CN117425401A - 用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容的实施方案涉及一种用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的方法。该方法可以包括对培养的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径和基因型的茎的砧木；以及制作穿过至少一个砧木茎的切口并且邻近砧木茎上的切口放置稳定装置。该方法还可以包括通过将至少一个切割的接穗茎插入到稳定装置中来产生嫁接的植物，其中至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐；以及从嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。

Description

用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物
背景
在不使用脱氧核糖核酸(DNA)进行突变起始的情况下进行的基因组编辑的方法被称为“无DNA”基因组编辑技术。植物中的无DNA基因组编辑通常需要将转基因核糖核酸(RNA)和/或蛋白质从基因组编辑试剂直接递送到植物细胞，并且将转化的细胞再生为整株植物和经编辑的品系。这种方法需要专门的植物转化和组织培养方案，以将转基因RNA和/或蛋白质直接递送到植物组织，并且将转化的材料再生为整株植物。在一些情况下，RNA病毒已经被用于递送基因组编辑试剂诸如单引导RNA(sgRNA)或小RNA。然而，严格的病毒大小限制阻止了较大的试剂诸如转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或Crisper相关蛋白9(Cas9)直接掺入到病毒颗粒中。此外，掺入原生质体、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、生根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)或双生病毒复制子(geminivirusreplicon，GVR)的“瞬时”试剂递送方法也已得到展示，但是需要昂贵的组织培养方案开发且有将DNA整合到宿主植物中的风险。另外，一些物种诸如大麻(Cannabis sativis)难以直接转化和再生，并且因此很难使用无DNA基因组编辑技术进行编辑。
概述
提供本概述来以简化形式介绍在下文详述中被进一步描述的精选概念。
在一方面，本公开内容提供了一种用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的方法。该方法包括对培养的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径和基因型的茎的砧木；以及制作穿过至少一个砧木茎的切口并且邻近砧木茎上的切口放置稳定装置。该方法还包括通过将至少一个切割的接穗茎插入到稳定装置中来产生嫁接的植物，其中至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐；以及从嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。
在一些实例中，该方法包括产生以与切割的接穗茎的基因型嫁接相容的基因型表达表达构建体的转基因植物。在一些实例中，该方法包括通过用携带表达构建体的根癌土壤杆菌感染宿主植物来产生表达表达构建体的转基因植物。在一些实例中，该方法包括通过用携带表达构建体的生根根瘤菌感染宿主植物来产生表达表达构建体的转基因植物。在一些实例中，该方法包括使用粒子轰击产生表达表达构建体的转基因植物。在一些实例中，该方法包括制作穿过至少一个砧木茎的切口包括制作穿过至少一个砧木茎的第一成角度切口，该方法还包括制作穿过至少一个接穗茎的第二成角度切口，其中穿过至少一个接穗茎的第二成角度切口与穿过至少一个砧木茎的第一成角度切口基本上相似。在一些实例中，该方法包括制作穿过至少一个砧木茎的切口包括制作穿过至少一个砧木茎的第一楔形切口，该方法还包括制作穿过至少一个接穗茎的第二楔形切口，其中穿过至少一个接穗茎的第二楔形切口与穿过至少一个砧木茎的第一楔形切口基本上相似。在一些实例中，表达构建体包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)mRNA，并且其中从嫁接的植物中筛选新的生长物包括对新芽生长物进行取样，用于使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹检测TALEN mRNA和/或蛋白质。在一些实例中，表达构建体包括mRNA编码序列和启动子。在一些实例中，启动子是35S启动子。在一些实例中，启动子是胭脂碱合酶(Nos)启动子。
在另一方面，本公开内容提供了一种通过基因组编辑技术产生的非天然存在的植物。在这样的实施方案中，基因组编辑技术包括通过用包含TALEN mRNA编码序列、来自韧皮部移动RNA(phloem-mobile RNA)的邮政编码元件和组成型启动子、诱导型启动子或韧皮部特异性启动子的根癌土壤杆菌、生根根瘤菌溶液或者粒子轰击感染宿主植物来产生转基因植物。生根根瘤菌也可以被称为生根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes，A.rhizogenes)，并且这两个术语在本文中可以可互换地使用。本公开内容还包括对转基因植物的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径和基因型的茎的砧木；以及制作穿过至少一个砧木茎的切口并且邻近砧木茎上的切口放置稳定装置。此外，基因组编辑技术包括通过将至少一个切割的接穗茎插入到稳定装置中来产生嫁接的植物，其中至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐；以及从嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。
在一些实例中，基因组编辑技术包括制作穿过至少一个砧木茎的切口，并且邻近砧木茎上的切口放置稳定装置。在一些实例中，基因组编辑技术包括从嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。在一些实例中，TALENmRNA编码序列靶向甘氨酸最大脂肪酸去饱和酶3(GmFAD3)基因、大麻八氢番茄红素去饱和酶(CsPDS)基因或马铃薯八氢番茄红素去饱和酶(StPDS)基因。
