肿瘤组织切片进行孵育染色,用拉曼光谱检测仪采用流线高速采集模式对染色后的肿瘤组织切片进行正交缝隙增强拉曼检测。
优选的,在步骤1中,将多通道拉曼分子SEE、STE、SPE和MDBM单层附着在金核上的方法具体如下:
将SEE去离子水溶液、STE去离子水溶液、SPE去离子水溶液和MDBM去离子水溶液分别加入到金纳米粒子(直径为20nm)去离子水溶液中,超声2min后静置吸附3h,然后用CTAC去离子水溶液对金核溶液进行离心洗涤,将沉淀重新分散于CTAC去离子水溶液中。
优选的,在步骤1中,将金壳生长到改性的金核上形成核壳结构O-GERTs的方法具体如下:
将CTAC去离子水溶液加入到HAuCl4去离子水溶液中混合均匀,然后快速加入抗坏血酸去离子水溶液,之后分别加入SEE改性的金核溶液、STE改性的金核溶液、SPE改性的金核溶液和MDBM改性的金核溶液,超声处理2min。
优选的,在步骤2中,用单克隆抗体对SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs进行修饰的方法具体如下:
将SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs分别加入到HS-PEG-COOH去离子水溶液中,在室温下孵育30min,然后加入mPEG-SH去离子水溶液,在室温下反应3h,对反应液进行离心纯化,将沉淀分散在PBS缓冲液(pH 7.4、10mM,下同)中,继续加入EDCI去离子水溶液和NHS去离子水溶液,在室温下反应3h,对反应液进行离心纯化,沉淀分散在PBS缓冲液中,向各分散液中分别加入抗MLH1抗体、抗MSH2抗体、抗MSH6抗体和抗PMS2抗体,在室温下反应2h,对反应液进行离心纯化,沉淀分散在PBS缓冲液中。
优选的,在步骤3中,检测条件为:λex=785nm,Pex≈30mW,采集时间为2s。
优选的,在步骤3中,通过WiRE 4.2软件生成并分析所有拉曼图。
本发明的有益之处在于:
(1)本发明提供的检测方法,通过使用一组多通道O-GERTs,可以实现单次对四种错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)同时进行检测,极大提升了检测效率和精度。
(2)本发明提供的检测方法不仅可以定性检测错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)之间的共存关系,还可以精准定量这些错配修复蛋白的表达水平及相互关系,这些信息对于理解肿瘤MSI的表型和开发新的治疗方法具有重要意义。
附图说明
图1是SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs的TEM形貌图,尺寸棒= 20nm;
图2是SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs的混合拉曼光谱图;
图3是使用本发明提供的多通道O-GERTs法同步检测错配修复蛋白得到的成像图,尺寸棒= 400μm;
图4是使用经典的IHC法分步检测错配修复蛋白得到的成像图,尺寸棒= 300μm。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
以结直肠癌组织切片标本作为待检对象,结直肠癌组织切片标本由滨州医学院烟台附属医院提供。
一、基于多通道O-GERTs的错配修复蛋白的检测方法
1、选取多通道拉曼分子
结直肠癌MSI的错配修复蛋白为MLH1、MSH2、MSH6和PMS2,选取与MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的结构特征和特定结合位点相互匹配的特异性分子作为多通道拉曼分子,最终确定的多通道拉曼分子分别为:
S-(4-乙基苯基)乙硫醇(SEE)、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫醇(STE)、S-(4-(苯乙炔基)苯基)乙硫醇(SPE)和2-巯基-4,5,6,7-d4-苯并咪唑(MDBM)。
2、将多通道拉曼分子组装成O-GERTs
正交缝隙增强拉曼探针的组装步骤具体如下:
(1)将选取的多通道拉曼分子单层附着在金核上
将100μL浓度为4mM的SEE去离子水溶液、100μL浓度为4mM的STE去离子水溶液、100μL浓度为4mM的SPE去离子水溶液和100μL浓度为4mM的MDBM去离子水溶液分别加入到4mL浓度为0.08nM的金纳米粒子(金核,直径在20nm左右)去离子水溶液中,超声2min后静置吸附3h,然后用浓度为0.05M的CTAC去离子水溶液对金核溶液进行离心洗涤,11000rpm离心10min,弃上清,将沉淀重新分散于1mL浓度为0.05M的CTAC去离子水溶液中,分别得到SEE改性的金核溶液、STE改性的金核溶液、SPE改性的金核溶液和MDBM改性的金核溶液。
(2)将金壳生长到改性的金核上形成核壳结构正交缝隙增强拉曼探针
将20mL浓度为0.05M的CTAC去离子水溶液加入到1mL浓度为4.86mM的HAuCl4去离子水溶液中混合均匀,然后快速加入600μL浓度为40mM的抗坏血酸去离子水溶液,此时混合溶液由淡黄色变为无色透明,之后分别加入1mL SEE改性的金核溶液、1mL STE改性的金核溶液、1mL SPE改性的金核溶液和1mL MDBM改性的金核溶液,超声处理2min,分别得到SEE改性的增强拉曼探针(记为SEE O-GERTs)、STE改性的增强拉曼探针(记为STE O-GERTs)、SPE改性的增强拉曼探针(记为SPE O-GERTs)和MDBM改性的增强拉曼探针(记为MDBM O-GERTs)。
经检测,SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs四种探针的TEM形貌见图1。由图1可知,四种探针的尺寸均在60nm左右,内部的缝隙分别为0.9nm、1.0nm、1.0nm和 0.9nm。
