CN117451901A - 一种基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用 - Google Patents
一种基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于IMAC‑HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用,所述分析方法包括:(1)制备参比品溶液、质控品溶液和待测样品溶液,进行IMAC‑HPLC检测;(2)以参比品溶液的上样量为横坐标X,组氨酸标签蛋白峰面积为纵坐标Y,拟合线性方程得到标准曲线;(3)将质控品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到质控品组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与理论上样量的比值为回收率;将待测样品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到待测样品中组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与样品进样体积的比值为组氨酸标签蛋白浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物制品分析领域,具体涉及一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用。
背景技术
生物制品的原液生产工艺一般分为以细胞培养为主的上游工艺和以多步纯化工序为主的下游工艺。其中,上游工艺研究主要关注操作条件对细胞生长特性、代谢水平和目的产物的影响,但在上游工艺研究中还无法及时得知目的蛋白的准确含量。随后经裂解细胞、收获裂解液,再经澄清、离心后进入下游纯化工艺。下游工艺主要依靠多种层析方法配合使用,实现产品相关杂质或工艺相关杂质的去除与控制。
为将少量的目的蛋白从众多蛋白中分离出来,研究人员往往会给目的蛋白带上纯化标签,便于通过层析工艺实现目的蛋白的收获与富集。组氨酸标签是最简单,使用最广泛的标签,它通常由6-10个连续的组氨酸构成,它可以与固定化的过渡金属离子形成配位键,利用这一特性可纯化携带组氨酸标签的蛋白,在层析过程中,蛋白因与金属离子的亲和力不同而分离。包括亲和层析在内的层析方法均需将蛋白上样载量控制在合理范围,低载或高载都可能导致样品的损失或杂质的增加,因此载量控制对于层析步骤的工艺至关重要。生产中常用的上样方法有体积上样和质量上样,体积上样是指控制上样体积,但在放大生产中,目的蛋白浓度可能与小试中存在较大差别,因此体积上样极易造成低载或高载。质量上样可以避免此问题,但需在上样前得知目的蛋白的准确浓度。对于细胞裂解液等复杂样品,由于存在众多杂蛋白的干扰,准确测定含组氨酸标签的目的蛋白的浓度是困难的。
综上所述,寻求一种简单、可靠、易操作的分析方法用于准确快速指导商业蛋白工艺研发及生产过程中复杂样品如细胞裂解液的亲和层析上样具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用。所述分析方法可以对组氨酸标签蛋白准确定量,用于快速指导工艺研发和生产过程。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,所述分析方法包括:
(1)制备参比品溶液、质控品溶液和待测样品溶液,进行IMAC-HPLC检测;
(2)以参比品溶液的上样量为横坐标X,组氨酸标签蛋白峰面积为纵坐标Y,拟合线性方程得到标准曲线;
(3)将质控品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到质控品组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与理论上样量的比值为回收率;将待测样品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到待测样品中组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与样品进样体积的比值为组氨酸标签蛋白浓度。
本发明首次将固定化金属离子亲和层析(IMAC)与HPLC技术相结合应用于指导商业蛋白工艺研发及生产,可准确快速指导商业蛋白工艺研发及生产过程包括但不限于细胞裂解液亲和层析上样,减少目的蛋白过载或低载情况发生,极大的节省研发和生产费用。
