CN117405472A - 一种秀珍菇子实体组织切片的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种秀珍菇子实体组织切片的制备方法及其应用，属于生物组织学技术领域，该秀珍菇子实体组织切片的制备方法，包括以下步骤：秀珍菇子实体进行固定和脱水处理，将脱水处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯无水乙醇混合液中，进行第一次透明处理；第一次透明处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯中，进行第二次透明处理；第二次透明处理的秀珍菇子实体进行浸蜡、包埋、切片、烘片、脱蜡和复水处理；脱蜡和复水处理后的切片依次采用1％番红溶液和1％固绿溶液进行染色处理、封片，得秀珍菇子实体组织切片。本发明所述切片制备方法所得切片透明度好且染色效果佳，可以最大程度的保持秀珍菇组织的完整性，保证观察效果清晰。
Description
技术领域
本发明属于生物组织学技术领域，尤其涉及一种秀珍菇子实体组织切片的制备方法及其应用。
背景技术
秀珍菇(Pleurotuspulmonarius)，属于担子菌门，伞菌纲，伞菌亚纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，肺形侧耳种，学名为肺形侧耳，别名珊瑚菇、袖珍菇、迷你蚝菇和珍珠菇等，隶属于菌物界担子菌门伞菌纲，伞菌亚纲伞菌目，侧耳科、侧耳属。
石蜡切片技术作为研究组织细胞学和发育生物学经典的实验手段(梁艳,刘德强,潘朋等.带有愈伤组织的红松种子石蜡切片制作方法改良[J].分子植物育种,2022.)，主要利用植物的组织能够很好地与石蜡结合的基本原理，在植物发育生物学、组织学研究中有着十分重要的角色和重要的意义，它可以清晰如实地反映机体的形态变化和结构特征(李亚男,严炜,罗丽娟等.一种低毒透明剂制作植物叶片石蜡切片的方法[J].热带农业科学,2019.)，高质量的石蜡切片对操作要求较高，对不同植物组织或同一植物不同部位组织在进行石蜡制片时往往需根据组织的结构特点摸索适用的制作方法。首先，透明剂的选择会影响样品的溶解度恒温渗透性，透明剂的使用量液会影响样品的溶解甚至于破坏样品的组织结构。其次，染色剂的选择会影响制备所得切片的清晰度，染色剂的类型和染色处理的方式均会对切片的制作造成不可逆的影响。目前石蜡切片技术已用于大型真菌的子实体研究中，但研究中采用的石蜡切片技术大多直接引自于植物或动物石蜡切片的研究，根据大型食用真菌的材料自身的特点对石蜡制片技术进行优化较少。本发明对石蜡切片法进行了改良，根据秀珍菇子实体组织结构特点进行了优化。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种秀珍菇子实体组织切片的制备方法及其应用，根据秀珍菇子实体组织结构特点，对透明环节进行了优化，同时对染色处理进行了优化，得到一种透明度好、染色效果佳且耗时短的石蜡切片方法，此方法不仅可以最大程度的保持秀珍菇组织的完整性，同时透明效果较好，能保证观察效果清晰。
为实现上述目的，本发明提供了一种秀珍菇子实体组织切片的制备方法，包括以下步骤：
(1)秀珍菇子实体进行固定和脱水处理，将脱水处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯无水乙醇混合液中，进行第一次透明处理；
(2)将步骤(1)所得第一次透明处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯中，进行第二次透明处理；
(3)将步骤(2)所得第二次透明处理的秀珍菇子实体进行浸蜡、包埋、切片、烘片、脱蜡和复水处理；
(4)将步骤(3)脱蜡和复水处理后的切片依次采用1％番红溶液和1％固绿溶液进行染色处理、封片，得秀珍菇子实体组织切片。
优选的，在步骤(1)中，所述第一次透明处理的时间为30min。
优选的，在步骤(2)中，所述第二次透明处理的时间为30min。
优选的，在步骤(4)中，所述的依次采用1％番红溶液和1％固绿溶液进行染色处理，包括以下步骤：
复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色4h后，用70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，1％固绿溶液处理10～20s，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡2min。
