CN117442551A - 一种产h2s促进创面愈合的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种产H2S促进创面愈合的水凝胶及其制备方法。本发明将一种释放H2S的供体药物—GYY4137包载入纤维素‑丙烯酸‑聚赖氨酸形成的水凝胶中，制备出可缓慢释放硫化氢的水凝胶敷料。该水凝胶具有孔隙结构，可包载硫化氢供体，同时硫化氢供体释放响应性能与创面微环境的pH改变特点结合，本发明水凝胶作为药物缓释载体能够长久缓慢释放硫化氢，有利于促进组织中血管生成，细胞增殖，提高伤口愈合效率。

Description

一种产H2S促进创面愈合的水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种产H2S促进创面愈合的水凝胶及其制备方法。
背景技术
组织创伤是日常生活中常见的外部损伤之一，在伤口愈合过程中伤口感染仍是一个亟待解决的难题。抗菌肽聚赖氨酸具有很好的杀菌能力和热稳定性，聚赖氨酸的加入使水凝胶具有良好的抗菌性能，可降低愈合过程中的伤口感染问题。同时难愈合的创面涉及到过度的炎症，再上皮化、血管新生和胶原沉积等。硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后发现的第三种内源性信号转导分子具有极其广泛的生物学活性，同时具有舒张血管、抗炎、抗氧化的作用。目前关于H2S的促进创面愈合的水凝胶报道较少。
发明内容
本发明将一种释放H2S的供体药物-GYY4137包载入纤维素-丙烯酸-聚赖氨酸形成的水凝胶中，制备出可缓慢释放硫化氢的水凝胶敷料。该水凝胶具有孔隙结构，可包载硫化氢供体，同时硫化氢供体释放响应性能与创面微环境的pH改变特点结合，本发明水凝胶作为药物缓释载体能够长久缓慢释放硫化氢，有利于促进组织中血管生成，细胞增殖，提高伤口愈合效率。
一方面，本发明提供了一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其包括：
1)CNF-C-SH的制备
将羧基化纤维素纳米纤维(CNF-C)加入去离子水中，搅拌至溶解；然后加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌溶解并通入氮气来活化羧基，最后加入L-半胱氨酸，将得到的混合物在氮气中避光搅拌24小时，反应24小时后，将混合物离心将沉淀除去，上清液中纳米原纤维分散体在分子量为14000的透析袋透析24小时，最后将透析后样品冻干，得到类似海绵状的产物，即CNF-C-SH；
2)CA溶液的制备
称取CNF-C-SH溶解于去离子水中，得到CNF-C-SH溶液，在配置好的CNF-C-SH溶液中加入丙烯酸(AA)和去离子水，磁力搅拌混合均匀，加入光引发剂，调节溶液pH＝4.0，此时溶液记为CA溶液；
3)CAE溶液的制备
取上述CA溶液，加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合，活化羧基半小时后之后加入聚赖氨酸(EPL)，此时溶液记为CAE溶液；
4)CAEG的制备
取CAE溶液，加入硫化氢供体GYY4137(吗啡盐)使得，此时溶液记为CAEG溶液。分别取CAEG溶液放在模具中，用功率为10W波长为365nm的紫外灯光照10min成胶，得到CAEG水凝胶。
作为优选，所述步骤1)中的羧基化纤维素纳米纤维与去离子水的重量体积比为1g：100mL。
作为优选，所述步骤1)中的羧基化纤维素纳米纤维：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺：L-半胱氨酸的重量比100：27：18：50。
作为优选，所述步骤2)中CNF-C-SH与去离子水的重量体积比为1g：100mL。
作为优选，所述步骤2)中CNF-C-SH：AA：H2O的体积比＝3：1：1。
作为优选，所述步骤2)中光引发剂为浓度为1％(w/v，g/mL)的2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)溶液，所述步骤2)中CNF-C-SH与光引发剂的添加重量比为30：50。
作为优选，所述步骤3)中1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐与CA溶液的重量体积比为135g：20000mL。
作为优选，所述步骤3)中聚赖氨酸与CA溶液的重量体积比为120mg：20mL。
作为优选，所述步骤4)中硫化氢供体GYY4137与CAE溶液的重量体积比为50mg：10mL。