附图说明
当结合附图时，通过参考以下详述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易理解，在附图中：
图1图示出了与本公开内容一致的用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的示例性方法。
图2是进一步图示出与本公开内容一致的用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的示例性方法的图。
图3A和图3B图示出了与本公开内容一致的用于递送基因组编辑试剂的示例性表达构建体。
图4A、图4B、图4C和图4D图示出了与本公开内容一致的产生微嫁接的(micrografted)马铃薯植物的阶段。
图5图示出了与本公开内容一致的从进行的多种嫁接实验获得的数据。
图6A和图6B图示出了与本公开内容一致的嫁接的大豆植物的砧木中的转基因基因表达。
图7A、图7B和图7C图示出了与本公开内容一致的嫁接的工业大麻(hemp)植物的砧木中的转基因基因表达。
图8A、图8B和图8C图示出了与本公开内容一致的嫁接的工业大麻植物中野生型接穗组织的基因组编辑的结果。
图9A、图9B、图9C、图9D、图9E、图9F、图9G、图9H、图9I和图9J图示出了与本公开内容一致的嫁接的大豆植物中野生型组织的基因组编辑的结果。
详述
多种基因组编辑方法允许在植物中进行无DNA编辑。这些方法包括RNA和/或蛋白质的直接递送，经由原生质体、根癌土壤杆菌、生根根瘤菌或粒子轰击的“瞬时”DNA递送，以及RNA试剂(即sgRNA和小RNA)或DNA(即双生病毒复制子)的病毒递送。所有这些方法需要一定程度的向靶植物基因型的试剂递送和经编辑的组织的再生。此外，这些递送方法通常效率低下，并且需要制备RNA、蛋白质和病毒颗粒，这可能进一步降低效率。
植物转化和组织培养技术对基因组编辑提出了显著的限制，需要大量的时间、劳动力和材料来开发和实施专门的方案。无DNA编辑技术可以通过不需要掺入转基因DNA来节省时间。
植物嫁接，在本文中被称为“嫁接(grafting)”或“嫁接(graft)”，是指以下园艺技术或者包括以下园艺技术，在该园艺技术中，来自一种植物的维管组织与另一种植物的维管组织融合，使得两种植物通过其维管组织的连结形成单个嫁接的植物。嫁接的植物有许多优点，包括但不限于增强的植物活力、更好的抗病性、对环境胁迫的改善的耐受性以及在延长的收获期内产生的更重的作物。植物嫁接还可以帮助植物抵御其他侵袭(infestation)，包括早疫病(茄链格孢菌(Alternaria solani))、晚疫病(致病疫霉(Phytophthora infestans))和脐腐病(blossom end-rot)(一种由低钙水平引起的生理紊乱)。嫁接的植物还可以更能耐受环境胁迫，如极端盐度或温度。
与本公开内容一致的将转基因植物材料嫁接到非转基因植物材料用于无DNA基因组编辑试剂递送，允许将无DNA基因组编辑试剂递送到植物组织，而不需要制备试剂并将试剂直接递送到植物组织，并且可以扩大能够被编辑的植物基因型的数量。
植物的维管系统允许将水和矿物质(经由木质部)和糖(经由韧皮部)转运到植物的生长部分(即，库(sink))。诸如RNA和蛋白质的大分子也通过维管系统(主要是韧皮部)转运，用于长距离信号传导并控制多种植物功能。长距离信号传导的工作原理是在叶和根(即，源)的韧皮部的伴细胞(companion cell)中合成大分子，并且将大分子装载到筛管分子(sieve element)中，以便经由胞间连丝转运到植物的远处生长部分(即，库)。如本文公开的，基因组编辑试剂在韧皮部伴细胞中的表达可以促进转基因RNA和/或蛋白质的长距离转运以及在库组织中的无DNA编辑，用于个体经编辑的事件的繁殖和分离。
通过基因组编辑试剂的嫁接递送实现了许多益处。首先，在靶基因型背景中开发编辑事件不需要靶基因型的直接转化和再生，这降低了开发和实现基因型特异性转化和再生方案的成本。第二，不需要制备无DNA试剂诸如RNA和蛋白质，这进一步降低了这样的专用方案的生产成本和技术开发。第三，在开发出表达基因组编辑试剂的转基因品系后，不需要组织培养来递送基因组编辑试剂，并且可以在非组织培养环境中进行生产。本公开内容的优点不限于上文列举的那些，并且可以实现另外的益处。
图1图示出了与本公开内容一致的用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的示例性方法100。方法100在101包括对培养的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径和基因型的茎的砧木。如本文使用的，术语“砧木”是指嫁接的植物的下部部分或者包括嫁接的植物的下部部分，该嫁接的植物的下部部分将根赋予到嫁接的植物。术语“接穗”是指嫁接的植物的上部部分或者包括嫁接的植物的上部部分，该嫁接的植物的上部部分将叶、花和/或果实赋予到嫁接的植物。术语“分级(grade)”或“分级(grading)”是指使用某些标准或鉴定某些属性来评估或评价植物或植物组织的过程或者包括使用某些标准或鉴定某些属性来评估或评价植物或植物组织的过程。在本公开内容中，对培养的砧木组织进行分级包括评估或评价砧木组织的由基因组编辑产生的mRNA和/或蛋白质的表达。在多种实例中，培养的砧木组织可以使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹进行分级。在一些实例中，分级包括鉴定具有带有嫁接相容的直径和基因型的茎的砧木。嫁接相容的茎直径可以在从约0.5毫米(mm)至约3.0mm的范围内。嫁接相容的基因型被定义为砧木和接穗之间的遗传关系足够接近，以便形成成功的嫁接结合部，假设其他因素诸如直径、湿度和温度得到满足。
在一些实例中，方法100开始于产生以与切割的接穗茎的基因型嫁接相容的基因型表达表达构建体的转基因植物。例如，表达TALEN的转基因植物可以首先使用各种方法在与靶基因型嫁接相容的基因型或物种中产生。产生转基因植物的方法可以取决于靶物种。例如，该方法可以包括通过用携带表达构建体的根癌土壤杆菌GV3101、AGL1、18r12v、EHA105、LBA4404、MP90感染宿主植物来产生表达表达构建体的转基因植物。