优选地,步骤(1)中,所述参比品溶液和质控品溶液由如下步骤制备得到:
将消光系数大于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于水中,配制成1.0±0.2mg/mL参比品溶液或质控品溶液,例如可以是0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL或1.2mg/mL等;
将消光系数小于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于水中,配制成7.0±0.2mg/mL参比品溶液或质控品溶液,例如可以是6.8mg/mL、6.9mg/mL、7.0mg/mL、7.1mg/mL或7.2mg/mL等。
优选地,所述溶剂选自水或稀释缓冲液,所述稀释缓冲液为15-25mM HEPES+450-550mM NaCl,pH为7.3-7.7。
其中,“15-25mM HEPES”例如可以是15mM、17mM、19mM、20mM、21mM、23mM或25mM等。
“450-550mM NaCl”例如可以是450mM、470mM、490mM、500mM、510mM、530mM或550mM等。
“pH为7.3-7.7”例如可以是7.3、7.4、7.5、7.6或7.7等。
本发明中,使用的检测器为紫外检测器,当组氨酸标签蛋白消光系数k≥0.6时,组氨酸标签蛋白在5-50μg范围内线性良好;当组氨酸标签蛋白消光系数k<0.6时,组氨酸标签蛋白在35-350μg范围内线性良好。
本发明中,若样品浓度低于定量下限,依据目的蛋白性质选择合适规格的超滤离心管和离心条件对样品进行浓缩预处理。若样品浓度高于定量上限,用稀释缓冲液或超纯水将样品稀释至定量范围。
优选地,步骤(1)中,在所述IMAC-HPLC检测中,通过改变参比品溶液的进样体积,控制参比品溶液的上样量。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的色谱柱的填料为螯合了Ni2+的色谱柱填料,优选为Polar MC30-Ni Excel色谱柱。
色谱柱的填料结构如下所示:
本发明中,采用固定化金属离子亲和色谱对携带组氨酸标签的目的蛋白进行定量检测。固定化金属离子亲和色谱是将过渡金属离子通过配体螯合在固相基质上,过渡金属离子带正电,可与局部带有负电荷的组氨酸标签相吸引,从而与携带组氨酸标签的目的蛋白特异性结合形成相对稳定的复合物,之后利用咪唑以竞争性洗脱方式实现目的蛋白的富集、分离和分析,洗脱先后顺序与目的蛋白结合能力相关。常用于含有组氨酸标签蛋白的分离纯化与分析的过渡金属离子有Zn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+等。本发明所使用的关键耗材色谱柱填料为螯合Ni2+型Polar MC-IMAC Excel,它是一种金属亲和层析填料,以聚甲基丙烯酸酯微球为基质,粒径为30μm,孔径为具有较高的物理和化学稳定性,此外,Polar MC-IMACExcel具有高度亲水性,可最大程度地避免与生物类样品的非特异性吸附,非常适用于富集、分离、分析含组氨酸标签的蛋白。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测采用梯度洗脱方法对样品进行分离。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为15-25mM HEPES+450-550mM NaCl;所述流动相B为15-25mM HEPES+450-550mMNaCl+450-550mM咪唑。
其中,“15-25mM HEPES”例如可以是15mM、17mM、19mM、20mM、21mM、23mM或25mM等。
“450-550mM NaCl”例如可以是450mM、470mM、490mM、500mM、510mM、530mM或550mM等。
“450-550mM咪唑”例如可以是450mM、470mM、490mM、500mM、510mM、530mM或550mM等。
优选地,所述流动相A的pH为7.3-7.7,例如可以是7.3、7.4、7.5、7.6或7.7等。
优选地,所述流动相B的pH为7.3-7.7,例如可以是7.3、7.4、7.5、7.6或7.7等。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的流速为0.8±0.2mL/min,例如可以是0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min或1.0mL/min等。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的梯度洗脱的程序为:
0-4min 流动相A为100% 流动相B为0%;
4-7min 流动相A为0-100%流动相B为0-100%;
7-9min 流动相A为0% 流动相B为100%;
9-12min 流动相A为0-100%流动相B为0-100%;
12-30min 流动相A为100% 流动相B为0%。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的梯度洗脱的程序为:
0min 流动相A为100% 流动相B为0%;
4min 流动相A为100% 流动相B为0%;
7min 流动相A为0% 流动相B为100%;
9min 流动相A为0% 流动相B为100%;
12min 流动相A为100% 流动相B为0%;
30min 流动相A为100% 流动相B为0%。
在本发明梯度洗脱程序下,组氨酸标签目标蛋白与其他杂蛋白可实现良好的分离,有利于目标蛋白的准确定量。此外,该梯度洗脱时长适中,可在较短时间内分析复杂样品,快速指导商业蛋白工艺研发及生产过程中如细胞裂解液的亲和层析上样。
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的柱温设置为25±5℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃或30℃等。
作为本发明的优选技术方案,所述分析方法包括:
(1)制备参比品溶液、质控品溶液和待测样品溶液,进行IMAC-HPLC检测;
将消光系数大于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于溶剂中,配制成1.0±0.2mg/mL参比品溶液或质控品溶液;
对于在280nm消光系数k≥0.6的组氨酸标签蛋白,所述参比品溶液的进样体积分别为5μL、10μL、20μL、30μL和50μL;对应的各点上样量分别为5μg、10μg、20μg、30μg和50μg;
将消光系数小于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于溶剂中,配制成7.0±0.2mg/mL参比品溶液或质控品溶液;
在280nm消光系数k<0.6的组氨酸标签蛋白,所述参比品溶液的进样体积分别为5μL、10μL、20μL、30μL和50μL;对应的各点上样量分别为35μg、70μg、140μg、210μg和350μg;
IMAC-HPLC检测的色谱条件:
Agilent 1260Infinity II液相色谱系统;使用Sepax Technologies,PolarMC30-Ni Excel色谱柱,色谱柱规格为7.8mm×250mm,30μm,色谱柱柱温为25±5℃;方法流速为0.8±0.2mL/min;流动相A和B分别为15-25mM HEPES+450-550mM NaCl,pH 7.3-7.7和15-25mM HEPES+450-550mM NaCl+450-550mM咪唑,pH 7.3-7.7;方法默认进样体积为20μL,若不适用于样品,则对样品进样体积进行适当调整;检测器检测波长为280nm;进样盘温度为5±3℃;
所述IMAC-HPLC检测的梯度洗脱的程序为:
(2)以参比品溶液的上样量为横坐标X,组氨酸标签蛋白峰面积为纵坐标Y,拟合线性方程得到标准曲线;
(3)将质控品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到质控品组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与理论上样量的比值为回收率;将待测样品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到待测样品中组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与样品进样体积的比值为组氨酸标签蛋白浓度;
依据以下公式计算质控品回收率:
依据以下公式计算组氨酸标签蛋白浓度:
第二方面,本发明提供第一方面所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法在蛋白工艺研发和/或生产过程中的应用。
