CN117431190A - 一株能够缓解自闭症谱系障碍的短双歧杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能够缓解自闭症谱系障碍的短双歧杆菌及其应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一株短双歧杆菌XA‑1267，此菌株的保藏编号为CGMCC No.26614；实验证明，此菌株能够显著改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的过度活跃行为、焦虑行为、重复刻板行为以及社交障碍，可见，此菌株可以显著改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的自闭症谱系障碍核心症状及并发症状，在制备自闭症谱系障碍的治疗药物中极具应用前景；实验证明，此菌株能够有效修复肠屏障，可见，此菌株具有改善肠屏障功能的效果，在制备改善肠屏障的药物中极具应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株能够缓解自闭症谱系障碍的短双歧杆菌及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，简称ASD），是一种广泛性神经发育障碍。根据美国精神病学协会发布的《精神疾病诊断与统计手册》第五版（DSM-5）表示，自闭症谱系障碍的核心症状分别为社交障碍和刻板重复行为，同时也常伴随易激惹、高攻击性、焦虑、过度活跃和失眠等并发症状。目前为止，对于自闭症谱系障碍的致病机制仍然不清晰。传统观点认为，遗传因素及环境高危因素导致了自闭症谱系障碍的发生，其中，遗传因素导致的自闭症谱系障碍约占60%。
关于自闭症谱系障碍的治疗，现阶段只有美国食品药品监督管理局（FDA）批准过两种可用于治疗自闭症儿童的药物，即利培酮（risperidone，商品名Risperdal）和阿立哌唑（aripiprazole，商品名Abilify），这两种药物可有效改善自闭症谱系障碍患者的易激惹、攻击及刻板行为。但是，这两种药物均有不同程度的副作用，例如，增加食欲、体重增加以及嗜睡等。因此，亟需开发副作用小的能够有效治疗自闭症谱系障碍的药物以克服现有自闭症谱系障碍治疗药物存在的缺陷。
短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）是一种益生菌，广泛存在于人类的肠道中，尤其是婴儿的肠道内，也可以在成年人的肠道中找到。研究表明，短双歧杆菌能够帮助维持肠道菌群平衡，促进食物消化和营养吸收，增强免疫力，预防肠道感染和炎症等。并且，短双歧杆菌还可以帮助降低胆固醇水平，改善肠胃道功能，减少过敏反应等。
找到能够有效治疗自闭症谱系障碍的短双歧杆菌，对开发副作用小的能够有效治疗自闭症谱系障碍的药物十分有帮助。公开号为CN110664848A的专利文本就提供了一株能够治疗自闭症谱系障碍的短双歧杆菌CCFM1025，但是，该短双歧杆菌CCFM1025仅对自闭症谱系障碍的刻板行为这一核心症状有显著改善效果，而对自闭症谱系障碍的社交障碍这一核心症状无显著改善效果。因此，亟需找到治疗自闭症谱系障碍的效果更好的短双歧杆菌以克服现有自闭症谱系障碍治疗药物存在的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一株短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）XA-1267，所述短双歧杆菌XA-1267保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26614，保藏日期为2023年02月21日。
所述短双歧杆菌XA-1267来源于深圳地区的健康成年人粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI的Blastn程序进行核酸序列比对，结果显示菌株为短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）。
本发明还提供了上述短双歧杆菌XA-1267在制备药物中的应用，所述药物具有如下任一所示的功能：
（a）治疗自闭症谱系障碍（ASD）；
（b）改善肠屏障功能。
在本发明的一种实施方式中，所述治疗自闭症谱系障碍包括改善自闭症谱系障碍核心症状和/或并发症状。
在本发明的一种实施方式中，所述自闭症谱系障碍核心症状包括重复刻板行为和/或社交障碍；所述自闭症谱系障碍并发症状包括过度活跃行为和/或焦虑行为。
在本发明的一种实施方式中，所述改善自闭症谱系障碍核心症状包括改善重复刻板行为和/或改善社交障碍；所述改善自闭症谱系障碍并发症状包括改善过度活跃行为和/或改善焦虑行为。
在本发明的一种实施方式中，所述药物含有上述短双歧杆菌XA-1267的活菌、灭活菌和/或代谢物。
