CN117447603A - 一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法，包括以下步骤：S1)将缓冲液、磁性聚合物微球与Protein A混合常温反应，得到中间体；所述磁性聚合物微球具有环氧壳层；S2)将中间体用封闭液封闭后，得到偶联Protein A的微球。与现有技术相比，本发明采用具有环氧壳层的磁性聚合物微球偶联Protein A，Protein A中的巯基基团与磁性聚合物微球中的环氧基团通过化学键结合，过程简单，反应条件温和，偶联效率高。

Description

一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，尤其涉及一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法。
背景技术
传统的偶联Protein A的方式是将Protein A的氨基与固相载体的羧基通过化学键结合，通用方法有两种：一是以碳二亚胺(EDC)为交联剂的一步法；二是以碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂的两步法。其中，EDC试剂对水敏感，要求现用现配，且中间产物在水溶液中极不稳定，易水解，导致偶联效率偏低，整个反应不可控，使终产物除了目的产物外，可能还会有大量的多个蛋白自连产物，这样不仅浪费蛋白，还大大降低了反应效率。而对于通用的两步法，EDC对pH值敏感，活化羧基的最适pH值在3.5～4.5，但是活化羧基后形成的中间产物与氨基偶联的最适pH在4.5～7.5，在实际应用过程中，这种操作比较繁琐，影响反应效率。因此，现有技术中由于使用EDC作为交联剂，导致反应条件受到诸多限制，操作条件的苛刻与操作步骤的繁琐进一步导致了目前的羧基微球偶联氨基方法成本高、偶联效率低。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法，该方法简单且偶联效率高。
本发明提供了一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法，包括以下步骤：
S1)将缓冲液、磁性聚合物微球与Protein A混合常温反应，得到中间体；所述磁性聚合物微球具有环氧壳层；
S2)将中间体用封闭液封闭后，得到偶联Protein A的微球。
优选的，所述磁性聚合物微球按照以下方法制备：
a)将聚合物基体单体和引发剂在液相介质中进行聚合反应，随后再加入功能单体继续反应，得到含有功能基团的聚合物微球；
所述功能基团为可与环氧基进行开环反应的基团；
b)在惰性气体气氛下，将所述聚合物微球、铁盐和亚铁盐在碱性介质中混合反应，反应过程中生成四氧化三铁颗粒并在聚合物微球表面沉积，之后再加入环氧单体进行反应，所述环氧单体在聚合物微球表面形成环氧壳层，得到磁性聚合物微球；
所述环氧单体包括含两个环氧基团的单体。
优选的，所述缓冲液选自pH值5～6的MES溶液、pH值7～8的PBS溶液、pH值7～8的PBST溶液、pH为9～10的碳酸钠溶液或pH为9～10的NaOH溶液。
优选的，所述缓冲液选自pH值5～5.6的MES溶液、pH值7.4的PBS溶液、pH值7.4的PBST溶液、pH为10的碳酸钠溶液或pH为10的NaOH溶液。
优选的，所述缓冲液与磁性聚合物微球的比例为0.5mL：5mg～5mL：5mg。
优选的，所述Protein A与磁性聚合物微球的质量比为1：10～1：1。
优选的，所述常温反应的时间为6～15h。
优选的，所述封闭液为牛血清蛋白溶液；所述封闭的时间为1～3h；所述封闭在室温条件下进行。
优选的，所述偶联Protein A的微球的蛋白载量为33.5～143.3μg/mg。
本发明提供了一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法，包括以下步骤：S1)将缓冲液、磁性聚合物微球与Protein A混合常温反应，得到中间体；所述磁性聚合物微球具有环氧壳层；S2)将中间体用封闭液封闭后，得到偶联Protein A的微球。与现有技术相比，本发明采用具有环氧壳层的磁性聚合物微球偶联Protein A，Protein A中的巯基基团与磁性聚合物微球中的环氧基团通过化学键结合，过程简单，反应条件温和，偶联效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的磁性聚合物微球的光学显微镜图；
图2为本发明实施例2中制备的磁性聚合物微球的光学显微镜图；
图3为本发明实施例3中制备的磁性聚合物微球的光学显微镜图；
图4为本发明实施例4中制备的磁性聚合物微球的扫描电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法，包括以下步骤：S1)将缓冲液、磁性聚合物微球与Protein A混合常温反应，得到中间体；所述磁性聚合物微球具有环氧壳层；S2)将中间体用封闭液封闭后，得到偶联Protein A的微球。
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
