CN117412750A - 用作变力剂的哌啶脲衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由化学式(I)所示的化合物作为变力剂的用途。在本文中，据报道化学式(I)所示的化合物，其优选地包括1‑[(1S)‑1‑(2,3‑二氯‑4‑甲氧基苯基)乙基]‑3‑甲基‑3‑[(4R)‑1‑甲基‑3,3‑二甲基‑4‑哌啶基]‑脲及其盐酸盐，对来自正常和心肌梗塞引起的心力衰竭动物模型的心肌细胞具有显著的变力活性，这使得它们对于治疗对其有需要的心血管患者有用。不同于已知的变力剂，本发明的化合物对心肌细胞收缩性有效且不影响钙动员。因此，它们有利地不具有钙浓度升高所引起的不利影响，如需氧量升高、心动过速、心律不齐、缺血等。总体而言，新型、安全且有效的变力治疗因此是可用的。

Description

用作变力剂的哌啶脲衍生物
背景技术
心力衰竭(HF)，也称为充血性心力衰竭，是一种常见的严重的病理学病况，其特征在于心脏泵血能力不足，从而无法维持身体代谢所需的血流速率，或者该血流速率仅在神经激素激活后可以得到维持，从而导致尤其体液潴留及心力衰竭的病征和症状。在老年人中，HF是住院治疗的主要原因。在2015年，其影响全球约4千万人。总体而言，约2％的成年人患有心力衰竭，而在65岁以上的人群中，这提高至6-10％。HF可以具有致命后果，诊断后第一年内的死亡风险为约35％。
心力衰竭的病征和症状通常包含呼吸急促、过度疲劳及腿部肿胀。呼吸急促通常在运动或躺下时恶化，并且可以在晚上惊醒患者。心力衰竭的常见原因包括冠状动脉病，其包括既往心肌梗塞(心脏病发作)、高血压、心房颤动、瓣膜性心脏病、过量饮酒、感染及不明原因的心肌病。这些因素通过改变心脏的结构和/或功能导致心力衰竭。基于左心室收缩或松弛的生理能力是丧失还是保留，HF可以与射血分数降低(HFrEF)或射血分数保留(HFpEF)有关。
HF的治疗取决于该疾病的严重程度及病因。在患有慢性稳定性心力衰竭的人中，不考虑射血分数，治疗通常由以下组成：改变生活方式，如戒烟、体育锻炼及饮食改变，根本风险因素，如高血压的治疗及用利尿剂缓解症状。对于治疗HF有用的药物种类本质上是非常多样化的，其包括具有不同作用及机制的分子，如：血管扩张剂，其旨在扩张血管、减轻血流及降低血压；利尿剂及醛甾酮拮抗剂，其旨在帮助体液潴留；ACE抑制剂、ARB或ARNi药物，其旨在改善心脏功能及预期寿命；毛地黄糖苷，其旨在加强心脏收缩；抗凝血剂或抗血小板剂，用以防止血液凝结；β阻断剂，用以改善心脏功能；SGLT2抑制剂，其具有复杂的有益作用，镇静剂，用以减轻焦虑。例如，在由于射血分数降低而导致心力衰竭的患者中，推荐使用血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂或沙库比曲/缬沙坦(sacubitril/valsartan)(ARNi)，以及β阻断剂、盐皮质激素受体拮抗剂及钠-葡萄糖共转运蛋白2-抑制剂(SGLT2抑制剂)。
上述方法旨在阻断及潜在逆转HFrEF中的不利结构和/或功能性心脏变化，也降低因心力衰竭而住院治疗及死亡的风险。然而，他们不能解决HF的根本病理：心脏收缩性降低。可以使用提高收缩性的药物(通常称为变力剂(inotropes))：它们包括磷酸二酯酶3(PDE3)抑制剂(例如，米力农(milrinone))及肾上腺素激动剂(例如，多巴酚丁胺)。这些药剂一般通过提高钙浓度起作用，这导致一些副作用，包括心肌需氧量增加、缺血、心律不齐，并且它们还通过多种机制引起过度低血压。左西孟旦(Levosimendan)在一些国家可获得且通过提高钙敏感性部分起作用，但它也通过PDE3抑制起作用，从而提高钙浓度并引起心律不齐，并且还对脉管系统起作用，从而导致低血压。
一类新的变力剂——肌球蛋白激活剂正处于开发中，但仍担心它们可能会引起缺血并导致肌钙蛋白升高，且3期结果表明对CV死亡率无益处(New England Journal ofMedicine 2021Jan 14；384(2):105-116)。在败血病、肾脏疾病、肺栓塞、心脏感染及心力衰竭的病例中也已报道了肌钙蛋白水平升高，其具有重要预后价值。
胃饥饿素是一种由胃肠道细胞产生的激素，其刺激生长激素的释放，提高胃运动性/分泌，并刺激食欲及进食。胃饥饿素也参与调节奖励认知学习及记忆、睡眠-睡醒周期、味觉、奖励行为及葡萄糖代谢。还报道了胃饥饿素对心血管的作用：在健康受试者中，它扩张动脉、降低血压、减少心脏后负荷并提高心脏输出量(Hypertension,2014,64,450-454)。关于胃饥饿素可能的变力作用(inotropic effects)，文献中存在矛盾的报道。在Endocrinology 2010,15(1),4446-4454中，发现缺血后胃饥饿素的心脏灌注对心肌细胞产生变力作用。然而，在Peptides,2006,27(7),1616-1623中，发现胃饥饿素产生部分由KCa通道介导的负变力作用。出版物International Journal of Cardiology,2009,137(3),267-275报道人胃饥饿素对心力衰竭的大鼠模型中的心脏功能没有影响；同样地，在分离的起搏心房中未发现胃饥饿素的变力作用(Cardiovascular Research,2006,69,227-235)。
生长激素促分泌素是合成肽，与胃饥饿素类似，其刺激生长激素的分泌。它们中的一些可以显示出心血管作用，如提高的冠状动脉阻力、加速的心率及亲心性作用(cardiotropic effects)，后者经钙动员获得(Endocrinology,2003,144(11),5050-5057)。
在WO2012/116176及WO2015/134839中公开了用于治疗胃饥饿素介导的疾病的具有胃饥饿素调节活性的不对称脲衍生物家族；在这些文档中未提供所公开的化合物中任一种的任何心脏作用的实验证据。其它专利申请WO2019/179878关注3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲的盐酸盐，其具有增强的脑渗透性质，并且用于治疗多种神经障碍；还报道该化合物具有中枢介导的心动过缓作用；该文献将心动过缓作为可能因素进行讨论，如果严重，可以有助于明显的心力衰竭，但如果轻微，可以保护心力衰竭(European Heart Journal，1999，20,252-255)。出版物Endocrinology,2010,151(9),第4446-4454页报道了天然生长激素促分泌素胃饥饿素(28个氨基酸的多肽)及其类似物海沙瑞林(hexarelin)的钙介导的正变力作用；该论文也承认对于一般种类的生长激素促分泌素的作用存在矛盾的报道，包括负变力作用的报道病例。
考虑到上述现有技术，对能够解决HF的核心问题及根本原因(即心脏收缩性降低)的安全且无副作用(具体地由钙动员引起的那些副作用)的药物的需求仍然很高。
发明概述
本发明人已意外地发现由化学式(I)所示的化合物
在详细说明中定义了其基团R1-R6和指数m、n，对心肌细胞具有不同的变力活性，这使得它们对于治疗对其有需要的心血管患者有用。
因此，本发明的化合物，优选地包括1-[(1S)-1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-3-[(4R)-1-甲基-3,3-二甲基-4-哌啶基]-脲及其盐酸盐的本发明的化合物在以减低和/或无效的心脏收缩性为特征或与之相关的病理学状况的治疗中有效。这些病况的实例是心力衰竭、心脏病、心源性休克、脓毒性休克、心肌梗塞、心肌病、肺动脉高压(PAH)等。优选的适应症是心力衰竭，其可以是任何类型(即急性或慢性以及降低或保持的射血分数)、严重程度(轻度、中度或重度)和阶段(即初期或晚期)。更优选的适应症是急性或慢性晚期心力衰竭。最优选的适应症是射血分数降低(HFrEF)的急性或慢性晚期心力衰竭。心肌病的优选实例是扩张性心肌病(DCM)，具体地由遗传变异引起的DCM(也称为家族性DCM)。PAH的优选实例是具有右心室收缩功能的PAH。
化学式(I)所示的化合物，包括化合物1-[(1S)-1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-3-[(4R)-1-甲基-3,3-二甲基-4-哌啶基]-脲及其盐酸盐在它们发挥变力活性而不影响钙动员中是进一步有用的：事实上，其不是增加心肌细胞胞液中的钙浓度，而是通过增强心肌细胞肌节对现有钙水平的敏感性来发挥作用。因此，本发明的化合物在对其有需要的患者中获得了显著的变力反应，同时避免了已知变力剂由心肌细胞胞液中钙浓度升高(本文中简称为“钙浓度升高”)所引起的常见副作用，如需氧量增加、心动过速、心律不齐、缺血等。总体而言，新颖、安全且有效的变力治疗因此是可用的。
附图说明
图1(上)：AC01/HM01在小鼠心肌细胞中(上图版)引起剂量依赖性收缩性升高：在心肌细胞(SHAM，即经历不引起心肌梗塞的假程序的心肌细胞)中在不同浓度(0.2、0.5及1μM)下测量AC01/HM01的收缩作用，使用长度缩短分数(FS％)变化作为读数。与媒介物相比(*p＜0.05，**p＜0.01)，在1μM下的AC01/HM01显示出最大收缩作用。柱状图显示了如所述分析的N个细胞的平均缩短分数。
图1(下)：AC01/HM01在从SHAM及心脏衰竭(HF)小鼠(小鼠经历左前降支动脉结扎，导致心肌梗塞；几周后，小鼠患上心力衰竭)的心脏中分离的心肌细胞中引起由D-Lys3(特异性胃饥饿素拮抗剂)抑制的收缩性升高：使用胃饥饿素受体激动剂AC01/HM01(1μM)提高心肌细胞收缩性，而用胃饥饿素受体拮抗剂D-Lys3-GHRP-6(3μM)预处理阻断该收缩作用。从SHAM(左)及MI组(右)中分离的心肌细胞通过提高其收缩性对AC01/HM01作出积极反应。(*p＜0.05，**p＜0.01)。柱状图显示了如所述分析的N个细胞的平均值。
图2(左及右上)：从使用媒介物或不同浓度的AC01/HM01处理的SHAM的心脏中分离的心肌细胞中的代表性线扫描图像(左)及Ca2+瞬变(动员)曲线(右上)。在任何浓度下，使用AC01/HM01的处理均不会引起Ca2+瞬变幅度的改变，其显示图1中收缩性升高是由于Ca2+敏感性升高而不是由于Ca2+瞬变所造成的。
图2(右下)：柱状图显示如所述分析的N个细胞的平均Ca2+瞬变(p＝所有比较均不显著)。
图3：从SHAM小鼠的心脏中分离的心肌细胞中的代表性线扫描及Ca2+瞬变曲线。从SHAM小鼠的心脏中分离的心肌细胞中的代表性Ca2+瞬变线扫描(左)、代表性幅度变化曲线(右)及平均Ca2+瞬变幅度(下)。使用或不使用D-Lys 3GHRP-6的AC01/HM01处理(1μM)不改变Ca2+瞬变幅度。柱状图显示了如所述分析的N个细胞的平均值。
图4：通过蛋白印迹评价的磷酸化(Ser 22-23)cTnI水平。
(上)：磷酸化cTnI及总cTnI的代表性印迹。使用AC01/HM01(1μM；中间柱)处理SHAM心肌细胞降低心脏肌钙蛋白I在丝氨酸22-23残基处的磷酸化水平。使用胃饥饿素受体拮抗剂D-Lys3-GHRP-6(3μM，右柱)的预处理阻断心肌细胞中通过AC01/HM01激活的信号转导，并将cTnI的磷酸化水平恢复至在媒介物处理的心肌细胞中观察到的生理水平(左柱)。
(下)：柱状图显示了表示为相对于媒介物处理的心肌细胞的变化倍数的磷酸化TnI的表达水平。如所述的，在管内收集多批心肌细胞(～105个细胞)并处理。柱状图显示了如所述分析的N个批次的平均值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图5.分离的心肌细胞中的蛋白激酶A(PKA)活性。使用AC01/HM01(1μM)处理的心肌细胞显示出PKA活性降低(灰色柱)。D-Lys 3-GHRP-6阻断AC01/HM01胞内信号转导，并将PKA活性恢复至生理水平(红色柱)，其与媒介物处理的心肌细胞(白色柱)类似。如所述的，在管内收集多批心肌细胞(～105个细胞)并处理。柱状图显示了N个批次的平均值。
图6.通过AC01/HM01及胃饥饿素受体相互作用所引发的分子信号转导：AC01/HM01激活Gαi信号转导，其与PKA活性降低及cTnI在丝氨酸22至23处的磷酸化降低相关。这种机制是AC01/HM01刺激后心肌细胞中对Ca2+敏感性增强及收缩性改善所造成的。
发明详述
本发明的第一主要目标在于提供用作变力剂的化学式(I)所示的化合物或化学式(I)的药学上可接受的盐。
在本发明的化学式(I)中：
R2、R3、R5彼此独立地为C1-C6烷基，
R1、R4彼此独立地为氢或C1-C6烷基，
R6是C1-C6烷基、卤代、C1-C6烷氧基或C1-C6卤代烷基，
n是2-3，
m是1-3。
整体上，在本发明的化学式(I)中：术语“烷基”包括直链和支链烷基两者；术语“C1-Cn”公开了1-n的范围内的单个同系物中的每一个，例如，术语C1-C6相当于C1、C2、C3、C4、C5、C6。
在一般优选实施方式中，R4是氢。
在更优选的实施方式中，R4是氢且n是2。
在甚至更优选的实施方式中，R4是氢，n是2且R2是甲基。
在进一步更优选的实施方式中，R4是氢，n是2，R2是甲基，且两个R2基团连接至哌啶环的相同碳原子，具体地不直接连接至哌啶氮原子的碳原子，即它们连接至哌啶环的3-基位置(相当于5-基位置)。
在优选的变化形式中，全部以上所提供的实施方式的特征可以进一步在于以下条件中的一种或多种，优选地全部：
-R3和R5两者均为C1-C3烷基，优选地甲基。
-m为3，
-R6是卤代和/或烷氧基，优选地其中至少一个R6是烷氧基。
其中R1是C1-C6烷基的化学式(I)所示的化合物表示一般适用的变化形式；作为另外一种选择，其中R1是氢的化学式(I)所示的化合物表示另一种一般适用的变化形式。
术语“卤代”在本文中表示氯、氟、溴或碘；优选地，术语“卤代”表示氯；优选地，术语烷氧基表示甲氧基或乙氧基。
术语“药学上可接受的盐”在本文中表示通常在药物实践中认为无毒的任何盐；具体地，如果化学式(I)所示的化合物是盐形成胺，则任何适合的盐形成酸可以用于药物实践以从化学式(I)所示的游离碱形成药学上可接受的盐：典型的药学上可接受的盐是盐酸盐(盐酸盐)，具体地一氢氯化物。