本发明的一种实施方式中，所述药物中，上述短双歧杆菌XA-1267的活菌含量为不低于1×1010CFU/mL或1×1010CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述药物还含有药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂或浸膏。
本发明还提供了一种治疗自闭症谱系障碍的药物，所述药物的成分包含上述短双歧杆菌XA-1267的活菌、灭活菌和/或代谢物。
在本发明的一种实施方式中，所述治疗自闭症谱系障碍包括改善自闭症谱系障碍核心症状和/或并发症状。
在本发明的一种实施方式中，所述自闭症谱系障碍核心症状包括重复刻板行为和/或社交障碍；所述自闭症谱系障碍并发症状包括过度活跃行为和/或焦虑行为。
在本发明的一种实施方式中，所述改善自闭症谱系障碍核心症状包括改善重复刻板行为和/或改善社交障碍；所述改善自闭症谱系障碍并发症状包括改善过度活跃行为和/或改善焦虑行为。
本发明的一种实施方式中，所述药物中，上述短双歧杆菌XA-1267的活菌含量为不低于1×1010CFU/mL或1×1010CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述药物还含有药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂或浸膏。
本发明还提供了一种改善肠屏障功能的药物，所述药物的成分包含上述短双歧杆菌XA-1267的活菌、灭活菌和/或代谢物。
本发明的一种实施方式中，所述药物中，上述短双歧杆菌XA-1267的活菌含量为不低于1×1010CFU/mL或1×1010CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述药物还含有药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂或浸膏。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一株短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）XA-1267，此短双歧杆菌XA-1267的保藏编号为CGMCC No.26614；实验证明，此短双歧杆菌XA-1267能够显著改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的过度活跃行为、焦虑行为、重复刻板行为以及社交障碍，可见，此短双歧杆菌XA-1267可以显著改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的自闭症谱系障碍核心症状及并发症状，在制备自闭症谱系障碍的治疗药物中极具应用前景；同时，实验证明，此短双歧杆菌XA-1267能够有效修复肠屏障，可见，此短双歧杆菌XA-1267具有改善肠屏障功能的效果，在制备改善肠屏障的药物中极具应用前景。
生物材料保藏
一株短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）XA-1267，分类学命名为Bifidobacterium breve，已于2023年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26614，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1：短双歧杆菌XA-1267的系统发育树。
图2：不同组小鼠的旷场测试行为学结果。图2中，a为总运动距离，b为中心区运动时间百分比。
图3：不同组小鼠的高架十字迷宫测试行为学结果。
图4：不同组小鼠的理毛测试行为学结果。
图5：不同组小鼠的埋珠测试行为学结果。
图6：不同组小鼠的三箱社交测试行为学结果。
图7：不同组小鼠的互惠社交测试行为学结果。
图8：不同组单层上皮炎症损伤模型的细胞单层跨膜电阻值。
图9：不同组单层上皮炎症损伤模型的FITC-dextran细胞膜通透率。
图10：不同组单层上皮炎症损伤模型中紧密连接蛋白ZO-1的表达情况。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的活菌数的检测方法为：采用国标《GB 4789.35-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检测 乳酸菌检测》。
实验例1：短双歧杆菌XA-1267的获取及鉴定
具体步骤如下：