按照本发明，所述缓冲液优选为pH值5～6的MES溶液、pH值7～8的PBS溶液、pH值7～8的PBST溶液、pH为9～10的碳酸钠溶液或pH为9～10的NaOH溶液，更优选为pH值5～5.8的MES溶液、pH值7.2～7.6的PBS溶液、pH值7.2～7.6的PBST溶液、pH为9.5～10的碳酸钠溶液或pH为9.5～10的NaOH溶液，再优选为pH值5～5.6的MES溶液、pH值7.4的PBS溶液、pH值7.4的PBST溶液、pH为10的碳酸钠溶液或pH为10的NaOH溶液；在本发明中，所述MES溶液中MES的浓度优选为0.08～0.1g/mL，更优选为0.09～0.1g/mL，再优选为0.095～0.1g/mL，最优选为0.0976g/mL；所述MES溶液的pH值通过氢氧化钠进行调节。
按照本发明，所述磁性聚合物微球具有环氧壳层；所述磁性聚合物微球优选按照以下方法制备：a)将聚合物基体单体和引发剂在液相介质中进行聚合反应，随后再加入功能单体继续反应，得到含有功能基团的聚合物微球；所述功能基团为可与环氧基进行开环反应的基团；b)在惰性气体气氛下，将所述聚合物微球、铁盐和亚铁盐在碱性介质中混合反应，反应过程中生成四氧化三铁颗粒并在聚合物微球表面沉积，之后再加入环氧单体进行反应，所述环氧单体在聚合物微球表面形成环氧壳层，得到磁性聚合物微球；所述环氧单体包括含两个环氧基团的单体。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述聚合物基体单体优选包括甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，更优选还包括苯乙烯；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯与苯乙烯的质量比优选为9.5:(50～100)，具体可为9.5:50、9.5:55、9.5:60、9.5:65、9.5:70、9.5:75、9.5:80、9.5:85、9.5:90、9.5:95或9.5:100。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述引发剂优选为偶氮二异丁腈(AIBN)；所述引发剂与聚合物基体单体的质量比优选为1:(40～100)，具体可为1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或1:100。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述液相介质优选为乙醇；所述液相介质中优选含有分散剂，所述分散剂优选为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；所述聚乙烯吡咯烷酮的K值优选为30，即PVP-K30；所述分散剂与液相介质的质量比优选为1:(20～250)，具体可为1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:170、1:200、1:230或1:250。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述聚合反应的过程中优选还添加交联剂；所述交联剂优选为二乙烯基苯(DVB)；所述交联剂与聚合物基体单体的质量比优选为1:(10～100)，更优选为1:(20～80)，具体可为1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75或1:80。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述聚合反应的温度优选为60～90℃，具体可为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃；所述聚合反应的时间优选为3～9h，具体可为3h、4h、5h、6h、7h、8h或9h。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述功能单体为可与聚合物基体单体进行反应，且含有功能基团的单体；所述功能基团为可与环氧基进行开环反应的基团，优选为羟基、氨基、胺基、磺酸基和羧基中的一种或多种。在本发明中，所述功能单体具体可为1,6-己二胺和/或D-天冬氨酸；所述功能单体与聚合物基体单体的质量比优选为(0.1～10):1，具体可为0.1:1、0.3:1、0.5:1、0.7:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述继续反应的温度优选为60～90℃，具体可为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃；所述继续反应的时间优选为3～9h，具体可为3h、4h、5h、6h、7h、8h或9h；所述继续反应结束后，对得到的反应产物进行洗涤。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述含有功能基团的聚合物微球优选为含有功能基团的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球(PGMA)、含有功能基团的聚苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯微球(PSt-GMA)或含有功能基团的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯微球(PGMA-DVB)。