化学式(I)所示的化合物含有两个不对称碳原子并且可以以不同的立体异构化形式及其混合物存在，本发明的化学式(I)包含了它们全部；其中，优选形式1(S)、4(R)，其对应于以下结构：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m和n具有以上所定义的含义。在特别优选的实施方式中，化学式(I)所示的化合物为1-[(1S)-1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-3-[(4R)-1-甲基-3,3-二甲基-4-哌啶基]-脲或其药学上可接受的盐，具体地一氢氯化物盐，其具有以下结构(Ia)：
根据(例如)Frontiers in Pharmacology,2018,第9卷,论文号869,第1-16页，结构(Ia)所示的化合物本身是已知的，并且一般地在本文中简称为AC01或HM01。
当提及本发明的化学式(I)所示的化合物的活性时，术语“变力剂”以及术语“变力活性”或“变力作用”表示所讨论的化合物能够刺激(即增强)患者心脏的收缩性及力量。术语变力在本文中表示“正”变力活性，即对肌肉的作用是刺激性的，且不延伸至相反的负变力作用。本发明化合物的变力活性对心脏肌细胞(即心肌细胞)有效，其将转化为相关肌肉器官(即心脏)增强的收缩性。提高的收缩性改善心脏功能，具体地其收缩强度，从而增强泵血能力，随之改善多个身体区域的血液输送及氧合。
与可用的变力剂不同，本发明的化学式(I)所示的化合物的变力作用不由钙浓度升高介导；这种作用是通过心肌细胞胞质中钙浓度没有升高(即没有来自细胞间隙及肌浆网的钙释放及流出)的迹象通过实验所引起的。因此，意外发现这些化合物在不提高肌肉细胞的基础钙浓度的情况下是收缩有效的，即而是它们增强了细胞对现有钙水平的敏感性。因此，可以将术语“变力剂”更准确地定义为“基于钙敏化作用的”变力剂，或者作为另外一种选择，定义为“钙水平中性”变力剂。因此，本发明的化学式(I)所示的化合物典型的相应变力活性有利地不同于可用的变力剂的变力活性，其中它不包含由于细胞钙浓度升高而引起的副作用，如心肌需氧量增加、缺血、心律不齐及过度低血压等。因此，所讨论的医学用途的特征进一步在于没有与细胞钙浓度升高相关的上述副作用。
本发明的化学式(I)所示的化合物对于在治疗以心脏收缩性降低及/或无效为特征或与之相关的人或动物患者的任何病理学状况中的使用是有效的。这些病况的实例为心力衰竭(还鉴别为充血性心力衰竭)、心脏病、心源性休克、脓毒性休克、心肌梗塞、心肌病、肺动脉高压(PAH)等。优选的适应症是心力衰竭：它可以是任何类型(即急性或慢性；具有降低或保持的射血分数)、严重程度(轻度、中度或重度)和阶段(即初期或晚期)。特别需要本发明的治疗/本发明的治疗特别有效的心力衰竭病况是射血分数降低(HFrEF)的心力衰竭，具体地晚期HFrEF，所述心力衰竭是急性的或慢性的。具体指明的治疗是处于初期阶段或晚期阶段的慢性HFrEF。心肌病的优选实例是扩张性心肌病(DCM)，具体地由遗传变异引起的DCM(也称为家族性DCM)。PAH的优选实例是具有右心室收缩功能的PAH。
根据本发明的用途在需要用变力剂长期治疗的病况(如心力衰竭的慢性形式)下是特别有利的：在所有这些情况下，避免钙相关副作用的相伴发展对患者是特别有益的，因为它防止长期暴露于长远来看可能致命的危险后果，因此使得更安全、具有更长存活远景的变力疗法可用。
因此，在优选的实施方式中，本发明的医学用途有利地针对对于他们尤其避免了与心肌细胞中的钙浓度升高相关的副作用的患者亚群，即曾患、患有或有患缺血、心律不齐及/或低血压的风险的患者，他们对应于更脆弱的心血管患者亚群，对于他们，上述副作用的产生可能是高度危险且可能是致命的。
在本文中，所治疗的心力衰竭可以由任何削弱心肌的疾病或导致心肌僵硬的疾病或将身体组织的需氧量提高至超过心脏输送能力的疾病引起。多种疾病可以损害心室的泵血作用。例如，心室肌肉可以因既往心脏病发作或炎症(心肌炎)而削弱，从而随时间导致进行性心力衰竭。由于肌肉削弱所导致的心室泵血功能减弱被称为收缩功能障碍。每次心室收缩后，(收缩期)心室肌肉需要松弛以允许来自心房的血液充满心室。心室的这种松弛被称为舒张。疾病，如血色素沉着症或淀粉样变性可以导致心脏肌肉僵硬并损害心室松弛及充盈能力；这被称为舒张功能障碍。其最常见的原因是长期高血压，从而导致心脏增厚(肥大)。此外，在一些患者中，尽管心脏的泵血作用及充盈能力可能是正常的，但是身体组织的异常高的需氧量(例如，患有甲状腺机能亢进)可以使心脏难以提供足够的血流(这被称为高排血量心力衰竭)。在一些患者中，可以存在一种或多种这些因素以导致充血性心力衰竭。充血性心力衰竭可以影响身体的多个器官。例如，削弱的心脏肌肉可能无法为肾脏提供足够血液，其然后开始失去排泄盐(钠)及水的正常能力。这种肾功能减弱可导致身体保留更多流体。肺部可变得充满流体(肺水肿)，且人的运动能力降低。流体同样可在肝脏中累积，从而损害其身体清除毒素及生产必要蛋白质的能力。肠在吸收营养物及药物方面可能变得低效。随着时间的推移，未治疗或甚至用现有治疗进行最优治疗，恶化的充血性心力衰竭将影响几乎身体中的每个器官。这种情况的发生与导致心力衰竭的后续发展的原始事件无关。因此，本发明的治疗进一步涉及治疗心力衰竭的所有上述症状及影响。
本发明的特征可以进一步在于如上定义的化学式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在生产用于治疗任何上述病理学状况的变力药剂中的用途。本发明的特征进一步在于治疗任何上述病理学状况的方法，所述方法包括将化学式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐施用于对其有需要的受试者。
本发明的治疗所针对的适合的受试者包括哺乳动物受试者。哺乳动物包括具有任一种性别且处于任何发育阶段的人受试者；哺乳动物进一步包括(但不限于)犬、猫、牛、山羊、马、绵羊、猪、啮齿类、兔类、灵长类等，并且涵盖子宫内的哺乳动物。
有用的剂量范围可以优选地在0.1至10mg/天，例如0.2至10mg/天的范围内；每日剂量可以分成每日不止一次施用，优选地每日两次施用，例如0.1至5mg BID(每日两次)。
可以将本发明的化学式(I)所示的化合物配制成适合于施用上述每日剂量的药物可施用剂量形式。例如，如果旨在每日重复施用，则它们可以含有0.1至10mg范围内的量或该量的一部分的化学式(I)所示的化合物。
本领域的技术人员将能够在没有过度实验且依赖于个人知识及本发明申请的公开内容的情况下，对于要产生的特定药物形式优化这些范围。
用于口服施用的固体剂量形式可以(例如)以离散单元的形式存在，如硬胶囊或软胶囊、丸剂、扁囊剂、糖锭、囊剂、片剂或小片剂，其分别含有预定量的至少一种所公开的化合物。在一些形式中，口服施用可以处于粉末或颗粒形式。在一些形式中，口服剂量形式是舌下的，如(例如)糖锭或口服膜。在这些固体剂量形式中，化学式I所示的化合物一般与一种或多种佐剂组合。这些胶囊剂或片剂可以是控释制剂。在胶囊剂、片剂、小片剂及丸剂的情况下，剂量形式还可以包含缓冲剂或可以制备有肠溶衣。
用于口服施用的液体剂量形式包括(例如)含有本领域中常用的惰性稀释剂(例如水)的药物可用的乳液、溶液、混悬液、糖浆及酏剂。这些组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂、混悬剂、调味剂(例如甜味剂)和/或芳香剂。
在一些形式中，所公开的组合物可以包含肠胃外剂量形式。“肠胃外施用”包括(例如)皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、胸骨内注射及输注。可以根据已知技术使用适合的分散剂、润湿剂及/或混悬剂配制可注射制剂(例如，无菌可注射水性或油性混悬液)。通常，在制剂中使用适当的量的药物可用的载体以使所述制剂等渗。药物可用的载体的实例包括(但不限于)盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液。其它可接受的赋形剂包括(但不限于)增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。
所公开的化合物可以通过任何合适的途径，优选地以适合于该途径的药物组合物的形式且以对于预定治疗或预防有效的剂量施用。例如，可以口服、直肠、肠胃外、眼部、吸入或局部施用活性化合物及组合物。具体地，施用可以是表皮、吸入、灌肠、结膜、滴眼剂、滴耳剂、肺泡、鼻、鼻内、阴道、阴道内、经阴道、眼部、眼内、经眼、肠内、口服、口内、经口、肠、直肠、直肠内、经直肠、注射、输注、静脉内、动脉内、肌内、脑内、心室内、脑室内、心内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内、海绵体内、骨髓内、眼内、颅内、经皮、经粘膜、经鼻、吸入、脑池内、硬膜上、硬膜外、玻璃体内等。优选的施用途径是口服或静脉内。
通常以治疗有效量施用本发明的化学式(I)所示的化合物。治疗有效量可以基于疾病的严重程度、个体的年龄及相对健康状况、所使用的化合物的效力及其它因素而大范围变化。化学式(I)所示的化合物的治疗有效量可以在约0.001mg/Kg体重至约0.1mg/Kg体重，优选地约0.001mg/Kg体重至约0.01mg/Kg体重的范围内。本领域的技术人员将能够在没有过度实验且依赖于个人知识及本发明申请的公开内容的情况下，对于以上所提及的多种病理学状况中的每一种优化这些范围。
在整个本发明申请中，参考了多个出版物。这些出版物的公开内容以其全部作为参考并入本发明申请以更全面地描述本发明所属领域的技术现状。对于在参考文献所依赖的句子中进行讨论的那些中所含有的材料，所公开的参考文献也单独且具体地作为参考并入本文。
除非上下文明确规定，否则如本说明书及所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”及“所述”包括复数对象。因此，例如，提及“病理学病况”的治疗包括两种或更多种这类病况的治疗，即使在相同受试者中同时发生。
如本文所使用的，单次“或”或类似术语表示特定列表的任何一个成员并且也包括该列表的成员的任意组合。
“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情况可以或可以不发生，并且描述包括其中所述事件和情况发生的情况和其中它不发生的情况。
当用于修饰任何参数值及其范围时，术语“约”是指可以发生的数值量的实验变化，例如，通过用于制备化合物、组合物等的典型测量及处理程序；通过这些程序中的疏忽误差；通过用于实施这种方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度的差异；及类似考量。术语“约”还涵盖了由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的老化而不同的量以及由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的混合或加工而不同的量。所有这些实验变化通常保持在给定值的±5％以内。无论是否被术语“约”修饰，它所附的主张包括这些量的等价量。
术语“包含”以及该单词的变化形式，如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”表示“包括(但不限于)”并且不意欲排除，例如，其它添加物、组分、整数或步骤。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”表示以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理学病况或病症为目的对患者进行的医学管理。这些术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理学病况或病症的治疗，并且还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理学病况或病症的原因，恢复患者在患病前的原始参数的治疗，包含提高任何病理性降低的参数，如心脏收缩性。这些术语可以表示减轻根本疾病的症状，和/或减少导致这些症状的根本细胞、生理或生化原因或机制中的一种和多种。应理解如上下文中所使用的，降低表示相对于该疾病的状态，包括该疾病的分子状态，而不仅该疾病的生理状态。此外，这些术语包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理学病况或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理学病况或病症的发展的治疗；及支持性治疗，即用于补充另一种针对该相关疾病、病理学病况或病症的改善的特定疗法的治疗。这些术语表示具有治愈或减轻目的的治疗及具有预防目的的治疗两者。所述治疗可以急性或慢性进行。应理解治疗可以表示相对于对照，一种或多种症状或特征减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、99.99％、100％。在这些术语的背景中，预防是指化合物或组合物(如所公开的化合物和组合物)在诊断患有疾病的患者中或者在处于发生这种疾病的风险的患者中预防本文所鉴别的疾病的能力。在这种背景下，预防包含相对于对照延迟该疾病的发病。这些术语不要求该治疗实际上有效以产生任何预期结果。达到这些结果即足够。
可以在本文中使用本领域的技术人员熟知的缩写(例如，“h”或“hr”表示小时，“g”或“gm”表示克，“mL”表示毫升且“rt”表示室温，“nm”表示纳米，“M”表示摩尔以及类似缩写)。
描述了以下实施例以向本领域技术人员提供如何制备和评价本文所主张的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且以下实施例旨在是纯粹示例性的，并且不意欲限制本发明公开。已进行了工作以确保相对于数值的准确度(例如，量、温度等)，但是应说明一些误差和偏差。除非另外说明，否则份数是重量份数，温度以℃为单位并且如果未提及，则温度是环境温度，且压力在大气压力下或附近。
实验
实施例1
HM01对来自心肌梗塞引起的心力衰竭的小鼠模型及对照小鼠的心肌细胞的影响
方法
动物研究的伦理批准
研究是在瑞典斯德哥尔摩的卡罗琳斯卡学院(Karolinska Institutet)进行的。本研究经斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会(Stockholm North Ethical Committee onAnimal Experiments)批准。动物实验符合瑞典动物福利法(Swedish Animal WelfareAct)、瑞典福利条例(Swedish Welfare ordinance)及瑞典当局的建议及适用法规(伦理许可2155-2020及N273-15)。动物实验符合欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU的指南。将小鼠维持在12小时光照/黑暗周期中，并无限制提供食物及水。
心肌梗塞引起的心力衰竭的小鼠模型
用氧气及异氟烷的气体混合物麻醉12至16周大的C57BL/6小鼠。如前所述，通过永久结扎左冠状动脉引起心肌梗塞(MI)。假手术动物接受相同程序，且无冠状动脉结扎(假(SHAM))。在程序后4周，当在MI组中出现明显心力衰竭(HF)病征时，处死动物：超声心动描记显示左心室缩短分数(FS)降低及非收缩性梗塞前壁(％FS MI＝29.3±1.1，SHAM＝61.4±2.1)。镇静后，通过颈椎脱位使小鼠安乐死，并收集心脏并处理以用于心肌细胞分离。使用心脏重量对体重之比作为评价心脏肥大的参数(心脏重量/体重，MI＝9.5±1.3，SHAM＝6.0±0.4)。此外，患MI的小鼠心脏在冠状动脉闭塞下方的LV前壁上显示出坏死梗塞区域，其覆盖约1/3的左心室。总计使用5只SHAM及3只MI小鼠进行研究。
心肌细胞分离
按照Alliance for Cellular Signalling(AfCS程序规程ID PP00000125)开发的规程，从分别来自SHAM及HF小鼠的心室新鲜分离心肌细胞。从5个SHAM及3个HF心脏，制备细胞悬浮液并分别分成10等份，总计50个来自SHAM的等份及30个来自HF心脏的等份。如所说明的，用媒介物、AC01/HM01或D-Lys3-GHPR-6+AC01/HM01处理这些等份并用于后续生理及生化实验。
试剂
将AC01/HM01在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS：以mM为单位：NaCl 137、KCl 7、Na2HPO410、KH2PO4 1.8M)中混悬并在Tyrode溶液中稀释以获得3个不同浓度：0.2、0.5或1μM。我们使用在0.2-1μM内的浓度范围以确保受体被激活。将D-Lys 3GHRP-6(胃饥饿素受体拮抗剂；Sigma Aldrich，Stockholm,Sweden；拮抗活性的IC50＝0.9μM)在PBS中活性，并以3μM作为在Tyrode溶液(以mM为单位：NaCl 121、KCl 5.0、CaCl2 1.8、MgCl2 0.5、NaH2PO4 0.4、NaHCO324、EDTA0.1、葡萄糖5.5)中的最终浓度使用。在收缩性及Ca2+信号转导测量及生化测定之前，将来自SHAM及HF心脏的心肌细胞混悬液随机分成3种治疗类型：媒介物、AC01/HM01或D-Lys3-GHPR-6+AC01/HM01。用不同试剂的治疗在室温下进行15分钟。将一些细胞混悬液等份在液N2中快速冷冻并储存在-80℃以用于随后的生化分析。关于心肌细胞的治疗，所有实验均以盲法实施。
共聚焦成像
将新鲜分离的心肌细胞等分至1.5ml管中，并与细胞可渗透形式的荧光Ca2+指示剂Fluo-3 AM一起培育，随后清洗＞5min。在用不同试剂刺激之前，将细胞在涂有层粘连蛋白的玻璃底皿(Mattek，Ashland，MA，USA)上铺板，其构成定制灌注/刺激室，并连续灌注具有以下组成的O2/CO2(95/5％)鼓泡的Tyrode溶液(以mM为单位：NaCl121、KCl 5.0、CaCl21.8、MgCl2 0.5、NaH2PO4 0.4、NaHCO3 24、EDTA0.1、葡萄糖5.5)，其表示媒介物溶液。将来自SHAM的15个批次及来自HF的9个批次心肌细胞随机分配至不同治疗：媒介物、AC01/HM01(0.2、0.5或1μM)或用D-Lys3-GHPR-6(3μM)，随后用AC01/HM01(1μM)预处理。使用连接至该灌注/刺激室的两个铂电极之间的电场，在超阈值电压下以1Hz刺激心肌细胞收缩。使用共聚焦显微镜(Biorad；40×油镜)仅对电刺激后收缩并显示出正常形态(例如，纹状、“砖形”)的心肌细胞采集线扫描荧光图像。不分析显示出自发收缩的细胞。使用ImageJ软件(由NIH(Bethesda,USA)开发的开源软件)定量单个心肌细胞的荧光(Ca2+瞬时)及收缩性的变化。
心肌细胞收缩性的测量
将新鲜分离的心肌细胞等分至1.5ml管中，并与细胞可渗透形式的荧光Ca2+指示剂Fluo-3 AM一起培育约20分钟，随后清洗＞5min。将细胞在涂有层粘连蛋白的玻璃底皿(35mm，Matek，Ashland，MA，USA)上铺板，并且然后在定制的灌注/刺激室中封固。用具有以下组成(以mM为单位)的O2/CO2(95/5％)鼓泡的Tyrode溶液连续灌注细胞：NaCl 121、KCl5.0、CaCl2 1.8、MgCl2 0.5、NaH2PO4 0.4、NaHCO3 24、EDTA 0.1、葡萄糖5.5，其表示媒介物溶液。
将来自SHAM的15个等份及来自HF的9个等份的心肌细胞混悬液随机分配至不同治疗：媒介物、AC01/HM01(0.2、0.5或1μM)或用D-Lys3-GHPR-6(3μM)，随后用AC01/HM01(1μM)预处理。使用连接至该灌注/刺激室的两个铂电极，以超阈值电压以1Hz电刺激心肌细胞收缩。使用共聚焦显微镜(Biorad；40×油镜)采集线扫描荧光图像。仅从在电刺激时收缩并且显示出正常形态(例如，纹状、“砖形”)的心肌细胞记录图像。不分析显示出自发收缩的细胞。使用ImageJ软件(由NIH(Bethesda,USA)开发的开源软件)定量单个心肌细胞的荧光(Ca2+瞬时)及收缩性的变化。
胞内Ca2+的测量
使用共聚焦显微镜(Biorad)以线扫描模式测量Ca2+瞬变。将491nm的波长用于激发，并在＞515nm的波长收集发射光。将线扫描沿心肌细胞的长轴取向。将荧光信号(F/Fo)计算为Ca2+瞬变开始前的静态荧光(F0)与Ca2+瞬变的峰值荧光(F)之比。
心肌细胞收缩性的测量
将心肌细胞的收缩性测量为长度缩短的百分比(缩短分数；％FS)。将分离的心肌细胞在灌注室中暴露于上述试剂：媒介物或AC0/HM01(在Tyrode溶液中0.2、0.5或1μM)，其具有或不具有胃饥饿素受体拮抗剂D-Lys3-GHPR-6(在Tyrode溶液中3μM)。
蛋白免疫印迹
使用补充有磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich P2850-1ML，P5726-1ML，斯德哥尔摩，瑞典)的NP40缓冲液(Thermo Fisher FNN0021，斯德哥尔摩，瑞典)裂解冷冻心肌细胞悬浮液等分试样。通过电泳分离蛋白裂解物并转移至膜上。将膜与以下一抗培育：兔抗磷酸(Ser22-23)心脏肌钙蛋白I(cTnI,Cell Signalling,Leiden,The Netherlands#4004S)及兔抗cTnI(Cell Signaling#4002S,Leiden,The Netherlands)。然后，使用红外标记的第二抗体(IRDye 680及IRDye 800，1:5000，Licor)。使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor,BadHomburg,Germany)分析免疫反应性条带。用Image J(NIH，贝什斯达，美国)定量条带密度，归一化至总cTnI，并且将最终数据表示为与表示提取自媒介物处理的细胞的蛋白质的条带相比的升高倍数。
心肌细胞中的PKA活性测定
使用基于Elisa的PKA激酶活性测定试剂盒(ab139435，Abcam，剑桥，英国)来确定心肌细胞中的PKA活性。将冷冻心肌细胞等份融化并与含有(mM)下列的裂解缓冲液混合：20MOPS、50β-磷酸甘油、5EGTA、2EDTA、1苯甲脒、1原钒酸钠、1％NP40、1DTT、完全蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche Diagnostics，西萨塞克斯(West Sussex)，英国)及磷酸酶抑制剂混合物3(Sigma，吉林厄姆(Gillingham)，英国)。根据生产商的说明书27测定每种样品约2μg的蛋白质。
统计
使用学生氏t检验(未配对)在2组之间进行统计比较。对于＞2组之间的比较，使用ANOVA分析。将p＜0.05认为具有统计显著性。将平均数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。在图中，如下表示P值：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
结果
AC01/HM01提高心肌细胞收缩性(图1)
在分离的心肌细胞中测量对不同浓度(0.2、0.5及1μM)的AC01/HM01及媒介物响应的收缩性。图1上图显示了SHAM心肌细胞的收缩性(测量为长度缩短分数的百分比(FS％))以剂量依赖性方式升高，其在0.5及1μM的AC01/HM01下具有相当大且统计学显著的反应。图1下图显示在SHAM及HF两者中用AC01/HM01(1μM)处理的心肌细胞显示出表示为缩短分数百分比(FS％)的收缩性相比于媒介物的显著升高，并且使用胃饥饿素受体拮抗剂D-Lys3GHRP-6(3μM)预处理阻断AC01/HM01的收缩作用，从而表明该分子机制对胃饥饿素受体信号转导特异。我们使用从对照(SHAM)及心肌梗塞引起的心力衰竭(HF)小鼠中分离的心肌细胞来测量收缩性。与使用AC01/HM01的治疗无关，HF心肌细胞中的心肌细胞收缩性相较于SHAM似乎更高。来源于心脏非缺血部分的来自MI引起的HF的活心肌细胞通过增强Ca2+循环及肌丝敏感性来改善其收缩性，从而补偿梗塞/坏死的心肌。然而，在SHAM及HF中均观察到AC01/HM01引起的收缩性相比于媒介物处理的心肌细胞升高，从而表明不考虑心肌细胞的状态，这种分子均可进一步改善收缩性。
AC01/HM01提高心肌细胞收缩性且不升高Ca2+瞬变幅度(图2；图3)
所有临床可用的变力剂均通过提高胞内Ca2+浓度来提高收缩性，这导致了它们不良的安全性谱。因此，意外地观察到在图1中所观察到的收缩性升高是在不改变Ca2+瞬变的情况下实现的：图2显示在AC01/HM01的任何测试浓度下均未观察到Ca2+瞬变幅度的显著变化。然而，如图1所示，AC01/HM01提高缩短分数(收缩性)。这表明收缩作用与Ca2+敏感性增强相关，而不是与Ca2+释放升高相关。图3显示AC01/HM01不提高SHAM心肌细胞中的Ca2+瞬变。在来自SHAM小鼠的心肌细胞中，与媒介物处理的细胞相比，添加或不添加D-Lys3前处理的AC01/HM01均对Ca2+瞬变幅度没有任何影响(图3)。这进一步确认AC01/HM01的收缩作用是通过增强Ca2+敏化机制驱动的，如图2所示。
AC01/HM01降低与Ca2+敏感性增强相关的cTnI磷酸化(图4)
先前已显示在心脏肌节蛋白cTnI的丝氨酸残基22-23上的磷酸化变化通过cAMP-PKA依赖性机制影响剥皮小鼠及大鼠肌细胞中的肌丝Ca2+敏感性。为探索在我们的实验模型中Ca2+敏感性及收缩性增强背后的分子机制，在添加或不添加D-Lys 3的情况下使用媒介物或AC01/HM01处理SHAM小鼠心肌细胞混悬液，然后进行生化分析。图4显示在蛋白提取物的蛋白印迹测定中，与媒介物处理的心肌细胞(左柱，白色柱)相比，AC01/HM01处理的心肌细胞显示出降低的cTnI(丝氨酸22-23)的磷酸化水平(中间柱；灰色柱)，而使用D-Lys3预处理阻断了这种作用(右柱，红色柱)。这些数据与AC01/HM01激活胃饥饿素受体并经由cTnI磷酸化减少提高Ca2+敏感性的模型一致。
AC01/HM01降低心肌细胞PKA活性并降低cTnI磷酸化(图5)
cTnI磷酸化(Ser 22-23)是由PKA介导的。因此，我们研究AC01/HM01是否影响PKA的酶活力。图5显示与媒介物相比，AC01/HM01处理的心肌细胞的PKA活性降低，且在AC01/HM01刺激前使用D-Lys 3的预处理会阻断这种作用。这意外地表明胃饥饿素受体激动剂AC01/HM01可以激活Gα抑制性(Gαi)信号转导，其抑制腺苷酸环化酶活性，从而导致PKA活性降低。
讨论
我们的数据显示AC01/HM01以剂量依赖性方式提高心肌细胞收缩性，但媒介物不会。出乎我们意料之外并且与现有变力剂相比，AC01/HM01提高收缩性而不提高心肌细胞Ca2+瞬变幅度，从而表明作为替代通过提高肌丝Ca2+敏感性来提高收缩性。
特异性胃饥饿素拮抗剂D-Lys 3GHRP-6阻断AC01/HM01对心肌细胞收缩性的影响，这进一步证实收缩作用是受胃饥饿素受体信号转导控制的。AC01/HM01引起的肌丝Ca2+敏感性升高似乎与胃饥饿素受体G-α抑制性(G-αi)信号转导相关，其导致PKA活性降低及cTnISer 22-23磷酸化降低。这表明了一种影响肌丝功能以提高收缩性的新型药理学方式。这些结果突出显示了这种新型首创(first in class)分子在没有提高Ca2+浓度并导致需氧量增加、心动过速、心律不齐、缺血及死亡率升高的常规变力剂机制的情况下，用于治疗心力衰竭、提高收缩性及心输出量的潜在用途和新型作用机制。
血液动力学调控的核心是自主神经系统，其控制儿茶酚胺(肾上腺素和去甲肾上腺素)从交感神经末梢及肾上腺释放。其重要功能是调控心脏中的变力状态。心脏中β-肾上腺素能受体的激活导致刺激cAMP-PKA信号转导，其导致由于心率升高(心率变律)、收缩力升高(心率变律性(chronotropy))及松弛速率升高(舒张性)而导致的心输出量增加。通过cAMP-PKA激活提高心脏收缩力取决于肌细胞中Ca2+信号转导的增强。不需要Ca2+释放的毒性强化作用的提高收缩性的替代机制是肌丝Ca2+敏化作用。确实存在经由cTnI在N末端的丝氨酸残基22及23(小鼠中的Ser22/23及人中的Ser23/24)处的PKA依赖性磷酸化来调控Ca2+敏感性的生理机制，其调控cTnC的Ca2+结合亲和力。当cTnI磷酸化时，肌丝Ca2+敏感性降低，并且力-Ca2+关系曲线右移(对于给定的Ca2+浓度，力较小)。cTnI磷酸化(Ser 22-23)与肌丝的Ca2+敏感性之间存在逆相关的证据在晚期衰竭心脏中找到实例，与供体心脏相比，其显示出cTnI的磷酸化降低且Ca2+敏感性增加，而使用PKA的治疗消除了衰竭及非衰竭肌细胞之间Ca2+敏感性的任何差异。这表明在衰竭心脏中，存在激活的代偿机制以通过Ca2+敏感性增强来改善收缩性。出乎我们意料之外，AC01/HM01似乎加强了这些Ca2+敏感性机制。