以来源于深圳地区的健康成年人粪便为分离源样本，取1.0g新鲜粪便样本添加至9mL的无菌无氧磷酸盐缓冲液中，涡旋混匀，得到混匀的样本；吸取0.5mL混匀的样本添加至4.5mL无菌无氧磷酸盐缓冲液中获得10-1稀释液，然后吸取0.5mL 10-1稀释液于4.5mL无菌无氧磷酸盐缓冲液中，得到10-2稀释液，按此操作，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释液；吸取100μL梯度稀释液涂布于YCFA固体培养基上（购自北京索莱宝科技有限公司）上，10-4、10-5、10-6、10-7每个梯度2个板，37°C厌氧培养72h，得到菌落；根据菌落形状、大小、边缘、透明度等选择YCFA固体培养基上具有短双歧杆菌典型特征的菌落，用接种环挑取菌落在RCM固体培养基上进行划线，37°C厌氧培养72h，得到纯化的单菌落；挑取纯化的单菌落分别接种至4mL的BHI液体培养基（购自北京索莱宝科技有限公司）中，37°C厌氧培养24h，得到菌液；将各菌液所对应的各菌株编号后，进行菌株鉴定分析，得到菌株XA-1267。
其中，菌株鉴定过程如下：
取10μL菌株XA-1267的菌液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）提取DNA，得到裂解液；使用序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的细菌通用引物27F和1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TGTACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），以裂解液为模板进行扩增，得到菌株XA-1267的16S rRNA（菌株XA-1267的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示）；将菌株XA-1267的16S rDNA在NCBI的Blastn程序进行核酸序列比对（构建而得的系统发育树见图1），结果显示此菌株为短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）XA-1267。将短双歧杆菌XA-1267的菌液置于20%（v/v）甘油水溶液（甘油水溶液与菌液的体积比为1：1）中，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26614。
实验例2：短双歧杆菌XA-1267对母体免疫激活模型小鼠雄性子代自闭症样行为的影响
本实验例提供了短双歧杆菌XA-1267对母体免疫激活模型小鼠雄性子代自闭症样行为的影响实验，实验过程如下：
1、菌液供试品制备
取1 mL短双歧杆菌XA-1267的保藏菌液接种于25 mL改良GAM培养基（购自青岛海博生物科技有限公司）中，于37 °C厌氧培养18 h，得到活化液；将活化液按照4%（v/v）的接种量接种至改良GAM培养基中，于37°C厌氧培养18 h，得到发酵液；将发酵液于室温（25°C）、8000g下离心10min后，收集菌体；在菌体中加入发酵液体积的1/10的D-磷酸盐缓冲液（货号G4200-500ML，购自武汉赛维尔生物科技有限公司）洗涤菌体后，再次于室温（25°C）、8000g下离心10min，收集经洗涤的菌体；在经洗涤的菌体中加入发酵液体积的1/10的10%（v/v）甘油水溶液，得到菌悬液；将菌悬液分装于2mL离心管，每管1mL，并置于-80°C冰箱保存。灌胃给药使用前从-80°C冰箱取出菌悬液，在37°C中孵育5 min化冻复苏，于室温（25°C）、8000g下离心5 min，取复苏菌体；在复苏菌体中加入菌悬液等体积的含1%（w/v，g/100mL）L-半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲液（货号G4202-500ML，购自武汉赛维尔生物科技有限公司）洗涤菌体后，再次于室温（25°C）、8000g下离心10min，收集经洗涤的复苏菌体；使用含1%（w/v，g/100mL）L-半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲液将经洗涤的复苏菌体重悬至菌体浓度为2×1010个/mL，得到用于灌胃的菌液。
2、母体免疫激活模型（Maternal immune activation，MIA）构建
母体免疫激活模型是自闭症谱系障碍领域临床前研究常用的动物模型（参照文献“Elaine Y. Hsiao, et al., Cell. 2013; Gloria B. Choi, et al., Science, 2016;Sangdoo Kim et al., Nature. 2017; Yeong shin Yim, et al. Nature. 2017.”）。雌性小鼠孕期中如果免疫细胞Th17细胞被药物激活，体内会产生大量炎症因子IL-17，使得小鼠胚胎大脑皮层发育异常，增加后代患自闭症风险。
2.1、实验动物