在本发明提供的制备方法中，步骤a)中，所述含有功能基团的聚合物微球的粒径优选为800nm～4μm，具体可为800nm、850nm、900nm、950nm、1μm、1.2μm、1.5μm、1.7μm、2μm、2.3μm、2.5μm、2.7μm、3μm、3.2μm、3.5μm、3.7μm或4μm。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述惰性气体气氛优选由氮气提供。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述铁盐包括但不限于氯化铁；所述亚铁盐包括但不限于氯化亚铁；所述铁盐中Fe3+与亚铁盐中Fe2+的摩尔比优选为4:(2～4)，更优选为4:3；所述铁盐和亚铁盐的合计质量与所述聚合物微球质量的比优选为(0.1～1):1，具体可为0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1或1:1。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述碱性介质的pH值优选为9～12，更优选为10～11；所述碱性介质优选为氨水溶液；所述混合反应的温度优选为50～70℃，具体可为50℃、52℃、55℃、57℃、60℃、62℃、65℃、67℃或70℃；所述混合反应的时间优选为0.5～3h，具体可为0.5h、0.7h、1h、1.2h、1.5h、1.7h、2h、2.3h、2.5h、2.7h或3h，所述混合反应结束后，优选向反应体系中吹气脱氨，使反应体系的pH值达到7.5～8.5。在本发明中，弱碱性的环境更有利于后续环氧单体进行反应，从而提高反应速率，缩短反应时间，减少Fe3O4的氧化。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述环氧单体包括含两个环氧基团的单体；所述含两个环氧基团的单体的化学结构优选如式(i)所示：
式(i)中，R1为取代基。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述含两个环氧基团的单体更优选为1,4-丁二醇缩水甘油醚双酚A二缩水甘油醚和聚乙二醇二缩水甘油醚/>中的一种或多种。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述含两个环氧基团的单体更优选为1,4-丁二醇缩水甘油醚和双酚A二缩水甘油醚的混合单体或者1,4-丁二醇缩水甘油醚和聚乙二醇二缩水甘油醚的混合单体；其中，对于所述1,4-丁二醇缩水甘油醚和双酚A二缩水甘油醚的混合单体而言，混合单体中1,4-丁二醇缩水甘油醚和双酚A二缩水甘油醚的体积比优选为(1～20):1，具体可为1:1、2:1、5:1、7:1、10:1、12:1、15:1、17:1或20:1；对于所述1,4-丁二醇缩水甘油醚和聚乙二醇二缩水甘油醚的混合单体而言，混合单体中1,4-丁二醇缩水甘油醚和聚乙二醇二缩水甘油醚的体积比优选为(1～5):1，具体可为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述含两个环氧基团的单体与所述聚合物微球的用量比优选为(2～5)mL:1g，具体可为2mL:1g、2.25mL:1g、2.5mL:1g、2.75mL:1g、3mL:1g、3.25mL:1g、3.5mL:1g、3.75mL:1g、4mL:1g、4.25mL:1g、4.5mL:1g、4.75mL:1g或5mL:1g。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，所述环氧单体优选还包括含一个环氧基团的单体；所述含一个环氧基团的单体优选为缩水甘油；所述含一个环氧基团的单体与所述聚合物微球的用量比优选为(0.05～1)mL:1g，具体可为0.05mL:1g、0.08mL:1g、0.1mL:1g、0.15mL:1g、0.2mL:1g、0.3mL:1g、0.4mL:1g、0.5mL:1g、0.6mL:1g、0.7mL:1g、0.8mL:1g、0.9mL:1g或1mL:1g。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，加入所述环氧单体进行反应的温度优选为70～90℃，具体可为70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃、87℃或90℃；所述反应的时间优选为4～12h，具体可为4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h。