总之，我们的数据证实新型分子AC01/HM01是首创新型促肌剂(myotrope)，其特异性作用于胃饥饿素受体并提高心肌细胞收缩性。与通过有害地提高Ca2+瞬变而起作用的常规变力剂相反，作为替代AC01/HM01降低PKA活性并降低cTnI磷酸化，这可能通过Gαi介导的受体信号转导并因此提高Ca2+敏感性(图6)。这是显示AC01/HM01在心肌细胞中收缩性升高的首次报道。本研究支持AC01/HM01作为HF中心脏收缩性降低的治疗的用途。
实施例2
用于评价口服施用的HM01在男性健康志愿者中的安全性及药物动力学的人类单次递增剂量1期随机双盲安慰剂对照研究
主要目标
·通过评价单次递增剂量口服HM01的安全性及耐受性来确立最大耐受剂量(MTD)，研究最大剂量高至10mg。
·评价单次口服施用后HM01及其代谢产物(M2、M6及M9)的药物动力学(PK)。
次要目标
·评价药效学(PD)生物标志物。
·评价与HM01作用机制有关的功能参数。
研究设计
单中心、随机、双盲、安慰剂对照、单次递增剂量(SAD)研究。
在剂量施用前28天内进行筛选检查。如果没有安全性问题，则合格受试者在第-1天早上返回研究中心，并继续住院直至在剂量施用后72小时(第4天早晨)出院。在第1天早晨施用口服剂量。受试者在治疗后7天，即在第8天(±1天)早晨返回诊所进行安全性评价。
在完成群组全部72小时评价后，审查盲法安全性及化名化PK数据，并由剂量递增委员会(DEC)决定下一次剂量增量。
根据安全性谱的性质、频率及严重程度，DEC(在适当的时候包括主题专家)决定是否：·继续按照计划方案进行该剂量递增；·停止该剂量递增(即不进一步剂量施用研究药物)；·继续剂量递增进一步至计划剂量，即剂量＞5mg(但＜10mg)。
所涉及的受试者
健康男性不吸烟的受试者，年龄在18至50岁(含)之间，体重指数(BMI)在18.5至29.9kg/m2(含)之间。计划每个剂量步骤8位受试者的群组。在对4位受试者剂量施用后，终止群组1(10mg或安慰剂)。群组2至4各由8位受试者组成，即将总数28位受试者随机分配并完成研究。无人退出。
测试产品、剂量及施用方式
明胶胶囊中的HM01 HCl粉末。群组1的胶囊强度为0.1mg及1.0mg及10mg。
群组1：10mg HM01
群组2：0.1mg HM01群组3：0.3mg HM01群组4：1.0mg HM01
第一群组由4位受试者(3个活性剂，1个安慰剂)组成。
群组2至4由8位受试者组成，6位受试者接受一剂量HM01，且2位受试者接受安慰剂。出于安全性原因，将各群组分成2个子组：第一子组2位受试者(1位HM01，1位安慰剂)及第二子组6位受试者(5位HM01，1位安慰剂)。第二子组仅在由研究者评价后至少24小时不存在任何重大安全性问题的情况下才开始。
受试者在禁食状态(至少8小时不进食)下接受剂量施用。限制获取食物，直至剂量施用后4小时。胶囊与240mL水一起口服施用。
安全性变量
在筛选期间评价并在整个研究期间几次评价不良事件(AE)、生命体征(血压、脉搏率及体温)、12-导联ECG、霍尔特氏(Holter)-ECG、身体检查(PE)及实验室检查(血液学、临床化学及尿分析)。
药物动力学变量
在剂量施用前(药物施用前60分钟内)及在剂量施用后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、16、24、30、36、48、60及72小时收集用于HM01及3种主要代谢产物(M2、M6及M9)分析测定的血液样品(18个样品)。剂量施用后24小时收集尿液。使用验证的LC-MS/MS方法分析血液及尿液样品的HM01及其代谢产物浓度。
所评估的PK参数包括Cmax(最大观察浓度)、Cmax/D(Cmax/剂量单位)、tmax(峰值时间)、Clast(高于定量下限的最后可测量浓度)、tlast(Clast的时间)、AUC(0-24)及AUClast(分别为从时间0至24小时及至最后可测量浓度tlast的血浆浓度-时间曲线下面积)，AUClast/D(AUClast/剂量单位)，AUC∞(从时间零至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积)，AUC∞(/D(AUC∞/剂量单位)，t1/2(表观终末半衰期)，CL/F(血管外施用后的全身性清除，仅对于母体药物)，Vz/F(血管外施用后的表观分布容积，仅对于母体药物)，MRT(平均停留时间)。
其它参数来源于尿液，即Ae(0-24)，即24小时内排泄的母体药物及代谢产物的量，及CLR，即肾清除率。
药效学变量
在剂量施用前及剂量施用后0.5、1、2、3、4、6及24小时通过静脉穿刺收集用于确定血清中生长激素(GH)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促乳激素、皮质醇及醛甾酮的血液样品。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定所有生物标志物。简化的营养食欲调查问卷基于在第-1天晚餐后及第1天剂量施用前、剂量施用后1、2、4、8及24小时的食欲评价。大便日记从第1天开始，直至第4天出院。
结果
药物动力学
对于HM01及M6，观察到AUC∞及Cmax中的剂量成比例升高。观察到HM01及M6的AUClast稍大于剂量成比例升高，其斜率分别为1.29及1.26，且90％置信区间大于1。所有剂量的HM01的算术平均半衰期(9至11小时)、中位tmax(3至4小时)、几何平均清除(55.9至65.8L/h)及分布容积(801至911L)是类似的。施用0.1mg至10mg HM01后，M6的算术平均半衰期在23至37小时范围内，且中位tmax在3.0至5.0小时范围内。施用0.3及1.0mg HM01后M6对HM01的AUC∞之比是类似的(2.330，2.336)，且对于10mg剂量稍低(1.761)。约10％的10mg剂量作为母体化合物HM01从尿液中排泄出，且16％作为M6排泄出。
药效学
施用HM01后GH的浓度从基线升高，剂量施用后2至3小时达到峰值浓度。施用1.0及10mg HM01后GH升高更高，而施用0.3及0.1mg HM01后观察到较低的升高。施用1.0及10mgHM01后，平均GH曲线类似。达到峰值后，GH浓度快速下降。对于IGF-1血清浓度，未观察到剂量组与安慰剂组之间的相关差异。施用较高剂量的1.0及10mg HM01后，ACTH、促乳激素、皮质醇及醛甾酮的浓度迅速升高至高于基线值。通常在剂量施用后2至3小时观察到峰值浓度。此后，浓度迅速下降。施用1.0及10mg HM01后的升高是类似的，除了促乳激素，其中相较于1.0mg，施用10mg后的升高更高，及ACTH，仅在1.0mg HM01剂量后确定其水平。食欲问卷调查显示剂量组与安慰剂组之间无相关或一致差异。每天排便数及排便受试者数在剂量组间没有剂量相关差异。
安全性
报告治疗紧急不良事件(TEAE)的受试者数及TEAE数剂量依赖性升高：与5位受试者(71.4％)在安慰剂后报告5次TEAE相比，在0.1mg HM01后无TEAE报告，2位受试者(33.3％)在0.3mg后报告5次TEAE，3位受试者(50.0％)在1.0mg后报告7次TEAE，及3位受试者(100％)在10mg HM01后报告19次TEAE。
