CN117431289A - 用于水产保鲜的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法与保鲜方法 - Google Patents
用于水产保鲜的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法与保鲜方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于水产保鲜的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法与保鲜方法，本发明利用鱼皮制备的浆液进行酶解，分离出分子量在2000‑5000Da的鱼皮蛋白肽，再将蛋白肽与低聚木糖经过低温糖基化反应制得蛋白糖肽保鲜剂，对鱼肉进行保鲜。本发明开发的产品安全，采用多种食品级复合蛋白酶，在温和条件下，经过适度酶解和分离获得特定功能的鱼皮蛋白肽；经过低温糖基化反应制成糖基化鱼蛋白肽产品，整个加工过程中没有添加任何其它的物质。本发明的鱼皮蛋白糖肽具有较强的抗菌、抗氧化和保水能力，将其应用于冷藏鱼肉，能够显著抑制微生物生长繁殖和鱼肉氧化腐败，减少鱼肉的水分流失，具有良好的保鲜效果，可显著延长产品贮藏期。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，涉及一种鱼皮蛋白糖肽及其制备方法，尤其涉及一种用于水产保鲜的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法与保鲜方法。
背景技术
冷藏和冷冻作为一种常用的水产品保鲜方式，通过降低内源酶活性和微生物的生长代谢速率，以此延长水产品的贮藏时间。
鱼肉冷藏或冷冻贮藏期间，会出现感官品质劣变、菌落总数超标、蛋白质降解、脂肪氧化、水分流失等现象。目前水产品保鲜的方法主要包括物理保鲜(气调保鲜和辐照保鲜)、化学保鲜(天然产物及其提取物和合成保鲜剂)和生物保鲜(ε-聚赖氨酸、乳酸菌等微生物来源的保鲜剂)等。但是，采用上述方法进行保鲜都很难保持鱼肉原有的口感及营养。
发明内容
为了充分利用鱼体自身资源，同时降低其他来源的保鲜剂对鱼肉口感的影响，以及出于安全性的考虑，本发明提供一种可以对水产品保鲜的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法和保鲜方法。本发明利用鱼体自身的蛋白质，通过生物技术开发具有特定功能的蛋白肽，利用富含特定功能的多肽和低聚糖制备得到鱼蛋白糖肽，具备较好的鱼肉抗菌、抗冻和保鲜能力。
本发明提供一种具有鱼肉保鲜作用的鱼皮蛋白糖肽的制备方法，所述制备方法包括：将鱼皮依次经酶解、超滤，得到鱼皮蛋白肽；
然后将所述鱼皮蛋白肽与低聚糖进行混合并反应，即得所述的鱼皮蛋白糖肽。
在一些实施例中，所述低聚糖为低聚木糖；
所述鱼皮为鲤鱼鱼皮和/或鲢鱼鱼皮。
在一些实施例中，超滤截留到分子量为2000-5000Da的鱼皮蛋白肽；
所述酶解采用由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶进行酶解；优选地，所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为(1～2)：1：(1～2)；
和/或，鱼皮在酶解前先进行前处理，优选地，所述前处理包括煮制和/或超声处理；更优选地，所述前处理为煮制后经超声处理。
在一些实施例中，所述超声处理的频率为100-120kHz，优选地，超声处理的时间为10-15分钟；
所述煮制为将鱼皮浸没入水中，加热至煮沸并保持煮沸60～120分钟；优选地，水的添加量是鱼皮重量3～4倍；更优选地，所述煮沸的温度为95-100℃。
所述复合蛋白酶的加入量为所述鱼皮质量的0.1～0.3％；优选地，所述酶解反应的温度为50～60℃，更优选地，酶解反应的时间为1.0～2.0h。
所述碱性蛋白酶的酶活为5万U/g-50万U/g，所述胰蛋白酶的酶活为10万U/g-100万U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为5万U/g-50万U/g。
一般来说，蛋白酶的浓度和酶活越高，反应速度会越快。这是因为酶的浓度和酶活越高，参与反应的酶分子数量越多，能够提供更多的活性中心来催化反应。但是，蛋白酶的浓度和酶活并不是越高越好，当蛋白酶的浓度和酶活过高时，可能会发生自身抑制作用，降低酶的作用，从而减缓酶解反应的速度。同时酶的浓度和酶活越高，酶的费用越高，发明人在试验中发现，当采用由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶对鱼皮浆液进行酶解时，当复合蛋白酶的添加量为鱼皮质量的0.1～0.3％时，得到的鱼皮蛋白糖肽中分子量为2000-5000Da的蛋白肽较多，同时酶的费用较低。
