CN117441817A - 一种可抑制口腔常见致病菌的益生菌软糖及其制作方法 - Google Patents
一种可抑制口腔常见致病菌的益生菌软糖及其制作方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种益生菌软糖，具体是一种可以抑制常见致病菌的益生菌活菌型软糖的制作方法，属于功效性的益生菌食品技术领域。本发明中应用一种可以产生抗菌肽、过氧化氢等抑制物质的植物乳杆菌KF‑18的专利菌粉，通过发酵、离心、洗涤、冷冻干燥等步骤得到专利菌粉，然后在软糖熬煮过程中与其他辅料一起加入软糖中，经冷凝成型后得到成品益生菌软糖。本益生菌软糖添加益生菌后证实其对口腔常见致病菌，如牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌等有抑制作用，通过不同的配比寻找最优的益生菌/糖类的配比，既要保证较高的活菌数，又有良好的抑菌效果。本发明打破传统“吃糖得蛀牙”的传统认知，预防及缓解口腔健康问题，具有良好的社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌食品技术领域，具体为一种新型的可抑制口腔常见致病菌的益生菌软糖，可用于保护口腔，预防口腔问题。
背景技术
根据世卫组织发布的《2017年全球疾病负担研究》估计，全球口腔疾病影响近35亿人，大部分是恒牙的疾病。在全球范围内，约有23亿人患有恒牙的龋齿，超过5.3亿儿童患有乳牙的龋齿，全球有近10%的人口受到可能导致牙齿脱落的牙周病的影响。我国第四次全国口腔健康流行病学调查结果显示，我国儿童患龋情况呈上升趋势，12岁儿童平均龋齿数为0.86颗，12岁儿童恒牙龋患率为34.5%，35—44岁居民口腔内牙石检出率为96.7%，牙龈出血检出率为87.4%，成年人的牙周健康不容乐观。而造成口腔的问题的元凶是牙菌斑，牙菌斑是基质包裹的互相粘附、或粘附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体，为不能被水冲去或漱掉的一种细菌性生物膜。它是导致龋齿和牙周病的最主要问题。
牙菌斑的形成主要是由于口腔致病菌代谢蔗糖产生的胞外多糖逐渐粘附于牙齿表面形成不可逆粘附，糖类等甜食的摄入成为口腔问题的主导。糖果是我们最爱吃的零食，是我们无法抗拒的美食。而传统糖果又会导致牙菌斑的产生，加重口腔问题。我们想要开发一种能抑制致病菌的软糖，从根源上切断牙菌斑的形成。同时还要添加对人体健康有益的益生菌，通过与致病菌之间的生物拮抗竞争等作用来抑制口腔致病菌的定植，从而保护口腔健康，打破传统“吃糖得虫牙”的传统认知，让大家更安心的享受糖果美食。
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。市面上的益生菌糖果也有很多，但是大多数益生菌都是能够调节肠道菌群，从而对身体产生有益作用，基本没有任何一款益生菌糖果可以用来预防或解决口腔问题。本发明所采用的主要益生菌为植物乳杆菌KF-18，这是一株从开菲尔酸奶中提取出来的对人体健康有益的菌株。经研究发现KF-18产过氧化氢的能力为26.19ug/mL，3%的过氧化氢是市面上大多数漱口水要添加的口腔清洁剂。同时它能产抗菌肽，对口腔致病菌变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌都有抑制作用，将其应用于糖果中是一种创新，也是一种突破。我们要打造一款可以预防“蛀牙”的益生菌糖果。
发明内容
本发明研发一款可预防口腔问题的益生菌软糖，为了保护口腔健康而添加可抑制口腔致病菌、清洁口腔的益生菌，做出口感好、有功效的益生菌活菌软糖。
本发明技术方案：本发明主要包含以下步骤。
植物乳杆菌KF-18菌粉制备与获得。
本菌株是从开菲尔源酸奶中分离得到，于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC60118。
将菌株活化制备种子培养基，然后接入MRS培养基中，接种量为1%，培养温度为37℃，培养基初始pH6.0~6.4，培养时间为18~22h，得到发酵液，经过三次离心、洗涤、添加冻干保护剂，通过真空冷冻干燥机进行冻干获得植物乳杆菌菌粉。
筛选可抑制变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌的食品用益生菌菌株。根据国家卫健委发布的《消毒技术规范》中规定的抗（抑）菌试验要求，筛选抑菌环实验抑菌环直径大于等于7mm的益生菌菌株。
