CN1174240C - 用于测定生物流体和组织悬浮液中脂质类物质过氧化作用的方法及装置 - Google Patents

用于测定生物流体和组织悬浮液中脂质类物质过氧化作用的方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于测定生物流体和组织悬浮液中脂质过氧化程度的方法及装置(2)，其中加热专门制备的含有脂质的样品，以便引发热化学发光光线，该光线由样品发射并增强到可由特殊目的的光检测器(18)测到的光量。通过测定该光线可得出过氧化物的含量，并由此准确评估脂质的过氧化作用。

Description

用于测定生物流体和组织悬浮液中脂质类物质过氧化作用的方法及装置
                        发明背景
1、发明领域
本发明涉及一种用于评估生物尤其是人的体液和人的组织悬浮液中脂质过氧化程度的方法及装置。然而应该理解，本发明还可用于测定含有脂质的其他物质中脂质的过氧化作用。
2、现有技术描述
许多维持生命的代谢反应都需要氧。氧的活性形式(自由基)作用于不饱和脂肪酸上，通常可产生脂质过氧化物。将氧分子引入双键中，由此可完成对不饱和脂肪酸的氧化作用。在反应过程中，顺式双键部位被转化成共轭双键，由此产生了具有共轭双键的氢过氧化物形式的脂质过氧化物。
当在光敏氧化反应中将氧分子直接引入饱和或不饱和脂肪酸中时，可产生具有或没有共轭双键的脂质氢过氧化物。在裂解和聚合反应中，作为由氧化作用衍生的初产物的脂质氢过氧化物可产生不同类型的次级氧化物。
氧及其活性中间体可与细胞成分发生反应，最终使分子分解或失活。
能够化学或代谢产生活性氧种类例如超氧化基、氢过氧化物、脂质过氧化物或相关形式的胞内或胞外条件已知称为氧化应力。正常情况下，细胞的代谢活性可控制或阻止氧化应力的副作用。氧化应力的敏感性是发挥氧化应力的因素和具有抗氧化能力的因素之间全面平衡的结果。
由自由基诱发的对膜脂质的过氧化性损坏一直被认为是导致细胞损伤的关键性引发事件。在自由基或自由基引发剂的存在下，含有相当高比例的多不饱和脂质的生物材料尤其是细胞膜易于被氧化。
因此脂质的过氧化过程关系到膜多不饱和脂肪酸的损失以及氢过氧化物、自由基中间体和其他次级产物的形成。必需脂肪酸的过氧化作用可干扰生物膜的精细结构并由此影响膜的渗透性和功能。当脂质的过氧化过程不能停止时，则可引起细胞膜的破裂和破坏产物的释放。其结果是，这些过程使细胞产生无法挽救的损失，并且可引发和/或加速损伤和疾病的某些发病状态。
利用细胞内已经存在的许多抗氧化防御体系或者向细胞注入来自外界的不同形式的人工抗氧化剂，可阻止氧及其活性中间体的潜在副作用。
因此需要一种简便、灵敏和可靠的用于测定生物尤其是人的体液及组织中脂质过氧化程度的方法来作为研究诸如营养失调、遗传疾病、心血管疾病、癌症、糖尿病和成人呼吸窘迫综合症(ARDS)等等这些疾病的病理学的重要工具。
过氧化物的分解以化学发光的形式来释放能量。事实上已获得化学发光强度与氢过氧化物分解速率之间的相关性。在热化学发光(简称为TCL)过程中通过加热可诱发化学发光。
TCL现象主要是通过以下两种基本类型的反应引起的。
I、以下证实了dioxatans-环过氧化物的热分解：
Figure C9881350700071
              
II、在加热过程中脂质基团的氧化：
              
              
其中
1O2--单体氧
C＝O*--不稳定的羰基化合物
ROO0--脂质过氧基团
这两种反应展示了脂质物质的能力，这些脂质物质存在于生物流体和组织中，通过自由基氧化链反应而发生反应，从而形成不稳定的羰基产物。
由不同来源的羰基部分的不稳定性所产生的低强度化学发光可在400-600nm的可见光范围内检测到。多数用于测定脂质过氧化程度的常规方法，例如熟知的TBA-RS脂质过氧化试验，并不依赖于化学发光。在Miyazawa等人的美国专利4,900,680中所描述的方法是，使含有脂质类物质的样品进行脂质色谱分离，从而将脂质类物质分成若干个脂质种类，随后与发光试剂接触，从而产生相应于脂质氢过氧化物含量的光量。
与本发明最相关的公知方法是用于测定生物流体的发光性的方法及装置，如Shnizer等人的德国待公开专利4421792中所述，在此一并作为参考文献。在该文献中，所描述的用于制备生物流体的方法包括在一定温度下于真空中加热样品，所述温度在样品的冷冻点和足以使试验流体发射冷光的温度之间的范围内。
不幸的是，这个公知方法不能以可靠的方式测定发光强度并获得TCL强度与时间的稳定相关性。其原因是冷冻样品的结构不连贯并且含有与液相抽空有关的空隙。其他原因是相对减慢了样品的加热，从而没有留下足够的时间来测定TCL。
因此，很容易想到需要一个方案来解决可靠测定LPX程度的难题。
3、发明简述
本发明的主要目的是提供一种足以减小或解决上述难题的用于测定TCL的方法及装置。
具体地说，本发明的主要目的是提供一种新颖和改进的用于测定脂质过氧化程度的方法和装置，本发明能够可靠测定TCL并获得TCL强度与时间之间的稳定相关性。
以下结合本发明的实质性特点并参照不同的实施方案可获知本发明的上述和其他目的及优点。
在本发明的用于测定生物流体、生物组织悬浮液或类似流体中的脂质过氧化作用的方法的一个实施方案中，加热所述流体或悬浮液样品，以便引发其中的热化学发光(TCL)并测定所述TCL的量，所述方法包括以下步骤：
a)提供一个具有平底且用于容纳所述样品的贮器；
b)将所述样品加入到所述贮器中；
c)使所述贮器与一由高热导性材料制成的基底接触；
d)使所述贮器做往复运动，以便以均匀的方式在所述贮器的底部上分布所述样品；
e)通过减压处理对所述样品进行干燥一段时间，其中不使所述样品冷冻而且无需增加热，该段时间足以从所述样品中除去液体并形成一个由干燥固体构成的连续薄膜；
f)将所述干燥固体薄膜加热至足以引发热化学发光的温度；
g)在一段时间内传感并测定所述热化学发光，这段时间应足以获得热化学发光的强度与时间之间的稳定相关性。
按照本发明的一个优选实施方案，所述贮器是由薄金属箔构成的一次性容器，而且所述平台是由铝制成的。
按照另一优选实施方案，使所述样品至少进行40秒钟往复运动，以使所述样品在所述贮器底部上分布成厚度为0.3-0.5mm的薄层。
按照再一个优选实施方案，所述升华步骤是在不超过2mbar的减压下完成的并且这段时间不超过10分钟。
在又一优选实施方案中，在将所述贮器放到所述平台上之前，将所述平台加热到至少60℃的温度。
在与本发明方法有关的另一优选实施方案中，在至少30秒的时间内在400-600nm的范围内测定所述TCL强度。
在本发明的用于测定生物流体、生物组织悬浮液或类似流体中的脂质过氧化作用的装置的第一优选实施方案中，加热所述流体或悬浮液样品，以便引发其中的热化学发光(TCL)并测定所述TCL的量，所述装置包括：
用于由样品中抽空液体的抽空装置，
一贮器和用于接纳该贮器的升华室，所述贮器内装有所述样品，所述升华室带有一盖子并用该盖子密封而且与所述抽空装置连通，由此不使样品冷冻而且不向样品增加热，所述升华室包括
i)由高热导性材料制成的基底，和
ii)用于使所述贮器做往复运动的驱动装置；
加热室，其配有用于加热所述贮器的装置以及用于测量干燥样品的热化学发光的装置；
用于显示所述热化学发光的测定结果的数据显示单元；以及
控制和数据处理单元，用于控制所述驱动装置、所述抽空装置、所述加热装置、所述用于测定热化学发光的装置以及所述数据显示单元。
按照本发明装置的一个优选实施方案，所述升华装置包括能够在升华室内产生减压的真空泵。
按照另一优选的实施方案，所述基底是由铝制成的盘，该盘由将所述盘与所述升华室基座连接起来的弹性管件支撑着，而所述驱动装置包括通过凸轮使所述平板做往复运动的电机。
按照本发明装置的又一优选实施方案，所述加热装置包括晶体管和温度传感器，而所述用于检测和测定TCL的装置包括光电倍增器。
以上只是简单地总结了本发明的不同实施方案。为了更好地理解本发明及其优点，以下参照附图来描述本发明的实施方案。
                       附图简述
图1a、b示意性地示出了按照本发明的用于测定脂质过氧化程度的装置和用于保存生物流体样品的贮器。
图2a、b分别是升华室的纵向截面和局部剖面顶视图。
图3是按照本发明用于测定脂质过氧化程度的方法的流程图。
图4是表示按照现有技术方法得到的TCL强度与时间的相关性的图表。
图5a、b示出了两条代表按照本发明的方法获得的TCL强度与时间的相关性的曲线。
                  优选实施方案的详细描述
参照图1a，按照本发明的用于测定TCL的装置包括样品制备单元1和测定单元2。参照图1b，将少量(典型的是150ml)要检验脂质过氧化含量的生物流体样品放入贮器3中，贮器3优选的是具有典型直径为5cm平底的一次性小池。
将上述含有液体样品的小池放入样品制备单元即圆柱形升华室4中，通过O形环密封件5，一个盖子(未示出)紧紧地盖在该升华室上，从而使室内相对于外界来说是密封的。
在室内有一电机6利用托架6’刚性安装到该室的机座上。利用穿过该室的机座上的开口7的电线而给电机充电。电机轴8利用固定螺杆9’承载连接在其上的凸轮9。在支撑件10上有一基本上是平坦的板子11，平板11的上侧有一凹处12用于将贮器3纳入其中。平板下侧具有圆柱形通孔13，通孔13直径的选择应使凸轮进入通孔并且当电机转动凸轮时可带动平板做往复运动。
支撑件10是由弹性材料制成的薄管，从而当凸轮驱动平板时平板可基本上平坦地进行往复运动。将装有生物流体样品的贮器放入平板的凹处12中并启动电机，以便使平板做往复运动并由此摇晃样品。可选择摇晃动作的频率和幅度，以便使样品液体层在贮器底部基本上达到均匀分布。实际上摇晃过程应该在40-60秒钟内完成，以便在摇晃之后使样品层的厚度为0.3-0.5mm。前述试验性测定的样品液体层厚度实质上避免了样品液体气泡的形成和它们对摇晃之后进行的干燥(升华)步骤(以下更详细地描述)的影响。
如果适当地完成摇晃步骤，那么在即将到来的升华步骤之后可得到均匀分布在贮器底部上的连续薄膜形式的干燥残留物(升华物)。
在减压下于升华室内进行干燥(升华)过程，利用通过开口14与室内相联的真空泵(未示出)来停止和维持升华过程。一个通过开口15与室内相联的适宜的真空传感装置还可测定升华室内的现时压力。业已通过试验发现，升华过程为了得到减压而需要的合理的时间段与能够可靠测定TCL的升华残留物所需要的性质之间应该具有一个平衡。这些性质包括残留物薄膜中干燥物的量，即应该至少为99.9％并且不存在与升华过程中流体气泡有关的空隙。
业已通过试验发现，如果对所述室抽真空1-3分钟以便使压力降到至少2mbar并且这个压力可维持至少6-8分钟，那么则可得到短期升华过程的最好结果和能够最可靠测定TCL的升华样品的工作性质。为了此目的，优选使用泵速为20l/min、最终压力为1×10-3托的机械真空泵。为了避免较高的升华速率而导致升华样品冷冻，平板11由具有高热导性的材料例如金属制成。因此可容易地理解，当装有样品的贮器放入平板的凹处12内时，它们彼此之间可得到热接触并且由于平板的高热导性在升华过程中没有样品冷冻。实践中优选的是用具有较好的热导性和较好的加工性的铝制造平板。然而热导性、加工性和成本与铝相符的其他金属或非金属材料也是可用的。
升华过程完成之后，关闭真空泵并通过开口16使室与外界环境相通，以便使室内的压力恢复到正常压力。
打开盖子，将装有升华样品的贮器从样品制备单元1转移到测定TCL的测定单元2的处理至20中。
处理室配有用于将装有冷冻样品的贮器放在光学检测装置18之下的平板17、用于加热平板的加热装置19以及用于测定平板温度的传感装置21。与将平板上的冷冻样品与平板一起加热以便引发TCL的本领域中的已有技术相反，在本发明中，样品是放在已经加热的平板上，而平板在放置贮器之前已被加热到某一温度。
业已得知，非常优选的是利用大功率晶体管作为加热装置。晶体管的温度可由安装在晶体管主体上的传感器来调节。由于晶体管的快速响应时间，可维持对于适宜的发光度测定来说极为紧要的稳定温度范围。实践中在将贮器放入处理室内并放在平板上之前将平板加热到大约60℃的温度。
利用光学检测装置18例如常规的光电倍增器来分析样品，从而能够在300-650nm的可见光范围内测定TCL强度。
可在测定样品发射的TCL之前和之后测定由高频二极管标准信号振荡器产生的校准信号并由放大器23倍增。
放大倍增器阳极输出的信号被放大并输送到作为数据接收终端的计算机中，同时记录时间和所发射的发光光线强度。利用数学方法处理所得到的TCL曲线并提供两个用于处理的主要参数；1)TCL振幅和2)TCL曲线斜率，这两个参数是在将样品放在热板上之后的120-140秒钟之间测定的。这段时间之后终止测定。在控制和数据处理单元24内利用通常公知的信号处理方法来进行分析结果的处理和数学处理。
在数据记录单元25的计算机屏幕和/或打印机上展示TCL的强度测定值与时间的关系曲线的结果。电源26用于提供驱动该装置所需的电能。
现在参照图4-5a、b和下面的非限定性例子，将展示按照本发明的TCL测定是如何完成的以及在实践中如何优选地利用这些测定结果与已有技术方法相比较。
在图4中，示出了按照升华样品与平板同时加热的已有技术方法测定的TCL与时间的典型关系曲线。可容易地理解，该关系曲线不具有单调性并包括两部分。第一上升部分与样品的加热有关并与发光的引发相对应。第二部分与或多或少得到的由样品发射的发光量有关。根据这部分曲线的形状，难以得到发光速率，而看到TCL强度随着时间的推移没有发生明显的变化，因此不可能明确地预测该关系曲线的趋势。
在以下的非限定性实施例1中描述了如何利用按照本发明的TCL测定值来测定急性呼吸窘迫综合症病人的脂质过氧化程度。
                         实施例1
已经检验了12份来自急性呼吸窘迫综合症(ARDS)病人的支气管肺泡灌洗液(BALF)的样品。
所有病人由于超过2.5的肺损伤比数的影响都患有严重的肺机能障碍并且利用增压换气设备进行机械换气。对照组包括6个具有正常呼吸运动的病人。病人在接受广泛的腔体(cavity)治疗之后再进行术后阻滞，随后除管2-4小时。在除管之前已经完成了TCL分析。
将具有150ml BALF的小池放入本装置的升华室内，再放到平板上并水平摇晃40秒钟，以便将样品均匀地分布在小池底部上。然后抽空该室，从而使其中的压力减至2mBar。使该压力维持6-8分钟一直到在小池底部形成0.3mm厚度的BALF干燥残留物的连续薄膜为止。将小池放入测定室并放在已预先加热到80℃的热板上。
利用所购得的光电倍增器进行TCL测定。结果如图5a、b所示。
对照组病人的BALF TCL(图5a)的特征在于由负斜率限定出TCL的下降强度。而ARDS病人的TCL动力曲线(图5b)的特征在于一个非常确定的正斜率限定出TCL强度的直接增加。业已发现，TCL强度的雪崩式增加与ARDS病人的BALF中高脂质过氧化(LPx)状态有关。
以上所述的TCL的测定方法以及实施该方法的装置在测定作为LPx产物的活性反应羰基的实际应用中是非常有用的。在较短的样品制备过程中可快速得到数据并能够可靠预测作为时间函数的TCL强度，由此更有价值地诊断与LPx有关的可能因素。