优选的，所述柠檬烯无水乙醇混合液中柠檬烯与无水乙醇的体积比为1:1。
优选的，在步骤(3)中，所述浸蜡，包括以下步骤：
第二次透明处理的秀珍菇子实体在柠檬烯石蜡混合液中第一次浸渍2h，第一次浸渍温度为58℃；在石蜡液中第二次浸渍1.5h，第二次浸渍温度为58℃；然后在新的石蜡液中第三次浸渍1.5h，第三次浸渍温度为58℃；
所述柠檬烯石蜡混合液中柠檬烯与石蜡的体积比为1:1。
优选的，在步骤(3)中，所述脱蜡和复水处理，包括以下步骤：
将烘片处理后的切片在柠檬烯中第一次浸泡20min，在新的柠檬烯中第二次，浸泡20min，然后在无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇和70％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min。
优选的，在步骤(1)中，所述固定、脱水处理，包括以下步骤：
秀珍菇子实体浸入FAA固定液中固定处理24h，用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇和无水乙醇依次进行逐级脱水处理，每级脱水处理时间均为30min。
优选的，所述FAA固定液由70％乙醇、乙酸、40％甲醛按照体积比90:5:5组成。
本发明还提供了所述的制备方法制备所得秀珍菇子实体组织切片在鉴定秀珍菇黄斑病中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明所述的切片的制备方法，根据秀珍菇子实体组织结构特点对其中关键的透明环节进行了优化，采用柠檬烯进行透明处理，秀珍菇子实体的组织结构完整，细胞壁结构清晰，同时针对染色处理进行了优化，采用番红染色4h后再用1％固绿溶液染色10～20s处理对秀珍菇组织结构形态影响最小，染色效果最佳。本发明所述制备方法耗时短，且制备得到的石蜡切片透明度好、染色效果佳，不仅最大程度的保持了秀珍菇组织的完整性，而且能够更加清晰的观察秀珍菇子实体组织。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对比例1～3制备切片秀珍菇组织形态结构，其中，a为对比例1切片菌盖结构，d为对比例1切片菌柄纵切结构，g为对比例1切片菌柄横切结构，j为对比例1切片菌褶结构，b为对比例2切片菌盖结构，e为对比例2切片菌柄纵切结构，h为对比例2切片菌柄横切结构，k为对比例2切片菌褶结构，c为对比例3切片菌盖结构，f为对比例3切片菌柄纵切结构，i为对比例3切片菌柄横切结构，l为对比例3切片菌褶结构(标尺为50μm)；
图2为对比例4制备切片秀珍菇组织形态结构，其中，A为菌盖结构，B为菌柄纵切结构，C为菌柄横切结构，D为菌褶结构(标尺为50μm)；
图3为实施例1和对比例5～9制备切片秀珍菇组织形态结构，其中，A为对比例5菌盖结构，B为对比例5菌柄结构，C为对比例5菌褶结构，D为对比例6菌盖结构，E为对比例6菌柄结构，F为对比例6菌褶结构，G为对比例7菌盖结构，H为对比例7菌柄结构，I为对比例7菌褶结构，J为对比例8菌盖结构，K为对比例8菌柄结构，L为对比例8菌褶结构，M为实施例1菌盖结构，N为实施例1菌柄结构，O为实施例1菌褶结构，P为对比例9菌盖结构，Q为对比例9菌柄结构，R为对比例9菌褶结构(标尺为50μm)；
图4为正常与发病秀珍菇外观形态，其中，左图为正常秀珍菇，右图为发病秀珍菇；
图5为正常与发病秀珍菇子实体组织形态结构，其中，L1为正常秀珍菇菌盖结构，L2为正常秀珍菇菌柄结构，L3为正常秀珍菇菌褶结构，M1为发病秀珍菇菌盖结构，M2为发病秀珍菇菌柄结构，M3为发病秀珍菇菌褶结构(标尺为50μm)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所述的50％乙醇为乙醇体积浓度为50％的乙醇水溶液；60％乙醇为乙醇体积浓度为60％的乙醇水溶液；70％乙醇为乙醇体积浓度为70％的乙醇水溶液；80％乙醇为乙醇体积浓度为80％的乙醇水溶液；90％乙醇为乙醇体积浓度为90％的乙醇水溶液；95％乙醇为乙醇体积浓度为95％的乙醇水溶液；40％甲醛为甲醛体积浓度为40％的甲醛水溶液；50％二甲苯为二甲苯体积浓度为50％的二甲苯水溶液；1％番红溶液为0.1g番红溶解于100mL 70％乙醇；1％固绿溶液为0.1g固绿溶解于100mL 95％乙醇；石蜡液为纯石蜡液。