SPF级8~12周龄C57BL/6J小鼠雄性20只与雌性80只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），小鼠交配前需检测雌鼠粪便是否带有分解丝状菌（segmentedfilamentous bacteria，SFB），如无则不可用于母体免疫激活模型构建。SPF级小鼠饲养于独立通气笼中，每笼饲养密度为5只，所有小鼠用打上耳标标记编号。准备繁殖前5天，雄鼠单笼单只饲养。环境温湿度分别维持于23±1°C、50±10%，自动光暗周期为12小时。除非下列实验方法中有限定，小鼠可自由摄取食物及饮水。
2.2、母体免疫激活模型
F0代雌雄小鼠按2：1的比例进行交配，第二天进行阴道栓检查，如有栓则于胚胎第12.5天（E12.5），对孕鼠进行腹腔注射Poly(I:C)（注射剂量20mg/kg，Sigma Aldrich，CAS号42424-50-0），对照组孕鼠注射生理盐水。孕鼠腹腔注射后单笼饲养，并在笼内放置玩具及筑巢材料，注意该阶段不可惊吓到孕鼠，以防止雌鼠产仔后啃食幼崽。幼崽出生后母鼠对其哺乳21~28天，然后将雄性子代小鼠捡出分笼，每笼饲养密度不超过5只，并用耳标进行编号。
3、清肠与给药
3.1、小鼠抗生素清肠
对所有组的雄性子代小鼠使用抗生素进行清肠。
抗生素清肠的具体步骤如下：将万古霉素（灌胃剂量50mg/kg，Sigma Aldrich，CAS号1404-93-9）、新霉素（灌胃剂量100mg/kg，Sigma Aldrich，CAS号1405-10-3）和甲硝唑（灌胃剂量100mg/kg，Sigma Aldrich，CAS号443-48-1）用无菌水溶解后给雄性子代小鼠灌服，灌胃的溶液量按10g体重0.1mL的溶液。溶液每天新鲜配制，每12小时灌胃一次，连续灌胃7天。
小鼠抗生素清肠期间（7天），将氨苄西林用无菌饮用水配置成1mg/mL的氨苄西林水溶液供小鼠饮水，每三天更换一次。
小鼠抗生素清肠期间（7天），所有操作必须在生物安全柜中进行，包括垫料更换、饮用水更换、食物添加以及灌胃操作，禁止在生物安全柜外打开笼盖或将小鼠曝露于安全柜外的空间。
3.2、小鼠分组与灌胃给药
取30只母体免疫激活模型小鼠的雄性子代按随机区组设计法分为3组，分别为模型组（Poly(I:C)+Vehicle组）、阳性药组（Poly(I:C)+Risperidone）、实验组（Poly(I:C)+XA-1267组），每组10只小鼠。取孕期注射生理盐水雌鼠的10只雄性子代小鼠作为对照组（Saline+Vehicle组），该对照组小鼠体重的总和与其余3组雄性子代小鼠体重总和分别相比，差值在±2g以内。所有组雄性子代小鼠为期7天的抗生素清肠结束后，立即进行灌胃给药，给药体积按10g体重0.1mL供试品进行。Saline+Vehicle和Poly(I:C)+Vehicle组的小鼠灌胃含1%（w/v，g/100mL）L-半胱氨酸盐酸盐（Sigma Aldrich，CAS号52-89-1）的磷酸盐缓冲液（GibcoTM，货号10010023），Poly(I:C)+Risperidone组的小鼠灌胃阳性药利培酮（Risperidone剂量0.2mg/kg，Sigma Aldrich，CAS号106266-06-2），Poly(I:C)+XA-1267组的小鼠灌胃短双歧杆菌XA-1267的菌液（每1mL菌液含有2×1010个菌体）。每天固定时间点灌胃一次，行为学测试前连续进行21天灌胃，行为学测试开始后继续灌胃，直至实验终点前一天。
4、行为学测试
实验前小鼠需要在行为学测试房间不被打扰60min。每次测试后均需要用75%（v/v）酒精擦拭行为学设备，并待酒精气味散去方可进行下一只小鼠的测试。使用NoldusEthoVision XT软件（Noldus Information Technology; Leesburg, VA, USA）记录视频记录及轨迹追踪，分别识别小鼠鼻子、身体中央以及尾巴三个区域。行为学实验员不知小鼠分组情况。
4.1、旷场测试
在旷场箱子（41cm×41cm×38cm）中，用位于箱子正上方的摄像头记录小鼠自发行为。旷场中心区域定义为20cm×20cm的虚拟区域。每只小鼠在旷场中记录10min，记录并分析小鼠总运动距离（Total Distance，cm）和在中心区所时间占总时间的百分比（Time inCenter，%）。
4.2、理毛测试
旷场测试结束后，实验人员通过视频分析统计小鼠在旷场箱中10min内的自发性理毛行为，计算总的累计理毛时间。
4.3、高架十字迷宫测试
将实验鼠放入十字型迷宫中进行测试，十字型迷宫的封闭臂尺寸为：高15cm×长30cm×宽5cm，开放臂尺寸为：高1cm×长30cm×宽5cm。迷宫呈灰色，材质为有机玻璃，离地高度为50cm。每只小鼠从十字迷宫的中心区域放入，记录其在开放臂的运动时间。
4.4、埋珠测试
将实验鼠放入测试箱子中（40cm×20cm×30cm，垫料深度5cm）用摄像头记录30min视频，箱子中含有20个玻璃球（分成4排，每排5个，玻璃球之间间距保持一致为4cm）。在第30分钟结束时，将小鼠从箱子中小心转移出，掩埋超过珠子2/3体积的记为被掩埋珠子，统计被掩埋的玻璃球数量。
