CN117431195A

CN117431195A - 一种耐盐碱的促生菌、促生菌菌剂及其应用

Info

Publication number: CN117431195A
Application number: CN202311772611.3A
Authority: CN
Inventors: 梁雪杰; 曹轶; 赵为民; 郭亚冲; 梁方方; 马瑞强
Original assignee: Beijing Green Nitrogen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Green Nitrogen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2043-12-21
Also published as: CN117431195B

Abstract

本公开涉及一种耐盐碱的促生菌，该促生菌的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，所述促生菌的保藏编号为CGMCC NO.29057。菌种已保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月17日，保藏编号为CGMCC NO.29057。本公开还进一步提供了一种耐盐碱的促生菌菌剂，所述促生菌菌剂含有培养基和菌体，所述菌体含有保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌。通过上述技术方案，本公开提供了一种耐盐碱的促生菌及含有该菌株的菌剂，菌株具有较好的固氮、解磷、解钾等能力，还能够作为产铁载体菌株，能够在盐碱环境下促进植物的生长，尤其是促进玉米的生长。

Description

一种耐盐碱的促生菌、促生菌菌剂及其应用

技术领域

本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种耐盐碱的促生菌、促生菌菌剂及其应用。

背景技术

土壤盐碱化制约农业发展；盐碱地是指土壤中盐分和碱性物质过高，导致土壤性质发生严重变化，不利于种植作物的土地。盐碱地危害主要表现为影响土壤物理、化学和生物性质，造成土壤板结、泥沙淤积和土壤冲刷等现象，严重影响植物的生长和发育，进而影响农业生产和生态环境。盐碱地的形成是多种因素综合作用的结果，如长期过度耕作、过量施肥、缺水等。土壤盐碱化会造成粮食减产，对粮食安全构成严重威胁。改良并利用盐碱化土地可以改良中低产田、增加土地的可耕作面积，对维护生态安全和粮食供应安全具有重要意义。

微生物菌剂中含有的有益微生物菌群经固氮、光合、解磷、解钾等一系列的分解、合成作用，可将土壤中的物质转化成各种营养元素，提高土壤肥力，促进植物生长；有益微生物可分泌多种抗生素等抗菌物质，抑制病原菌的生长繁殖，诱导植物系统抗病性，减少病害的发生，提高植物抗逆性。近年来，微生物技术在盐碱土壤修复中的应用得到不断重视和加强，并主要集中在微生物增强植物耐盐碱性的研究方面。已有研究发现，耐盐碱微生物可以改善植物根际环境，减轻盐分对作物生长的抑制作用，达到改良盐碱土壤的目的。如菌根真菌能够与多种植物共生，通过根外菌丝的伸展扩大植物根系的吸收范围，使植物吸收更多的矿物元素和水分，以增强植物抗盐碱性；也有研究发现，一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluoresceBSP53a)能够在NaCl胁迫下促进小麦的生长和生物量的积累，缓解盐胁迫对小麦的伤害。由此可见微生物作用可在一定程度上提高盐碱土壤植被的成活率与保存率，对长期改良盐碱土壤恢复土壤理化特性、重构盐碱十壤生态环境起到重要作用。

通过种植调整盐碱土的结构和含盐量，可以改善土壤性质，促进土壤自我修复。而玉米作为一种大面积种植的作物，其根系能够深入土壤，吸收土壤中的营养物质，有效地改善盐碱地的土壤质量，提高土壤肥力，从而促进盐碱地的生态环境恢复。盐碱地种植玉米能够提高土地利用率，提高土地的利用价值，同时提高农业生产效益。此外，芽孢杆菌属菌株具有耐氧化、耐高温、耐酸碱等特性，在农业上具有很大的潜在应用潜力，所以分离鉴定新的芽孢杆菌属菌株具有重要意义。