在本发明提供的制备方法中，步骤b)中，优选还包括对所述磁性聚合物微球的环氧壳层进行功能化改性，以满足不同使用场景需求；所述功能化改性使用的改性试剂优选为HS-R2-COOH、HS-R2-NH2、HOOC-R2-NH2、H2N-R2-NH2、HOOC-R2-COOH中的一种或多种，R2为取代基；所述改性试剂更优选为巯基乙酸和/或D-天冬氨酸；所述改性试剂与步骤a)制得的聚合物微球的质量比优选为1:(0.5～5)，具体可为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。
在本发明提供的制备方法中，制得的所述磁性聚合物微球的粒径优选为1～4.5μm，具体可为1μm、1.2μm、1.5μm、1.7μm、2μm、2.3μm、2.5μm、2.7μm、3μm、3.2μm、3.5μm、3.7μm、4μm、4.2μm或4.5μm。
本发明提供的制备方法首先通过分散聚合合成含有功能基团的聚合物微球，然后在微球表面原位沉积四氧化三铁颗粒，之后在完成四氧化三铁沉积的反应体系中加入环氧单体进行反应，反应过程中环氧单体与聚合物微球表面的功能基团进行化学键合，同时环氧单体与环氧单体之间发生聚合，最终形成牢固包覆于聚合物微球外表面的环氧壳层，得到夹心结构的磁性聚合物微球。在此基础上，本发明提供的制备方法还可以进一步对制得的聚合物微球的环氧壳层进行功能化改性，以满足不同使用场景需求。本发明提供的方法能够制备得到夹心结构的第三代磁性聚合物微球，该方法制备步骤简单，可以避免四氧化三铁在多步反应中过度氧化而影响磁性，整个制备过程易于控制，适合工业化生产。
按照本发明，所述Protein A优选为重组Protein A。
将缓冲液、磁性聚合物微球与Protein A混合常温反应，得到中间体；所述缓冲液与磁性聚合物微球的比例优选为0.5mL：5mg～5mL：5mg，更优选为0.5mL：5mg～3mL：5mg，再优选为1mL：5mg～3mL：5mg，最优选为1mL：5mg～2mL：5mg；所述Protein A与磁性聚合物微球的质量比为1：10～1：1，更优选为1：6～1：1，再优选为1：4～1：1，最优选为1：3.6～1：1.25；在本发明中，优选将缓冲液与磁性聚合物微球混合，然后加入Protein A混合常温反应；所述反应优选在混匀仪上进行；所述常温反应的时间优选为6～15h，更优选为6～12h，再优选为8～10h；常温反应后，优选清洗，得到中间体；所述清洗优选采用缓冲液进行；所述缓冲液同上所述，在此不再赘述；所述清洗的次数优选为2～8次，更优选为4～6次，再优选为5次。
将中间体用封闭液封闭后，得到偶联Protein A的微球；所述封闭液优选为牛血清蛋白溶液；所述封闭的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，再优选为2h；所述封闭在室温条件下进行。
按照本发明，所述偶联Protein A的微球的蛋白载量优选为33.5～143.3μg/mg；在本发明提供的一些实施例中，所述偶联Protein A的微球的蛋白载量具体为33.5μg/mg、54.1μg/mg、45μg/mg、49.4μg/mg、121.8μg/mg、143.3μg/mg或88.6μg/mg。
本发明采用具有环氧壳层的磁性聚合物微球偶联Protein A，Protein A中的巯基基团与磁性聚合物微球中的环氧基团通过化学键结合，过程简单，反应条件温和，偶联效率高。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售；实施例中所用Protein A为重组Protein A(杭州纽龙生物有限公司，NRPA04S)、PBS缓冲液(1×PBS缓冲液pH＝7.2-7.4厂家伊诺凯)；PBST缓冲液(阿拉丁，10×，用时稀释到1×)、洗脱液(自制pH＝2的甘氨酸缓冲液，0.125M)；实施例中所用MES缓冲液制备方法为：9.76g MES与80mL水混合，NaOH将pH调节至5，定容到100mL；洗脱液制备：0.37535g甘氨酸溶解于40ml水中，用盐酸调节pH＝2。
实施例1
(1)以乙醇(70g)为分散介质，GMA(8g)为单体，PVP-K30(2.5g)为分散剂，AIBN(0.16g)为引发剂，反应温度为70℃，搅拌速度为200r/min，聚合6h后加入65g 1,6-己二胺，保持70℃继续聚合6h，结束反应，用乙醇洗涤3次，水洗3次，即得到粒径为1.5μm的含氨基PGMA微球。
(2)将1g PGMA微球分散于100mL水中，并将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O按摩尔比4:3的比例(FeCl3·6H2O 0.0016mol，FeCl2·4H2O0.0012mol)加入分散液中，在氮气保护下，30℃搅拌1h，随后升温到60℃加入10mL浓氨水使反应体系的pH值达到10～11，保温反应1h；然后增大氮气流量(200～250mL/min)将体系中过量的氨排出，使体系pH值达到7.5～8.5；随后加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(2mL)、双酚A二缩水甘油醚(1mL)、缩水甘油(0.1mL)，升温至75℃后继续反应8h，即得到粒径为1.5μm表面富含环氧基团的磁性聚合物微球。