经检测,SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs四种探针的混合拉曼光谱图见图2。由图2可知,四种探针对应的特征拉曼峰定位在细胞沉默区,且完全分开。
3、用抗体修饰O-GERTs
选取针对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2靶向的单克隆抗体对前面制得的拉曼探针(SEEO-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs)进行修饰。用抗体修饰O-GERTs的方法具体如下:
取1mL SEE O-GERTs、1mL STE O-GERTs、1mL SPE O-GERTs和1mL MDBM O-GERTs,分别加入到60μL浓度为10μM的 巯基-聚乙二醇-羧基(HS-PEG-COOH)去离子水溶液中,在室温下孵育30min。然后加入120μL新鲜制备的浓度为10μM的甲氧基聚乙二醇-巯基(mPEG-SH)去离子水溶液,在室温下反应3h。之后对反应液进行三轮离心纯化(7200rpm,10min),沉淀分散在1mL PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)中。继续加入5μL浓度为25mM的碳化二亚胺(EDCI)去离子水溶液和5μL浓度为25mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)去离子水溶液,在室温下反应3h。之后对反应液进行三轮离心纯化(7200rpm,10min),将沉淀分散在1mL PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)中。向各分散液中分别加入3μL浓度为0.69mg/mL的抗MLH1抗体、3μL浓度为0.07mg/mL的抗MSH2抗体、3μL浓度为0.33mg/mL的抗MSH6抗体和3μL浓度为1.00mg/mL的抗PMS2抗体,在室温下反应2h,之后对反应液进行三轮离心纯化(7200rpm,10min),将沉淀分散在1mLPBS缓冲液(pH 7.4,10mM)中,得到抗体修饰后的拉曼探针,分别记为SEE O-GERTs@MLH1、STE O-GERTs@MSH2、SPE O-GERTs@MSH6 和 MDBM O-GERTs@PMS2。
4、用抗体修饰后的拉曼探针对四种错配修复蛋白同时进行检测
按照1:1:1:1的体积比混合SEE O-GERTs@MLH1、STE O-GERTs@MSH2、SPE O-GERTs@MSH6和MDBM O-GERTs@PMS2,得到检测用混合正交缝隙增强拉曼探针(记为混合O-GERTs)。
将结直肠癌组织切片标本(5μm)放置于载玻片上,用800μL混合O-GERTs在室温下进行孵育染色,孵育染色2h后用PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)冲洗染色后的结直肠癌组织切片标本至表面无多余探针残留。
用拉曼光谱检测仪采用流线高速采集模式对染色后的结直肠癌组织切片标本进行正交缝隙增强拉曼检测,检测条件如下:λex=785nm,Pex≈30mW,采集时间为2s。通过WiRE4.2软件(Renishaw)生成并分析所有拉曼图。
基于本发明的多通道O-GERTs法对结直肠癌组织切片标本的四种错配修复蛋白进行检测得到的成像结果见图3。
二、用IHC法检测肿瘤MSI错配修复蛋白
将结直肠癌组织切片标本(5μm)放置于载玻片上,将载玻片放入60℃烘箱中烘烤40min,之后用二甲苯脱蜡2次,每次10min,然后依次在体积浓度为100%、95%、85%和75%的乙醇溶液中各放置5min,随后用体积浓度为3%的过氧化氢溶液在室温下浸泡10min,再用PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)将结直肠癌组织切片标本表面多余的试剂冲洗干净。将冲干净的结直肠癌组织切片标本置于柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5,2mM)中,用微波高火加热8min后进行抗原提取,随后用PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)洗涤结直肠癌组织切片标本3次,每次3min,之后将结直肠癌组织切片标本与1.0mL质量浓度为5%的牛血清白蛋白(BSA)水溶液孵育20min(以阻断非特异性吸附)。接下来将结直肠癌组织切片标本分别与80μL浓度为0.0138mg/mL的抗MLH1抗体、80μL浓度为0.0014mg/mL的抗MSH2抗体、80μL浓度为0.0066mg/mL的抗MSH6抗体和80μL浓度为0.02mg/mL的抗PMS2抗体共计4种一抗在4 ℃下孵育24h,然后用PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)洗去多余的一抗。再用80μL浓度为0.0025mg/mL的抗免疫球蛋白G抗体(抗IgG抗体,二抗)与结直肠癌组织切片标本在37℃下共孵育1h,然后用二氨基联苯胺(DAB)对结直肠癌组织切片标本染色5min,再用苏木素复染3min,之后用蒸馏水冲洗结直肠癌组织切片标本并用碳酸锂返蓝,最后使用光学显微镜对处理好的结直肠癌组织切片标本进行检查。
用IHC法对结直肠癌组织切片标本的四种错配修复蛋白进行检测得到的成像结果见图4。
三、比较多通道O-GERTs法和IHC法
对比图3和图4可知:本发明提供的多通道O-GERTs法检测肿瘤MSI的错配修复蛋白的结果更准确。