本发明所述柠檬烯、正丁醇、Van-clear透明剂和番红购自润友化学有限公司。
实施例1
柠檬烯透明处理且1％番红溶液染色的秀珍菇切片制备
采集：采集秀珍菇成熟子实体，将菌盖皮层、菌肉、菌褶切成1cm*1cm*1cm，菌柄切成0.5cm*0.5cm*0.5cm，秀珍菇子实体块。
固定和脱水处理：将秀珍菇子实体块浸入FAA固定液(70％乙醇、乙酸、40％甲醛按照体积比90:5:5)中固定处理24h，用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇和无水乙醇依次进行逐级脱水处理，每级脱水处理时间均为30min，最后在新的无水乙醇中再次脱水处理30min。
透明处理：将脱水处理的秀珍菇子实体块浸泡于柠檬烯无水乙醇混合液(柠檬烯与无水乙醇的体积比为1:1)中，第一次透明处理30min；第一次透明处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯中，第二次透明处理30min。
浸蜡处理：选择熔点为54℃～56℃的石蜡，融化过滤除杂后凝固，削取石蜡碎屑与柠檬烯混合，得到柠檬烯石蜡混合液(柠檬烯：石蜡的体积比为1:1)；第二次透明处理的秀珍菇子实体在柠檬烯石蜡混合液中第一次浸渍2h，第一次浸渍温度为58℃；在石蜡液中第二次浸渍1.5h，第二次浸渍温度为58℃；然后在新的石蜡液中第三次浸渍1.5h，第三次浸渍温度为58℃。柠檬烯石蜡混合液浸渍后需要更换两次纯液态石蜡，更换两次纯石蜡为了保证组织材料里面石蜡纯度，使得浸蜡更充分。
包埋处理：将浸蜡处理的秀珍菇子实体材料置于装有56～58℃液体石蜡的包埋盒中，根据观察的角度调整好材料位置，同时用加热的镊子将材料周围的气泡赶走，保持秀珍菇子实体材料水平，无褶皱，移入冷水中2h以上使其凝固。
切片和烘片处理：将包埋处理后的秀珍菇子实体蜡块修整成上下两面平行的小块(长宽不超过载玻片宽度)，将修片好的蜡块内固定好，确保切成的蜡带不弯曲成一条直线，设置切片厚度为25μm开始修片，直至切到组织，改用10μm切片；将切好的蜡带放入40℃水中进行展片，待其展开后用载玻片进行捞片；为防止组织脱离，将其放入50℃烘箱中烘烤2h。
脱蜡和复水处理：将烘片处理后的切片在柠檬烯中第一次浸泡20min，在新的柠檬烯中第二次浸泡20min，用柠檬烯脱去材料里面的石蜡，重复2次保证替换干净，避免残留；然后在无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇和70％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min。
染色和封片处理：复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色4h，70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，1％固绿溶液处理10～20s，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡1min，最后用新的柠檬烯浸泡1min，封片。
对比例1
方法一正丁醇透明处理秀珍菇切片制备
采集秀珍菇成熟子实体，将菌盖皮层、菌肉、菌褶切成1cm×1cm×1cm，菌柄切成0.5cm×0.5cm×0.5cm，秀珍菇子实体块，迅速放入装有固定液的青霉素瓶中，抽气3次，静置10min，打开瓶塞使材料沉底，加盖密封，固定24h。
采用乙醇脱水剂梯度浓度法脱水：脱水过程依次为50％乙醇(50min)→60％乙醇(50min)→70％乙醇(40min)→80％乙醇(40min)→90％乙醇(40min)→95％乙醇(40min)→无水乙醇(1h)→无水乙醇(1h)。无水乙醇处理2次。
透明：材料先经1/2纯正丁醇+1/2无水乙醇透明40min，再经过2次纯正丁醇处理，每次处理时间为1h，温度40℃。
浸蜡与埋蜡：选择熔点为54℃～56℃的石蜡，过滤除杂后凝固，用刀刮取石蜡碎屑，加入到含有纯正丁醇的小瓶中，放入恒温鼓风干燥箱，调节温度至50℃，过夜；次日，将试验材料转移至56℃～58℃液态石蜡中，温度不得超过石蜡熔点2℃，每隔1h后更换纯石蜡一次，更换3次。将石蜡(56℃～58℃)倒入提前叠好的包埋纸盒中，纸盒用A4纸(厚约0.5mm)折成，并需用铅笔在反面写上日期及材料。待石蜡表面有一层薄膜时，用镊子迅速将材料移入纸盒，调整材料位置，同时用加热的镊子赶走材料周围的气泡，使材料水平，无倾斜，无褶皱，移入冷水中促使凝结，蜡面凝结成薄层时，将纸盒全部沉入，水冷凝后，将纸盒撕去，即获蜡块。
切片：将已包埋好的蜡块切成小块，将多余的蜡块切除，可粗视到材料切面，但不要太靠近组织，将蜡块上下两面修成平行的面，使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲。切片机进行切片，将修整好的蜡块在固定架上固定好，装好切片刀，调整刀的倾斜角度至7.5°(与竖直平面夹角)后固定，开启电源，转动转轮，调至30μm开始修片，直至切到组织时，改用12μm切片，切好的蜡带放于纯水中供粘片用。
粘片：将切好的符合要求的蜡带浮于装有纯水的洁净培养皿里，然后将洗净的载玻片一端浸入培养皿中，并用镊子将蜡带轻轻位移载玻片上排列整齐，使切片展开烫平，材料不出现皱纹为准。用滤纸吸去多余水分，放入烘箱，温度35℃～37℃，放置12h即干。
脱蜡并染色：玻片烘干后，用二甲苯脱蜡，经酒精脱水，而后再染色。其顺序为：纯二甲苯2次(每次20min，37℃)→50％二甲苯(5min)→无水乙醇(5min)→95％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→70％乙醇(5min)→60％乙醇(5min)→50％乙醇(5min)→1％番红溶液(3h)→50％乙醇洗涤三次，洗去多余的浮色→60％乙醇(5min)→70％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→90％乙醇(5min)→95％乙醇(5min)，然后再1％固绿溶液(10～20s)→95％乙醇漂洗(20s)→无水乙醇(1min)→1/2纯二甲苯+1/2无水乙醇(5min)→纯二甲苯2次(每次5min)。
封固：在二甲苯未挥发时，将中性树胶，取一滴在材料上，盖上盖玻片。待树胶冻结后，用刀片沿载玻片边缘将多余的明胶去除即可获得切片，然后封片。
对比例2
方法一Van-clear透明剂透明处理秀珍菇切片制备
采集秀珍菇成熟子实体，将菌盖皮层、菌肉、菌褶切成1cm×1cm×1cm，菌柄切成0.5cm×0.5cm×0.5cm，秀珍菇子实体块，迅速放入装有固定液的青霉素瓶中，抽气3次，静置10min，打开瓶塞使材料沉底，加盖密封，固定24h。
采用乙醇脱水剂梯度浓度法脱水：脱水过程依次为50％乙醇(50min)→60％乙醇(50min)→70％乙醇(40min)→80％乙醇(40min)→90％乙醇(40min)→95％乙醇(40min)→无水乙醇(1h)→无水乙醇(1h)。无水乙醇处理2次。
透明：材料先经1/2Van-clear透明剂+1/2无水乙醇透明40min，再经过2次Van-clear透明剂处理，每次处理时间为1h，温度40℃。
浸蜡与埋蜡：选择熔点为54℃～56℃的石蜡，过滤除杂后凝固，用刀刮取石蜡碎屑，加入到含有Van-clear透明剂的小瓶中，放入恒温鼓风干燥箱，调节温度至50℃，过夜；次日，将试验材料转移至56℃～58℃液态石蜡中，温度不得超过石蜡熔点2℃，每隔1h后更换纯石蜡一次，更换3次。将石蜡(56℃～58℃)倒入提前叠好的包埋纸盒中，纸盒用A4纸(厚约0.5mm)折成，并需用铅笔在反面写上日期及材料。待石蜡表面有一层薄膜时，用镊子迅速将材料移入纸盒，调整材料位置，同时用加热的镊子赶走材料周围的气泡，使材料水平，无倾斜，无褶皱，移入冷水中促使凝结，蜡面凝结成薄层时，将纸盒全部沉入，水冷凝后，将纸盒撕去，即获蜡块。
切片：将已包埋好的蜡块切成小块，将多余的蜡块切除，可粗视到材料切面，但不要太靠近组织，将蜡块上下两面修成平行的面，使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲。切片机进行切片，将修整好的蜡块在固定架上固定好，装好切片刀，调整刀的倾斜角度至7.5°(与竖直平面夹角)后固定，开启电源，转动转轮，调至30μm开始修片，直至切到组织时，改用12μm切片，切好的蜡带放于纯水中供粘片用。
粘片：将切好的符合要求的蜡带浮于装有纯水的洁净培养皿里，然后将洗净的载玻片一端浸入培养皿中，并用镊子将蜡带轻轻位移载玻片上排列整齐，使切片展开烫平，材料不出现皱纹为准。用滤纸吸去多余水分，放入烘箱，温度35℃～37℃，放置12h即干。
脱蜡并染色：玻片烘干后，用二甲苯脱蜡，经酒精脱水，而后再染色。其顺序为：纯二甲苯2次(每次20min，37℃)→50％二甲苯(5min)→无水乙醇(5min)→95％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→70％乙醇(5min)→60％乙醇(5min)→50％乙醇(5min)→1％番红溶液(3h)→50％乙醇洗涤三次，洗去多余的浮色→60％乙醇(5min)→70％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→90％乙醇(5min)→95％乙醇(5min)，然后再1％固绿溶液(10～20s)→95％乙醇漂洗(20s)→无水乙醇(1min)→1/2纯二甲苯+1/2无水乙醇(5min)→纯二甲苯2次(每次5min)。
封固：在二甲苯未挥发时，将中性树胶，取一滴在材料上，盖上盖玻片。待树胶冻结后，用刀片沿载玻片边缘将多余的明胶去除即可获得切片，然后封片。
对比例3
方法一柠檬烯透明处理秀珍菇切片制备
采集秀珍菇成熟子实体，将菌盖皮层、菌肉、菌褶切成1cm×1cm×1cm，菌柄切成0.5cm×0.5cm×0.5cm，秀珍菇子实体块，迅速放入装有固定液的青霉素瓶中，抽气3次，静置10min，打开瓶塞使材料沉底，加盖密封，固定24h。
采用乙醇脱水剂梯度浓度法脱水：脱水过程依次为50％乙醇(50min)→60％乙醇(50min)→70％乙醇(40min)→80％乙醇(40min)→90％乙醇(40min)→95％乙醇(40min)→无水乙醇(1h)→无水乙醇(1h)。无水乙醇处理2次。
透明：材料先经1/2柠檬烯+1/2无水乙醇透明40min，再经过2次柠檬烯处理，每次处理时间为1h，温度40℃。
浸蜡与埋蜡：选择熔点为54℃～56℃的石蜡，过滤除杂后凝固，用刀刮取石蜡碎屑，加入到含有柠檬烯的小瓶中，放入恒温鼓风干燥箱，调节温度至50℃，过夜；次日，将试验材料转移至56℃～58℃液态石蜡中，温度不得超过石蜡熔点2℃，每隔1h后更换纯石蜡一次，更换3次。将石蜡(56℃～58℃)倒入提前叠好的包埋纸盒中，纸盒用A4纸(厚约0.5mm)折成，并需用铅笔在反面写上日期及材料。待石蜡表面有一层薄膜时，用镊子迅速将材料移入纸盒，调整材料位置，同时用加热的镊子赶走材料周围的气泡，使材料水平，无倾斜，无褶皱，移入冷水中促使凝结，蜡面凝结成薄层时，将纸盒全部沉入，水冷凝后，将纸盒撕去，即获蜡块。
切片：将已包埋好的蜡块切成小块，将多余的蜡块切除，可粗视到材料切面，但不要太靠近组织，将蜡块上下两面修成平行的面，使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲。切片机进行切片，将修整好的蜡块在固定架上固定好，装好切片刀，调整刀的倾斜角度至7.5°(与竖直平面夹角)后固定，开启电源，转动转轮，调至30μm开始修片，直至切到组织时，改用12μm切片，切好的蜡带放于纯水中供粘片用。
粘片：将切好的符合要求的蜡带浮于装有纯水的洁净培养皿里，然后将洗净的载玻片一端浸入培养皿中，并用镊子将蜡带轻轻位移载玻片上排列整齐，使切片展开烫平，材料不出现皱纹为准。用滤纸吸去多余水分，放入烘箱，温度35℃～37℃，放置12h即干。
脱蜡并染色：玻片烘干后，用二甲苯脱蜡，经酒精脱水，而后再染色。其顺序为：纯二甲苯2次(每次20min，37℃)→50％二甲苯(5min)→无水乙醇(5min)→95％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→70％乙醇(5min)→60％乙醇(5min)→50％乙醇(5min)→1％番红溶液(3h)→50％乙醇洗涤三次，洗去多余的浮色→60％乙醇(5min)→70％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→90％乙醇(5min)→95％乙醇(5min)，然后再1％固绿溶液(10～20s)→95％乙醇漂洗(20s)→无水乙醇(1min)→1/2纯二甲苯+1/2无水乙醇(5min)→纯二甲苯2次(每次5min)。
封固：在二甲苯未挥发时，将中性树胶，取一滴在材料上，盖上盖玻片。待树胶冻结后，用刀片沿载玻片边缘将多余的明胶去除即可获得切片，然后封片。
对比例4
方法二Van-clear透明剂透明处理秀珍菇切片制备