本发明与现有通过柱体积和经验指导蛋白工艺研发及生产上样方法相比,操作方便、专属性强、稳定可靠,不受人员和仪器的影响,在蛋白工艺研发和/或生产过程中具有重要的应用价值。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明首次将固定化金属离子亲和层析(IMAC)与HPLC技术相结合应用于指导商业蛋白工艺研发及生产,可准确快速指导商业蛋白工艺研发及生产过程中包括但不限于细胞裂解液亲和层析上样,减少目的蛋白过载或低载情况发生,极大的节省研发和生产费用。
(2)本发明与现有通过柱体积和经验指导蛋白工艺研发及生产上样方法相比,操作方便、专属性强、稳定可靠,不受人员和仪器的影响。
(3)本发明适用范围极广,可用于绝大部分消光系数(k≥0.22)组氨酸标签蛋白的准确定量。
附图说明
图1是实施例1中空白对照溶液(流动相A)的IMAC-HPLC色谱图原图。
图2是实施例1中空白对照溶液(流动相A)的IMAC-HPLC色谱图放大图。
图3是实施例1中组氨酸标签蛋白参比品色谱图原图叠图。
图4是实施例1中组氨酸标签蛋白参比品色谱图叠图放大图。
图5是实施例1中组氨酸标签蛋白参比品的标准曲线。
图6是实施例1中组氨酸标签蛋白质控品色谱图原图。
图7是实施例1中样品IMAC-HPLC色谱图原图。
图8是实施例2中组氨酸标签蛋白参比品色谱图原图叠图。
图9是实施例2中组氨酸标签蛋白参比品色谱图叠图放大图。
图10是实施例2中组氨酸标签蛋白参比品的标准曲线
图11是实施例2中组氨酸标签蛋白质控品色谱图原图。
图12是实施例2中样品IMAC-HPLC色谱图原图。
图13是实施例3中实施例3组氨酸标签蛋白参比品色谱图原图叠图。
图14是实施例3中组氨酸标签蛋白参比品色谱图叠图放大图。
图15是实施例3中组氨酸标签蛋白参比品的标准曲线。
图16是实施例3中组氨酸标签蛋白质控品色谱图原图
图17是实施例3中细胞裂解液样品色谱图原图。
图18是实施例3中细胞裂解液样品色谱图放大图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种基于IMAC-HPLC测定样品中组氨酸标签蛋白浓度的分析方法。具体步骤如下:
A、标曲溶液、质控品溶液制备
组氨酸标签蛋白(Recombinant Protein G,His-tag)为冻干粉,消光系数为1.35,大于0.6,以超纯水为稀释剂,配制1.0mg/mL参比品溶液,平行配制2份,分别用于标曲溶液和质控品溶液进样,质控品溶液进样量为20μL。通过改变参比品溶液进样体积,使得标曲各点组氨酸标签蛋白上样量分别为5μg、10μg、20μg、30μg和50μg。标曲溶液进样体积和各点上样量参考表1。
表1
名称 | 进样体积(μL) | 上样量(μg) |
STD-1 | 5 | 5 |
STD-2 | 10 | 10 |
STD-3 | 20 | 20 |
STD-4 | 30 | 30 |
STD-5 | 50 | 50 |
B、样品溶液制备
转移足量样品溶液至进样瓶中,等待进样。
C、空白溶液制备
转移足量流动相A至进样瓶中,等待进样。
D、IMAC-HPLC检测方法
(1)流动相A为20mM HEPES+0.5M NaCl(pH 7.5),流动相B为20mM HEPES+0.5MNaCl+0.5M咪唑(pH 7.5)。
(2)色谱条件为:Agilent 1260Infinity II液相色谱系统;使用SepaxTechnologies,Polar MC30-Ni Excel色谱柱,色谱柱规格为7.8mm×250mm,30μm,柱温为25±5℃;流速为0.8mL/min;检测器检测波长为280nm;进样盘温度为5±3℃;方法默认进样体积为20μL。
(3)梯度洗脱程序如下:
E、标准曲线建立
以参比品组氨酸标签蛋白的上样量为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,拟合一次线性方程即得标准曲线。
F、质控品回收率计算
将质控品组氨酸标签蛋白峰面积带入标曲线性方程,计算得到质控品组氨酸标签蛋白的实测上样量,依据以下公式计算质控品回收率。
G、样品组氨酸标签蛋白浓度的计算
将样品组氨酸标签蛋白峰面积带入标曲线性方程,得到样品中组氨酸标签蛋白的上样量,依据以下公式计算组氨酸标签蛋白浓度。
试验结果如下:
(1)空白对照溶液的IMAC-HPLC色谱图如图1-图2所示。其中图1为本发明空白对照溶液的IMAC-HPLC色谱图原图;图2为本发明空白对照溶液IMAC-HPLC色谱图放大图。从中可以看出在组氨酸标签蛋白出峰位置无杂质峰干扰,表明本方法专属性良好。
(2)本实施例的组氨酸标签蛋白参比品IMAC-HPLC色谱图如图3-图4所示,图3为组氨酸标签蛋白参比品色谱图原图叠图,图4为组氨酸标签蛋白参比品色谱图叠图放大图;标曲溶液组氨酸标签蛋白上样量及峰面积拟合结果见表2,由此建立的标准曲线见图5。