根癌土壤杆菌是一种用于转化植物细胞并且导致“去除毒力的菌株(disarmedstrain)”的可用性的土壤杆菌属物种，“去除毒力的菌株”能够将单个转移DNA(T-DNA)递送到植物宿主组织，而不引入细菌用于发病机制的另外的T-DNA。去除毒力的菌株被定义为不再携带所谓的肿瘤诱导(Ti)质粒的根癌土壤杆菌菌株，这些肿瘤诱导(Ti)质粒具有用于发病机制的另外的T-DNA。受感染的植物宿主组织可以用于再生和发育能够表达所递送的T-DNA上的基因的转基因品系。T-DNA，诸如来自携带基因组编辑试剂的二元载体的那些T-DNA，可以被递送到宿主植物组织，并且可以在植物组织中表达。TALEN是可以被递送到植物宿主组织的携带基因组编辑试剂的二元载体的一个实例，如在本文进一步论述的。实例不限于经由用根癌土壤杆菌感染来产生转基因植物。在另外的和/或可选的实施方案中，方法100可以包括使用粒子轰击或生根根瘤菌产生表达表达构建体的转基因植物。
如本文使用的，表达构建体是指核酸序列和启动子或者包括核酸序列和启动子，所述核酸序列包括携带基因组编辑试剂(诸如TALEN mRNA)的一个或更多个二元载体。术语‘启动子’是指使基因开启或关闭的DNA的序列或者包括使基因开启或关闭的DNA的序列。在一些实例中，启动子可以是在体内有活性的组成型启动子、可以开启和/或关闭的诱导型启动子、或在韧皮部组织中具有活性的韧皮部特异性启动子。在一些实例中，表达构建体可以包括一个或更多个邮政编码元件(zip-code element)。如本文使用的，邮政编码元件是指顺式作用信号或‘邮政编码’或者包括顺式作用信号或‘邮政编码’，该顺式作用信号或‘邮政编码’允许mRNA序列通过韧皮部转运(例如，韧皮部移动RNA)。邮政编码元件可以包括来自韧皮部移动RNA的非翻译区(UTR)或来自韧皮部移动RNA的全长序列。邮政编码元件的非限制性实例包括赤霉酸不敏感(GAI)mRNA，诸如拟南芥GAI和knotted1样同源盒(KNOX)mRNA、番茄KNOTTED1(LeT6)、马铃薯BEL5、拟南芥tRNAmet(At5g57885)、拟南芥tRNAgly(At5g57885)、拟南芥CENTRORADIALIS(ATC)、马铃薯KNOTTED1(StPOTH1)、南瓜NACP(NAM、ATAF1/3和CUC2)和南瓜GAIP以及其他。根据本公开内容的多种实施方案可以包括基本上相同的特征和属性中的至少一些，包括邮政编码元件和基因序列，如以下参考文献中所论述的，这些参考文献中的每一个在此通过引用以其整体并入，用于它们与邮政编码元件相关的一般教导和与特定基因的序列相关的特定教导：Huang,NC.；Yu,TS.The sequences ofArabidopsis GA-INSENSITIVE RNA constitute the motifs that are necessary andsufficient for RNA long-distance trafficking.Plant J.2009,59,921-929；Kim,M.；Canio,W.；Kessler,S.；Sinha,N.Developmental changes due to long distancemovement of a homeobox fusion transcript in tomato.Science 2001,293,287–289；Banerjee,A.K.；Chatterjee,M.；Yu,Y.；Suh,S.G.；Miller,W.A.；Hannapel,D.J.Dynamicsof a mobile RNA of potato involved in a long-distance signaling pathway.PlantCell 2006,18,3443–3457；Li,C.；Gu,M.；Shi,N.；Zhang,H.；Yang,X.；Osman,T.；Liu,Y.；Wang,H.；Vatish,M.；Jackson,S.；等人Mobile FT mRNA contributes to the systemicflorigen signalling in floral induction.Sci.Rep.2011,1,73；Zhang,W.；ThiemeC.J.；Kollwig G.；Apelt,F.；Yang,Lei.；Winter,N.；Andresen,N.；Walther,D.；Kragler,F.tRNA-Related Sequences Trigger Systemic mRNA Transport in Plants.Plant Cell2016,28,1237-1249；Huang,N.C.；Jane,W.N.；Chen,J.；Yu,T.S.ArabidopsisCENTRORADIALIS homologue acts systemically to inhibit floral initiation inArabidopsis.Plant J.2012,72,175–184；Mahajan,A.；Bhogle,S.；Kang,I.H.；Hannapel,D.J.；Banerjee,A.K.The mRNA of a Knotted1-like transcription factor of potatois phloem mobile.Plant Mol.Biol.2012,79,595–608；Ruiz-Medrano,R.；Xoconostle-Cazares,B.；Lucas,W.J.Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA:Implications for supracellular regulation in plants.Development 1999,126,4405–4419；Haywood,V.；Yu,T.S.；Huang,N.C.；Lucas,W.J.Phloem long-distancetrafficking of GIBBERELLIC ACID-INSENSITIVE RNA regulates leafdevelopment.Plant J.2005,42,49–68。