本发明提供的多通道O-GERTs法一次即可同时检测四种错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2),极大提升了检测效率,并且具有高谱图分辨率与特异性。四个蛋白通道可以精确地分离开,结合其生物正交的无背景干扰信号,可以实现精准定量成像。
而IHC法一次只能对一种错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)进行标记,需要操作四次才能完成所有错配修复蛋白的成像,耗时较长,检测效率较低。由于IHC法不能做到同时并行检测,所以检测结果的重复性与精度都受到一定限制。此外,IHC法只能进行半定量分析。
需要说明的是,上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,所述肿瘤为结直肠癌,所述错配修复蛋白为MLH1、MSH2、MSH6和PMS2,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、将多通道拉曼分子组装成O-GERTs:
(1)将多通道拉曼分子SEE、STE、SPE和MDBM单层附着在金核上,分别得到SEE改性的金核溶液、STE改性的金核溶液、SPE改性的金核溶液和MDBM改性的金核溶液,所述SEE、STE、SPE和MDBM分别是S-(4-乙基苯基)乙硫醇、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫醇、S-(4-(苯乙炔基)苯基)乙硫醇和2-巯基-4,5,6,7-d4-苯并咪唑的缩写;
(2)将金壳生长到改性的金核上形成核壳结构O-GERTs,分别得到SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs;
步骤2、用抗体修饰O-GERTs:
选取针对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2靶向的单克隆抗体对SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPEO-GERTs和MDBM O-GERTs进行修饰,分别得到SEE O-GERTs@MLH1、STE O-GERTs@MSH2、SPEO-GERTs@MSH6 和 MDBM O-GERTs@PMS2;
步骤3、用抗体修饰后的拉曼探针对错配修复蛋白进行检测:
将SEE O-GERTs@MLH1、STE O-GERTs@MSH2、SPE O-GERTs@MSH6 和 MDBM O-GERTs@PMS2混合,得到混合O-GERTs,用混合O-GERTs在室温下对肿瘤组织切片进行孵育染色,用拉曼光谱检测仪采用流线高速采集模式对染色后的肿瘤组织切片进行正交缝隙增强拉曼检测。
2.根据权利要求1所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,在步骤1中,将多通道拉曼分子SEE、STE、SPE和MDBM单层附着在金核上的方法具体如下:
将SEE去离子水溶液、STE去离子水溶液、SPE去离子水溶液和MDBM去离子水溶液分别加入到金纳米粒子去离子水溶液中,超声2min后静置吸附3h,然后用CTAC去离子水溶液对金核溶液进行离心洗涤,将沉淀重新分散于CTAC去离子水溶液中。
3.根据权利要求2所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,所述金纳米粒子的直径为20nm。
4.根据权利要求1所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,在步骤1中,将金壳生长到改性的金核上形成核壳结构O-GERTs的方法具体如下:
将CTAC去离子水溶液加入到HAuCl4去离子水溶液中混合均匀,然后快速加入抗坏血酸去离子水溶液,之后分别加入SEE改性的金核溶液、STE改性的金核溶液、SPE改性的金核溶液和MDBM改性的金核溶液,超声处理2min。
5.根据权利要求1所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,在步骤2中,用单克隆抗体对SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs进行修饰的方法具体如下:
将SEE O-GERTs、STE O-GERTs、SPE O-GERTs和MDBM O-GERTs分别加入到HS-PEG-COOH去离子水溶液中,在室温下孵育30min,然后加入mPEG-SH去离子水溶液,在室温下反应3h,对反应液进行离心纯化,将沉淀分散在PBS缓冲液中,继续加入EDCI去离子水溶液和NHS去离子水溶液,在室温下反应3h,对反应液进行离心纯化,沉淀分散在PBS缓冲液中,向各分散液中分别加入抗MLH1抗体、抗MSH2抗体、抗MSH6抗体和抗PMS2抗体,在室温下反应2h,对反应液进行离心纯化,沉淀分散在PBS缓冲液中。
6.根据权利要求5所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,所述PBS缓冲液的pH为7.4、浓度为10mM。
7.根据权利要求1所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,在步骤3中,检测条件为:λex=785nm,Pex≈30mW,采集时间为2s。