另一方面，本发明提供了如上述方法制备得到的产H2S促进创面愈合的水凝胶。
再一方面，本发明提供上述产H2S促进创面愈合的水凝胶在制备治疗伤口感染药物中的应用。
本发明采用点击化学反应，将羧基化纤维素与半胱氨酸反应，使纤维素接枝巯基，加入丙烯酸和光引发剂，纤维素的巯基和丙烯酸的双键在自由基光引发剂作用下经紫外光辐照，巯基可以极快速度完成对碳碳双键加成聚合，实现快速固化形成水凝胶。
本发明制备得到的水凝胶具有良好的抗菌性能，聚赖氨酸的加入有着良好的抗菌性能，使伤口在愈合过程可减少细菌感染。
本发明制备得到的水凝胶缓慢释放硫化氢供体，可以抗炎、抗氧化、促进血管生成，可促进伤口愈合。
附图说明
图1为CA、CAE、CAEG的SEM图像。
图2为硫化氢供体和装载硫化氢供体的水凝胶的释放曲线，其中，图a为pH＝6.0条件下，图b为pH＝7.4条件下，硫化氢供体和装载硫化氢供体的水凝胶的释放曲线。
图3为CA、CAE、CAEG组水凝胶的溶胀曲线。
图4为不同水凝胶的抗菌实验。
图5为不同浓度的水凝胶培养孵育L929的相对细胞活力的影响图。
图6为空白组(Control)、CA、CAE、CAEG组5000μg/mL浓度培养的孵育L929细胞的AO/EB染色形态和存活状态。
图7为空白对照组、市售水凝胶组、CA组、CAE组、CAEG组在第0、3、7、14天的创面愈合图像。
图8为空白对照组、市售水凝胶组、CA组、CAE组、CAEG组在第0、3、7、14天的创面收缩率。
图9为空白对照组、市售水凝胶组、CA组、CAE组、CAEG组的体内生物相容性实验。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
GYY4137：对-(4-甲氧基苯基)-P-4-吗啉基-二硫代磷酸。
实施例1水凝胶的制备
1)CNF-C-SH的制备
将1.0g羧基化纤维素纳米纤维(CNF-C)加入装有100mL去离子水烧瓶中，搅拌至溶解；然后加入0.27g(0.14mmol)1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.18g(1.5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌溶解并通入氮气30min来活化羧基，最后加入0.5g L-半胱氨酸，将得到的混合物在氮气中避光搅拌24小时。反应24小时后，将混合物以8000rpm离心将沉淀除去，上清液中纳米原纤维分散体在分子量为14000的透析袋透析24小时，最后将透析后样品冻干，得到类似海绵状的产物，即CNF-C-SH。
2)水凝胶的制备
称取0.30g CNF-C-SH于30mL去离子水中，搅拌溶解配置成浓度为1％(w/v，g/mL)溶液，在配置好的CNF-C-SH溶液中加入10mL丙烯酸(AA)和10mL去离子水，各组分体积比为CNF-C-SH：AA：H2O＝3：1：1，磁力搅拌混合均匀，加入0.50g光引发剂2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)浓度为1％(w/v，g/mL)，调节溶液pH＝4.0，此时溶液记为CA溶液。
取CA溶液20mL加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.135g，0.7mmol)混合，活化羧基半小时后之后加入120mg聚赖氨酸(EPL)，使得聚赖氨酸浓度为6mg/mL此时溶液记为CAE溶液。
取CAE溶液10mL加入50mg硫化氢供体GYY4137(吗啡盐)使得GYY4137浓度为5mg/mL，此时溶液记为CAEG溶液。
分别取CA，CAE，CAEG溶液1mL放在长×宽×高为1cm×1cm×1cm的模具中，用功率为10W波长为365nm的紫外灯光照10min成胶，分别得到CA、CAE、CAEG水凝胶。
实施例2水凝胶的表征
电镜扫描的方法：利用扫描电镜(Zeiss Sigma 500)观察凝胶的内部形貌。在测试之前，CA水凝胶CNF-C-SH/AA、CAE水凝胶CNF-C-SH/AA/EPL、CAEG水凝胶CNF-C-SH/AA/EPL/GYY4137放在冻干机中冷冻干燥，冻干后，用刀切取横截面，取适量样品于导电胶上，并置于样品台，喷金处理，使用扫描电子显微镜在3.0kV加速电压下观察水凝胶横断面形貌。