对本实施例制备的磁性聚合物微球进行粒径及分布分析，结果如图1所示，图1是本发明实施例1提供的磁性聚合物微球的光学显微镜图。
对本实施例制备的磁性聚合物微球进行性能检测，结果为：CV(变异系数，表示微球的单分散性)＝3％，磁响应时间为18s(测试浓度为10mg/mL，2mL离心管内测试)。
实施例2
(1)以乙醇(200g)为分散介质，苯乙烯(75g)为单体，PVP-K30(7.5g)为分散剂，AIBN(1.5g)为引发剂，反应温度为75℃，搅拌速度为200r/min，聚合3h后加入单体GMA(9.5g)，再聚合3h后加入77g 1,6-己二胺，保持75℃继续聚合6h，结束反应，用乙醇洗涤3次，水洗3次，即得到粒径为4μm的含氨基的PSt-GMA微球。
(2)将1g PSt-GMA微球分散于100mL水中，并将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O按摩尔比4:3的比例(FeCl3·6H2O 0.26g，FeCl2·4H2O 0.24g)加入分散液中，在氮气保护下，30℃搅拌1h，随后升温到60℃加入10mL浓氨水使反应体系的pH值达到10～11，保温反应1h；然后增大氮气流量(200～250mL/min)将体系中过量的氨排出，使体系pH值达到7.5～8.5；随后加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(2.5mL)、双酚A二缩水甘油醚(0.25mL)、缩水甘油(0.08mL)，升温至75℃后继续反应8h后，得到表面富含环氧基团的磁性聚合物微球。
对本实施例制备的磁性聚合物微球进行粒径及分布分析，结果如图2所示，图2是本发明实施例2提供的磁性聚合物微球的光学显微镜图。
对本实施例制备的磁性聚合物微球进行性能检测，结果为：CV(变异系数，表示微球的单分散性)＝5％，磁响应时间为21s(测试浓度为10mg/mL，2mL离心管内测试)。
实施例3
(1)以乙醇(200g)为分散介质，GMA(30g)为单体，DVB(0.6g)为交联剂，PVP-K30(1g)为分散剂，AIBN(0.325g)为引发剂，反应温度为70℃，搅拌速度为200r/min，聚合6h后加入28g D-天冬氨酸，继续聚合6h，结束反应，用乙醇洗涤3次，水洗3次，即得到粒径为2μm的含羧基的PGMA-DVB微球。
(2)将1g PGMA-DVB微球分散于100mL水中，并将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O按摩尔比4:3的比例(FeCl3·6H2O 0.26g，FeCl2·4H2O 0.24g)加入分散液中，在氮气保护下，30℃搅拌1h，随后升温到60℃加入10mL浓氨水使反应体系的pH值达到10～11，保温反应1h；然后增大氮气流量(200～250mL/min)将体系中过量的氨排出，使体系pH值达到7.5～8.5；随后加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(3mL)和聚乙二醇二缩水甘油醚(1.5mL)，缩水甘油(0.8mL)，升温至75℃后继续反应8h，即得到粒径为2μm表面富含环氧基团的磁性聚合物微球。
对本实施例制备的磁性聚合物微球进行粒径及分布分析，结果如图3所示，图3是本发明实施例3提供的磁性聚合物微球的光学显微镜图。
对本实施例制备的磁性聚合物微球进行性能检测，结果为：CV＝4％，磁响应时间为20s(测试浓度为10mg/mL，2mL离心管内测试)。
实施例4
(1)以乙醇(200g)为分散介质，苯乙烯(75g)为单体，PVP-K30(7.5g)为分散剂，AIBN(1.5g)为引发剂，反应温度为75℃，搅拌速度为200r/min，聚合3h后加入单体GMA(9.5g)，再聚合3h后加入77g 1,6-己二胺，保持75℃继续聚合6h，结束反应，用乙醇洗涤3次，水洗3次，即得到粒径为4μm的含氨基的PSt-GMA微球。
(2)将1g PSt-GMA微球分散于100mL水中，并将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O按摩尔比4:3的比例(FeCl3·6H2O 0.26g，FeCl2·4H2O 0.24g)加入分散液中，在氮气保护下，30℃搅拌1h，随后升温到60℃加入10mL浓氨水使反应体系的pH值达到10～11，保温反应1h；然后增大氮气流量(200～250mL/min)将体系中过量的氨排出，使体系pH值达到7.5～8.5；随后加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(5mL)、双酚A二缩水甘油醚(0.5mL)、缩水甘油(0.16mL)，升温至75℃后继续反应8h后，得到表面富含环氧基团的磁性聚合物微球。
利用扫描电子显微镜对实施例4中得到的磁性聚合物微球进行分析，得到其扫描电镜图如图4所示。
实施例5