将筛选出的抑菌性能好的菌株与植物乳杆菌KF-18进行复配，筛选益生菌菌株间没有拮抗作用，可协同共生的菌株，同时抑菌能力强的益生菌进行复配，强化益生功效。
益生菌软糖制备。
本发明所用的胶凝剂为明胶、果胶、卡拉胶、淀粉、黄原胶、魔芋胶中的任意一种、两种或两种以上的组合物。
本发明所用的糖为固体糖或液体糖浆；所述的固体糖为白砂糖、异麦芽酮糖醇、水苏糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、结晶果糖、木糖醇、山梨糖醇、低聚果糖中的任意一种、两种或两种以上组合物；所述的液体糖浆为麦芽糖浆、山梨醇糖浆、低聚异麦芽糖浆中的任意一种、两种及两种以上的组合物，所述的糖浆固化物含量为70%~85%。
本发明所用的果粉为蓝莓粉、葡萄粉、柠檬粉、橘子粉、甜橙粉、沙棘粉、苹果粉等天然果粉中的一种、两种或两种以上的组合物。
本发明所用的益生菌为对变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌等口腔致病菌有抑制作用的益生菌包括长植物乳植杆菌KF-18菌粉、唾液链球菌嗜热亚种菌菌粉、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌粉、动物双歧杆菌乳亚种菌粉、罗伊氏粘液乳杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、瑞士乳杆菌菌粉、发酵粘液乳杆菌菌粉、植物乳植杆菌菌粉、鼠李糖乳酪杆菌菌粉中的任意一种、两种或两种以上的组合物。
所述的抑菌作用的益生菌软糖中，所述的矫味剂为苹果酸、柠檬酸、三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷、维生素C、香精中的任意一种、两种或两种以上的组合物。
本发明的具有抑菌作用的益生菌软糖的制备方法，包括以下步骤。
熬糖：将糖类物质加纯化水熬制，控制温度在100~120℃熬化。
化胶：去胶凝剂加纯化水在化胶罐内加热充分溶胀，加热温度控制在80~100℃。
取纯化水将果粉、矫味剂、益生菌等辅料溶解待用。
将熬糖和化胶两步骤所得物料进行料液混合熬煮，至固化物含量为70%~80%，糖度为72~80之间后，将辅料在搅拌条件下加入到混合液中，混合均匀，得浇注前软糖料液。
浇注、脱模、干燥、筛选、包装成品。
工艺流程图见图1。
成品软糖活菌数及抑菌性能鉴定。
附图说明
图 1益生菌软糖制作流程图
图 2益生菌冻干菌粉制备流程图
实施方式
植物乳杆菌KF-18的制备。
在无菌环境下用移液枪吸取0.3~0.5mlMRS液体培养基加入菌种管内，轻轻振荡，使冻干菌粉溶解。酒精灯灼烧接种环，冷却后沾取一环菌粉溶液，划线至MRS固体培养基中.培养24h后，挑取单菌落接种于10mlMRS液体培养基中,作为种子发酵液。然后接入MRS培养基中，接种量为1%，培养温度为37℃，pH6.0~6.4，培养时间为18~22h，得到发酵液，经过三次离心、清洗、添加冻干保护剂，通过真空冷冻干燥机进行冻干获得植物乳杆菌菌粉。其中，选择添加的冻干保护剂为：脱脂乳粉，麦芽糊精，低聚半乳糖，比例为5-15%，得到原始冻干菌粉，活菌数达1010cfu/g。
冻干菌粉制备流程图见图二。
本实验根据国家卫健委发布的《消毒技术规范》中规定的抗（抑）菌试验要求，将益生菌菌株菌粉制成直径为5mm，厚不超过4mm的圆片，每4片/组。用无菌棉拭子蘸取浓度为5X105cfu/ml~5X106cfu/ml试验菌（牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌）悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每个平板上按要求放置4片试验样品，置37℃温箱，培养16h~18h观察结果，抑菌环直径>7mm为有抑菌作用。
筛选出单菌粉有抑菌作用的初筛结果如表一。
最终确定以唾液链球菌嗜热亚种、德氏乳杆菌保加利亚亚种、动物双歧杆菌乳亚种、鼠李糖乳酪杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌、嗜酸乳杆菌这六种益生菌菌粉与植物乳杆菌KF-18按照1:1：1：1:1:1：2的比例进行复配，在软糖制作过程中添加不同量的益生菌，得到活菌数最高的益生菌组合。