电镜结果图如图1所示各组水凝胶具有良好的孔隙结构，结果表明，在以硫化氢为供体的负载过程中，水凝胶CAEG保持了原有的形态。没有可见的GYY4137团聚现象表明，细小的GYY4137晶体在水凝胶支架内得到了很好的分散。水凝胶支架中都存在高度互联的孔洞和随机分布的孔洞，CAEG与未载供体的水凝胶支架CA、CAE之间没有实质性差异，可缓慢释放H2S。
实施例3硫化氢供体GYY4137的装载及释放
在1mL的CAE溶液里加入5mg GYY4137，形成CAEG溶液。取2mL CAEG溶液，在紫外灯下成胶后加入30mL PBS(pH＝7.4)的烧杯中，然后放入转速为110r/min温度为37℃的恒温震荡箱振荡进行模拟体外H2S释放动力学实验。分别在第1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h时离心取出1mL上清液(同时补充1mL原pH值的PBS溶液)后放回振荡器中继续振荡。用H2S试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)检测取出样品中的H2S含量，最后用酶标仪在635nm波长测定了结果，并以标准曲线方程计算H2S释放量。
硫化氢的释放结果见图2，结果表明：H2S气体从GYY4137和CAEG水凝胶中释放的特点。在不同的pH环境下(pH 6.0和7.4)，H2S气体的释放显示出不同的特点。在pH为6.0的环境中，H2S气体呈现快速的释放特性，而在pH为7.4的环境中，H2S气体的释放速度则较平缓，这说明了GYY4137对pH的敏感性。这一释放响应性能与创面微环境的pH改变特点结合，早期炎症阶段的创面的低pH环境启动了H2S气体的释放，而后期再生阶段pH值逐渐升高，减缓了H2S气体的释放，使CAEG水凝胶能更好地应用于创面愈合。将GYY4137和CAEG水凝胶进行比较，发现CAEG水凝胶使H2S气体释放高峰出现右移，达到了相对的缓释效果，实现了CAEG水凝胶作为药物缓释载体的作用。
实施例4水凝胶的溶胀性能实验
水凝胶是一种可降解的三维网络结构聚合物，它具有极为亲水的功能特性，在水中可以迅速达到溶胀状态。用重量法测定了水凝胶的溶胀能力。将冻干后的水凝胶CA，CAE，CAEG分别称取重量后放入pH为7.4的PBS溶液中，分别在1h、2h、4h、6h、8h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h这几个时间点取出样品，用滤纸吸除水分，记下重量并根据公式计算溶胀率，结果见图3。
结果表明，三组水凝胶具都有良好的溶胀性能，24h内水凝胶快速溶胀，7天后水凝胶溶胀达到平衡。由于聚赖氨酸具有良好的吸水性能，CAE组和CAEG组由于加入聚赖氨酸溶胀率达到7000％，说明该光交联水凝胶可以容纳大量的水，这赋予了优异的膨胀性能，类似于软组织，可吸收多余的组织渗出物，保持湿润的伤口环境，隔绝外界细菌的入侵。这一特性直接影响营养物质和废物的运输，与细胞的存活和增殖密切相关。
实施例5水凝胶的抗菌实验
将浓度为106CFU/mL的金黄色葡萄球菌与大豆酪蛋白琼脂培养基(TSB)混合，100mL的培养基加入100μL菌液，待培养基凝固后，用200μL枪头在培养基上打孔，每个孔的口径为6mm，分别将三组水凝胶CA、CAE、CAEG分别制成直径为5mm高为5mm的圆柱形，然后将三组水凝胶分别放入打好孔的培养基上，放入细菌培养箱37℃培养12h，用游标卡尺测量其抑菌圈大小。水凝胶的抗菌效果可根据抑菌圈的大小来判断，抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好。
结果见图4，结果表明，加入聚赖氨酸后的水凝胶CAE和CAEG组对比未加入的CA组，金黄色葡萄球菌的生长有显著的抑制作用，抑菌圈直径达40mm，硫化氢供体的加入虽然对抗菌效果有点影响，但抑菌效果仍然显著，可达35mm。聚赖氨酸的作用机制：作用于功能蛋白或关键酶，引起代谢过程受阻；作用于细胞壁和细胞膜系统，使细胞的能量、物质和信息传递中断；作用于遗传微粒或遗传物质结构，使遗传性状发生改变。聚赖氨酸的抑菌作用也是通过与生物膜作用，影响细菌呼吸作用，进入细菌体内的聚赖氨酸还会抑制酶和蛋白的合成，从而影响菌株的物质代谢。
实施例6水凝胶的细胞实验