表2
(3)本实施例的组氨酸标签蛋白质控品IMAC-HPLC色谱图如图6所示。质控品溶液峰面积及定量结果见表3。
表3
(4)样品IMAC-HPLC色谱图如图7所示,样品中组氨酸标签蛋白浓度结果见表4
表4
名称 | 保留时间(min) | 峰面积(μV*sec) | 浓度(mg/mL) |
样品 | 20.279 | 1397520 | 0.39 |
上述结果表明,当组氨酸标签蛋白消光系数k≥0.6时,本发明方法蛋白上样量在5-50μg范围内线性良好,可用于样品中组氨酸标签蛋白浓度的准确测定,这对于指导商业蛋白工艺研发及生产过程具有重要意义。
实施例2
本实施例提供了一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法。实施例2和实施例1的不同之处在于,实施例2所用组氨酸标签蛋白为Recombinant Protein A,His-tag。具体步骤如下:
A、标曲溶液、质控品溶液制备
本实施例中组氨酸标签蛋白参比品(Recombinant Protein A,His-tag)为冻干粉,消光系数为0.22,低于0.6,以超纯水为稀释剂,配制7.0mg/mL参比品溶液,平行配制2份,分别用于标曲溶液和质控品溶液进样,质控品溶液进样量为20μL。通过改变参比品溶液进样体积,使得标曲各点组氨酸标签蛋白上样量分别为35μg、70μg、140μg、210μg和350μg。标曲溶液进样体积和各点上样量参考表5。
表5
名称 | 进样体积(μL) | 上样量(μg) |
STD-1 | 5 | 35 |
STD-2 | 10 | 70 |
STD-3 | 20 | 140 |
STD-4 | 30 | 210 |
STD-5 | 50 | 350 |
B、样品溶液制备
转移足量样品溶液至进样瓶中,等待进样。
空白溶液制备,IMAC-HPLC检测方法,标准曲线建立,质控品回收率计算及样品组氨酸标签蛋白浓度的计算与实施例1一致。
试验结果如下:
(1)本实施例的组氨酸标签蛋白参比品IMAC-HPLC色谱图如图8-图9所示,标曲溶液组氨酸标签蛋白上样量及峰面积拟合结果见表6,由此建立的标准曲线见图10。
表6
(2)本实施例的组氨酸标签蛋白质控品IMAC-HPLC色谱图如图11所示。质控品溶液峰面积及定量结果见表7。
表7
(3)样品IMAC-HPLC色谱图如图12所示,样品中组氨酸标签蛋白浓度结果见表8。
表8
名称 | 保留时间(min) | 峰面积(μV*sec) | 浓度(mg/mL) |
样品 | 20.236 | 1306246 | 2.57 |
上述结果表明,当组氨酸标签蛋白消光系数0.22≤k<0.6时,本发明方法蛋白上样量在35-350μg范围内线性良好。
综合实施例1和2的实验结果,表明本发明的方法适用范围极广,可用于绝大部分消光系数(k≥0.22)组氨酸标签蛋白的准确定量。
实施例3
本实施例为本发明所述基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法在蛋白工艺研发过程的实际应用,将IMAC与HPLC技术相结合测定细胞裂解液中组氨酸标签蛋白浓度,用于指导蛋白工艺研发层析上样步骤。具体步骤如下:
A、标曲溶液、质控品溶液制备
组氨酸标签蛋白消光系数>0.6,浓度为1.49mg/mL,用20mM HEPES,0.5M NaCl,pH7.5溶液将参比品稀释至1.0mg/mL,平行配制2份,分别用于标曲溶液和质控品溶液进样,质控品溶液进样量为20μL。通过改变参比品溶液进样体积,使得标曲各点组氨酸标签蛋白上样量分别为5μg、10μg、20μg、30μg和50μg。标曲溶液进样体积和各点上样量参考表1。
B、样品溶液制备
转移足量细胞裂解液样品溶液至进样瓶中,等待进样。
空白溶液制备,IMAC-HPLC检测方法,标准曲线建立,质控品回收率计算及细胞裂解液样品组氨酸标签蛋白浓度的计算与实施例1一致。
试验结果如下:
(1)组氨酸标签蛋白参比品IMAC-HPLC色谱图如图13-图14所示,标曲溶液组氨酸标签蛋白上样量及峰面积拟合结果见表9,由此建立的标准曲线见图15。
表9
(2)组氨酸标签蛋白质控品IMAC-HPLC色谱图如图16所示。质控品溶液峰面积及定量结果见表10。
表10
(3)由于默认进样体积不适用于细胞裂解液样品,故本实施例将样品进样体积调整为50μL。细胞裂解液样品IMAC-HPLC色谱图如图17-图18所示,其中图17为细胞裂解液样品色谱图原图,图18为细胞裂解液样品色谱图放大图。细胞裂解液样品组氨酸标签蛋白浓度结果见表11。