8.根据权利要求1所述的基于多通道拉曼探针肿瘤MSI错配修复蛋白的检测方法,其特征在于,在步骤3中,通过WiRE 4.2软件生成并分析所有拉曼图。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311837005.5A CN117471101B (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 基于多通道拉曼探针肿瘤msi错配修复蛋白的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311837005.5A CN117471101B (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 基于多通道拉曼探针肿瘤msi错配修复蛋白的检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117471101A CN117471101A (zh) | 2024-01-30 |
CN117471101B true CN117471101B (zh) | 2024-03-12 |
Family
ID=89627908
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311837005.5A Active CN117471101B (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 基于多通道拉曼探针肿瘤msi错配修复蛋白的检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117471101B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103221589A (zh) * | 2010-11-29 | 2013-07-24 | 东丽株式会社 | 聚酰胺极细纤维及其熔融纺丝方法及装置 |
CA2809872A1 (en) * | 2012-03-23 | 2013-09-23 | Myriad Genetics, Incorporated | Large deletions in human pms2 gene and use thereof |
CN106248648A (zh) * | 2016-07-10 | 2016-12-21 | 复旦大学 | 金为核银为壳的“拉曼静默区”基底及其制备方法与应用 |
WO2018175501A1 (en) * | 2017-03-20 | 2018-09-27 | Caris Mpi, Inc. | Genomic stability profiling |
CN108627492A (zh) * | 2017-03-22 | 2018-10-09 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种pH敏感型表面增强拉曼散射探针及其制备 |
CN111351937A (zh) * | 2018-12-20 | 2020-06-30 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种mmr蛋白表达缺失检测试剂盒及其检测方法 |
CN113324968A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-31 | 吉林大学 | 一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012158385A1 (en) * | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Baylor Research Institute | Detecting dna mismatch repair-deficient colorectal cancers |
US10876150B2 (en) * | 2017-01-27 | 2020-12-29 | Duke University | Nanoprobe compositions and methods of use thereof |
-
2023
- 2023-12-28 CN CN202311837005.5A patent/CN117471101B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103221589A (zh) * | 2010-11-29 | 2013-07-24 | 东丽株式会社 | 聚酰胺极细纤维及其熔融纺丝方法及装置 |
CA2809872A1 (en) * | 2012-03-23 | 2013-09-23 | Myriad Genetics, Incorporated | Large deletions in human pms2 gene and use thereof |
CN106248648A (zh) * | 2016-07-10 | 2016-12-21 | 复旦大学 | 金为核银为壳的“拉曼静默区”基底及其制备方法与应用 |
WO2018175501A1 (en) * | 2017-03-20 | 2018-09-27 | Caris Mpi, Inc. | Genomic stability profiling |
CN108627492A (zh) * | 2017-03-22 | 2018-10-09 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种pH敏感型表面增强拉曼散射探针及其制备 |
CN111351937A (zh) * | 2018-12-20 | 2020-06-30 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种mmr蛋白表达缺失检测试剂盒及其检测方法 |
