CN117417979A - 一种rna文库构建用封闭探针、建库试剂盒、制备方法 - Google Patents
一种rna文库构建用封闭探针、建库试剂盒、制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及核苷酸类原料技术领域，具体涉及一种RNA文库构建用封闭探针、建库试剂盒、制备方法。本发明提供的封闭探针，5’端连接特定结构的聚合物分子，封闭探针靶向目标区域结合RNA形成双链复合结构，聚合物分子通过氢键、分子纠缠等分子间作用力，以及聚合物结构中直链官能团与双链复合结构在分子空间结构上的嵌合作用，提高双链复合结构的稳定性，同时，能够有效阻止逆转录酶在链置换活性的作用下置换封闭探针，提高封闭探针的封闭作用，减少RNA文库中不需要RNA的文库含量，优化文库质量，提高对RNA序列信息分析的便捷性和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及核苷酸类原料技术领域，具体涉及一种RNA文库构建用封闭探针、建库试剂盒、制备方法。
背景技术
近年来，随着高通量测序技术的快速发展，各类RNA建库技术和测序技术层出不穷并且迭代升级，大大地降低了RNA建库和测序的难度和成本，这也使得RNA高通量测序技术成为生命进展和疾病诊断等领域的重要研究手段。但是，不同来源的样本中的RNA种类占比具有极大的不一致性，如正常细胞中核糖体RNA(rRNA)约占总RNA的90％-95％，血液中球蛋白的mRNA约占总mRNA的76％以上，这些RNA的存在占据了大部分的测序数据，严重影响到低丰度RNA的检测，提高了测序的成本。
现有技术中存在从两个方向解决上述RNA建库中存在的问题，分离出目标RNA或者去除/消耗掉不需要的RNA，主要涉及到三类技术，其中第一类技术是靶向分离出目标RNA；第二类技术是将不需要的RNA从样本中去除或者消耗掉，比如核糖体RNA、球蛋白mRNA等；第三类技术是将不需要的RNA作为模板合成cDNA的功能阻断掉，比如通过阻碍探针与不需要的RNA结合，避免不需要的RNA作为模板合成cDNA。其中第一类技术的具体方法包括polyA富集法，利用oligo(dT)磁珠来捕获富集含有polyA的mRNA，这种方法只适用于完整性较好的RNA，能够捕获的RNA种类有限，大大降低了测序的多样性，而且这种方法对polyA长度越长的RNA存在捕获效率越高，会造成RNA建库的偏好性；第二类技术的具体方法包括在构建NGS文库前使用反义DNA或RNA探针以杂交RNA样品中不需要的RNA，杂交后，使用双链RNA特异性酶消化样品，从而去除RNA探针和不需要的RNA，这种方法虽然有效，但是技术实现上存在不确定性；第二类技术的另一种具体实现方法还包括反义DNA或RNA探针是生物素化的探针，其能够通过将探针/靶RNA分子捕获到链霉亲和素被覆的珠或表面而将不需要的RNA由样品选择性去除，但是该方法珠结合和洗涤很费力，并且因非特异性结合和捕获，通常导致显著的样品损失。因此，这类技术整体上成本高、操作复杂(约20-40步)、耗时长(约2h)、对样本来源和RNA丰度要求高、试剂难以储存等缺陷。
第三类技术是为了解决第一类和第二类技术存在的技术缺陷逐渐开发和发展起来的技术，其具体方法及实现过程如专利CN201980062732.4所记载，其核心原理是涉及一种或多种3’端不能延伸的阻断寡核苷酸退火至待分析RNA样品，阻断寡核苷酸与不需要的RNA物质稳定结合，在cDNA合成过程中不需要的RNA被抑制，不能作为模板合成cDNA。从该技术的核心原理分析，影响该技术应用效果的关键是阻断寡核苷酸的阻断效果，那么为了保证阻断效果，该专利中给出的解决方案包括设计多条探针组合使用，多条探针靶向同一种不需要的RNA的不同区域，以确保对该RNA作为模板合成cDNA过程的阻断；另一个辅助的解决方案是在阻断寡核苷酸探针结构中设计修饰的寡核苷酸，提高阻断寡核苷酸与不需要的RNA的互补区域的结合作用力，避免阻断寡核苷酸脱落。
但是在实际应用过程中，仍然存在阻断寡核苷酸结合不稳定，不能高效率阻断逆转录酶以探针互补的RNA为模板合成cDNA，尤其是对于高GC区域的RNA(如外显子区域)，通常需要逆转录酶具有一定的链置换活性来保证这些区域有效逆转录，但是具有逆转录酶的链置换活性又会影响阻断寡核苷酸探针的阻断效果，因此，如何在两者之间实现平衡，解决现有技术的局限性，需要进一步对阻断寡核苷酸的结构进行优化，提升RNA文库质量。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的之一是提供一种RNA文库构建用封闭探针，在探针的5’端连接特定结构的聚合物，该聚合物通过分子间作用力与探针、目标RNA之间形成缠绕结构，提升探针的阻断作用，改善RNA文库的构建效果。
本发明的目的之二在于提供一种RNA文库构建用建库试剂盒，包括本发明提供的封闭探针。
同时，本发明还在于提供一种RNA文库构建用封闭探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种RNA文库构建用封闭探针，所述封闭探针与不需要的RNA的目标区域互补配对结合；其中封闭探针的3’端包含防止封闭探针延伸的修饰结构；封闭探针的5’端共价连接如式(Ⅰ)所示聚合物：
其中X1、X2为O或胺基或取代的氨基；
L1、L2为2～4个碳原子的亚烷基或取代亚烷基或杂亚烷基。
作为优选的，为了降低聚合物对核酸分子的非特异性结合，所述聚合物的数均分子量范围为4595.1±5％，PD值为1.2。其中聚合物分子结构的分子量大小通过聚合物及其中间体合成过程中的物料投入量及反应时间控制。
可选的，所述X1、X2为胺基或取代的氨基。
可选的，所述L1、L2为2～4个碳原子的亚烷基；进一步优选为3个碳原子的亚烷基。
可选的，所述3’端的修饰结构为-NH2C6；进一步优选的，为了进一步提高封闭探针与目标RNA区域的结合作用力，所述3’端的修饰结构还包括二氢环吡咯三肽。
可选的，所述封闭探针的核苷酸链长度为30～60nt；与目标RNA区域之间形成的双链体的解链温度(Tm)≥80℃；进一步优选≥90℃。
可选的，所述封闭探针的核苷酸链中包括锁核酸；进一步优选的，锁核酸的数量为5～7个；更进一步优选的，所述锁核酸的位置靠近封闭探针的5’端。
一种RNA文库构建用建库试剂盒，包括多个上述封闭探针、随机引物、逆转录酶和反应缓冲液；其中多个封闭探针能够实现不需要的RNA的全长至少1/6覆盖有封闭探针，相邻封闭探针的间隔距离不超过100nt；
进一步优选的，相邻封闭探针的间隔距离不超过30nt；封闭探针的核苷酸序列长度为25～45nt；优选的，封闭探针的核苷酸序列长度为40nt。
一种RNA文库构建用封闭探针的制备方法，其特征在于，包括合成聚合物，通过点击化学反应将聚合物连接至封闭探针的5’端。
上述RNA文库构建用封闭探针的制备方法，其特征在于，还包括合成式(Ⅱ)中间产物然后将中间产物连接至封闭探针5’端。其中X3为O或胺基或取代的氨基；
其中式(Ⅱ)中间产物由式(Ⅲ)单体1式(Ⅳ)单体2式(Ⅴ)单体3/>合成。
本发明提供的封闭探针，5’端连接特定结构的聚合物分子，封闭探针靶向目标区域结合RNA形成双链复合结构，聚合物分子通过氢键、分子纠缠等分子间作用力，以及聚合物结构中直链官能团与双链复合结构在分子空间结构上的嵌合作用，提高双链复合结构的稳定性，同时，能够有效阻止逆转录酶在链置换活性的作用下置换封闭探针，提高封闭探针的封闭作用，减少RNA文库中不需要RNA的文库含量，优化文库质量，提高对RNA序列信息分析的便捷性和准确性。
本发明RNA文库构建用建库试剂盒，采用本发明体用的封闭探针结构，针对不需要的RNA，例如核糖体RNA和球蛋白RNA等，以阵列间隔分布的方式与不需要的RNA结合形成双螺旋结构，在RNA建库的一链cDNA合成过程中实现对核糖体RNA和球蛋白RNA等不需要的RNA的高效率高特异性抑制，减少或消除核糖体RNA和球蛋白RNA等不需要的RNA参与到后续的建库过程以及序列信息检测及分析过程，减少这些不需要的RNA对下游测序或分析的干扰。
进一步的，本发明封闭探针在制备过程中，可以通过定制合成或者自主合成途径按照常规的方法合成寡核苷酸链主体结构，并且根据需求在寡核苷酸主体结构的3’端在合成过程中采用3’OH被修饰为不可延伸结构的原料合成在3’端；通过定制合成或者自主合成的途径按照化学领域已知的聚合方法按照聚合物结构合成相应的聚合物，并在聚合物一侧连接带有点击化学官能团的分子结构，与寡核苷酸链主体的5’端通过点击化学反应的方式快速高效的连接在5’端，完成封闭探针整理结构的合成和制备，工艺过程操作简便，适于工业化推广应用。
具体实施方式
定义：
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所述技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
其中下述实施例和对比例提供的封闭探针，核苷酸序列由上海生工定制合成；合成聚合物使用的化合物单体分子由芜湖华仁定制合成，具体为单体1：
单体2：连接聚合物与探针主体结构用引发剂：
实施例1
本实施例提供一种RNA文库构建用封闭探针结构，其整体分子结构为：
其中核苷酸序列探针与目标区域特异性互补配合结合形成双螺旋结构，靠近5’端的前5个核苷酸为锁核酸；其5’端共价连接聚合物分子：其数均分子量范围为4595.1±5％，PD值为1.2。
本实施例提供的封闭探针制备方法的具体操作步骤为：
1)按照设计的序列结构，合成核苷酸序列探针，其中5’端修饰炔基官能团，3’端OH修饰为NH2C6；
2)聚合物及中间体合成：
①称取单体1(1.41mmol)和单体2(1.41mmol)于100mL三口瓶中，加入14mL超纯水使其溶解，室温搅拌；取称取引发剂(0.141mmol)，加入上述三口瓶中，将混合物在室温搅拌下鼓氩气30min，控制在3个气泡/秒左右。
②取另一个50mL三口瓶，加入2mL超纯水，使用移液枪量取Me6TREN(0.0131mmol)
于其中，室温下置换氩气4次，置于室温搅拌。
③称取CuBr(0.01787mmol)加入步骤②的溶液中，反应1min后，氩气置换4次，置于室温搅拌。
④将步骤①中鼓气结束的反应液快速加入到步骤③的混合液中，两个三口瓶上均有插氩气球的三通，使体系始终存在氩气流中。室温搅拌4h后反应结束。
⑤机械搅拌状态下，将聚合物溶液逐滴滴加至300mL乙腈中，结晶以析出聚合物中间体，并使用自封袋将聚合物中间体中残余的乙腈挤出，然后将聚合物中间体重新复溶于40mL水中。
⑥将复溶的聚合物中间体溶液分装至50mL离心管中，每管约22.5mL，放于-80℃下冷冻，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得干粉聚合物中间体产品。质控检测聚合物中间体分子量控制在4861.2±5％；
3)聚合物中间体与探针5’通过点击化学反应共价连接的反应过程
①将5’端炔基修饰的探针溶于适量超纯水中，并用pH 7.0的2M TEAA溶液稀释至0.2M，加入小容量反应瓶中；
②加入1.5当量10mM聚合物中间体的DMSO溶液，混匀后再加入5mM抗坏血酸溶液，充氮气保护并密封；
③加入10mM Copper(II)-TBTA的DMSO溶液，在氮气的充分保护下于室温条件反应24小时；
④采用乙醇沉淀的方法提纯产物，并用丙酮洗涤3次，离心机离心后除去上清液，得到目标产品；
实施例2
本实施例提供一种RNA文库构建用封闭探针结构，其整体分子结构为：
其他结构及制备工艺与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种RNA文库构建用封闭探针结构，其整体分子结构与实施例2的不同之处在于，5’端不连接聚合物分子结构。
对比例2
本对比例提供一种RNA文库构建用封闭探针结构，其整体分子结构与实施例2的不同之处在于，5’端连接的聚合物分子结构的分子量为7524±5％，其中聚合物分子结构的分子量大小通过聚合物及其中间体合成过程中物料投入量及反应时间控制。
试验例：
试验方法：
1、设计封闭探针核苷酸序列：
根据人5.8S rRNA序列，设计靶向5.8S rRNA的封闭探针组，封闭探针组的探针数量为3，每个探针的核苷酸序列长度为40nt，每个探针的结合区域不重叠；
2、设计5.8S rRNA逆转录引物，其核苷酸序列为：AAGCGACGCTCAGACAGGCGTAG；
18S rRNA逆转录引物，其核苷酸序列为：TACCGACGCTCAGACAGGCGTAG；
2、试验分组：
分四组平行试验：
第一组不使用封闭探针；
第二组每个封闭探针的整体分子结构为实施例2提供的封闭探针结构；
第三组每个封闭探针的整体分子结构为对比例1提供的封闭探针结构；
第四组每个封闭探针的整体分子结构为对比例2提供的封闭探针结构。
3、实验过程：
1)杂交：
通用人类参考RNA(Universal Human Reference RNA，UHRR)(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，100ng；1μM封闭探针1μL；1μM 5.8S rRNA逆转录引物1μL；1μM18S rRNA逆转录引物1μL；10mM dNTPs mix 1μL；定量至15μL；热循环孵育后，4℃保持；
2)逆转录反应：
步骤1)体系中加入逆转录buffer 3μL、RNA酶抑制剂1μL、逆转录酶1μL，热循环仪中孵育：25℃10分钟，42℃30分钟，4℃保持；
3)纯化：
向步骤2)体系中添加80ul水和130ul QIAseq珠。用200ul 80％乙醇(EtOH)洗涤结合的cDNA两次。干燥，用20ul水洗脱；
4)QPCR定量：
向步骤3)纯化制得的cDNA样品，加入多重QPCR Mix buffer，加入靶向5.8S rRNA的定量引物，正向引物为：CTCTTAGCGGTGGATCACTCG；反向引物为：GCAAGTGCGTTCGAAGTGTC；
靶向18S rRNA的定量引物，正向引物为：GTTTTCGGAACTGAGGCCATG；反向引物为：TCGGAACTACGACGGTATCTG；
在热循环仪中孵育：95℃9分钟，98℃1分钟，40个循环(98℃15秒，60℃1.5分钟)，定量以5.8S rRNA为模板合成的cDNA浓度、和以18S rRNA为模板合成的cDNA浓度。
4、性能评价：
以第一组不添加封闭探针的5.8S rRNA定量浓度检测结果为基础浓度，其他各组检测结果为试验组浓度，计算其他各组加入封闭探针后对5.8S rRNA的封闭效率＝(基础浓度-试验组浓度)/基础浓度*100％。结果如下表1所示：
表1
| 分组 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 |
| 封闭效率(％) | 98.78％ | 78.09％ | 97.78％ |
以第一组不添加封闭探针的18S rRNA定量浓度检测结果为基础浓度，其他各组检测结果为试验组浓度，计算其他各组加入封闭探针后对18S rRNA的非特异性封闭效率＝(基础浓度-试验组浓度)/基础浓度*100％。结果如下表2所示：
表2
上述试验结果表明，本发明通过在封闭探针的5’端连接特定的聚合物分子结构，提高对目标靶区域的阻断封闭效果，更进一步的，通过优化聚合物分子量，降低对其他非目标靶区域的非特异性封闭，提高封闭探针应用于RNA建库的应用效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述封闭探针与不需要的RNA的目标区域互补配对结合；其中封闭探针的3’端包含防止封闭探针延伸的修饰结构；封闭探针的5’端共价连接如式(Ⅰ)所示聚合物：
其中X1、X2为O或胺基或取代的氨基；
L1、L2为2～4个碳原子的亚烷基或取代亚烷基或杂亚烷基。
2.如权利要求1所述的RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述聚合物的数均分子量范围为4595.1±5％，PD值为1.2。
3.如权利要求2所述的RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述X1、X2为胺基或取代的氨基。
4.如权利要求3所述的RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述L1、L2为2～4个碳原子的亚烷基；进一步优选为3个碳原子的亚烷基。
5.如权利要求4所述的RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述3’端的修饰结构为-NH2C6；进一步优选的，所述3’端的修饰结构还包括二氢环吡咯三肽。
6.如权利要求5所述的RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述封闭探针的核苷酸链长度为30～60nt；与目标RNA区域之间形成的双链体的解链温度(Tm)≥80℃；进一步优选≥90℃。
7.如权利要求6所述的RNA文库构建用封闭探针，其特征在于，所述封闭探针的核苷酸链中包括锁核酸；进一步优选的，锁核酸的数量为5～7个；更进一步优选的，所述锁核酸的位置靠近封闭探针的5’端。
8.一种RNA文库构建用建库试剂盒，其特征在于，包括多个如权利要求1～7任一项所述的封闭探针、随机引物、逆转录酶和反应缓冲液；其中多个封闭探针能够实现不需要的RNA的全长至少1/6覆盖有封闭探针，相邻封闭探针的间隔距离不超过100nt；
进一步优选的，相邻封闭探针的间隔距离不超过30nt；
封闭探针的核苷酸序列长度为25～45nt；
进一步优选的，封闭探针的核苷酸序列长度为40nt。
9.一种如权利要求1～7任一项所述的RNA文库构建用封闭探针的制备方法，其特征在于，包括合成聚合物，通过点击化学反应将聚合物连接至封闭探针的5’端。
10.如权利要求9所述的RNA文库构建用封闭探针的制备方法，其特征在于，还包括合成式(Ⅱ)中间产物然后将中间产物连接至封闭探针5’端；
其中式(Ⅱ)中间产物由式(Ⅲ)单体1式(Ⅳ)单体2式(Ⅴ)单体3/>合成。
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