4.5、三箱社交测试
三箱社交测试在一个60cm×40cm×22cm的蓝色有机玻璃箱子中进行，其中箱子被2块隔板（透明有机玻璃，中央区带有5cm×8cm的滑门）分隔为20cm×40cm×22cm的三个区域（左、中、右），左右室正中央各有一个圆形笼子（直径10cm，高18cm，格栅直径3mm，格栅间距7mm），摄像头位于中央室正上方对小鼠进行视频记录及轨迹追踪。首先，实验鼠从中央室放入箱体中，小鼠在三箱中自由行动，熟悉左右室各有圆形笼子（笼子内不放任何物体）的三箱环境，记录10min。然后，在随机一侧的笼子内放入一只与实验鼠非同笼饲养的小鼠（品系背景、性别、鼠龄与实验鼠一致），实验鼠从中央室放入箱体中，另一侧区域笼子内不放物体，实验鼠从中央室放入箱体中自由探索，记录10min。
4.6、互惠社交测试
将实验小鼠放置在饲养笼中，与一只陌生的同性别同年龄同品系的小鼠自由活动10min，并用摄像头拍摄视频。实验员分析视频中实验鼠对陌生鼠的社交互动的累计时间，社交互动行为包括：鼻对鼻嗅探、鼻对肛门嗅探、跟随、触碰、为对方理毛、从对方身上或身下穿行。
5、行为学结果分析
旷场测试结果显示，与对照组小鼠（总运动距离3331.06±94.06cm）相比，模型组小鼠在10min的总运动距离显著降低（降低至2580.61±78.69cm）。而与模型组小鼠相比，灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠运动障碍得到恢复（恢复至3182.40±169.5cm）。同时，阳性药组小鼠的总运动距离（总运动距离2922.40±281.60cm）与模型组相比无显著性差异（图2中的a，单因素方差分析，P 对照组VS模型组= 0.0010，P 模型组VS阳性药组= 0.5748，P 模型组 VS 实验组=0.0088）。另外，与对照组小鼠相比（中心区运动时间占比13.66±0.34%），模型组小鼠在旷场中心区的运动时间显著降低（降低至7.89±0.82%）。而与模型组小鼠相比，灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠在该区域的活动时间增加（增加至14.82±0.94%）。同时，阳性药组小鼠在在旷场中心区的运动时间（中心区运动时间占比12.31±2.54%）与模型组相比无显著性差异（图2中的b，单因素方差分析，P 对照组VS模型组= 0.0188，P 模型组VS阳性药组= 0.0876，P 模型组 VS 实验组= 0.0042）。说明短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的过度活跃行为和焦虑行为。
高架十字迷宫测试结果显示，与对照组小鼠相比（开放臂区域运动时间71.12±8.81s），模型组小鼠在十字迷宫的开放臂区域的运动时间显著降低（降低至30.08±4.41s）。而灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠在该区域的运动时间与模型组小鼠相比显著增加至63.66±10.35s）。同时，阳性药组小鼠在在开放臂区域的运动时间（开放臂区域运动时间49.31±8.74s）与模型组相比无显著性差异（图3，单因素方差分析，P 对照组 VS 模型组=0.0037，P 模型组 VS 阳性药组= 0.2565，P 模型组 VS 实验组= 0.0193）。说明短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的焦虑行为。
理毛测试结果显示，与对照组小鼠相比（理毛时间61.80±2.32s），模型组小鼠在旷场测试中累计的理毛时间显著增加（增加至111.70±4.84s）。而灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠的理毛行为的时间与模型组小鼠相比显著降低（降低至74.60±5.40s）。同时，阳性药组小鼠的理毛时间也显著降低（降低至86.90±6.23s）（图4，单因素方差分析，P 对照组 VS 模型组<0.0001，P 模型组 VS 阳性药组= 0.0030，P 模型组 VS 实验组<0.0001）。说明短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代重复刻板行为。
埋珠测试结果显示，与对照组小鼠相比（埋珠数量1.60±0.22个），模型组小鼠所掩埋珠子的数量显著增加（增加至4.70±0.72个）。而灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠所掩埋珠子的数量与模型组小鼠相比显著降低（降低至1.10±0.31个）。同时，阳性药组小鼠的埋珠数量与模型组相比也显著降低（降低至1.30±0.67个）（图5，单因素方差分析，P 对照组 VS 模型组= 0.0005，P 模型组 VS 阳性药组= 0.0002，P 模型组 VS 实验组<0.0001）。说明短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代重复刻板行为。