发明内容

本公开的目的是提供一种耐盐碱的促生菌、促生菌菌剂及其应用，该菌株具有较好的固氮、解磷、解钾等能力，还能够作为产铁载体菌株，能够在盐碱环境下促进植物的生长，尤其是促进玉米的生长。

为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种耐盐碱的促生菌，该促生菌的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，所述促生菌的保藏编号为CGMCC NO.29057。

可选地，所述促生菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，所述促生菌为革兰氏阳性、形状为圆形、表面有褶皱、边缘锯齿形、白色和杆状。

本公开第二方面提供一种耐盐碱的促生菌菌剂，所述促生菌菌剂含有培养基和菌体，所述菌体含有保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌。

可选地，每克所述促生菌菌剂中，保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌的活菌数为1.0-5.0×10⁹CFU。

可选地，所述培养基包括LB培养基、营养琼脂培养基、TY培养基和YPGA培养基中的至少一种。

本公开第三方面提供第一方面所述的促生菌或第二方面所述的促生菌菌剂在固氮方面、解磷方面、解钾方面、作为产铁载体菌株方面和促进植物生长方面中的应用。

可选地，包括以下步骤：在盐碱或非盐碱的环境下，将所述促生菌或所述促生菌菌剂施用于所述植物的种子上，或者，施用于所述植物的种植基质中。

可选地，所述植物包括玉米、小麦、水稻和大豆中的至少一种。

可选地，所述促生菌的施用量为每株所述植物2-6×10⁸CFU。

通过上述技术方案本公开提供了一种耐盐碱的促生菌及其应用，该菌株具有较好的固氮、解磷、解钾等能力，可以作为产铁载体菌株，能够在盐碱环境下促进植物对氮元素、磷元素、钾元素及铁元素的吸收，进而促进植物的生长，尤其是促进玉米的生长。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏信息

耐盐碱的促生菌，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年11月17日，保藏编号为CGMCC NO.29057。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本公开促生菌的菌落形态图。

图2是本公开的促生菌的菌体形态图。

图3是本公开的促生菌的16Sr RNA基因的系统发育树。

图4是本公开的促生菌在不同盐浓度中的生长曲线。

图5是本公开的促生菌在12%盐浓度中的菌体形态图。

图6是本公开的促生菌解磷的平板溶解圈。

图7是本公开的促生菌解钾的平板溶解圈。

图8是本公开的促生菌作为产铁载体的平板溶解圈。

图9是本公开的促生菌在不同pH值下的生长曲线。

图10是本公开的促生菌在不同温度下的生长曲线。

图11是本公开的促生菌在最适温度下的生长曲线。

图12是本公开的促生菌在盐碱环境下或非盐碱环境下对玉米生长的影响。

图13是本公开的促生菌菌剂在与不同浓度水溶肥混合后对菌含量变化的影响。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开的发明人从海南省临高县东英镇玉米农田土中分离培养出一种新的菌株，经鉴定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus.sp），被命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中进行保藏，保藏日期为2023年11月17日，保藏编号为CGMCC NO.29057。

本公开第一方面提供一种耐盐碱的促生菌，该促生菌的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，所述促生菌的保藏编号为CGMCC NO.29057。

根据本公开，所述促生菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本公开的一种实施方式中，本公开对促生菌进行了形态学鉴定，所述促生菌为革兰氏阳性、形状为圆形、表面有褶皱、边缘锯齿形、白色和杆状。在上述实施方式中，表面有褶皱可以包括表面略有褶皱。

根据本公开，保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌的活菌数可以在较大的范围内变化。在本公开的一种实施方式中，每克所述促生菌菌剂中，保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌的活菌数为1.0-5.0×10⁹CFU。

在本公开的一种实施方式中，所述培养基包括LB培养基、营养琼脂培养基、TY培养基和YPGA培养基中的至少一种。在本公开中，培养基可以为液体培养基，也可以为固体培养基，优选为液体培养基。