生物相容性是创面愈合材料合格的必要条件之。通过培养的小鼠成纤维细胞(L929)采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法评价水凝胶CA、CAE、CAEG组的细胞毒性。L929细胞株于低糖培养基(MEM)中培育：含10％的胎牛血清，500μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。细胞在培养箱(37℃，5％CO2)中培养。将L929细胞以5×105的密度均匀接种于96孔板中，培养箱中培养24h，使细胞均匀铺满孔板底部，每孔加入180μL的培养基。将水凝胶浸入PBS(pH＝7.4)37℃共孵24h，母液浓度为50000μg/mL，逐步稀释得到不同浓度的浸提液(500μg/mL～50000μg/mL)，取20μL浸提液加入每孔中，使药物作用浓度为50μg/mL～500μg/mL，空白组加入20μL培养基，培养箱培养24h后，每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)注意避光操作，培养4h，吸出悬浮液，再加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，37℃恒温震荡箱水平振荡10min，用酶标仪在490nm处测定其OD值。其中ODtest为药物处理后细胞孔的吸光度值，ODcontrol为空白对照孔的吸光度值相对细胞活力计算：
结果如图5所示，结果表明，CA、CAE、CAEG组水凝胶浓度在50～500μg/mL范围内，L929细胞的存活率均大于80％(＞70％，无细胞毒性)，另外CAE组随着提取液浓度的增加，细胞活力显著增加，归因于聚赖氨酸的抗氧化活性以维持细胞活力。
将细胞以每孔1.5×105的密度接种于12孔中，补充培养基到2mL，二氧化碳培养箱37℃培养24h，将水凝胶CA、CAE、CAEG与培养基共孵育24h，浓度为5000μg/mL，24h后，取出12孔板，吸出培养基，对照组加入正常的培养基，实验组加入与水凝胶共孵育后的培养基，每孔加入2mL，二氧化碳培养箱37℃培养24h，然后取出12孔板，吸出培养基，加入2mLPBS(pH＝7.4)小心清洗3次，最后一次清洗留取细胞悬浮液500μL，加入配置好的荧光染色剂AO/EB工作液(AO：EB：AO/EB Dilution Buffer＝1:1:8)20μL，孵育15min，吸出液体，加入2mLPBS洗3次，清洗多余的染色剂，荧光显微镜观察并拍摄细胞存活状态，注意加入染色剂和拍摄过程中要避光，防止荧光淬灭。
结果如图6所示，AO/EB染色用荧光显微镜定性评估不同材料的细胞相容性，与空白对照组(Control)相比CA、CAE、CAEG组水凝胶对细胞形态和存活状态无明显影响，表明具有良好的体外细胞相容性。
实施例7水凝胶的动物实验
采用小鼠全层皮肤感染性伤口模型评价CAEG水凝胶对ICR小鼠的伤口愈合能力。ICR小鼠适应性喂养一周后，平均体重25g随机分6组(6只小鼠/组)：空白对照组、市售水凝胶(康乐保公司，水胶体敷料，型号33547)组、CA、CAE、CAG、CAEG。用4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.1mL/10g)，用动物电动剃毛器和10％Na2S脱去小鼠背部的毛，用使用无菌活检打孔器在每只小鼠背部形成圆形全层皮肤伤口(r＝8mm)，在伤口处滴加20μL浓度为1×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌(S.aureus)。然后将每组同等量的(长10mm，宽10mm，高2mm)敷料敷于创面上，每天更换敷料，并在第0、3、7和14天对每只小鼠的伤口进行拍照。用ImageJ测量创面初始面积(A0)和第3、7和14天的创面(Ad)。伤口收缩(％)按下式计算：
A0为第0天伤口面积，Ad为第3、7和14天的伤口面积。
结果见图7和图8所示，我们研究了空白组、市售水凝胶(康乐保公司，水胶体敷料，型号33547)，CA、CAE、CAEG水凝胶分别在第3天、7天、14天伤口愈合示意图和愈合率。其结果表明：随着愈合时间延长，创面愈合面积逐渐减小，经敷料CAEG治疗的小鼠创面愈合的效果最明显，伤口愈合效果做好，第14天实现完全闭合。愈合3天时，空白对照组、市售水凝胶组(康乐保公司，水胶体敷料，型号33547)、CA、CAE、CAEG组的伤口面积依次减少，其中CAEG组具有最大的伤口收缩率。在第7天市售水凝胶组、CA组、CAE组、CAEG组的伤口面积仍然小于空白对照组，在第14天，空白对照组伤口收缩率为84.69％，市售水凝胶组为89.196％，CA组为90.153％，CAE组94.239％，CAEG组95.178％。