5.1在2mL离心管中加入0.5mL pH为10的碳酸钠溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例2)，然后加入70μL 10mg/mL的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
5.2用pH为10的碳酸钠溶液清洗5次，加入1mL 10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
5.3用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
5.4磁吸去掉上清液，用PBST缓冲液洗涤4次。
5.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁吸，收集上清液，即为目标抗体，加入40μLTris-HCl缓冲液。
5.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
5.7计算蛋白载量为33.5μg/mg。
实施例6
6.1在2mL离心管中加入1mL pH为5的MES溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例2)，然后加入200μL 10mg/ml的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
6.2用MES溶液清洗5次，加入1mL 10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
6.3用PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
6.4磁吸去掉上清液，用PBST洗涤4次。
6.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁性，收集上清液，加入40μL Tris-HCl缓冲液。
6.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
6.7计算蛋白载量为54.1μg/mg。
实施例7
7.1在2mL离心管中加入1mL pH为5.6的MES溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例2)，然后加入200μL 10mg/mL的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
7.2用pH为5.6的MES溶液清洗5次，加入1ml10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
7.3用PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
7.4磁吸去掉上清液，用PBST洗涤4次。
7.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁性，收集上清液，加入40μL Tris-HCl缓冲液。
7.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
7.7计算蛋白载量为45μg/mg。
实施例8
8.1在2mL离心管中加入1mL pH为7.4的PBS溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例2)，然后加入200μL 10mg/ml的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
8.2用PBS溶液清洗5次，加入1mL 10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
8.3用PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
8.4磁吸去掉上清液，用PBST洗涤4次。
8.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁性，收集上清液，加入40μL Tris-HCl缓冲液。
8.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
8.7计算蛋白载量为49.4μg/mg。
实施例9
9.1在2mL离心管中加入1mL pH为5.6的MES溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例4)，然后加入200μL 10mg/mL的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
9.2用pH为5.6的MES溶液清洗5次，加入1mL 10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
9.3用PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
9.4磁吸去掉上清液，用PBST洗涤4次。