在本公开中，该促生菌或含有该促生菌的菌剂具有较好的固氮作用，还具有解磷、解钾等特性，此外，其还能够作为产铁载体菌株，能够促进植物对氮、磷、钾、铁等元素的吸收，进而促进植物的生长。

在本公开的一种实施方式中，包括以下步骤：在盐碱或非盐碱的环境下，将所述促生菌或所述促生菌菌剂施用于所述植物的种子上，或者，施用于所述植物的种植基质中。

在上述实施方式中，本公开对施用的具体方式不作限定，例如，当将促生菌或所述促生菌菌剂施用于植物的种子上时，可以采用浸渍或喷洒的施用方式；当将促生菌或所述促生菌菌剂施用于植物的种植基质中时，可以采用喷洒在种植基质中或与种植基质搅拌的施用方式。

在上述实施方式中，所述植物包括玉米、小麦、水稻和大豆中的至少一种；优选地，所述植物为玉米，进一步优选为，玉米的品种为郑单958。

根据本公开，促生菌的施用量可以在较大的范围内变化。在本公开的一种实施方式中，所述促生菌的施用量为每株所述植物2-6×10⁸CFU；优选地，所述促生菌或促生菌菌剂的施用量可以为1-3kg/亩。

以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。

如无特殊说明，本实施例使用的材料均为商购产品。

营养琼脂培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏粉3g/L、氯化钠5g/L、琼脂（固体）15g/L、pH调节至7.0-7.2。

LB液体培养基：5g/L的酵母提取物、10g/L的胰蛋白胨、10g/L的NaCl、pH调节至7。

固氮培养基（Ash无氮培养基）：甘露醇10.0 g/L、CaCO₃5g/L、KH₂PO₄0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、NaCl 0.2g/L、CaSO₄·2H₂O 0.2g/L、琼脂15g/L，pH调节至7.0。

解磷培养基（PKO无机磷培养基）：葡萄糖10.0 g/L、酵母提取物0.5g/L、（NH₄)₂SO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、MnSO₄·4H₂O 0.03g/L、KCl 0.3g/L、FeSO₄·7H₂O 0.03g/L、NaCl 0.3g/L、Ca₃(PO₄)₂5g/L、琼脂15 g/L，pH调节至7.0-7.5。

解钾培养基（亚历山大罗夫培养基）：蔗糖5.0 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、Na₂HPO₄2.0g/L、FeCl₃0.005g/L、CaCO₃0.1g/L、钾长石1.0g/L、琼脂15g/L。

产铁载体菌株培养基：CAS 0.605 g/L、HDTMA 1.457 g/L、氯化铁（HCl配制）0.016g/L、10 mmol/L盐酸溶液10 mL/L，pH调节至6.5-7.0。

实施例1

本实施例用于说明促生菌菌株的分离与鉴定。

（1）促生菌菌株的分离：

样品采集：从海南省临高县东英镇玉米农田土中采集土壤样品；土壤采集采用五点取样法，在选定区域内，确定五点采样点，选择植株长势良好的植株，去除表层土，采集5-15cm的近根土壤，每点采集等量土壤，混匀后装入灭菌袋中密封，标明采集编号、采集地、日期等关键信息，带回实验室4℃低温保存。

样品富集：土壤样品处理：取土样经20目样品筛（孔径约为1mm）过筛；称取10g待测样品，放入装有90mL的无菌4%NaCl水溶液的三角瓶中（内可放置10-15颗灭菌玻璃珠），28℃，150rpm振荡2-3h，静置10min，得到稀释10倍的土壤悬液，计为10^-1稀释液。以移液枪吸取1mL 10^-1稀释液加入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，吹吸均匀，稀释成10^-2稀释液，再按此方法依次稀释制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等系列梯度稀释液；吸取0.1mL各梯度稀释液均匀涂布于Ash无氮培养基平板上，每个浓度重复3皿，将平板于28℃恒温培养箱中倒置培养3-4d。