具体的，通过二步超滤方法进行处理，先利用孔径为5000Da的陶瓷膜将分子量小于5000Da的多肽进行分离，再用孔径为2000Da的膜将分子量大于2000Da的蛋白肽进行分离，取分子量在2000-5000Da的蛋白肽溶液。
发明人采用多种食品级复合蛋白酶，包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，在温和条件下，经过适度酶解和分离获得特定功能的鱼皮蛋白肽；分子量更小的鱼皮蛋白肽在制备过程中需要经多次超滤，提纯，工艺复杂，而且产品收率比较低，很难量产。经发明人多次试验发现，分子量在2000-5000Da(道尔顿)的蛋白肽与低聚木糖反应后能显著提高对鱼肉的保鲜效果，其在抗菌、抗氧化、抗冻和保水能力，以及肉质口感的保持都有更好的效果。同时生产成本较低，非常适合用于产业化生产。
在一些实施例中，酶解后经灭酶，过滤，收集滤过液，调节滤过液的蛋白含量，再进行超滤；所述过滤为采用纱布过滤；采用陶瓷膜进行超滤。
优选地，滤过液的蛋白含量调节到5-7wt％；发明人发现，当滤过液的蛋白含量为5-7％时，更有利于提高超滤的效率。超滤后得到的鱼皮蛋白糖肽中含有较多的抗菌肽和抗氧化肽等，而且，对鱼肉的保鲜效果也较好。蛋白含量的调节方法为将滤过液进行浓缩或向滤过液中加入水；
所述灭酶的温度为95-100℃，更优选地，所述灭酶的时间为10-15分钟。
在一些实施例中，鱼皮蛋白肽与低聚糖进行反应的温度为85-90℃，优选地，鱼皮蛋白肽与低聚糖进行反应的时间为50-70分钟；
和/或，鱼皮蛋白肽与低聚糖的重量比为(4～6)：1；
更优选地，将鱼皮依次经酶解、超滤，得到的鱼皮蛋白肽溶液与低聚糖进行混合并反应，然后浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白糖肽粉。
本发明还提供了一种上述的制备方法得到的鱼皮蛋白糖肽。
本发明还提供了一种保鲜剂，所述保鲜剂包括所述的鱼皮蛋白糖肽；优选地，所述鱼皮蛋白糖肽在保鲜剂中占比为80-100wt％。
在一些实施例中，所述的保鲜剂的保鲜方法，所述保鲜方法包括：用所述的鱼皮蛋白糖肽或所述的保鲜剂对鱼肉进行保鲜；优选地，用所述的鱼皮蛋白糖肽或所述的保鲜剂对鱼肉表面进行涂抹或用其水溶液将鱼肉浸没后，再进行冷藏或冻藏；更优选地，所述冷藏或冻藏为真空密封冷藏或真空密封冻藏。
在一些实施例中，所述保鲜方法具体包括如下步骤：
(1)将所述鱼皮蛋白糖肽或所述保鲜剂按重量5-10％溶到水中，混合均匀，得到保鲜剂溶液；
(2)在0-4℃环境下对全鱼进行预冷，将预冷后的全鱼浸没于步骤(1)得到的保鲜剂溶液中5-20分钟，沥干；
(3)将步骤(2)得到的沥干后的全鱼装入保鲜袋中，真空包装，然后冷藏或冻藏；
优选地，所述冷藏的温度为0-4℃；所述冷冻的温度为-18℃至-20℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下几点：
1、本发明开发的产品更加安全，利用鱼皮蛋白肽和低聚糖经过低温糖基化反应，开发的糖基化鱼蛋白肽产品，整个加工过程中没有添加任何其它的添加剂。
2、本发明的鱼皮蛋白糖肽具有较强的抗菌、抗氧化、抗冻和保水能力，将其应用于冷藏或冷冻鱼肉，能够显著抑制微生物的生长繁殖和鱼肉腐败，减少鱼肉的水分流失，具有良好的保鲜效果，可较好保持鱼原有的口感及营养等，可显著延长产品贮藏期，对于延长鱼肉货架期和提升产品品质具有重要意义。
3、本发明开发的鱼皮蛋白糖肽对水产品具有较好的抗冻功能，产品冷冻6个月后，产品感官品质等指标仍保持在90％以上。
4、本发明开发的蛋白糖肽，能广泛作为水产食品保鲜剂。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的原料除特殊说明外，均为市售。
在一些具体的实施例中，本发明提供了一种具有鱼肉保鲜作用的鱼皮蛋白糖肽的制备方法，具体按照如下方法：
(1)选用的鲤鱼或鲢鱼鱼皮，用水清洗鱼皮，洗净后加入鱼皮重量3～4倍的水，加热煮沸后继续煮制60-120分钟，将温度调整到85-90℃，经超声波处理，得到鱼皮浆液；
(2)按照鱼皮重量的0.1～0.3％向步骤(1)制得的鱼皮浆液中加入复合蛋白酶进行酶解，然后用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到5-7％，得到酶解分离液；
(3)将步骤(2)所得的酶解分离液通过超滤方法进行处理，得到分子量在2000-5000Da的蛋白肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的分子量在2000-5000kH的蛋白肽溶液与低聚木糖在85-90℃反应50-70分钟后，通过浓缩、冷冻干燥，即得所述的鱼皮蛋白糖肽。
具体的，所述步骤(1)中，鲤鱼或鲢鱼鱼皮的状态为冷冻或新鲜或干燥。