CN113324968A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-31 | 吉林大学 | 一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Orthogonal gap-enhanced Raman tags for interference-free and ultrastable surface-enhanced Raman scattering;Jin Li等;《Nanophotonics》;20220328;第11卷(第8期);1549-1560 * |
结直肠癌DNA错配修复蛋白和微卫星不稳定性与P53蛋白表达关系的研究;徐恩伟;《中国药物与临床》;20161231;第16卷(第12期);1733-1734 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117471101A (zh) | 2024-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5989668B2 (ja) | タンパク質検出方法 | |
CN108344783B (zh) | 一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用 | |
Bekmurzayeva et al. | Ultra-wide, attomolar-level limit detection of CD44 biomarker with a silanized optical fiber biosensor | |
Zhu et al. | Electrochemical sandwich immunoassay for Escherichia coli O157: H7 based on the use of magnetic nanoparticles and graphene functionalized with electrocatalytically active Au@ Pt core/shell nanoparticles | |
CN111413384B (zh) | 一种基于RGO-CS-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法 | |
CN111004836B (zh) | 双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用 | |
CN117471101B (zh) | 基于多通道拉曼探针肿瘤msi错配修复蛋白的检测方法 | |
EP3467498A1 (en) | Anti-human hemoglobin monoclonal antibody or antibody kit, insoluble carrier particle to which anti-human hemoglobin monoclonal antibody is immobilized, and measurement reagent and measurement method using same | |
CN114295591A (zh) | 双信号纳米探针及其在检测前列腺特异性抗原中的应用 | |
CN107356756A (zh) | 一种荧光探针及其合成方法和在循环肿瘤细胞检测中的应用 | |
CN115541880B (zh) | 基于铜金属有机框架纳米酶漆酶的新冠病毒抗原检测方法、材料及应用 | |
CN116381240A (zh) | 一种双染免疫组化试剂盒及应用 | |
CN114230804B (zh) | 一种过氧化铜/氢键有机骨架纳米材料及其探针、一种检测脂质运载蛋白-2试剂盒 | |
CN116027044A (zh) | 基于邻位诱导效应和门控式介孔硅的pcsk9检测方法 | |
CN115125331A (zh) | 一种基于原位杂交法的eb病毒检测方法 | |
Dixit et al. | Novel epoxy-silica nanoparticles to develop non-enzymatic colorimetric probe for analytical immuno/bioassays | |
CN110687178B (zh) | 一种结核分枝杆菌cfp-10抗原免疫传感器及其制备方法和应用 | |
CN106872243A (zh) | 组织芯片的rna-蛋白质-dna原位多重染色方法 | |
CN112904004A (zh) | 同时检测psa和sar的生物传感器及制备方法和应用 | |
Meng et al. | Adriamycin coated silica microspheres as labels for cancer biomarker alpha-fetoprotein detection | |
Zhang et al. | Development of a method to diagnose endometrial cancer based on the AuNRs‐AntiVimentin optical probe | |
CN114184789B (zh) | 一种前列腺特异性抗原检测探针、一种检测前列腺特异性抗原试剂盒 | |
CN110763845A (zh) | 一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断结肠癌的产品中的用途和试剂盒 | |
CN113984863B (zh) | 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法 | |
CN112213482B (zh) | 基于免疫组化空间电化学检测样品中抗原含量的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |