CN117431249A - 芝麻SiWAKL6基因及其编码的蛋白在抗病育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种芝麻SiWAKL6基因及其编码的蛋白在抗病育种中的应用，所述芝麻SiWAKL6基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。其中芝麻SiWAKL6基因能够受菜豆壳球孢和水杨酸诱导，参与芝麻对茎点枯病的抗性。异源超表达SiWAKL6的转基因拟南芥病情指数和M.phaseolina定殖量显著降低。进一步研究显示，超表达SiWAKL6的拟南芥能够激活SA信号通路相关基因高水平的表达以及积极调节体内活性氧稳态，进而提高拟南芥对M.phaseolina的抗性。本发明SiWAKL6基因的新功能为芝麻抗病育种提供了新方法，在芝麻生产中具有十分重要的价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种芝麻SiWAKL6基因及其编码的蛋白在抗病育种中的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum L.)属于胡麻科(Pedaliaceae)胡麻属(Sesamum Linn)，其含油量超过了花生、大豆和向日葵等作物，是富含营养的油料作物之一。由菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)引起的茎点枯病是芝麻生产中危害严重的真菌病害之一，对芝麻的产量和品质都造成了严重威胁。植物WAK样基因(WAK like genes,WAKLs)一般都能够通过调节包括细胞壁强化、抗病相关基因激活、水杨酸(SA)或茉莉酸(JA)积累、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及ROS稳态等过程赋予植物对病原菌的抗性。
申请人前期通过比较转录组学分析初步筛选出SiWAKL6为芝麻抗茎点枯病的候选基因。其中在M.phaseolina胁迫的48小时内，SiWAKL6在ZZ13(抗病品种)中被持续诱导表达，而在J9014(感病品种)中未被诱导。因此，鉴定芝麻SiWAKL6基因的功能对于芝麻抗病育种具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种芝麻SiWAKL6基因及其编码的蛋白在抗病育种中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种芝麻SiWAKL6基因，所述芝麻SiWAKL6基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
所述芝麻SiWAKL6基因编码的蛋白。
芝麻SiWAKL6基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的芝麻SiWAKL6基因在抗病育种中的应用。
所述芝麻SiWAKL6基因编码的蛋白在抗病育种中的应用。
本发明有益效果：
本发明发现芝麻SiWAKL6基因能够受菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina，M.phaseolina)和水杨酸(SA)诱导，参与芝麻对茎点枯病的抗性。异源超表达SiWAKL6的转基因拟南芥病情指数和M.phaseolina定殖量显著降低。进一步研究显示，超表达SiWAKL6的拟南芥能够激活SA信号通路相关基因高水平的表达以及积极调节体内活性氧稳态，进而提高了拟南芥对M.phaseolina的抗性。
本发明SiWAKL6基因的新功能为芝麻抗病育种提供了新方法，在芝麻生产中具有十分重要的价值。
附图说明
图1SiWAKL6基因在M.phaseolina(A)、水杨酸(B)和茉莉酸甲酯(C)处理下的表达分析。
图2SiWAKL6基因的结构示意图。
其中，A.SiWAKL6的染色体定位；B.SiWAKL6的基因结构；C.SiWAKL6蛋白的保守结构域；D.SiWAKL6蛋白的信号肽和跨膜结构域。
图3超表达pCAMBIA2301-KY载体示意图。
图4超表达SiWAKL6基因拟南芥的抗病性评价。
其中，A.WT和OE-SiWAKL6植株接菌14d后的症状；B.过表达株系PCR阳性验证；C.WT和OE-SiWAKL6植株接菌14d后的病情指数；D.WT和OE-SiWAKL6植株接菌14d后M.phaseolina和拟南芥基因组DNA的生物量相对丰度。
图5WT和OE-SiWAKL6中SA信号通路(A)和JA信号通路(B)标志基因在M.phaseolina胁迫12h后的表达模式。
图6WT和OE-SiWAKL6植株接种菌14d后的H2O2(A)和MDA(B)水平及CAT(C)和SOD(D)酶活检测。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1SiWAKL6受M.phaseolina和外源SA激素的诱导表达
1、芝麻材料和培养条件
抗茎点枯病芝麻品种：郑芝13(ZZ13)；感病品种：冀9014(J9014)。
将郑芝13和冀9014芝麻种子于5％(wt)的次氯酸钠(有效氯)溶液中消毒10分钟，再用70％(v/v)的酒精消毒30s，最后用无菌水冲洗3-4次，晾干后将芝麻种子种植于混合营养土(无菌土：营养土：无菌蛭石的体积比＝3:1:1)中，于人工气候箱中培养。培养条件为：温度29±1℃，相对湿度为80％，光周期为16h光照、8h黑暗。
2、芝麻幼苗接菌处理和外源激素处理
茎点枯病病原菌：菜豆壳球孢(M.phaseolina)，菌株编号为Mp2010028C。菌株由河南省农业科学院植物保护研究所生物防治研究室分离保存。
将保存的菌株活化后接种于PDA固体培养基中，30℃培养箱中培养7天至菌丝长满培养皿，然后将长满菌丝的培养基划成菌块，每1/2培养皿的菌块均匀接种至300mL的PD液体培养基中，然后在30℃、200r/min的条件下震荡培养5天。随后，用组织捣碎机将菌丝打碎，即得到菌丝悬液。每100mL菌丝悬液中加入100mL蒸馏水与灭过菌的混合营养土(草炭土：蛭石的体积比＝3:1)200g搅拌均匀，即得到带菌土壤。
接菌处理：待郑芝13和冀9014长至芝麻三叶一心时期，分别移栽至上述制备好的带菌土壤中。分别取接菌后0h、3h、6h、12h、24h和36h等6个不同时间点的芝麻根部组织，储存于-80℃备用。
激素处理：待郑芝13芝麻生长至三叶一心期，分别施用167mL浓度为200umol/L的茉莉酸甲酯、167mL浓度为2umol/L的水杨酸溶液进行灌根处理，以同等体积的水灌根处理作为对照。分别收取处理后0h、3h、6h、12h、24h和36h等6个不同时间点的芝麻根部组织，储存于-80℃备用。
3、qPCR分析
以芝麻SiUBQ5基因作为内参基因，对接种M.phaseolina后的郑芝13和冀9014的芝麻根部组织，及以水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)激素处理后的郑芝13芝麻根部组织，进行RNA提取、反转录以及荧光定量PCR试验，检测SiWAKL6基因的表达情况。引物如下：
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 |
| SiUBQ5 | TCTCGCCGACTACAACATTCA | TGGACACTCTTTCCTCAACCTCT |
| SiWAKL6 | CAGTTATTTGTTAGATCCATTTGAC | CACAGTAGCATACTTTACTTAATGT |
qPCR体系如下：
| 试剂 | 10μL体系 |
| 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | 5μL |
| 正向引物 | 0.25μL |
| 反向引物 | 0.25μL |
| cDNA模板 | 1μL |
| ddH2O | 3.5μL |
注：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix为通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒，诺唯赞(Vazyme)。
qPCR程序如下：94℃持续2分钟，然后94℃ 40个周期持续15秒，55℃持续15秒和72℃持续20秒。注：采用2-△△C方法分析qPCR数据。
通过qPCR技术检查接种M.phaseolina后不同时间点SiWAKL6基因在郑芝13(ZZ13)和感病品种冀9014(J9014)根部中的表达水平。结果显示，SiWAKL6基因在ZZ13中能够被M.phaseolina显著诱导表达，在3小时后达到峰值，而在J9014中却未被诱导表达(图1A)。
植物激素通常调节植物疾病相关蛋白的表达。为了探究与SiWAKL6相关的激素信号通路，对SA和MeJA激素处理后SiWAKL6在ZZ13中的表达模式进行检测，以水处理作为对照(Mock)。结果显示，植物激素对SiWAKL6的表达有不同的影响。施加外源SA后，SiWAKL6能够被迅速诱导表达，但是在对照处理中却没有被诱导表达(图1B)。MeJA处理后，SiWAKL6的表达量与水处理后的表达量基本接近(图1C)。
以上结果共同表明SiWAKL6受M.phaseolina和SA的诱导表达，可能通过SA介导的信号通路增强芝麻对茎点枯病的抗性。
4、SiWAKL6基因克隆
根据序列拼接结果设计SiWAKL6基因的引物，使用抗病品种郑芝13根部的cDNA扩增芝麻的SiWAKL6基因编码序列的全长。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min后放在4℃保存。然后对克隆SiWAKL6的PCR产物进行回收，得到纯化的目的DNA。引物信息如下：
SiWAKL6-F：ATGAGGCTGCCCTTGATACTCC
SiWAKL6-R：TCAAGCAACTAATGTTCGACTGTCG
随后对目的基因SiWAKL6进行连接转化，连接体系如下：
| 试剂 | 体系(10μL) |
| DNA | 5μL |
| Solution I | 4μL |
| pMD19-T simple victor | 1μL |
上述体系在16℃条件下连接4h。
注：pMD19-T simple victor为是两侧的3’端添加了“T”的线性化载体，SolutionI为连接体系中的缓冲液，pMD19-T simple victor和Solution I都为基因克隆载体试剂盒，塔克拉(TAKARA)。
然后将连接成功的载体利用DH5α大肠杆菌进行转化，挑取生长规则、饱满圆润的单菌落接种到含100mg/mL氨苄西林的LB培养基2mL管中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养12h，然后进行菌液PCR检测，选取含有正确条带的样本送去上海生工生物公司测序，得到SiWAKL6序列信息。
结果显示：SiWAKL6基因位于5号染色体上(图2A)，它包含两个外显子和一个内含子，基因长度为2924bp(图2B)，编码一个包含729个残基的WAKLs，其N端结构域是一个GUB-WAK结构域(aa 30至aa 89)，这是WAKL家族的特征结构域，C端结构域包含一个PKinase结构域(aa 398至aa 664)，这是其激酶活性的核心(图2C)。在SiWAKL6蛋白的N端检测到一个22aa的信号肽(SP)，此外，该蛋白在aa 323和aa 342之间有一个预测的跨膜(TM)结构(图2D)。这些特征都说明SiWAKL6编码一个典型的WAKL蛋白。
SiWAKL6基因的编码序列(SEQ ID NO.1)：
ATGAGGCTGTCCGTAATATACCTTTTCGTTTCCACCCTTTGCCTAATGACCTCTGCTGCTGTGGCTTTATCTTTGGCAAAGCGTGGATGTCAAGACACTTGTGGAAATGTCACCATTCCATATCCTTTTGGAATTGGTTCTGAATGTTATGCAAATTCGTCATTCGCAGTGGTCTGTGACAATTCAACCAATCCAGCAAGGCTGCACTTGAGCAGCATCCAATTGGAAATACTAGATATTTCGTTGCATGGTACAGTTAGAGTTGTGCAGCGTGTTTTCCCTATGACTTGCTCTGATGAACAGAAAACACAATCTTTGGGGAAATCACTTGTTGGAAGTCCTTTTACCATCTCATCGATTCAAAATTCATTGACTGTTTTGGGCTGCAGAAATTC
TGTCTGGTTGCGCGCCAACAAGACGACAATAACTGGTGGATGCATGGCTCTTTGTGATTACAACTCTAGG
GATACAAGTTGTAATGGTATAAACTGCTGCAAGATAACAATTCCTATGGGCCTTCAAGAGCTTCAAGTTA
CTTACCAAAGCATTGCAAATGACAAAAATAATACTCCCTTCTGTGGATATGCCTTCCTTGCTGACATGAA
ATGGTTTAGGGAAGATTACGGGAAATATAATGGCCTGCGCAGTTATTTGTTAGATCCATTTGACGGAGAA
TTCGGAAATGCAAGTATGGTGCTTGAGTGGGAATACGCCCGCAGTGTGAAGTTTATCCGTTCTAGTTTCT
GTGTGTATCCGGGTGATACAAGCTTTGCAGCTTTTAATTATGAAACATTAAGTAAAGTATGCTACTGTGA
CTTCGGGTTTGAAGGAAATCCCTATCTACCTGAAGGATGCCAAGATATTGATGAGTGTGGCAATTCGACA
ACTAATTCCTGTTCTGAGGGAGATACTTGTGTCAACAGAATAGGATCTTACGAATGTCAGAAGCCGAAAT
CTCGGCTGAAAATAGCATTTATCGTCATTGGTTCTGTGCTTGGTGCACTAATTTTGCTCCTGGGAGCATG
GAGGTCCACCAAGCTTATTAGAAAGAGAATCAAGGGTATTCGAAAACGAAAGTTTTTTAAGCGAAATGGA
GGCCTATTATTGGAACAGCAATTGTCTTCAACTGATAATGGCCTAGAGAAAACTAAGTTGTTTACTTCCA
AAGAGTTGGCAGCTGCTACCGACCATTATAATGAGAATCGTATACTTGGTCATGGCGGCCAAGGTACCGT
CTACAAAGGCATGTTGGCAGATGGAAGAATTGTGGCTGTCAAGAAGTCCAAAAGGGTAGATGAAGATGAT
CTTGAAGTCTTCATTAATGAGATCGTTATTCTATCTCAGATAAACCATAGAAATGTAGTAAAGTTACACG
GATGTTGTCTAGAGAACGAAGTTCCTCTTCTTGTCTACGAATTCATCCCAAATGGCACACTTTTCCGACA
CATCCATGAACCAAACGAGGACTTCCCGTTATCTTGGGAAATGCGTACGCGAATTGCTAGAGACGTAGCT
GGAGCACTTTCTTACTTGCACTCTGCTGCATATGCACCAATTTATCATAGGGATATCAAGTCAACAAACA
TACTATTGGATGAAAAGTATGGTGCCAAAGTTTCAGACTTCGGGACGTCAAAGTCAGTTGCCATTGATCA
AACTCACCTGACCACAAGAGTATTAGGCACCTTCGGATACTTGGATCCAGAGTACTTCCAATCGAGCCAG
TTCACAGAAAAGAGCGATGTCTACAGTTTCGGCGTTGTTATGGTTGAGCTTTTAACTGGGGAGAAAGCAA
TTTCATCAGTTAGAGCTGAAGTGGGAAAGAGTTTGGCCACACATTTCTTGCATTCAATGGAGGAAGATCA
TTTATTCGATATTCTTGACCCGAGGGTCCTCAAAGAGGGCAGTAGGGAAGAAGTTGTGGCTATTGCTGAA
CTTGCTAGAAGATGTCTGCATTTGAATGGAAAGAGAAGGCCAACAATGAAGGAAGTTGCCGTTGAGTTGG
AAGGAATTCAACTGCTGAAAGAAGGGTCGGTGGTGGTGCAAAATCATGATAATAACAGAGAATACCATTC
AGTTCATGAGTTTGCTGAGTGCTATGACTTCTCTGCCATGTCAGGAAGCATGCATTTCCACACAATTACT
GCATCCTCAGCCGAAGTCGAGCGTCCGTTGCTTGATGAGCCGTGA
SiWAKL6基因编码的蛋白序列(SEQ ID NO.2)：
MRLSVIYLFVSTLCLMTSAAVALSLAKRGCQDTCGNVTIPYPFGIGSECYANSSFAVVCD
NSTNPARLHLSSIQLEILDISLHGTVRVVQRVFPMTCSDEQKTQSLGKSLVGSPFTISSI
QNSLTVLGCRNSVWLRANKTTITGGCMALCDYNSRDTSCNGINCCKITIPMGLQELQVTY
QSIANDKNNTPFCGYAFLADMKWFREDYGKYNGLRSYLLDPFDGEFGNASMVLEWEYARS
VKFIRSSFCVYPGDTSFAAFNYETLSKVCYCDFGFEGNPYLPEGCQDIDECGNSTTNSCS
EGDTCVNRIGSYECQKPKSRLKIAFIVIGSVLGALILLLGAWRSTKLIRKRIKGIRKRKF
FKRNGGLLLEQQLSSTDNGLEKTKLFTSKELAAATDHYNENRILGHGGQGTVYKGMLADG
RIVAVKKSKRVDEDDLEVFINEIVILSQINHRNVVKLHGCCLENEVPLLVYEFIPNGTLF
RHIHEPNEDFPLSWEMRTRIARDVAGALSYLHSAAYAPIYHRDIKSTNILLDEKYGAKVS
DFGTSKSVAIDQTHLTTRVLGTFGYLDPEYFQSSQFTEKSDVYSFGVVMVELLTGEKAIS
SVRAEVGKSLATHFLHSMEEDHLFDILDPRVLKEGSREEVVAIAELARRCLHLNGKRRPT
MKEVAVELEGIQLLKEGSVVVQNHDNNREYHSVHEFAECYDFSAMSGSMHFHTITASSAEVERPLLDEP*
其中，*表示终止子。
实施例2SiWAKL6通过SA信号通路对M.phaseolina的抗性研究
1、拟南芥材料和培养条件
拟南芥种子(哥伦比亚野生型)用5％(wt)次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水重复清洗3至5次，然后将拟南芥种子播种在1/2MS培养基上，放于4℃冰箱中低温处理4天，处理结束后，于培养箱中22±1℃，16h光照、8h黑暗条件下培养。待拟南芥生长至两片真叶时，将幼苗转移到混合营养土(营养土：蛭石体积比＝3:1)中，继续在上述条件下培养。
2、超表达SiWAKL6基因的载体构建与拟南芥遗传转化
1)超表达SiWAKL6载体的构建
同源重组法构建SiWAKL6的超表达载体。质粒载体编号为pCAMBIA2301-KY，启动子为35S强启动子，含有卡那霉素抗性基因，载体结构如图3所示。本研究利用XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶对质粒载体进行双酶切消化和重组，将SiWAKL6基因插入载体的多克隆位点中，得到重组质粒pCAMBIA-SiWAKL6。随后将重组质粒pCAMBIA-SiWAKL6转化入DH5α大肠杆菌进行扩繁和检测。然后挑取生长规则、饱满圆润的单菌落接种到含40mg/mL氨苄西林的LB培养基2mL管中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养12h，然后进行菌液PCR检测，选取含有正确条带的样本送去上海生工生物公司测序。
所得重组质粒的检测序列(SEQ ID NO.3)：
GACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGA
GCTCCCGCGGGTCGACGGTACCCATATGTCTAGACTCGAGATGAGGCTGTCCGTAATATACCTTTTCGTT
TCCACCCTTTGCCTAATGACCTCTGCTGCTGTGGCTTTATCTTTGGCAAAGCGTGGATGTCAAGACACTT
GTGGAAATGTCACCATTCCATATCCTTTTGGAATTGGTTCTGAATGTTATGCAAATTCGTCATTCGCAGT
GGTCTGTGACAATTCAACCAATCCAGCAAGGCTGCACTTGAGCAGCATCCAATTGGAAATACTAGATATT
TCGTTGCATGGTACAGTTAGAGTTGTGCAGCGTGTTTTCCCTATGACTTGCTCTGATGAACAGAAAACAC
AATCTTTGGGGAAATCACTTGTTGGAAGTCCTTTTACCATCTCATCGATTCAAAATTCATTGACTGTTTT
GGGCTGCAGAAATTCTGTCTGGTTGCGCGCCAACAAGACGACAATAACTGGTGGATGCATGGCTCTTTGT
GATTACAACTCTAGGGATACAAGTTGTAATGGTATAAACTGCTGCAAGATAACAATTCCTATGGGCCTTC
AAGAGCTTCAAGTTACTTACCAAAGCATTGCAAATGACAAAAATAATACTCCCTTCTGTGGATATGCCTT
CCTTGCTGACATGAAATGGTTTAGGGAAGATTACGGGAAATATAATGGCCTGCGCAGTTATTTGTTAGAT
CCATTTGACGGAGAATTCGGAAATGCAAGTATGGTGCTTGAGTGGGAATACGCCCGCAGTGTGAAGTTTA
TCCGTTCTAGTTTCTGTGTGTATCCGGGTGATACAAGCTTTGCAGCTTTTAATTATGAAACATTAAGTAA
AGTATGCTACTGTGACTTCGGGTTTGAAGGAAATCCCTATCTACCTGAAGGATGCCAAGATATTGATGAG
TGTGGCAATTCGACAACTAATTCCTGTTCTGAGGGAGATACTTGTGTCAACAGAATAGGATCTTACGAAT
GTCAGAAGCCGAAATCTCGGCTGAAAATAGCATTTATCGTCATTGGTTCTGTGCTTGGTGCACTAATTTT
GCTCCTGGGAGCATGGAGGTCCACCAAGCTTATTAGAAAGAGAATCAAGGGTATTCGAAAACGAAAGTTT
TTTAAGCGAAATGGAGGCCTATTATTGGAACAGCAATTGTCTTCAACTGATAATGGCCTAGAGAAAACTA
AGTTGTTTACTTCCAAAGAGTTGGCAGCTGCTACCGACCATTATAATGAGAATCGTATACTTGGTCATGG
CGGCCAAGGTACCGTCTACAAAGGCATGTTGGCAGATGGAAGAATTGTGGCTGTCAAGAAGTCCAAAAGG
GTAGATGAAGATGATCTTGAAGTCTTCATTAATGAGATCGTTATTCTATCTCAGATAAACCATAGAAATG
TAGTAAAGTTACACGGATGTTGTCTAGAGAACGAAGTTCCTCTTCTTGTCTACGAATTCATCCCAAATGG
CACACTTTTCCGACACATCCATGAACCAA
检测引物依据载体序列在其启动子上游+目的基因下游设计引物对转基因植株进行PCR鉴定，序列如下：
35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC
SiWAKL6-R：TTGGTTCATGGATGTGTCGG
使用TAKARA质粒提取试剂盒进行重组质粒提取操作。并将重组质粒pCAMBIA-SiWAKL6转化入农杆菌GV3101感受态细胞(农杆菌GV3101属于根癌农杆菌，Agrobacteriumtumefaciens)中，并再次检测菌落中是否含有正确条带。将测序正确的单菌落菌液加入到装有100mL YEB液体培养液的锥形瓶中进行扩大培养，培养至菌液OD 600＝1.7左右时，以5000rpm离心5min，收集菌体。然后用重悬液重悬菌体至浓度OD 600＝0.8，备用。
2)SiWAKL6的遗传转化
利用农杆菌介导的拟南芥花器官原位转化法进行芝麻抗茎点枯病相关因SiWAKL6的遗传转化。
待培养箱中的拟南芥(哥伦比亚野生型)生长出主花序时，把已经完全开放的花序和果荚用剪刀剪掉，在一周后，会在侧枝产生更多的次级花序时，即可准备侵染。将配制好的农杆菌GV3101溶液转移到提前备好的大烧杯中，将待转化的拟南芥倒置使花序浸入装有渗透培养液的烧杯中，期间轻轻晃动花序，以保证花序和渗透培养液的充分接触，提高侵染效率。然后用喷过水的罩子将侵染处理好的拟南芥植株罩住，在黑暗条件下平放16～24h，然后恢复正常光照培养。待拟南芥荚果成熟干黄后及时收获种子，放置于有干燥剂的培养皿内干燥。干燥后收集种子于4℃短期保存或-20℃长期保存，备用。
3)拟南芥阳性植株的筛选和分子检测
收获的拟南芥T0代种子消毒后，平铺在含卡那霉素(40mg/L)的1/2MS培养平板上萌发，进行抗性筛选。选取长出真叶，并能正常生根的抗性苗移栽长大。待幼苗长出真叶，取适量叶片提取基因组DNA，利用检测引物(35S-F和SiWAKL6-R)对其进行PCR扩增，用重组质粒作为阳性对照，以验证拟南芥植株是否被转入SiWAKL6。按单株收获阳性植株的种子并作好标记，每个单株的后代是一个株系。用同样的方法筛选到T3代转SiWAKL6基因纯合拟南芥(即转基因拟南芥)，用于后续实验。
构建SiWAKL6的异源超表达拟南芥植物(OE-SiWAKL6)(图4A)。分别使用三个超表达转基因拟南芥株系OE-SiWAKL6(OE-1，OE-2和OE-3)以及哥伦比亚野生型(WT)的DNA为模板，进行PCR验证(图4B)。
从上述图中可以看出：SiWAKL6成功转入拟南芥中，得到了超表达SiWAKL6的转基因拟南芥的3个纯合株系OE-1、OE-2和OE-3。
3、SiWAKL6基因功能的验证
1)拟南芥抗病性评价
将保存的病原菌M.phaseolina接种于PDA固体培养基中，30℃培养箱中培养7天至菌丝长满培养皿，然后将长满菌丝的培养基划成菌块，每1/2培养皿的菌块均匀接种至300mL的PD液体培养基中，然后在30℃、200r/min的条件下震荡培养5天。随后，用组织捣碎机将菌液打碎，即得到菌丝悬液。每20mL菌丝悬液中加入100mL蒸馏水与灭过菌的混合营养土(草炭土：蛭石体积比＝3:1)120g搅拌均匀，即得到带菌土壤。待哥伦比亚野生型和转基因拟南芥生长至八周时，移栽至菌土中。取接菌后12h的叶片组织，储存于-80℃备用。
接菌14天后对拟南芥的抗病表型进行鉴定，根据叶片退绿、叶片坏死和死亡的表型，使用0-5级的分级标准对植物病害等级进行分类。
0级：植株健康(无症状)
1级：植物生长受损
2级：0～30％的植物组织褪绿或坏死
3级：30％～60％的植物组织发生褪绿或坏死
4级：60％～90％的植物组织发生褪绿或坏死
5级：90％以上的植物组织发生褪绿或坏死或植株死亡
病情指数(disease index)＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)。
结果显示，接种14天后，哥伦比亚野生型拟南芥(WT)接种菜豆壳球孢后叶片黄化、坏死现象明显，生长延缓，而3个超表达SiWAKL6基因的株系(OE1、OE2和OE3)叶片黄化、坏死症状明显减弱，生长延缓的现象也有所好转(图4A)。进一步统计拟南芥的病情指数，发现OE-1，OE-2和OE-3的病情指数分别为33.3、40和37.8，显著低于WT中71.1的病情指数(图4C)。
2)M.phaseolina菌量定殖实验
收集接菌14天后每个处理组的拟南芥植株地面部分，提取基因组DNA。利用qPCR定量分析M.phaseolina(MpSyk)和拟南芥(AtSK11)的序列特征扩增区相对表达量，确定M.phaseolina和拟南芥基因组DNA的相对丰富度。引物如下：
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 |
| MpSyk | ATCCTGTCGGACTGTTCCAG | CTGTCGGAGAAACCGAAGAC |
| AtSK11 | CTTATCGGATTTCTCTATGTTTGGC | GAGCTCCTGTTTATTTAACTTGTACATACC |
针对M.phaseolina(MpSyk)和拟南芥(AtSK11)DNA的种特异性序列特征扩增区(species-specific sequence characterized amplified regions)进行qPCR反应，比较接菌14天后M.phaseolina和拟南芥之间DNA的相对丰度。结果显示，与哥伦比亚野生型拟南芥(WT)相比，转基因植物中M.phaseolina的相对丰富度显著降低(图4D)，以上结果共同说明，SiWAKL6能够增强转基因拟南芥对M.phaseolina的抗性。
3)qPCR分析
在病原菌入侵时，我们推测SiWAKL6可能通过调节拟南芥下游的胁迫标记基因的表达水平来提高转基因拟南芥的抗病性。为了验证这一假设，我们检测了接种病原菌12h后拟南芥(OE-1)中SA和JA激素信号通路的标志基因的表达情况，包括水杨酸信号通路的AtNPR1、AtPR1和AtPR5基因以及茉莉酸信号通路的AtVSP2、AtPDF1.2基因，以水处理作为对照(Mock)。
在拟南芥中，使用拟南芥基因AtUBQ10作为内参基因，对从M.phaseolina胁迫处理后的叶片样本进行RNA提取、反转录以及qPCR试验。引物序列如下：
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 |
| AtUBQ10 | AACTTTGGTTTGTGTTTTGG | TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA |
| AtNPR1 | GGCTTGCGGAGAAGACGAC | ACGACGATGAGAGAGTTTACGG |
| AtPR1 | GCTACGCAGAACAACTAAGAGGC | CCAGACAAGTCACCGCTAC |
| AtPR5 | ACTCCAGGTGCTTCCCGACAG | GAACTCCGCCGCCGTTACATC |
| AtVSP2 | CTTTCACTTCTCTTGCTCTTGGC | GCAGTTGGCGTAGTTGATGGA |
| AtPDF1.2 | ACCCTTATCTTCGCTGCTCTTG | ATGTCCCACTTGGCTTCTCG |
其中AtNPR1、AtPR1和AtPR5是SA信号通路中的标志基因，AtVSP2和AtPDF1.2是JA信号通路中的标志基因。
结果显示，在接种病原菌以后，OE-SiWAKL6(OE-1)中SA相关标记基因的表达量高于WT(图5A)，然而JA相关标记基因在OE-SiWAKL6(OE-1)和WT中的表达水平总体相似(图5B)。由此可见，SiWAKL6可以通过调节SA信号通路的基因，进而提高拟南芥对M.phaseolina的抗性。
实施例3SiWAKL6调控ROS稳态参与免疫反应
在植物中，生物胁迫会使其体内产生活性氧，而过度的活性氧积累会引起氧化损伤。此时植物体内的抗氧化酶防御系统就会启动如SOD、CAT、POD等的表达，用以清除植物体内的活性氧(ROS)，从而抑制细胞死亡。为了研究SiWAKL6基因介导的抗性是否与ROS稳态相关，我们检测了接菌后转基因植株(OE-1)和野生型植株中的活性氧水平(H2O2和MDA)和抗氧化酶(SOD和CAT)的活性。
1、拟南芥材料和培养条件
拟南芥培养条件和接菌方法同实施例2。
2、拟南芥生理指标检测
接种M.phaseolina 14天后，取拟南芥植株地上部分，分别使用检测试剂盒(苏州格锐思生物科技有限公司)检测过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含量以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)两种酶的活性。
结果显示，接种病原菌后，H2O2和MDA含量都显著上升，但是相比于OE-SiWAKL6(OE-1)，WT积累了更多的H2O2和MDA(图6A、6B)。此外，接菌后，OE-SiWAKL6(OE-1)中的SOD和CAT活性显著高于WT(图6C、6D)。这说明SiWAKL6通过调节CAT和SOD的活性参与调控了植物的ROS稳态，进而增强了对M.phaseolina的抗性。
Claims (5)
1.一种芝麻SiWAKL6基因，其特征在于，所述芝麻SiWAKL6基因的编码序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种权利要求1所述芝麻SiWAKL6基因编码的蛋白。
3.如权利要求2所述的蛋白，其特征在于，芝麻SiWAKL6基因编码的蛋白序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种权利要求1所述的芝麻SiWAKL6基因在抗病育种中的应用。
5.一种权利要求2所述芝麻SiWAKL6基因编码的蛋白在抗病育种中的应用。
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