三箱社交测试结果显示，在社会性测试阶段，与对照组小鼠相比（陌生鼠笼区域探索时间144.42±4.82s），模型组小鼠对陌生鼠的探索时间显著降低（降低至93.28±3.89s）。而灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠与模型组相比对陌生鼠的探索时间显著增加（增加至136.98±12.23s）。同时，阳性药组小鼠（陌生鼠笼区域探索时间127.42±6.37s）与模型组相比无显著性差异（图6，双因素方差分析，P 对照组 VS 模型组= 0.0004，P 模型组 VS 阳性药组= 0.0723，P 模型组 VS 实验组= 0.0043）。说明短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的社交障碍。
互惠社交测试结果显示，与对照组小鼠相比（总社交时间68.80±2.45s），模型组小鼠对陌生鼠的总社交时间显著降低（降低至57.3±1.19s），而灌胃短双歧杆菌XA-1267的实验组小鼠与模型组相比对陌生鼠的探索时间显著增加（增加至71.70±4.27s）。同时，阳性药组小鼠（总社交时间49.32±8.74s）与模型组无显著性差异（图7，单因素方差分析，P 对照组 VS 模型组= 0.0004，P 模型组 VS 阳性药组= 0.0723，P 模型组 VS 实验组= 0.0043）。说明短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的社交障碍。
综上所述，短双歧杆菌XA-1267可以改善母体免疫激活模型小鼠雄性子代的自闭样行为，包括过度活跃行为、焦虑行为、重复刻板行为和社交障碍，并且在药效上优于阳性药利培酮。
实验例3：短双歧杆菌XA-1267的肠屏障修复功能
本实验例提供了短双歧杆菌XA-1267对单层上皮炎症损伤细胞模型的影响，实验过程如下：
1、单层上皮炎症损伤细胞模型的构建
将0.4μm孔径Transwell小室用DMEM-高糖完全培养基孵育2h，得到经预处理的Transwell小室；将处于生长对数期的CaCO-2细胞（购自ATCC）和HT-29-MTX-E12细胞按照9：1的细胞数量比接种到经预处理的Transwell小室的上室中，总接种量2.5×106个细胞，并在Transwell小室的上室和下室中分别加入100μL和600μL的完全培养基（购自赛默飞）后，于37°C、5%（v/v）CO2的细胞培养箱中培养，隔天更换新鲜完全培养基并用EVOM3细胞电阻仪测量不同时间点的细胞跨膜电阻，绘制电阻值曲线，待细胞完全融合后，连续三次测量电阻值稳定即得CaCO-2/HT-29-MTX-E12细胞单层模型，可进行后续试验；CaCO-2/HT-29-MTX-E12细胞单层模型构建完成后，移除上室及下室的培养基，以加入含10%（v/v）灭活FBS的DMEM高糖培养基（购自赛默飞）处理的单层细胞上皮为空白对照，在Transwell小室的上室和下室中分别加入100μL和600μL含100ng/mL IL-1β、40ng/mL TNFα、100μg/mL LPS（脂多糖）和10%（v/v）灭活FBS的DMEM高糖培养基，于37°C、5%（v/v）CO2的细胞培养箱中培养24h以处理单层细胞上皮，得到单层上皮炎症损伤细胞模型。细胞单层跨膜电阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）可以作为CaCO-2细胞单层致密性的评估参数。
2、短双歧杆菌XA-1267与单层上皮验证细胞模型互作实验
单层上皮炎症损伤细胞模型构建完成后，移除上室及下室的培养基，将Transwell小室经磷酸盐缓冲液洗涤1次后，在下室加入无双抗含10%（v/v）FBS的DMEM高糖细胞培养基，并以终浓度为2μM的丁酸钠溶液（溶剂为DMEM高糖细胞培养基）为丁酸钠对照，以DMEM高糖细胞培养基为溶媒对照，在上室以感染复数（MOI）为10：1的添加量加入100μL重悬于DMEM高糖细胞培养基的短双歧杆菌XA-1267（XA-1267对照组），在厌氧台37°C静置互作2h；互作结束后，移除上室及下室的培养基，将Transwell小室经磷酸盐缓冲液洗涤1次后，在Transwell小室的上室和下室中分别加入100μL和600μL无双抗的DMEM高糖细胞，于37°C、5%（v/v）CO2的细胞培养箱中培养22h；在上室加入20μL FITC-dextran（4KDa，100μg/mL），于37°C、5%（v/v）CO2的细胞培养箱中孵育0、1、3、6、12或24h后测量单层融合上皮跨膜电阻值（TEER），结果如图8所示；在下室补充20μL无双抗含10%（v/v）FBS的DMEM高糖细胞培养基后，收集下室培养基60μL，以每孔20μL的添加量加样至黑色96孔板内，在λex490 