益生菌软糖制备。
设定不同比例的糖及各种辅料的比例，分别进行熬煮，具体比例见表二。
实施案例1熬糖过程。
熬糖：取白砂糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、结晶果糖等共50kg，加入纯化水10公斤，置于熬糖锅内，打开搅拌，控制加热温度为100~120℃，熬煮30分钟后待糖液澄清透明测量糖液温度，糖液温度为105~108℃至熬糖终点。
化胶：取10kg明胶至化胶罐内，加入1.5kg纯化水，开启搅拌，控制加热温度为80~100℃，加热搅拌保持1小时，使明胶充分溶胀，得到透明胶液。
果粉、提取物、矫味剂溶解：取6kg甜橙粉加入2kg纯化水溶解待用；取3kg绿茶粉加入1kg纯化水溶解待用；取0.1kg苹果酸加入0.05kg纯化水溶解待用。
料液混合：将充分溶胀的明胶在搅拌的条件下加入糖液内，混合均匀，将溶解后的果粉、提取物、矫味剂加入混合液中，边搅拌边熬煮，熬煮至固形物为80%，降温至50~60℃，备用。
溶解益生菌：取益生菌（唾液链球菌嗜热亚种、德氏乳杆菌保加利亚亚种、动物双歧杆菌乳亚种、鼠李糖乳酪杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌KF-18）共6kg，加入3kg30~40℃的纯化水充分溶解备用。
总混合：将溶解好的益生菌在搅拌的条件下加入混合好的料液内，保温40~50℃混合30分钟。
.浇注、干燥、分装得到成品，成品中水分含量为20%。
实施案例2-5以和实施案例1相同的步骤进行软糖的制作。
益生菌软糖活菌数检测。
以无菌操作称取25g软糖，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10样品匀液，备用。
唾液链球菌嗜热亚种计数：根据待检样品唾液链球菌嗜热亚种活菌数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MC培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养72h±2h，培养后计数。唾液链球菌嗜热亚种在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
乳杆菌计数：根据待检样品乳杆菌活菌数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72h±2h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
实例1~6根据益生菌的加入量不同活菌数的数量也有所差异，具体数值如表三。
从表3实验结果可得实例1~6均符合含有益生菌食品的对于活菌数的要求，实例3为最优方案。
益生菌软糖对常见致病菌抑菌性能检测。
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断是否具有抑菌能力，抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用。
抑菌剂样片制备：将软糖制成直径为5mm，厚不超过4mm的圆片，每4片一组。
阴性对照样片的制备：将未加入益生菌的软糖样品制成与试验组大小相同的样片。
试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml~5×106cfu/ml试验菌悬液（金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）菌悬液、大肠杆菌（8099）菌悬液、白色念珠菌（ATCC 10231）菌悬液），在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。
抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其贴于平板表面。盖好平板，置于37℃温箱，培养16h~18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环直径（包括贴片）并记录。试验重复3次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。
实例1~5根据益生菌的加入量不同抑菌环的大小也有所差异，具体数值如下表四。