同样如本文使用的，韧皮部特异性启动子是指靶向韧皮部特异性基因表达的启动子或者包括靶向韧皮部特异性基因表达的启动子。这些启动子元件可以与在韧皮部细胞中特异性表达的基因或来自限于韧皮部的生物体的基因相关。韧皮部特异性启动子的非限制性实例包括蔗糖转运蛋白1(SUT1)、玄参花叶病毒(FMV)、蔗糖转运蛋白2(SUC2)、拟南芥SUC2、番茄SUT1、马铃薯PTB1和土壤杆菌rolC。同样如本文使用的，组成型启动子是指靶向韧皮部特异性基因表达的启动子或者包括靶向韧皮部特异性基因表达的启动子。这些启动子元件可以与跨越植物细胞类型表达的基因相关，并且可以来自非植物来源。组成型启动子的非限制性实例包括35S启动子、2x 35S启动子、胭脂碱合酶(Nos)启动子、VaUbi3以及其他。同样如本文使用的，诱导型启动子是指靶向韧皮部特异性基因表达的启动子或者包括靶向韧皮部特异性基因表达的启动子。这些启动子元件可以与由暴露于外源因子(即β-雌二醇)诱导的基因表达相关，并且可以来自非植物来源。诱导型启动子的非限制性实例包括P16ΔS:sXVE启动子、SUPERR:sXVE启动子以及其他。根据本公开内容的多种实施方案可以包括基本上相同的特征和属性中的至少一些，包括启动子和基因序列，如以下参考文献中所论述的，这些参考文献中的每一个在此通过引用以其整体并入，用于它们与植物遗传学相关的一般教导和与特定启动子的序列相关的特定教导：Srivastava,A.C.；Ganesan,S.；Ismail,I.O.；Ayre,B.G.Functional Characterization of the Arabidopsis AtSUC2Sucrose/H+Symporter by Tissue-Specific Complementation Reveals an EssentialRole in Phloem Loading but Not in Long-Distance Transport.Plant Physiol.2008,148,200-211；Kühn,C.；Hajirezaei,M.R.；Fernie,A.R.,Roessner-Tunali,U.；Czechowski.；Hirner,B.；Frommer,W.B.The Sucrose Transporter StSUT1Localizes toSieve Elements in Potato Tuber Phloem and Influences Tuber Physiology andDevelopment.Plant Physiol.2003,131,102-113；Butler,N.M.；Hannapel,D.J.Promoteractivity of polypyrimidine tract-binding protein genes of potato responds toenvironmental cues.Planta 2012,236,1747-1755；Schmiilling,T.；Schell,J.；Spena,A.Promoters of the rolA,B,and C Genes of Agrobacterium rhizogenes areDifferentially Regulated in Transgenic Plants.Plant Cell 1989,1,665-670；Schlückinga,K.；Edel,K.H.；Drerup,M.M.；P.；Eckert,C.；Steinhorst,L.,Waadt,R.；O.；Kudla,J.A Newβ-Estradiol-Inducible Vector Set that FacilitatesEasy Construction and Efficient Expression of Transgenes Reveals CBL3-Dependent Cytoplasm to Tonoplast Translocation of CIPK5.Mole.Plant 2013,6,1814-1829。
表达构建体可以包括多种核酸片段，这些核酸片段被选择和排列以促进基因组编辑试剂在宿主植物的韧皮部中的长距离转运。例如，表达构建体可以包括TALEN mRNA。在一些实例中，表达构建体可以包括mRNA编码序列和启动子。示例性表达构建体在图3中图示出并且在本文中进一步论述。
因此，用于产生转基因植物的表达构建体可以包括许多组分，诸如mRNA编码序列和启动子。可以使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹来筛选和选择TALEN mRNA和/或蛋白质高表达的个体转基因植物。例如，在一些实例中，包括在表达构建体中的韧皮部移动RNA是GAI。在一些实例中，韧皮部移动RNA可以是KNOX。类似地，在一些实例中，启动子是SUT1。在一些实例中，启动子可以是SUC2。启动子不限于所列出的特定实例。如本文论述的，可以使用不同的启动子。
如关于图3进一步论述的，启动子可以在mRNA编码序列的上游。实例不限于此，并且设想了另外的和/或不同的表达构建体。
方法100在103包括制作穿过至少一个砧木茎的切口。在一些实例中，方法100包括邻近砧木茎上的切口放置稳定装置，尽管实例不限于此。在101产生的转基因植物可以作为砧木被嫁接到野生型植物。取决于物种，这可以在组织培养(即微嫁接)或土壤条件(即传统嫁接)中进行。设备(即稳定装置的选择)、切口类型(即楔形(wedge)与对角线(diagonal))和其他嫁接技术可以取决于物种和嫁接条件。可以使用各种稳定装置，包括但不限于胶带、塑料包裹膜(plastic wrap)、橡皮筋、夹子及类似物或其任何组合。在一些实例中，转基因/野生型嫁接物可以在不使用稳定装置的情况下产生。例如，可以穿过转基因砧木制作“V形”切口，并且可以穿过野生型接穗制作相应的“V形”切口。如本文进一步论述的，切割的接穗可以以不需要稳定装置的这样的方式放置在相应的切割的砧木中(例如，在不使用稳定装置的情况下砧木的切口角度使接穗保持在适当的位置)。
方法100在105包括通过将至少一个切割的接穗茎插入到砧木茎的切口中和/或插入到稳定装置(如果适用)中来产生嫁接的植物，其中至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐。可以在砧木茎和接穗上制作各种类型的切口，并且制作的切口的类型可以取决于物种和嫁接条件。例如，制作穿过至少一个砧木茎的切口可以包括制作穿过至少一个砧木茎的第一成角度切口，以及制作穿过至少一个接穗茎的第二成角度切口，其中穿过至少一个接穗茎的第二成角度切口与穿过至少一个砧木茎的第一成角度切口基本上相似。作为另外的实例，制作穿过至少一个砧木茎的切口可以包括制作穿过至少一个砧木茎的第一楔形切口，以及制作穿过至少一个接穗茎的第二楔形切口，其中穿过至少一个接穗茎的第二楔形切口与穿过至少一个砧木茎的第一楔形切口基本上相似。
方法100在107包括从嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。例如，可以监测嫁接的植物的成功嫁接。成功的嫁接可以分别通过新芽组织(即，新的分生组织、叶、分枝和/或花序)的生长和在嫁接连接处周围的愈伤组织产生来指示。可以对新芽生长物进行取样，用于分别使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹检测TALEN mRNA和/或蛋白质。可以对TALEN靶基因使用扩增子测序来筛选对TALEN mRNA和/或蛋白质呈阳性的芽生长物，以用于检测编辑。取决于物种，对编辑呈阳性的芽生长物可以被进一步无性繁殖或通过种子进一步繁殖，以使个体植物中的编辑稳定化。因此，方法100可以包括从嫁接的植物中筛选具有来自基因组编辑的可检测的转基因mRNA或蛋白质的新的生长物，并且根据可检测的转基因mRNA或蛋白质繁殖组织。
图2是进一步图示出与本公开内容一致的用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的示例性方法200的图。在图2中，方法200包括，在209，通过用根癌土壤杆菌溶液感染宿主植物来产生转基因植物。根据本公开内容，可以通过将mRNA的编码序列定位在启动子的下游将感兴趣的mRNA靶向进行长距离转运。这样的mRNA的实例包括TALEN mRNA，并且被定位在mRNA的编码序列的上游的示例性启动子包括35S启动子和Nos启动子。韧皮部特异性启动子的非限制性实例包括蔗糖转运蛋白1(SUT1)、玄参花叶病毒(FMV)、蔗糖转运蛋白2(SUC2)、拟南芥SUC2、番茄SUT1、马铃薯PTB1和土壤杆菌rolC。
方法200在211包括将转基因砧木嫁接到野生型接穗上。特别地，如关于图1描述的，嫁接方法可以包括对转基因植物的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径的茎的砧木。嫁接方法还可以包括制作穿过至少一个砧木茎的切口，邻近砧木茎上的切口放置稳定装置，以及通过将至少一个切割的接穗茎插入到稳定装置中来产生嫁接的植物，其中至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐。该嫁接的植物包括野生型/转基因异种嫁接物。异种嫁接物可以靶向特定的植物物种，其中异种嫁接物可以被称为转基因种间异种嫁接物。例如，难以遗传修饰的物种或基因型(诸如大豆的MN151品种)可以与不太难以遗传修饰的物种或基因型(诸如大豆的Bert品种)嫁接。在一些实例中，异种嫁接物可以靶向特定的基因型，在这种情况下，异种嫁接物可以被称为转基因基因型间异种嫁接物。如图2中图示出的，通过野生型/转基因嵌合植物促进转基因mRNA和/或蛋白质从转基因砧木转移到野生型接穗。
方法200在213包括将TALEN mRNA和/或蛋白质转运到新的接穗生长物。可以对新芽生长物进行取样，用于分别使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹检测TALENmRNA和/或蛋白质。异种嫁接植物中的编辑程度可能与库组织中转基因mRNA和/或蛋白质的丰度直接有关，并且可以使用各种mRNA和蛋白质检测方法来追踪。例如，可以测定异种嫁接植物的新的芽组织(即，新的叶、分枝和/或花序)中转基因RNA和/或蛋白质的积累。可以对新芽生长物进行取样，用于分别使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹检测TALENmRNA和/或蛋白质。可以使用TALEN靶基因的扩增子测序来筛选对TALEN mRNA和/或蛋白质呈阳性的芽生长物，以用于检测编辑。因此，方法200可以包括从嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。方法200在215可以包括取决于物种，移植对编辑呈阳性的芽生长物和/或收获种子，并且筛选繁殖的种子以获得个体植物中的编辑。
本公开内容的多个实例包括通过关于图1描述的方法100和/或关于图2描述的方法200产生的非天然存在的植物。类似地，本公开内容涉及通过关于图1描述的方法100和/或关于图2描述的方法200产生的非天然存在的种子、生殖组织或营养组织。本公开内容还涉及通过关于图1描述的方法100和/或关于图2描述的方法200产生的野生型/转基因植物。例如，与方法100和方法200一致，可以通过无DNA基因组编辑技术产生非天然存在的植物。
图3A是图示出与本公开内容一致的用于递送基因组编辑试剂的示例性表达构建体300的图。图3A图示出了包含mRNA编码序列321和启动子317的表达构建体300。所使用的mRNA编码序列的非限制性实例可以包括靶向甘氨酸最大脂肪酸去饱和酶3(GmFAD3)基因、大麻八氢番茄红素去饱和酶(CsPDS)基因和马铃薯八氢番茄红素去饱和酶(StPDS)基因的TALEN mRNA序列。在一些实例中，表达构建体300可以包括来自韧皮部移动RNA的邮政编码元件(未图示出)。例如，一个或更多个邮政编码元件可以被掺入在mRNA编码序列的上游、mRNA编码序列321的下游或两者。如可以理解的，上游可以包括与参考序列相比靠近和/或更接近启动子317的5’末端的位置。相反地，下游可以包括与参考序列相比靠近和/或更接近终止子序列325的3’末端的位置。
如关于图2论述的，邮政编码元件可以来自不同的韧皮部移动RNA和/或来自相同的韧皮部移动RNA。此外，邮政编码元件中的每一个可以是来自韧皮部移动RNA的UTR或全长序列。作为非限制性实例，韧皮部移动RNA是GAI和/或KNOX。作为非限制性实例，启动子是SUT1和/或SUC2。
图3B图示出了包括与可检测的标志物323偶联的启动子317的示例性表达构建体300。可检测的标志物的非限制性实例包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或荧光蛋白报告物诸如RFP或YFP。
根据基础临时申请，即2020年10月7日提交的并且标题为“Grafted Plant forDelivery of Genome Editing Reagents”的美国临时申请第63/088,800号实施多种实施方案，要求保护该临时申请的权益，并且其通过引用整体地完全并入本文。除非特别说明，否则该临时申请中论述的实施方案不旨在以任何方式限制总体技术公开内容或要求保护的本发明的任何部分。
本文引用的出版物以及其引用的主题在此特定地通过引用以其整体并入。