表11
名称 | 保留时间(min) | 峰面积(μV*sec) | 浓度(mg/mL) |
细胞裂解液样品 | 20.278 | 1372073 | 0.44 |
上述结果表明,将IMAC与HPLC技术相结合可用于复杂样品细胞裂解液中组氨酸标签蛋白浓度的准确测定,这对于指导商业蛋白工艺研发及生产过程具有重要意义。
实施例4
采用与实施例1-3相同的实验条件,对基于IMAC-HPLC测定细胞裂解液中组氨酸标签蛋白浓度进行方法学研究。
试验结果
(1)本方法通过改变参比品溶液进样体积,来得到标曲各点峰面积响应。实施例1和实施例3中一次线性拟合结果分别见表2和表9,从中可以看出,当组氨酸标签蛋白参比品消光系数k≥0.6时,组氨酸标签蛋白上样量在5~50μg范围内,线性方程相关系数R2≥0.99,线性良好。实施例2中一次线性拟合结果见表6,从中可以看出,当组氨酸标签蛋白参比品消光系数k<0.6时,组氨酸标签蛋白上样量在35-350μg范围内,线性方程相关系数R2≥0.99,线性良好。
(2)实施例1-3系统精密度结果见表12,组氨酸标签蛋白保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于2.0%,表明本发明IMAC-HPLC分析方法学精密度良好。
表12
(3)实施例1-3标准曲线准确性结果分别见表3、表7和表10,从中可以看出质控品溶液回收率均大于90.0%,表明该方法所建标曲可用于准确测定样品组氨酸标签蛋白浓度。
对比例1
本对比例提供了一种基于IMAC-HPLC测定样品中组氨酸标签蛋白浓度的分析方法。所述方法与实施例1的区别仅在于,所述梯度洗脱程序如下:
试验结果如下:
(1)本梯度洗脱程序存在分析时间过长,基线信号干扰大的问题,无法实现快速定量组氨酸标签目标蛋白;
(2)本梯度洗脱程序下,样品目标蛋白与右侧杂质峰分离度较差,影响组氨酸标签蛋白的准确定量。
对比例2
本对比例提供了一种基于IMAC-HPLC测定样品中组氨酸标签蛋白浓度的分析方法。所述方法与实施例1的区别仅在于,所述IMAC-HPLC检测的流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为20mM HEPES,500mM NaCl,pH 7.0;所述流动相B为20mM HEPES,500mMNaCl,500mM咪唑,pH 7.0。
试验结果如下:
(1)将流动相A和流动相B的pH调节为7.0时,基线信号干扰过大,无法准确辨别目标蛋白出峰位置,影响组氨酸标签蛋白的准确定量。
对比例3
本对比例提供了一种基于IMAC-HPLC测定样品中组氨酸标签蛋白浓度的分析方法。所述方法与实施例1的区别仅在于,所述IMAC-HPLC检测的流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为20mM HEPES,0.5M NaCl,pH 8.0;所述流动相B为20mM HEPES,0.5MNaCl,0.5M咪唑,pH 8.0。
试验结果如下:
(1)将流动相A和流动相B的pH调节为8.0时,目标蛋白与杂质峰无法实现良好的分离,影响组氨酸标签蛋白的准确定量。
对比例4
本对比例提供了一种基于IMAC-HPLC测定样品中组氨酸标签蛋白浓度的分析方法。所述方法与实施例1的区别仅在于,所述IMAC-HPLC检测的色谱柱为SepaxTechnologies,Polar MC30-Ni Excel色谱柱,色谱柱规格为7.8mm×150mm,30μm,
试验结果如下:
(1)使用规格为7.8mm×150mm,30μm,的色谱柱,样品组氨酸标签目标蛋白峰响应偏低,影响组氨酸标签蛋白的准确定量。
上实施例与对比例1-4的对比实验结果可知,本发明的洗脱程序的时间长度设置更合适,能实现快速定量,在上述洗脱程序下,主峰与杂质峰的分离度符合要求,有利于准确定量。同时,所述流动相的pH值也会影响检测结果,当pH值在7.3-7.7范围之外时,影响组氨酸标签蛋白的准确定量。本发明采用的色谱柱也适用于组氨酸标签蛋白的检测,更换其他色谱柱,样品组氨酸标签目标蛋白峰响应偏低,影响组氨酸标签蛋白的准确定量。
综上,本发明首次将固定化金属离子亲和层析与HPLC技术相结合应用于指导商业蛋白工艺研发及生产,可准确快速指导商业蛋白工艺研发及生产过程包括但不限于细胞裂解液亲和层析上样,减少目的蛋白过载或低载情况发生,极大的节省研发和生产费用。本发明提供了一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,所述分析方法可以对组氨酸标签蛋白准确定量,在蛋白工艺研发和生产过程中具有重要的应用价值。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,所述分析方法包括:
(1)制备参比品溶液、质控品溶液和待测样品溶液,进行IMAC-HPLC检测;
(2)以参比品溶液的上样量为横坐标X,组氨酸标签蛋白峰面积为纵坐标Y,拟合线性方程得到标准曲线;
(3)将质控品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到质控品组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与理论上样量的比值为回收率;将待测样品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线,计算得到待测样品中组氨酸标签蛋白的实测上样量,实测上样量与样品进样体积的比值为组氨酸标签蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述参比品溶液和质控品溶液由如下步骤制备得到:
将消光系数大于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于溶剂中,配制成1.0±0.2mg/mL参比品溶液或质控品溶液;
将消光系数小于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于溶剂中,配制成7.0±0.2mg/mL参比品溶液或质控品溶液;
优选地,所述溶剂选自水或稀释缓冲液,所述稀释缓冲液按浓度计包括15-25mM HEPES+450-550mM NaCl,pH为7.3-7.7。
3.根据权利要求1或2所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,在所述IMAC-HPLC检测中,通过改变参比品溶液的进样体积,控制参比品溶液的上样量。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的色谱柱的填料为螯合了Ni2+的色谱柱填料,优选为Polar MC30-Ni Excel色谱柱。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测采用梯度洗脱方法对样品进行分离。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为15-25mM HEPES+450-550mM NaCl;所述流动相B为15-25mM HEPES+450-550mMNaCl+450-550mM咪唑;
优选地,所述流动相A的pH为7.3-7.7,优选为7.4-7.6;
优选地,所述流动相B的pH为7.3-7.7,优选为7.4-7.6。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的流速为0.8±0.2mL/min。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的梯度洗脱的程序为:
0-4min流动相A为100%流动相B为0%;
4-7min流动相A为0-100%流动相B为0-100%;
7-9min流动相A为0%流动相B为100%;
9-12min流动相A为0-100%流动相B为0-100%;
12-30min流动相A为100%流动相B为0%;
优选地,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的梯度洗脱的程序为:
0min流动相A为100%流动相B为0%;
4min流动相A为100%流动相B为0%;
7min流动相A为0%流动相B为100%;
9min流动相A为0%流动相B为100%;
12min流动相A为100%流动相B为0%;
30min流动相A为100%流动相B为0%。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法,其特征在于,步骤(1)中,所述IMAC-HPLC检测的柱温设置为25±5℃。
10.权利要求1-9中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法在蛋白工艺研发和/或生产过程中的应用。
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