具体的，所述步骤(1)中，超声波发生器频率为100-120kHz。
具体的，所述步骤(2)中，复合蛋白酶是由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成，碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为(1～2)：1：(1～2)。
具体的，步骤(2)中，蛋白含量的调节方法为浓缩或加入水。
具体的，步骤(4)中，蛋白肽溶液中的肽与低聚木糖的重量比为(4～6)：1。
按照上述制备方法得到鱼皮蛋白糖肽，并将鱼皮蛋白糖肽在鱼肉保鲜上应用。
实施例1
一种具有鱼肉保鲜作用的鱼皮蛋白糖肽的制备方法，其步骤如下：
(1)选用冷冻的鲤鱼鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,洗净后加入鱼皮重量4倍的水，在121℃的条件下煮制120分钟，将温度调整到90℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kHz)处理10分钟，得到鱼皮浆液；在蒸煮后进一步利用超声处理，有助于鱼皮更好的熬制；
(2)按照步骤(1)中的鱼皮重量的0.2％向步骤(1)得到的鱼皮浆液中加入复合蛋白酶，先在50℃的条件下进行酶解反应1.0h，再将温度调整到95℃，保持15分，用纱布过滤，收集过滤液，将过滤液的蛋白含量调节到6％，得到酶解分离液；其中，复合蛋白酶由质量比为1：1：1的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；碱性蛋白酶的酶活为35万U/g，所述胰蛋白酶的酶活为45万U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为30万U/g。
(3)将步骤(2)所得的酶解分离液通过二步超滤方法进行处理，具体是：先利用孔径为5000Da的陶瓷膜超滤，将酶解分离液中分子量小于5000Da的蛋白肽分离出来，再用孔径为2000Da的膜将其中分子量大于2000Da的蛋白肽分离出来，得到蛋白肽溶液作为鱼皮蛋白糖肽的原料；
(4)将步骤(3)得到的分子量在2000-5000Da的蛋白肽溶液与低聚木糖(肽与低聚木糖的质量比为6：1)在90℃反应50分钟，通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白糖肽；蛋白肽溶液与糖的水合发生糖基化反应；
(5)按照8％将(4)得到的鱼皮蛋白糖肽粉溶到水中，室温200rpm搅拌10分钟后，0-4℃水合0.5h，得到保鲜剂溶液；
(6)金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃步骤(5)得到的保鲜剂溶液中10分钟，沥干；
(7)将步骤(6)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，分别于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
实施例2
本实施例提供了一种具有鱼肉保鲜作用的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法和保鲜方法：
(1)选用新鲜的鲢鱼鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,洗净后加入鱼皮重量3倍的水，在115℃的条件下煮制120分钟，将温度调整到85℃，利用超声波发生器经超声波(频率为100kHz)处理15分钟，得到鱼皮浆液；
(2)按照鱼皮重量的0.3％向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为2：1：1组成，在60℃的条件下进行酶解反应2.0h，将温度调整到100℃，保持10分钟，用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到7％，得到酶解分离液；碱性蛋白酶的酶活为30万U/g，所述胰蛋白酶的酶活为50万U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为30万U/g；
(3)将步骤(2)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000Da的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000Da的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000Da的膜将分子量大于2000Da的蛋白肽分离出来；