本发明可在需要评估LPx的不同领域应用，并通过测定TCL来完成。例如评估由营养不平衡、环境暴露引起的特殊疾病、遗传性疾病、癌症、肝损伤、糖尿病、肾衰竭、不育症，评估新型的抗氧化剂的活性，评估新药的抗氧化性等等。

Claims (11)

1、一种测定生物样品中脂质过氧化作用的方法，其中加热所述样品以便引发其内的热化学发光并测定所述热化学发光，所述方法包括以下步骤：
a)提供一个具有平底且用于容纳所述样品的贮器；
b)将所述样品加入到所述贮器中；
c)使所述贮器与一由高热导性材料制成的基底接触；
d)使所述贮器做往复运动，以便以均匀的方式在所述贮器的底部上分布所述样品；
e)通过减压处理对所述样品进行干燥一段时间，其中不使所述样品冷冻而且无需增加热，该段时间足以从所述样品中除去液体并形成一个由干燥固体构成的连续薄膜；
f)将所述干燥固体薄膜加热至足以引发热化学发光的温度；
g)在一段时间内传感并测定所述热化学发光，这段时间应足以获得热化学发光的强度与时间之间的稳定相关性。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述贮器包括由铝箔制成的一次性容器，而所述基底是铝板。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述贮器进行至少40秒的往复运动，以便形成厚度为0.3-0.5mm的连续薄膜。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述减压的压力不超过2mbar，而所述干燥的时间不超过10分钟。
5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，加热所述干燥固体是在至少60℃的温度下进行的。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在400-600nm的范围内在至少300秒的时间内测定所述热化学发光的强度。
7、一种用于测定生物样品中脂质过氧化作用的装置，其中加热所述样品以便引发其内的热化学发光并测定所述热化学发光，所述装置包括：
用于由样品中抽空液体的抽空装置，
一贮器和用于接纳该贮器的升华室，所述贮器内装有所述样品，所述升华室带有一盖子并用该盖子密封而且与所述抽空装置连通，由此不使样品冷冻而且不向样品增加热，所述升华室包括
i)由高热导性材料制成的基底，和
ii)用于使所述贮器做往复运动的驱动装置；
加热室，其配有用于加热所述贮器的装置以及用于测量干燥样品的热化学发光的装置；
用于显示所述热化学发光的测定结果的数据显示单元；以及
控制和数据处理单元，用于控制所述驱动装置、所述抽空装置、所述加热装置、所述用于测定热化学发光的装置以及所述数据显示单元。
8、如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述贮器包括由铝箔制成的一次性容器，而所述基底是铝板，所述铝板具有一个用于在其中接收所述贮器的凹处。
9、如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述抽空装置包括能够在所述升华室内产生减压的真空泵。
10、如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述铝板由将所述铝板与所述升华室的底部连接起来的弹性管件支撑着，而所述驱动装置包括一个电机和凸轮。
11、如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述加热装置包括晶体管和温度传感器，所述用于测定热化学发光的装置包括光电倍增器。
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