菌株分离筛选：选择菌落生长密度合适（30-300/皿）的平板，挑取上述无氮培养基平板上不同类型单个菌落于无氮培养基平板上进行划线分离，28℃恒温培养2-3d，再次挑取单胞划线培养，经2-3次单胞划线，获取各菌株的单胞纯培养；挑取各菌株单胞，分别接种于含4%、8%NaCl的LB液体培养基中，28℃，150rpm振荡培养2-3d，筛选获得在8%NaCl培养基中有明显生长的菌株进行菌株纯化保存。

菌株纯化保存：根据菌落特征并结合染色镜检判断菌株是否为单一菌种，最后将纯菌种以20%甘油低温冷冻保存。选择在8%NaCl培养基中生长浓度最高的菌株，保存命名为GNMC00504（简写GN504）。

实施例2

本实施例用于说明促生菌菌株的形态学鉴定。

（1）挑取纯化后菌株GN504，采用划线法在营养琼脂培养基上培养，在28℃条件下培养2天。然后观察菌落形态，促生菌的菌落形态如图1所示。

保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌的菌落均呈现白色、近圆形、表面略有褶皱、干燥、边缘锯齿形的菌落形态。

（2）通过显微镜油镜（oil 100×10）观察菌株的菌体形态，结果如图2所示。

菌体细胞为杆状；并经过革兰氏染色后呈现紫色，鉴定为革兰氏阳性菌；且菌株在平板培养后可形成大量芽孢。

实施例3

本实施例用于说明促生菌菌株的分子生物学鉴定：

取分离纯化的菌株GN504进行分子生物学鉴定。通过DNA提取、PCR扩增、16S rRNA基因测序及芽孢杆菌的gyrB基因测序。

正向引物：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO.2）；

反向引物：

1492R：5’-TACGGCTACCTTACGACTT-3’（SEQ ID NO.3）。

将扩增得到的16S rRNA的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，详见附录序列表。

通过在NCBI上的GenBank数据库中进行核酸序列的同源性比对（Blastn），比对结果如图3所示，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属（Bacillus.sp）。

实施例4

本实施例用于说明促生菌菌株的耐盐能力。

GN504种子液的制备：挑取菌株GN504的单菌落接种至LB液体培养基试管中，28℃，180rpm，培养24h，制备菌种种子液。

制备分别含有质量浓度为1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%的NaCl的培养基，以2%的接种量接种菌株GN504种子液，培养48h，测定GN504菌株在不同盐浓度中的生长曲线。生长曲线如图4所示。

取含有浓度为12%的NaCl的培养液中的培养的菌株，采用显微镜油镜观察菌株的形态，结果如图5所示。

由图4可知：随着培养液中NaCl浓度的增加，菌株GN504进入对数期需要的时间越长；菌株在1%和2% NaCl浓度中生长性最好，培养2h进入对数期，10h后即可到达稳定期；菌株可以耐受8%及以上的NaCl浓度，在8% NaCl浓度中培养，到达稳定期时菌浓度OD600值达到4以上，在10% NaCl浓度的培养液中仍有明显的生长量，在12% NaCl浓度的培养液中生长量急剧减少。综上可知，菌株GN504在不高于8% NaCl浓度的培养液中均可正常生长，可保持稳定的活力及耐受能力。

由图5可知，菌株GN504在12% NaCl浓度中的培养液中，仍能保持菌体杆状形态。由此可知，菌株可在高盐浓度培养液中正常生长繁殖，保持活力。说明菌株可适应高盐高渗透压环境，有更广的应用场景，可用于高盐废水的生物处理以及盐碱地土壤改良等。

实施例5

本实施例用于说明促生菌菌株的固氮、解磷、解钾、产铁载体的特性。

（1）固氮的测试方法：

无氮培养基检测：挑取菌株GN504单菌落少许，在Ash无氮培养基上平板上划线，观察菌株能否在无氮培养基上生长形成菌落。

固氮酶活测定（乙炔还原法）：取菌株GN504种子液，以2%接种量接种于LB液体培养基中，28℃，180rpm，振荡培养36h；培养液转移至离心管，4℃，8000 rpm离心10 min收集菌体；以生理盐水洗涤2-3次后重悬菌体，调节菌体浓度OD600=1.0，制成菌悬液；取1mL菌悬液加入含9 mL无氮培养基的培养瓶（V_瓶=115mL）内，重复3瓶；向培养瓶中持续充入氩气排除空气，密封；向瓶内充入10%的乙炔和0.5%的氧气，30℃，200 rpm振荡培养6 h；从培养瓶内取1000 μL气体，注入气相色谱检测，记录乙烯峰的面积（乙烯的峰面积为6836.8）。根据气体样品中乙烯含量的高低反映菌株固氮酶活，公式为：

固氮酶活性（nmol/（mL×h））=气相色谱检测仪上乙烯峰的面积 × （培养瓶内气相体积/进样量）/（1mL菌液 × 1 nmol标准乙烯峰的面积 × 反应时间）。

经计算，本公开的菌株GN504的固氮酶活性=6836.8×（105mL/1mL）/（1mL菌液 ×1962.9/nmol×6h）=60.95nmol/（mL×h）。

由此可知，该菌株具有较高的固氮酶活性。

（2）解磷（无机磷）的测试方法：

取菌株GN504种子液5uL点接于PKO无机磷培养基检测平板中心，重复3板，置于28℃培养箱中培养3-5d，观察菌落周围有无透明圈产生。

结果如图6所示，该菌株在解磷培养基上产生明显的解磷透明圈，表明该菌株具有明显的解无机磷的效果。

（3）解钾的测试方法：

取菌株GN504种子液5uL点接于亚历山大罗夫培养基检测平板中心，重复3板，置于28℃培养箱中培养3-5d，观察菌落周围有无黄色的解钾圈产生。

结果如图7所示，该菌株在解钾培养基上具有明显的解钾圈，表明该菌株具有明显的解钾效果。

（4）产铁载体特性的检测方法：

取菌株GN504种子液5uL点接于产铁载体菌株培养基检测平板中心，重复3板，置于28℃培养箱中培养3-5d，观察菌落周围有无淡黄色晕圈产生。

结果如图8所示，该菌株在产铁载体检测培养基上能产生黄色晕圈，表明该菌株具有产铁载体的特性。

综上所述，本公开的菌株具有固氮、解磷、解钾以及作为产生铁载体菌株的特性，可以促进土壤中营养物质（氮、磷、钾和铁）的分解及转化，有利于促进植物对营养物质的吸收。

实施例6

本实施例用于说明促生菌菌株的环境适应能力。

（1）测定菌株GN504最适的pH范围：挑取菌株单胞接种至LB液体培养基中，培养24h，制备菌种种子液；以2%接种量接种至装有不同pH（pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11）的LB液体培养基中，摇瓶置于摇床中振荡培养，28℃，180rpm培养24h,测定不同pH培养液的OD600值，作为菌株生长量指标。以pH为横坐标，以生长量OD600值为纵坐标，绘制菌株最适pH曲线。结果如图9所示。

由图9可知，菌株可以耐受的pH值的范围是pH值为4-10，菌株在pH值为10时仍有一定的生长量；且菌株在pH值为4-8时生长量较一致，可以保持稳定的生长量。

（2）测定菌株GN504最适的温度范围：

挑取菌株单胞接种至LB液体培养基中，培养24h，制备菌种种子液；以LB液体培养基接种种子液，调节初始菌浓度OD600=0.05，上样，1mL体系，3次重复，设定不同培养温度，仪器系统自动每小时获取一次菌株生长量；培养2-3d；使用杰灵生长曲线测定仪测定菌株不同温度（20、22、25、28、30、33、35、37℃）下的生长量，并绘制生长曲线，结果如图10所示。选择不同温度下菌株培养24h生长量数据，绘制菌株最适温度曲线，结果如图11所示。

由图10可知，20-33℃范围内，随着温度升高，菌株GN504越快越早进入对数期，且菌生长量也较多，达到稳定期的时间越短。菌株在33℃培养时生长最好，培养2小时即可进入对数期，约15h进入稳定期，但46h后菌量有所下降；在30℃时约15h进入稳定期，后期菌量也会有所下降。在35℃、37℃培养时，进入稳定期后数小时（≤5h）内菌量开始减少，或许是菌体在过高温度下裂解消亡；

菌株在20℃-33℃温度条件下培养10-25h基本都能到达稳定期，达到最高生长量。由图11可知，取各温度处理下培养24h的生长量，绘制菌株最适生长温度曲线，确定菌株GN504最适生长温度约为33℃。

实施例7

本实施例用于说明促生菌促进玉米生长的能力。

模拟盐碱种植体系：以蛭石培养体系中添加混合盐溶液，来模拟盐碱种植环境，进行菌株对玉米苗期生长的促生作用验证实验。

配制含盐量为6g/kg（NaCl:Na₂CO₃=5:1）盐溶液，测定其pH值为10.57，EC=10.97mS/cm；以盐溶液润湿蛭石至合适湿度，装入盆钵中制备盐碱体系，并设置无盐体系做对照。

玉米品种：郑单958；表面消毒，95%酒精浸泡2min，2% 次氯酸钠溶液中搅拌3min，无菌水浸洗10次，保持水分，25℃暗处催芽2d，选择芽长1cm左右的发芽种子播种；

实验菌株：GN504菌株；LB液体培养基，28℃，180rpm，培养36h；菌液经8000rpm，10min离心获取菌泥，以生理盐水清洗一次后再重悬，调节OD600在0.4~0.5的范围内，接种量为2mL/苗（5×10⁸CFU）；

选择催芽后芽长较一致的种子，分别播种于盐碱体系盆钵中，进行接菌和不接菌处理，每处理种植16棵苗；并设置无盐体系对照，同样进行接菌和不接菌处理。播种完成后，每苗补充20mL含氮（尿素）0.12g/L的植物营养液；处理完成后置于人工气候室培养，25℃，湿度70%，16h光+8h暗，并每隔2天补充适当的水分；培养30d，测定玉米苗期株高、叶绿素、鲜重、干重等指标，评价菌株GN504对玉米生长表型的影响，结果如图12所示。

由图12可知，清水对照H₂O处理的植株表型优于盐碱对照NaCl处理，两处理有显著差异，说明制备的盐碱体系对玉米生长有明显的抑制作用。

在无盐体系中，接菌的处理表型优于未接菌的处理，说明在正常种植体系中，菌株可以促进玉米生长。

在盐碱体系中，接菌的处理表型优于未接菌的处理，说明菌株在盐碱环境中仍可促进玉米生长。

实施例8

本实施例用于说明促生菌菌剂与水溶肥混施时菌种存活力评价。

水溶肥：“高力高”大量元素水溶肥料20-20-20+TE（平衡型），推荐使用量：亩用2-5kg，稀释500-800倍。实验浓度：稀释500倍。

促生菌菌剂：GN504；挑取单菌落接种至LB液体培养基试管中，28℃，180rpm，培养24h，制备菌种种子液；取种子液以2%接种量接种至LB液体培养基摇瓶中（100mL/500mL），28℃，180rpm，培养36h，制备菌种发酵液；发酵液经8000rpm，10min离心获取菌泥，以生理盐水清洗一次后再重悬，制备形成耐盐碱的GN504液体菌剂；测定菌剂原液的菌活数。GN504菌剂推荐使用量：亩用1-2kg，稀释400倍。实验浓度：稀释400倍。

混合体系设置为3L。菌剂实验浓度使用最小量为400倍稀释，水溶肥实验浓度最高设置为推荐浓度的2倍，最低为最小推荐浓度，即依次为250倍（4g/L），333倍（3g/L）、500倍（2g/L）、800倍（1.25g/L）稀释等4个浓度处理。在5L的量杯中，加入3L无菌水，按水溶肥的实验浓度称取不同量的水溶肥加入体系，制备成不同浓度的水溶肥溶液，每浓度设置3次重复；按菌剂的实验浓度取7.5mL菌剂原液加入上述体系中，并设置不加菌剂对照，确定混合体系是否有杂菌污染。非封口体系室温条件下放置。

以梯度稀释涂布方法，进行菌活数的检测。测定GN504菌剂原液的菌活数，由此推算获得菌剂与水溶肥混合时的初始菌活数理论值；测定放置5h，24h各混合体系溶液中菌株GN504的菌含量，三次重复取平均值，获得不同水溶肥浓度下菌株的菌活数，将之与初始菌活数理论值相比较，评价与水溶肥对菌种存活力的影响。以水溶肥浓度为横坐标，以测得的菌含量的对数值为纵坐标，绘制菌株与不同浓度水溶肥混合时菌含量变化图如表1和图13所示。

表1菌株GN504与不同浓度水溶肥混合后菌含量。

由表1和图13可知，由菌剂与水溶肥混合5h菌含量检测结果可知，菌剂GN504在水溶肥4个浓度中检测到的菌存活量基本一致，无显著差异，未随着水溶肥浓度的增大而有所变化；且在4个浓度下菌存活量与混合初始理论值基本一致，无显著差异，因此可视为菌剂GN504在与水溶肥推荐浓度（500倍稀释）甚至2倍于推荐浓度（250倍稀释）下混合使用时，仍能保持菌种活力，菌剂GN504在水溶肥推荐浓度范围内与之混用，不影响菌剂的菌活力以及菌剂功能。

由菌剂与水溶肥混合24h菌含量检测结果可知，菌剂GN504在水溶肥250倍~500倍稀释浓度下，菌存活量与初始菌量理论值仍处于同一数量级，只菌含量略低于理论值，但仍有初始菌量的近90%，菌剂功能基本不受影响。

综合菌剂与水溶肥混合5h和24h后菌存活量检测结果，可知菌剂GN504与平衡水溶肥混合使用时（推荐浓度）菌存活力几乎不受影响，混合施用不影响菌剂功能；菌剂与水溶肥混施时，应尽快使用，混合后24h内施用完毕，最好是混合后立即施用。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims

1.一种耐盐碱的促生菌，其特征在于，该促生菌的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，所述促生菌的保藏编号为CGMCC NO.29057。

2.根据权利要求1所述的促生菌，其中，所述促生菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的促生菌，其中，所述促生菌为革兰氏阳性、形状为圆形、表面有褶皱、边缘锯齿形、白色和杆状。

4.一种耐盐碱的促生菌菌剂，其特征在于，所述促生菌菌剂含有培养基和菌体，所述菌体含有保藏编号为CGMCC NO.29057的促生菌。

5.根据权利要求4所述的促生菌菌剂，其中，每克所述促生菌菌剂中，保藏编号为CGMCCNO.29057的促生菌的活菌数为1.0-5.0×10⁹ CFU。

6.根据权利要求4所述的促生菌菌剂，其中，所述培养基包括LB培养基、营养琼脂培养基、TY培养基和YPGA培养基中的至少一种。

7.权利要求1-3中任意一项所述的促生菌或权利要求4-6中任意一项所述的促生菌菌剂在固氮方面、解磷方面、解钾方面、作为产铁载体菌株方面和促进植物生长方面中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：在盐碱或非盐碱的环境下，将所述促生菌或所述促生菌菌剂施用于所述植物的种子上，或者，施用于所述植物的种植基质中。

9.根据权利要求7所述的应用，其中，所述植物包括玉米、小麦、水稻和大豆中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的应用，其中，所述促生菌的施用量为每株所述植物2-6×10⁸CFU。