技术人员将认识到，除非另有指示，否则如在说明书(包括权利要求书)中使用的各种术语意味着本领域中的简单含义。如本文使用的，术语“包括(comprise(s))”、“包括(include(s))”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以”、“包含(contain(s))”及其变体意图是不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。本公开内容还设想“包括(comprising)”本文呈现的实施方案或要素、“由本文呈现的实施方案或要素组成”和“基本上由本文呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地阐述。
基于上文的论述和图示，本领域技术人员将容易认识到，可以对各种实施方案进行各种修改和改变，而无需严格遵循本文所示出和描述的示例性实施方案和应用。例如，如在图中例示的方法可以包括以各种顺序执行的步骤，其中保留本文中的实施方案的一个或更多个方面，或者可以包括更少或更多的步骤。这样的修改并不脱离本公开内容的各个方面，包括权利要求书中阐述的方面的真实精神和范围。
公开了这样的材料、组合物和组分，所述材料、组合物和组分可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物、或者是所公开的方法和组合物的产物。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，各种单独的和集体的组合中的每一种被具体地设想，即使这些化合物的每一个单独组合和排列的具体参考可能没有被明确地公开。该概念适用于本公开内容的所有方面，包括但不限于所描述的方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的特定要素可以组合或替代其他实施方案中的要素。例如，如果存在可以进行的多个另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤中的每一个可以用所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集被具体地设想，并且应该被认为是公开的。另外，应当理解，本文描述的实施方案可以使用任何合适的材料诸如本文别处描述的材料或本领域已知的材料来实现。
实验/更详细的实施方案
如下文结合实验实施方案进一步说明的，基因组编辑试剂可以经由嫁接的植物递送。根据本公开内容的各种实施方案可以包括如以下参考文献中所论述的基本上相同的特征和属性中的至少一些，这些参考文献中的每一个在此通过引用以其整体并入，用于它们与植物遗传学相关的一般教导和与转基因植物的制备相关的特定教导：Li S,Cong Y,LiuY,Wang T,Shuai Q,Chen N,Gai J,Li Y.Optimization of Agrobacterium-mediatedtransformation in soybean.Front.Plant Sci.2017年2月；https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00246；Han EH,Goo YM,Lee MK,Lee SW.An efficient transformationmethod for a potato(Solanum tuberosum L.var.Atlantic).J PlantBiotechnol.2015；42:77-82；Feeney M,Punja ZK.Tissue culture and Agrobacterium-mediated transformation of hemp(Cannabis sativa L.).In vitro Cell.Dev.Biol.—Plant.2003年11月-12月；39:578-585。
与以下方案一致，转基因大豆品系被微嫁接到野生型以用于基因组编辑。在实验之前2-3周，野生型和转基因大豆种子通过将种子放入在250mL烧杯中具有约100mL漂白剂的9L干燥器室中来灭菌。缓慢地添加约3.5mL浓HCL，并且将干燥器室保持关闭约16小时以用于氯气灭菌。在使用种子之前，允许氯气消散。将灭菌的种子转移到具有MS(Murashige&Skoog)培养基的PhytatraysTM，浸没种子并使种子种脐朝下。将种子放置在16小时/8小时的光/暗(75流明，约28℃)下。在幼苗达到V2阶段(营养2节)后，用无菌手术刀和无菌技术从所有幼苗中去除子叶和完全出现的叶子。通过以45度对角线切下在第二节的远轴的芽从野生型幼苗制备接穗插条。通过以45度对角线切下在子叶节的远轴的芽从转基因幼苗制备砧木插条，同时将砧木保持在培养基中。放置与砧木的切割端的直径相匹配的无菌嫁接夹子或胶带，使得至少0.5cm的夹子或胶带与切割端的每一侧重叠。将接穗的切割端插入以与砧木的切割端接触，使用嫁接夹子或胶带固定接穗。根据需要使用嫁接桩来固定接穗并保持与砧木的直接接触。将PhytatraysTM关闭并放置在16小时/8小时的光/暗(75流明，约28℃)下，直到愈伤组织在嫁接物内形成并观察到新的营养生长物(嫁接物组：约1-2周)。对新芽生长物进行取样，并且在组织培养物或土壤中繁殖以分离单独的经基因组编辑的品系。
与以下方案一致，将转基因马铃薯和工业大麻品系微嫁接到野生型以用于基因组编辑。在实验之前约3-4周，使用植株芽尖和无菌技术在具有MMS(改良的Murashige&Skoog)的MagentaTM盒中繁殖组织培养野生型植株和转基因植株。将植株放置在16小时/8小时的光/暗(75流明，约23℃)下。在植株达到5节阶段后，移除基部至第4节的完全出现的叶，留下单个节的完全出现的叶和顶端分生组织。通过在任一侧上进行60度切割形成矛状切割端来切下在第4节的远轴的芽，从野生型植株制备接穗插条。通过在切割表面的中间进行垂直切割产生V形切口来切下在第2节的远轴的芽，同时将砧木保持在培养基中，从转基因植株制备砧木插条。放置与砧木的切割端的直径相匹配的无菌嫁接夹子或胶带，使得至少0.5cm的夹子或胶带与切割端的每一侧重叠。将接穗的切割端插入到砧木的切割端中，并且使用嫁接夹子或胶带固定。根据需要使用嫁接桩来固定接穗并保持与砧木的直接接触。将MagentaTM盒关闭并放置在16小时/8小时的光/暗(75流明，约23℃)下，直到愈伤组织在嫁接物内形成并观察到新的营养生长物(嫁接物组：约1-2周)。对新芽生长物进行取样，并且在组织培养物或土壤中繁殖以分离单独的经基因组编辑的品系。