9.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁性，收集上清液，加入40μL Tris-HCl缓冲液。
9.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
9.7计算蛋白载量为121.8μg/mg。
实施例10
10.1在2mL离心管中加入1mL pH为5的MES溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例4)，然后加入200μL 10mg/ml的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
10.2用pH为5的MES溶液清洗5次，加入1ml 10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
10.3用PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
10.4磁吸去掉上清液，用PBST洗涤4次。
10.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁性，收集上清液，加入40μL Tris-HCl缓冲液
10.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
10.7计算蛋白载量为143.3μg/mg。
实施例11
11.1在2mL离心管中加入1mL pH为7.4的PBS溶液和2.5mg表面富含环氧的磁性聚合物微球(实施例4)，然后加入200μL 10mg/mL的Protein A溶液，将离心管置于混匀仪上，常温过夜。
11.2用PBS溶液清洗5次，加入1ml10g/L牛血清白蛋白BSA溶液，室温封闭2h。
11.3用PBS缓冲液洗涤2次，加入990μL PBST缓冲液，同时加入110μL小鼠血清，涡旋均匀，并置于混匀仪上室温混合20min。
11.4磁吸去掉上清液，用PBST洗涤4次。
11.5加入160μL洗脱液室温混合10min，磁性，收集上清液，加入40μL Tris-HCl缓冲液。
11.6检测：用nanodrop微量分光光度计检测，280nm处的吸收峰峰高×10即为载量。
11.7计算蛋白载量为88.6μg/mg。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于点击化学的高效偶联Protein A的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1)将缓冲液、磁性聚合物微球与Protein A混合常温反应，得到中间体；所述磁性聚合物微球具有环氧壳层；
S2)将中间体用封闭液封闭后，得到偶联Protein A的微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性聚合物微球按照以下方法制备：
a)将聚合物基体单体和引发剂在液相介质中进行聚合反应，随后再加入功能单体继续反应，得到含有功能基团的聚合物微球；
所述功能基团为可与环氧基进行开环反应的基团；
b)在惰性气体气氛下，将所述聚合物微球、铁盐和亚铁盐在碱性介质中混合反应，反应过程中生成四氧化三铁颗粒并在聚合物微球表面沉积，之后再加入环氧单体进行反应，所述环氧单体在聚合物微球表面形成环氧壳层，得到磁性聚合物微球；
所述环氧单体包括含两个环氧基团的单体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液选自pH值5～6的MES溶液、pH值7～8的PBS溶液、pH值7～8的PBST溶液、pH为9～10的碳酸钠溶液或pH为9～10的NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液选自pH值5～5.6的MES溶液、pH值7.4的PBS溶液、pH值7.4的PBST溶液、pH为10的碳酸钠溶液或pH为10的NaOH溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液与磁性聚合物微球的比例为0.5mL：5mg～5mL：5mg。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Protein A与磁性聚合物微球的质量比为1：10～1：1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述常温反应的时间为6～15h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述封闭液为牛血清蛋白溶液；所述封闭的时间为1～3h；所述封闭在室温条件下进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶联Protein A的微球的蛋白载量为33.5～143.3μg/mg。
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