从表4实验结果可得实例1~5抑菌环直径均大于7mm，都具有抑菌左右。从实验结果中可得出益生菌添加的份数约多抑菌环越大，实例2、实例3、实例4所添加的益生菌份数对抑菌环的影响不大。
综合实验例1、实验例2益生菌添加份数为4份时所得的活菌数与抑菌环为最优，实例3为最优方案。
我们单独对实例3的软糖进行了口腔常见致病菌的抑菌试验检测，除了对常见致病菌有抑制作用外，测试其对口腔是否有独特的健康作用。
试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml~5×106cfu/ml试验菌悬液牙龈卟啉单胞菌菌悬液、聚合梭杆菌聚核亚种菌悬液、伴放线放线杆菌菌悬液，在血琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。
试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml~5×106cfu/ml试验菌悬液变形链球菌菌悬液，在脑心浸出液琼脂BHIA培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。
抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其贴于平板表面。盖好平板，置于37℃温箱，培养16h~18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环直径（包括贴片）并记录。试验重复3次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。
实例3对口腔这几种致病菌的抑菌环具体数值如表五。
通过对几种常见致病菌的抑菌环实验，得出本次制作的益生菌软糖对这些致病菌都有抑制作用，食用后可对口腔及肠道菌群有调节作用，保护消化系统的健康。
Claims (7)
1.一种具有抑菌作用的益生菌软糖，包含以下重量份数的组分：糖60~75份，果粉5~10份，提取物0~5份，矫味剂0.1~1份，胶凝剂3~10份，益生菌1~10份，水15~20份。
2.本专利发明的具有抑菌作用的益生菌软糖，其特征是，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌、变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌有抑制作用。
3.本专利发明的具有抑菌作用的益生菌软糖，其特征是，所述的糖为固体糖或液体糖浆；所述的固体糖为白砂糖、异麦芽酮糖醇、水苏糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、结晶果糖、木糖醇、山梨糖醇、低聚果糖中的任意一种、两种或两种以上组合物；所述的液体糖浆为麦芽糖浆、山梨醇糖浆、低聚异麦芽糖浆中的任意一种、两种及两种以上的组合物，所述的糖浆固化物含量为70%~85%。
4.本专利发明的具有抑菌作用的益生菌软糖，其特征是，所选的抑菌剂为益生菌活菌组合，益生菌包括植物乳植杆菌KF-18菌粉、干酪乳酪杆菌菌粉、唾液链球菌嗜热亚种菌菌粉、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌粉、长双歧杆菌长亚种菌粉、短双歧杆菌菌粉、罗伊氏粘液乳杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、凝结魏茨曼氏菌菌粉、瑞士乳杆菌菌粉、发酵粘液乳杆菌菌粉、植物乳植杆菌菌粉、鼠李糖乳酪杆菌菌粉中的任意一种、两种或两种以上的组合物。
5.本专利发明的具有抑菌作用的益生菌软糖，其特征是，所述胶凝剂为明胶、果胶、卡拉胶、淀粉、黄原胶、魔芋胶中的任意一种、两种或两种以上的组合物。
6.本专利发明的具有抑菌作用的复合益生菌软糖制剂，其特征是，熬煮后的复合益生菌软糖成品对口腔常见致病菌有抑制作用，而非单个菌株的作用，强调益生菌的复合搭配后的整体作用及产生的益生功效。
7.本专利发明的具有抑菌作用的复合益生菌软糖制剂，其起到抑菌作用的有效成分是益生菌复合制剂，软糖只是复合益生菌的一种载体形式，也可以添加其他辅料做成压片糖果，或者做成复合益生菌粉等形式。
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