nm和λem520nm条件下，使用多功能酶标仪检测下室培养基中物质的荧光强度并计算FITC-dextran细胞旁瞬时通透率，计算结果见图9；移除上室及下室的培养基，将Transwell小室经磷酸盐缓冲液洗涤3次后，加入100μL预冷至4°C的4%（g/100mL）多聚甲醛，4°C固定25min；磷酸盐缓冲液清洗后，每孔加入200μL含0.2%（g/100mL）Triton X-100的磷酸盐缓冲液，冰上静置10min；磷酸盐缓冲液清洗后，每孔加入300μL含5%（g/100mL）BSA的磷酸盐缓冲液，室温（25°C）封闭1h；按照说明书加入抗ZO-1抗体（购自Abcam公司），4°C孵育16h；磷酸盐缓冲液清洗后，加入FITC标记的二抗，室温（25°C）避光孵育2h；磷酸盐缓冲液清洗后，将Transwell小室的膜小心剥下，加入含DAPI的封片剂，放置在玻底培养皿中用荧光显微镜进行观察，观察结果见图10；
其中，FITC-dextran细胞旁瞬时通透率P=（实验孔FITC-dextran荧光值/空白孔FITC-dextran荧光值）×100%；式中，实验孔是指空白对照组、丁酸钠对照组、溶媒对照组以及XA-1267实验组样本的孔，空白孔是指仅添加有与实验孔等量DMEM高糖细胞培养基的孔。
如图8所示，与空白对照组相比（24h TEER为0.9169），溶媒对照组的细胞单层跨膜电阻逐步降低（降至0.6702）。而XA-1267处理后，CaCO-2/HT-29-MTX-E12细胞单层模型的TEER得到恢复（恢复至0.8344）。如图9所示，相比于空白对照组（FITC-dextran细胞膜通透性0.7633%），溶媒对照组单层上皮炎症损伤细胞模型用IL-1β、TNFα和LPS处理后，FITC-dextran细胞膜通透性显著增加（增加至1.7067%），而用丁酸钠或短双歧杆菌XA-1267处理均能显著降低FITC-dextran的细胞膜通透性至未处理组水平（降低至0.8300%）。如图10所示，溶媒对照组单层上皮炎症损伤细胞模型中的紧密连接蛋白ZO-1的表达相比空白对照组降低，而经丁酸钠或短双歧杆菌XA-1267处理的单层上皮炎症损伤细胞模型中的紧密连接蛋白ZO-1表达能够恢复。上述结果显示短双歧杆菌XA-1267具有肠屏障修复的功能。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一株短双歧杆菌（Bifidobacterium breve），其特征在于，所述短双歧杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26614。
2.权利要求1所述的短双歧杆菌在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物具有如下任一所示的功能：
（a）治疗自闭症谱系障碍；
（b）改善肠屏障功能。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗自闭症谱系障碍包括改善自闭症谱系障碍核心症状和/或并发症状；所述自闭症谱系障碍核心症状包括重复刻板行为和/或社交障碍；所述自闭症谱系障碍并发症状包括过度活跃行为和/或焦虑行为。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述短双歧杆菌的活菌、灭活菌和/或代谢物。
5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药物中，权利要求1所述短双歧杆菌的活菌含量为不低于1×1010CFU/mL或1×1010CFU/g。
6.一种治疗自闭症谱系障碍的药物，其特征在于，所述药物的成分包含权利要求1所述短双歧杆菌的活菌、灭活菌和/或代谢物。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述治疗自闭症谱系障碍包括改善自闭症谱系障碍核心症状和/或并发症状；所述自闭症谱系障碍核心症状包括重复刻板行为和/或社交障碍；所述自闭症谱系障碍并发症状包括过度活跃行为和/或焦虑行为。
8.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药物载体和/或药用辅料。
9.一种改善肠屏障功能的药物，其特征在于，所述药物的成分包含权利要求1所述短双歧杆菌的活菌、灭活菌和/或代谢物。
10.如权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药物载体和/或药用辅料。
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| GR01 | Patent grant | ||
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