(4)将步骤(3)得到的分子量在2000-5000的蛋白肽溶液与低聚木糖(肽与低聚木糖的质量比为5：1)在90℃反应70分钟，通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白糖肽；
(5)按照10％将(4)得到的鱼皮蛋白糖肽溶到水中，室温200rpm搅拌10分钟后，4℃水合0.5h，得到保鲜剂溶液；
(6)金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃的步骤(5)得到的保鲜剂溶液中10分钟，沥干；
(7)将步骤(6)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，分别于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
实施例3
本实施例提供了一种具有鱼肉保鲜作用的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法和保鲜方法：
(1)选用新鲜的鲢鱼鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,洗净后加入鱼皮重量3.5倍的水，在118℃的条件下煮制60分钟，将温度调整到90℃，利用超声波发生器经超声波(频率为110kHz)处理12分钟，得到鱼皮浆液；
(2)按照鱼皮重量的0.1％向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为2：1：2组成，在55℃的条件下进行酶解反应1.5h，将温度调整到98℃，保持12分钟，用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到7％，得到酶解分离液；碱性蛋白酶的酶活为30万U/g，所述胰蛋白酶的酶活为50万U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为30万U/g；
(3)将步骤(2)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000Da的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000Da的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000Da的膜将分子量大于2000Da的蛋白肽分离出来，得到酶解分离液；
(4)将步骤(3)得到的分子量在2000-5000的蛋白肽溶液与低聚木糖(肽与低聚木糖的质量比为4：1)在85℃反应60分钟，通过浓缩、冷冻干燥，即得所述的鱼皮蛋白糖肽；
(5)按照5％将(4)得到的的鱼皮蛋白糖肽溶到水中，室温200rpm搅拌10分钟后，4℃水合0.5h，得到保鲜剂溶液；
(6)金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃的步骤(5)得到的保鲜剂溶液中10分钟，沥干；
(7)将步骤(6)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，分别于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
对比例1
本对比例与实施例3的制备方法基本相同，不同在于：没有加入低聚木糖与蛋白肽溶液进行反应，且没有截留分子量2000-5000的鱼皮蛋白肽。
本对比例的鱼皮蛋白肽鱼肉保鲜剂制备方法和保鲜方法具体为：
(1)选用冷冻的鲤鱼鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,洗净后加入鱼皮重量4倍的水，在121℃的条件下煮制120分钟，将温度调整到90℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kHz)处理10分钟，得到鱼皮浆液；
(2)按照鱼皮重量的0.2％向步骤(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为1：1：1组成，在50℃的条件下进行酶解反应1.0h，将温度调整到95℃，保持15分，用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到6％，得到酶解分离液；碱性蛋白酶的酶活为30万U/g，所述胰蛋白酶的酶活为50万U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为30万U/g；
(3)将步骤(2)得到的酶解分离液，通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽；