由于敷料与皮肤直接接触，我们对材料进行包埋，进一步考察水凝胶在体内的生物相容性。ICR小鼠适应性喂养一周后，平均体重25g随机分5组(6只小鼠/组)：空白对照组、市售水凝胶组、CAE、CAG、CAEG。用4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.1mL/10g)，用动物电动剃毛器和10％Na2S脱去小鼠背部的毛，用碘伏消毒后沿着脊柱剪开一条长为1cm的创口。分别称取，市售水凝胶组、CAE、CAG、CAEG水凝胶各5mg水凝胶，经紫外线灭菌分别植入小鼠皮下，然后用手术缝合线将小鼠皮肤缝合，对照组不放入水凝胶，其他操作与实验组均同。
如图9所示，在小鼠背侧皮肤植入材料，然后缝合，分别于第5天、10天、20天后取出材料对植入部位的皮肤、小鼠的肾脏、肝脏和脾脏进行HE染色，评估各部分的病理学结构。根据切片结果各组水凝胶对小鼠皮肤组织结构重建没有不利影响，不会引起肝脏、脾脏和肾脏的病理异常，具有了良好的体内生物相容性。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一些具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)CNF-C-SH的制备
将羧基化纤维素纳米纤维(CNF-C)加入去离子水中，搅拌至溶解；然后加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌溶解并通入氮气来活化羧基，最后加入L-半胱氨酸，将得到的混合物在氮气中避光搅拌24小时，反应24小时后，将混合物离心将沉淀除去，上清液中纳米原纤维分散体在分子量为14000的透析袋透析24小时，最后将透析后样品冻干，得到类似海绵状的产物，即CNF-C-SH；
2)CA溶液的制备
称取CNF-C-SH溶解于去离子水中，得到CNF-C-SH溶液，在配置好的CNF-C-SH溶液中加入丙烯酸(AA)和去离子水，磁力搅拌混合均匀，加入光引发剂，调节溶液pH＝4.0，此时溶液记为CA溶液；
3)CAE溶液的制备
取上述CA溶液，加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合，活化羧基半小时后之后加入聚赖氨酸(EPL)，此时溶液记为CAE溶液；
4)CAEG的制备
取CAE溶液，加入硫化氢供体GYY4137(吗啡盐)使得，此时溶液记为CAEG溶液。分别取CAEG溶液放在模具中，用功率为10W波长为365nm的紫外灯光照10min成胶，得到CAEG水凝胶。
2.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的羧基化纤维素纳米纤维与去离子水的重量体积比为1g：100mL。
3.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的羧基化纤维素纳米纤维：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺：L-半胱氨酸的重量比100：27：18：50。
4.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中CNF-C-SH与去离子水的重量体积比为1g：100mL。
5.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中CNF-C-SH：AA：H2O的体积比＝3：1：1。
6.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中光引发剂为浓度为1％(w/v，g/mL)的2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶液，所述步骤2)中CNF-C-SH与光引发剂的添加重量比为30：50。
7.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐与CA溶液的重量体积比为135g：20000mL；所述步骤3)中聚赖氨酸与CA溶液的重量体积比为120mg：20mL。
8.如权利要求1所述一种产H2S促进创面愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中硫化氢供体GYY4137与CAE溶液的重量体积比为50mg：10mL。
9.如权利要求1-8中任一项所述方法制备得到的产H2S促进创面愈合的水凝胶。
10.如权利要求9中所述的产H2S促进创面愈合的水凝胶在制备治疗伤口感染药物中的应用。
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