与以下方案一致进行转基因工业大麻品系与野生型的土壤嫁接以用于基因组编辑。在实验之前约2-3周，工业大麻野生型植物和转基因植物在具有用Clonex工作溶液(Hydrodynamics International:CCS)饱和的有机珍珠岩培养基(Espoma)的6英寸盆中使用浸泡在Hormodin(Olympic Horticultural Products)中的芽插条和消毒工具进行繁殖。将繁殖的植物放置在16小时/8小时的光/暗(75流明，约23℃)下。在植株达到5节阶段后，移除基部至第4节的完全出现的叶，留下单个节的完全出现的叶和顶端分生组织。通过在任一侧上进行60度切割产生矛状切割端来切下在第4节的远轴的芽，从野生型植株制备接穗插条。通过在切割表面的中间进行垂直切割产生V形切口来切下在第2节的远轴的芽，同时将砧木保持在培养基中，从转基因植物制备砧木插条。放置与砧木的切割端的直径相匹配的无菌嫁接夹子或胶带，使得至少1cm的夹子或胶带与切割端的每一侧重叠。将接穗的切割端插入到砧木的切割端中，并且使用嫁接夹子或胶带固定。根据需要使用嫁接桩来固定接穗并保持与砧木的直接接触。将嫁接的植物放置在16小时/8小时的光/暗(75流明，约23℃)下，直到愈伤组织在嫁接物内形成并观察到新的营养生长物。对新芽生长物进行取样，并且在组织培养物或土壤中繁殖以分离单独的经基因组编辑的品系。
使用以下方案制备MS培养基(PhytatraysTM或板)，以产生1L的培养基：
1600ml的ddH2O；
10g的蔗糖；
4.43g的MS基础盐+维生素(Phytotech,M519)；
用1000ml的ddH2O使溶液达到体积；
通过KOH的滴定将pH调节至5.7；
3.58g的GelzanTM(Phytotech,G3251)；
将培养基在液体循环中高压灭菌25分钟，冷却至55℃，并且每个PhytatrayTM或100×25mm板倾倒100mL。
使用以下方案制备MMS培养基(Magenta boxesTM)，以产生1L的培养基：
800ml的ddH2O；
25g的蔗糖；
4.43g的MS基础盐+维生素(Phytotech,M519)；
用1000ml的ddH2O使溶液达到体积；
通过KOH的滴定将pH调节至5.7；
7.5g的琼脂(Phytotech,A296)；
将培养基在液体循环中高压灭菌25分钟；
0.8ml的头孢噻肟(250mg/ml)；
0.1ml的6-BAP(1mg/ml)；
将培养基冷却至55℃，并且每个Magenta boxesTM(Sigma,V8505)倾倒100mL。
图4A、图4B、图4C和图4D图示出了与本公开内容一致的产生微嫁接的马铃薯植物的阶段。图4A图示出了包括转基因砧木和野生型接穗的嫁接的马铃薯植株。图4B图示出了如本文描述的具有偶联的(coupled)转基因砧木和野生型接穗的嫁接的马铃薯植株。图4C图示出了在嫁接之后1-2周的嫁接的马铃薯植株，图4D图示出了在转移到土壤之后2周的嫁接的马铃薯植株。
图5图示出了与本公开内容一致的从进行的多种嫁接实验获得的数据。特别地，图5图示出了St123-3(一种Ranger Russet衍生的马铃薯品种)、Jack大豆品种和Bert大豆品种在组织培养中的嫁接成功百分比。数据示出了如上文论述的与转基因植物成功嫁接的各个品种的百分比。对于St123-3嫁接物，所有嫁接的植物的约60％继续繁殖新芽生长物，如图4中图示出的。对于Jack嫁接物，所有嫁接的植物的约100％继续繁殖新芽生长物，如图4中图示出的。对于Bert嫁接物，所有嫁接的植物的约100％继续繁殖新芽生长物，如图4中图示出的。
图6A和图6B图示出了与本公开内容一致的嫁接的大豆植物的砧木中的转基因基因表达。具体地，图6A图示出了产生表达TALEN的嫁接的大豆植物，如关于图3A论述的。图6B图示出了对照实验，其中嫁接的大豆植物的转基因砧木在没有TALEN和具有GUS标志物的情况下产生，以指示mRNA和/或蛋白质的移动。如图6B中图示出的，在没有TALEN的情况下，标志物mRNA和/或蛋白质被固结在转基因砧木组织中，这导致植物的下部部分的蓝色染色。
图7A、图7B和图7C图示出了与本公开内容一致的嫁接的工业大麻植物的砧木中的转基因基因表达。具体地，图7A图示出了使用TALEN产生微嫁接的工业大麻植物，如关于图3A论述的。图7B图示出了黄色荧光蛋白(YFP)表达，指示在嫁接的工业大麻植物的转基因砧木中的TALEN表达。图7C图示出了对照实验，其中嫁接的工业大麻植物的转基因砧木在没有TALEN和具有GUS标志物的情况下产生，以指示mRNA和/或蛋白质的移动。如图7C中图示出的，在没有TALEN的情况下，标志物mRNA和/或蛋白质被固结在转基因砧木组织中，这导致植物的下部部分的蓝色染色。
图8A、图8B和图8C图示出了与本公开内容一致的嫁接的工业大麻植物中野生型接穗组织的基因组编辑的结果。图8A图示出了嫁接的工业大麻植物，其中顶部是野生型接穗并且底部是转基因砧木。图8B图示出了在图8A中图示出的嫁接的工业大麻植物的接穗中检测到的基因组编辑的百分比的比较。具体地，图8B的下半部分图示出了在野生型大麻(Cannabis sativa)对照样品的接穗中检测到的基因组编辑的百分比，而图8B的上半部分图示出了在图8A中图示出的嫁接的大麻植物中检测到的基因编辑的百分比。转基因砧木包括Nos启动子和靶向CsPDS基因的TALEN mRNA序列。如图8B中图示出的，嫁接的大麻展示出2.50％的编辑，而野生型大麻没有展示出任何编辑。这些结果在图8C中进一步图示出，其图示出通过从图8A中图示出的嫁接的植物的接穗组织获得的扩增子测序读段检测到的基因组编辑。
图9A、图9B、图9C、图9D、图9E、图9F、图9G、图9H、图9I和图9J图示出了与本公开内容一致的嫁接的大豆植物的组织中的基因组编辑的结果。图9A图示出了嫁接的大豆植物，具有如本文所描述地产生的野生型接穗(Jack或Bert)和转基因砧木(Gm1559)。图9H、图9I和图9J图示出了存在于对照组织的三个FAD3基因(FAD3a、FAD3b和FAD3c)中的基因组编辑的量和组成。具体地，图9H图示出了存在于Gm1559转基因对照的FAD3a基因中的基因组编辑的组成，图9I图示出了存在于Gm1559转基因对照的FAD3b基因中的基因组编辑的组成，并且图9J图示出了存在于Gm1559转基因对照的FAD3c基因中的基因组编辑的组成。在图9H和图9I中，转基因对照包括由饼图的蓝色组成部分表示的基因组编辑。图9J图示出了转基因对照中的基因组编辑，由饼图的蓝色部分、橙色部分和灰色部分表示。