(4)按照8％将步骤(3)得到鱼皮蛋白肽粉溶到水中，室温200rpm搅拌10分钟后，0-4℃水合0.5h，得到保鲜剂溶液；
(5)金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃的步骤(4)得到的保鲜剂溶液中10分钟，沥干；
(6)将步骤(5)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，分别于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
对比例2
本对比例与实施例3的制备方法基本相同，不同在于：没有加入低聚木糖与蛋白肽溶液进行反应。
分子量2000-5000的鱼皮蛋白肽鱼肉保鲜剂制备方法和保鲜方法：
(1)选用冷冻的鲤鱼鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,洗净后加入鱼皮重量4倍的水，在121℃的条件下煮制120分钟，将温度调整到90℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kHz)处理10分钟，得到鱼皮浆液；
(2)按照鱼皮重量的0.2％向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，蛋白酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为1：1：1组成，在50℃的条件下进行酶解反应1.0h，将温度调整到95℃，保持15分，用纱布过滤，收集过滤液，将蛋白含量调节到6％，得到酶解分离液；碱性蛋白酶的酶活为30万U/g，所述胰蛋白酶的酶活为50万U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为30万U/g；
(3)将步骤(2)所得的酶解分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000Da的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000Da的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000Da的膜将分子量大于2000Da的蛋白肽分离出来；
(4)将步骤(3)得到的分子量在2000-5000的蛋白肽溶液，通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽粉；
(5)按照8％将(4)得到的鱼皮蛋白肽粉溶到水中，室温200rpm搅拌10分钟后，0-4℃水合0.5h，得到保鲜剂溶液；
(6)金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃步骤(5)得到的保鲜剂溶液中10分钟，沥干；
(7)将步骤(6)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，分别于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
对比例3
本对比例采用低聚木糖对鱼肉保鲜，具体方法如下：
(1)按照8％将低聚木糖溶到水中室温200rpm搅拌10分钟后，0-4℃水合0.5h，得到保鲜剂溶液；
(2)金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃步骤(1)得到的低聚木糖中10分钟，沥干；
(3)将步骤(2)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
对比例4
金鲳鱼全鱼用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，于0-4℃冷藏和-18℃冻藏。
对比例5
本对比例采用单一蛋白酶酶解鱼皮蛋白糖肽，制备方法与实施例1的区别仅在于：用碱性蛋白酶代替复合蛋白酶。
实验例经冷藏后的鱼肉品质的测定
本实验例对实施例1、实施例2、实施例3和对比例1-5中经冷藏后的鱼进行品质测定，主要包括：
1、菌落总数的测定：
菌落总数的测定参照GB/T 4789.2-2010《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》方法。
2、硫代巴比妥酸值的测定：