最频繁报告的TEAE是神经系统病症(主要是头痛)及心脏病症(主要是窦性心律过缓)，其主要在剂量施用后不久开始且持续时间短。大多数TEAE是轻度强度，在各施用1.0mg(热潮红)及10mg AC01(窦性心律过缓)及安慰剂(头痛)后，有1位受试者报告中等强度的TEAE。任何实验室参数在剂量施用组之间均无临床相关差异。平均收缩压及舒张压及体温在剂量施用后未显示临床相关变化或者在这些治疗组之间未显示出差异。
实施例3
在患有射血分数降低(HFrEF)的心力衰竭的患者中，使用口服胃饥饿素激动剂AC01的随机、双盲、多次递增剂量、安慰剂对照、多中心、安全性、耐受性、效力、药物动力学(PK)及药效学(PD)1b/2a期试验。
本研究专注于患HFrEF的患者，其具有低心脏收缩性、低心输出量及维持心输出量的适应不良神经激素激活、严重症状及由于心力衰竭恶化所造成的高住院治疗率及死亡，且上述临床前数据表明AC01通过钙敏化作用而不是提高钙浓度来增加心肌细胞收缩性，并因此可以改善心脏收缩性、心输出量及临床结果，而不产生常规变力剂的副作用。
研究设计
多中心、随机、双盲、安慰剂对照研究分2部分进行：顺序群组剂量递增阶段(部分A)及后续平行群组扩展阶段(部分B)。患者将按3:1的比例在禁食状态下随机接受AC01或安慰剂小片剂BID 7天(剂量递增阶段，部分A)或28天(群组扩展阶段，部分B)。
剂量递增阶段(部分A)
将多达40-56位患者平分为多达7个群组。每个剂量组6位活性剂患者，2位安慰剂患者。起初，5个连续剂量群组中的每一个中的8位患者将用多次递增剂量的AC01(从每天两次0.1mg递增，最多5个连续剂量水平)或安慰剂BID治疗7天。如果认为有必要，则最多可以添加2个额外群组。剂量增量将不超过3.3倍，且比前一群组中的剂量水平高不低于25％。一旦达到每天两次5mg的总每日剂量，则终止剂量递增。患者将具有ICD(以防止心室性心律失常及重度心律过缓)。将选择两个剂量水平，在后续群组扩展阶段(部分B)中每组选择1个。然而，基于剂量递增阶段(部分A)的结果，可以鉴别群组扩展阶段(部分B)的其它剂量水平。剂量评价期将从第一次施用AC01至第12天(在每个群组中施用最后一次研究药物产品[IMP]后5天)。在1个群组中最后一次施用IMP后的第12天与下一群组中第一剂量之间至少有10天，以便有足够的时间用于安全审查委员会(SRC)审查数据。
群组扩展阶段(部分B)
在部分A完成后，40至60位之间的患者(来自部分A的不同个体)将被招募至部分B(群组扩展)。这些患者将被分至2个剂量群组，并以部分A中所鉴别的剂量水平BID治疗长达28天。如果对群组扩展选择超过2个剂量水平，则将重新评价每个群组的患者总数及/或群组总数以覆盖所有可能的剂量水平。
研究产品
将AC01配制成0.05mg及1mg强度的小片剂。安慰剂也以与AC01片剂相同外观、形状、气味及味道的小片剂递送。
目标
剂量递增阶段(部分A)
主要目标：建立多次递增剂量的口服AC01在接受每天两次(BID)治疗7天的患稳定性HfrEF的可走动患者中的安全性及耐受性，并评价群组扩展阶段(部分B)的建议剂量(RD)。
次要目标：确定AC01的PK；确定AC01的PD及PK/PD关系。
探索性目标：确定AC01对与其作用方式及靶向接合相关并与患稳定性HFrEF患者的临床结果相关的临床变量(直接影响，例如，循环GH；心搏出量[SV]及CO)的影响。
群组扩展阶段(部分B)
主要目标：扩展安全性及耐受性评价，并且在以剂量递增阶段(部分A)出现的两个剂量水平的AC01 BID治疗长达28天的患稳定性HFrEF的患者中对效力进行探索性评价。AC01的探索性效力包括(但不限于)主要直接(循环GH)及次要直接及间接血液动力学及疾病改善作用(例如，SV、CO及其它功能参数，如超声心动图指数及NT-proBNP)。
次要目标：产生关于AC01的PK的其它数据；产生关于AC01的PD及PK/PD关系的其它数据。
评价以下安全性结果(部分A及部分B)：
主要结果：心率、收缩压、平均动脉压、身体检查(肺、心脏、四肢(水肿))、心律不齐(霍尔特氏心电图[ECG]、12-导联EGG、可植入心脏复律除颤器[ICD]报告、连续遥测)、心律过缓或心跳过速(霍尔特氏ECG、12-导联ECG、ICD报告、连续遥测[仅部分A])、缺血(症状、ECG变化和/或hs-肌钙蛋白T/I)、ECG区间，即心率、PR、QRS及QTcF、血浆NT-proBNP、eGFR(钾；钠)、血液学(血红蛋白、有差异的白血球、血小板)、肝酶、不良事件(AE)、体重、血浆葡萄糖。
次要结果：PK测量：对于每个群组，将评价AC01及潜在活性M6代谢产物的PK参数以估计吸收、分布及消除的速率及程度，并支持对安全性及效力发现的解释。PD测量：将通过以上所列的安全性测量并通过使用生物标志物、非侵入性CO、超声心动描记术在事件时间表中的时间点进行的探索性效力测量来评价PD。

Claims (15)

1.用作变力剂的化学式(I)所示的化合物
或其药学上可接受的盐，
其中在化学式(I)中：
R2、R3、R5彼此独立地为C1-C6烷基，
R1、R4彼此独立地为氢或C1-C6烷基，
R6是C1-C6烷基、卤代、C1-C6烷氧基或C1-C6卤代烷基，
n为2-3，
m为1-3。
2.根据权利要求1所述的用于所述用途的化合物，其中所述变力剂不含由钙浓度升高所引起的副作用。
3.根据权利要求1-2所述的用于所述用途的化合物，其中R4是氢。
4.根据权利要求3所述的用于所述用途的化合物，其中n为2。
5.根据权利要求4所述的用于所述用途的化合物，其中R2是甲基。
6.根据权利要求5所述的用于所述用途的化合物，其中两个R2基连接至化学式(I)所示的哌啶环的相同碳环，优选地在3-基位置。
7.根据权利要求1-6所述的用于所述用途的化合物，其中适用以下条件中的一种或多种：
-R3和R5两者均为C1-C3烷基，优选地甲基，
-m为3，
-R6是卤代和/或烷氧基，优选地其中至少一个R6是烷氧基。
8.根据权利要求1-7所述的用于所述用途的化合物，为1-[(1S)-1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-3-[(4R)-1-甲基-3,3-二甲基-4-哌啶基]-脲。
9.根据权利要求1-8所述的用于所述用途的化合物，其中所述药学上可接受的盐为一氢氯化物盐。
10.根据权利要求1-9所述的用于所述用途的化合物，其用于治疗对其有需要的患者中与心脏收缩性降低或无效有关的病况。
11.根据权利要求1-10所述的用于所述用途的化合物，其用于治疗选自下列的病况：心力衰竭、心脏病、心源性休克、脓毒性休克、心肌梗塞、心肌病、肺动脉高压(PAH)。
12.根据权利要求1-11所述的用于所述用途的化合物，其中所述心肌病是扩张性心肌病(DCM)，具体地是家族性DCM。
13.根据权利要求1-11所述的用于所述用途的化合物，其用于治疗严重、晚期、慢性或急性心力衰竭。
14.根据权利要求1-11所述的用于所述用途的化合物，其用于治疗伴有心脏射血分数降低的严重、晚期、慢性或急性心力衰竭。
15.根据权利要求1-14所述的用于所述用途的化合物，其中由于钙浓度升高所造成的所述副作用选自心肌需氧量升高、缺血、心律不齐和低血压。
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