图9B、图9C、图9D、图9E、图9F和图9G图示出了在如图9A中图示出的嫁接的植物的野生型接穗中检测到的基因组编辑的组成。特别地，图9B图示出了当Jack大豆品种被嫁接到Gm1559转基因砧木时在FAD3a基因中检测到的基因组编辑。结果是在野生型接穗中检测到图9H中表示的基因组编辑(例如，饼图的蓝色部分)，但是检测到另外的基因组编辑，由图9B中图示出的饼图的绿色部分、黑色部分和黄色部分表示。类似地，图9C图示出了当Jack大豆品种被嫁接到Gm1559转基因砧木时在FAD3b基因中检测到的基因组编辑。结果是在野生型接穗中检测到图9I中表示的基因组编辑(例如，饼图的蓝色部分)，但是检测到另外的基因组编辑，由图9C中图示出的饼图的绿色部分和灰色部分表示。类似地，图9D图示出了当Jack大豆品种被嫁接到Gm1559转基因砧木时在FAD3c基因中检测到的基因组编辑。结果是在野生型接穗中检测到图9J中表示的基因组编辑的部分(例如，饼图的蓝色部分、橙色部分和灰色部分)，由图9D中图示出的饼图的蓝色部分和灰色部分表示，但是以不同的量。
图9E图示出了当Bert大豆品种被嫁接到Gm1559转基因砧木时在FAD3a基因中检测到的基因组编辑。结果是在野生型接穗中检测到图9H中表示的基因组编辑(例如，饼图的蓝色部分)，但是检测到另外的基因组编辑，由图9E中图示出的饼图的绿色部分和灰色部分表示。类似地，图9F图示出了当Bert大豆品种被嫁接到Gm1559转基因砧木时在FAD3b基因中检测到的基因组编辑。结果是在野生型接穗中检测到图9I中表示的基因组编辑(例如，饼图的蓝色部分)，但是检测到另外的基因组编辑，由图9F中图示出的饼图的绿色部分和灰色部分表示。类似地，图9G图示出了当Bert大豆品种被嫁接到Gm1559转基因砧木时在FAD3c基因中检测到的基因组编辑。结果是在野生型接穗中检测到图9J中表示的基因组编辑的部分(例如，饼图的蓝色部分、橙色部分和灰色部分)，但是检测到另外的基因组编辑，由图9G中图示出的饼图的绿色部分表示。

Claims (15)

1.一种用于产生用于递送基因组编辑试剂的嫁接的植物的方法，包括：
对培养的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径和基因型的茎的砧木；
制作穿过至少一个砧木茎的切口并且邻近所述砧木茎上的所述切口放置稳定装置；
通过将至少一个切割的接穗茎插入到所述稳定装置中来产生嫁接的植物，其中所述至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐；以及
从所述嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由所述表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。
2.根据权利要求1所述的方法，包括产生以与所述切割的接穗茎的基因型嫁接相容的基因型表达所述表达构建体的转基因植物。
3.根据权利要求1所述的方法，包括通过用携带所述表达构建体的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染宿主植物来产生表达所述表达构建体的转基因植物。
4.根据权利要求1所述的方法，包括通过用携带所述表达构建体的生根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)感染宿主植物来产生表达所述表达构建体的转基因植物。
5.根据权利要求1所述的方法，包括使用粒子轰击产生表达所述表达构建体的转基因植物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中制作穿过所述至少一个砧木茎的所述切口包括制作穿过所述至少一个砧木茎的第一成角度切口，所述方法还包括制作穿过所述至少一个接穗茎的第二成角度切口，其中穿过所述至少一个接穗茎的所述第二成角度切口与穿过所述至少一个砧木茎的所述第一成角度切口基本上相似。
7.根据权利要求1所述的方法，其中制作穿过所述至少一个砧木茎的所述切口包括制作穿过所述至少一个砧木茎的第一楔形切口，所述方法还包括制作穿过所述至少一个接穗茎的第二楔形切口，其中穿过所述至少一个接穗茎的所述第二楔形切口与穿过所述至少一个砧木茎的所述第一楔形切口基本上相似。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)mRNA，并且其中从所述嫁接的植物中筛选所述新的生长物包括对新芽生长物进行取样，用于使用终点逆转录酶PCR(RT-PCR)或蛋白质印迹检测所述TALEN mRNA和/或蛋白质。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体包括：
mRNA编码序列；和
启动子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述启动子是35S启动子。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述启动子是胭脂碱合酶(Nos)启动子。
12.一种非天然存在的植物、植物细胞或植物部分，通过基因组编辑技术产生，所述基因组编辑技术包括：
通过用根癌土壤杆菌溶液感染宿主植物来产生转基因植物，所述根癌土壤杆菌溶液包括：
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)信使核糖核酸(mRNA)编码序列；和
启动子；
对所述转基因植物的砧木组织进行分级，以获得至少一个表达表达构建体并具有带有嫁接相容的直径的茎的砧木；以及
通过将至少一个切割的接穗茎插入到稳定装置中来产生嫁接的植物，其中所述至少一个切割的接穗茎基本上与切割的砧木茎内的维管组织对齐。
13.根据权利要求12所述的非天然存在的植物，其中所述基因组编辑技术包括制作穿过至少一个砧木茎的切口并且邻近所述砧木茎上的所述切口放置稳定装置。
14.根据权利要求12所述的非天然存在的植物，其中所述基因组编辑技术包括从所述嫁接的植物中筛选新的生长物以获得由所述表达构建体的基因组编辑产生的基因编辑。
15.根据权利要求12所述的非天然存在的植物，其中所述mRNA编码序列包括甘氨酸最大脂肪酸去饱和酶3(GmFAD3)基因、大麻八氢番茄红素去饱和酶(CsPDS)基因或马铃薯八氢番茄红素去饱和酶(StPDS)基因。
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