硫代巴比妥酸值的测定参考Erkan等人(Quality assessment of whole andgutted sardines(Sardina pilchardus)stored in ice.International Journal ofFood Science&Technology,2010,43(9):1549-1559)的方法。取2g绞碎的鱼肉，加入16mL三氯乙酸溶液(5％；w/v)和100μL二丁基羟基甲苯乙醇溶液(2g/L)，8000rpm均质30s，5000rpm离心3分钟；取5mL上清液与1mL硫代巴比妥酸溶液(0.01M)混匀，沸水浴加热40分钟，冷却至室温，测定532nm下的吸光值；用样品中丙二醛的毫克当量表示硫代巴比妥酸值(mg/kg鱼肉)。
3、挥发性盐基氮值的测定：
挥发性盐基氮值的测定参考Hong等人(Effects of low concentration of saltand sucrose on the quality of bighead carp(Aristichthys nobilis)filletsstored at 4℃Food Chemistry,2012,133:102-107)，采用半微量蒸馏法测定；取5g绞碎的鱼肉，加入50mL蒸馏水，8000rpm均质30s，100rpm摇床震荡30分钟，3500rpm离心5分钟；取5mL上清液与5mL氧化镁混悬液(10g/L)在消化管中迅速混合，凯氏定氮仪蒸馏5分钟，期间以加有甲基红-次甲基蓝混合指示剂的10mL硼酸(20g/L)作为接受剂；用0.010mol/L的盐酸标准溶液滴定吸收液，以蓝紫色作为滴定终点。
4、K值的测定：
K值的测定参考Fan等人(Biogenic a分钟e and quality changes in lightlysalt-and sugar-salted black carp(Mylopharyngodon piceus)fillets stored at 4℃.Food Chemistry,2008,108:148-153.)的方法；取1g绞碎的鱼肉，加入2mL冷高氯酸(10％；v/v)，5000rpm均质30s，5000rpm离心3分钟，上清液留存待用，残渣用2mL冷高氯酸(5％；v/v)洗涤并离心两次，合并三次上清液；用KOH溶液(10mol/L；1mol/L)和高氯酸溶液(10％；5％)调节溶液pH值至6.40±0.05，6000rpm离心5分钟，残渣用pH6.4的冷高氯酸洗涤，合并上清液并定容至10mL；样液经0.22μm的水系滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪测定，所用色谱柱为COSMOSIL 5C18-PAQ(4.6×250mm)，流动相为pH6.8的磷酸盐缓冲液，检测波长为254nm，进样量为50μL，流速为1mL/分钟。根据标准曲线及峰面积计算ATP关联物的浓度。K值的计算公式如下：
其中，HxR表示次黄嘌呤核苷，Hx表示次黄嘌呤，ATP表示三磷酸腺苷，ADP表示二磷酸腺苷，AMP表示一磷酸腺苷，IMP表示肌苷酸。
5、感官评价：
根据Khazandi等人(Efficacy evaluation of a new water sanitizer forincreasing the shelf life of Southern Australian King George Whiting andTasmanian Atlantic Salmon fillets.Food Microbiology,2017,68,51-60)的方法，对鱼片进行感官分析。10名专门培训的感官评定小组成员根据表1的鱼肉感官评价标准对鱼肉感官品质综合评分，以色泽(C)、气味(O)和质构(T)三个感官参数的加权感觉指数(SI)作为最终结果。计算公式如下：
SI＝2×C+2×O+T。
当SI≤12.5时，鱼片被认为感官不可接受。
表1鱼肉感官评价标准
6、二硫键含量的测定参照Benjakul等人(Food Chemistry,2003,80(4):535-544)的方法。
二硫键含量计算公式为:二硫键含量＝A×D/(C×B)
其中A表示吸光值，B表示待测液蛋白浓度(mg/mL)，C表示摩尔吸收系数，其值为13600mol-1·cm-1·L，D为稀释倍数，本实验为1.25。
7、羰基含量的测定：将肌原纤维蛋白溶液含量统一调节至2mg/ml测定羰基含量。
羰基含量计算公式为:羰基含量(nmol/mg蛋白)＝(OD(370nm)-空白)/(22×浓度(mg/ml))×125×10×5
对各实施例和对比例中经0-4℃冷藏的金鲳鱼肉在冷藏期间的主要品质指标进行测定，结果见表2。然后分别在-18℃冻藏6个月后对金鲳鱼肉的主要品质指标再进行比较，结果见表3。
表2不同处理鱼肉冷藏(4℃)期间主要品质指标比较
/>
上述表2可知，根据菌落总数、感官评价指标、挥发性盐值、K值、硫代巴比妥酸值，实施例1、实施例2、实施例3均比对比例1、对比例2、对比例3、对比例4及对比例5的金鲳鱼冷藏货架期显著延长。由此，将本发明实施例1、实施例2或实施例3的鱼皮蛋白糖肽应用于冷藏鱼肉，可显著提升鱼肉的贮藏期的品质，是一种非常优良的鱼肉生物保鲜剂。
表3不同处理金鲳鱼肉在-18℃冻藏6个月后主要品质指标比较
/>
上述表3结果说明，本发明实施例1、实施例2、实施例3制得的鱼皮蛋白糖肽处理的鱼肉经过-18℃冻藏6个月后，其感官评价达到22.6分以上，感官品质保持在90％以上，蒸煮损失率低于12％，二硫键含量小于3.1mol/105g，羰基含量小于1.4nmol/mg蛋白，挥发性盐基氮小于10.5mg/100g，显著优于其它各组。可见本发明开发的鱼皮蛋白糖肽生物保鲜剂能够显著延长鱼肉冷冻保存期的品质，并在抗氧化和抗冻方面效果显著。
总上可知，本发明开发的鱼皮蛋白糖肽处理的鱼肉无论在冷藏，还是冷冻贮藏对鱼肉都有很好的保鲜、抗冻保护效果，可见，本发明提高的一种具有鱼肉保鲜作用的鱼皮蛋白糖肽及其制备方法和保鲜方法具有显著的创新性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种用于水产保鲜的鱼皮蛋白糖肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将鱼皮依次经酶解、超滤，得到鱼皮蛋白肽；
然后将所述鱼皮蛋白肽与低聚糖进行混合并反应，即得所述的鱼皮蛋白糖肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低聚糖为低聚木糖；
所述鱼皮为鲤鱼鱼皮和/或鲢鱼鱼皮。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，超滤截留到分子量为2000-5000Da的鱼皮蛋白肽；
所述酶解采用由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶进行酶解；优选地，所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为(1～2)：1：(1～2)；
和/或，鱼皮在酶解前先进行前处理，优选地，所述前处理包括煮制和/或超声处理；更优选地，所述前处理为煮制后经超声处理。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶的加入量为所述鱼皮质量的0.1～0.3％；优选地，所述酶解反应的温度为50～60℃，更优选地，酶解反应的时间为1.0～2.0h；
所述超声处理的频率为100-120kHz，优选地，超声处理的时间为10-15分钟；
所述煮制为将鱼皮浸没入水中，加热至煮沸并保持煮沸60～120分钟；优选地，水的添加量是鱼皮重量3～4倍；更优选地，所述煮沸的温度为95-100℃。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，酶解后经灭酶，过滤，收集滤过液，调节滤过液的蛋白含量，再进行超滤；
优选地，滤过液的蛋白含量调节到5-7wt％；
所述灭酶的温度为95-100℃，更优选地，所述灭酶的时间为10-15分钟。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，鱼皮蛋白肽与低聚糖进行反应的温度为85-90℃，优选地，鱼皮蛋白肽与低聚糖进行反应的时间为50-70分钟；
和/或，鱼皮蛋白肽与低聚糖的重量比为(4～6)：1；
更优选地，将鱼皮依次经酶解、超滤，得到的鱼皮蛋白肽溶液与低聚糖进行混合并反应，然后浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白糖肽粉。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法得到的鱼皮蛋白糖肽。
8.一种保鲜剂，其特征在于，所述保鲜剂包括权利要求7所述的鱼皮蛋白糖肽；优选地，所述鱼皮蛋白糖肽在保鲜剂中占比为80-100wt％。
9.一种权利要求7所述的鱼皮蛋白糖肽或权利要求8所述的保鲜剂的保鲜方法，其特征在于，所述保鲜方法包括：用所述的鱼皮蛋白糖肽或所述的保鲜剂对鱼肉进行保鲜；优选地，用所述的鱼皮蛋白糖肽或所述的保鲜剂对鱼肉表面进行涂抹或用其水溶液将鱼肉浸没后，再进行冷藏或冻藏；更优选地，所述冷藏或冻藏为真空密封冷藏或真空密封冻藏。
10.利用权利要求9所述的保鲜方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将所述鱼皮蛋白糖肽或所述保鲜剂按重量5-10％溶到水中，混合均匀，得到保鲜剂溶液；
(2)在0-4℃环境下对全鱼进行预冷，将预冷后的全鱼浸没于步骤(1)得到的保鲜剂溶液中5-20分钟，沥干；
(3)将步骤(2)得到的沥干后的全鱼装入保鲜袋中，真空包装，然后冷藏或冻藏；
优选地，所述冷藏的温度为0-4℃；所述冷冻的温度为-18℃至-20℃。
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