固定、脱水和透明：采集秀珍菇成熟子实体，将菌盖皮层、菌肉、菌褶切成1cm×1cm×1cm，菌柄切成0.5cm×0.5cm×0.5cm，秀珍菇子实体块，将切取的组织迅速浸没于FAA固定液中，并将固定液置于转速为10r/min的摇床中固定4h。固定完成后先将组织依次用浓度为75％、85％和95％的乙醇溶液进行脱水处理，每次处理0.5h，其次用无水乙醇脱水处理两次，每次0.5h。随后将脱水处理后的组织置于Van-clear透明剂与无水乙醇体积比为2:1的混合液中处理0.5h，然后置于Van-clear透明剂中透明0.5h，获得透明处理好的组织若干。
浸蜡和包埋：将透明处理后的组织浸于Van-clear透明剂与石蜡体积比为1:1的混合液中，于58℃的烘箱中浸蜡2h。最后将其置于新的液体石蜡中浸蜡处理两次，每次处理2h。浸蜡完成后进行包埋处理，包埋时将组织放入装有蜡液的包埋盒中，包埋完成后放于冷冻台上进行冷却。
切片和烘片：将包埋后的蜡块转移至轮转式切片机蜡块钳内，切片厚度设置为7μm。将得到的蜡片放入温水中进行展片，待其均匀展开后用粘附载玻片进行捞片。为防止组织脱离，将其放入50℃的烘箱烘烤2h。
脱蜡和复水：将烤片后的载玻片用Van-clear透明剂脱蜡处理两次，每次20min。脱蜡完毕后将其依次置于无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、50％乙醇和纯水中进行梯度复水，每个梯度浸泡1min。
染色：将复水后的载玻片置于质量分数为0.5％番红水溶液中染色0.7h，最后用蒸馏水缓慢清洗去除表面浮色，封片。
对比例5
与实施例1的区别仅在于，染色和封片处理步骤，具体如下：
染色和封片处理：复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色20min，70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡1min，最后用新的柠檬烯浸泡1min，封片。
对比例6
与实施例1的区别仅在于，染色和封片处理步骤，具体如下：
染色和封片处理：复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色30min，70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡1min，最后用新的柠檬烯浸泡1min，封片。
对比例7
与实施例1的区别仅在于，染色和封片处理步骤，具体如下：
染色和封片处理：复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色40min后，用70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡1min，最后用新的柠檬烯浸泡1min，封片。
对比例8
与实施例1的区别仅在于，染色和封片处理步骤，具体如下：
染色和封片处理：复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色2h后，用70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，1％固绿溶液处理10～20s，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡1min，最后用新的柠檬烯浸泡1min，封片。
对比例9
与实施例1的区别仅在于，染色和封片处理步骤，具体如下：
染色和封片处理：复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色24h，70％乙醇洗涤3次，采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，1％固绿溶液处理10～20s，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡1min，最后用新的柠檬烯浸泡1min，封片。
实验例1
观察实施例1和对比例1～9制备所得切片秀珍菇的组织形态结构
如图1所示，经对比例1(正丁醇)、对比例2(Van-Clear透明剂)、对比例3(柠檬烯)透明处理后，秀珍菇菌盖表皮都比较完好，对比例1正丁醇和对比例2VanClear透明剂处理后菌盖内部组织比对比例3柠檬烯处理后略显松散(如图1中a、b、c所示)；秀珍菇的菌柄纵切呈无规则纵向分布，结构较为紧密，但对比例1正丁醇和对比例2Van Clear透明剂对菌柄组织有一定的破坏作用，其中对比例1正丁醇处理其内部菌丝形状完整性破坏较为严重(如图1中d、e、f所示)；秀珍菇菌柄横切面细胞呈无规则网状结构，中间空隙大小不一、分布不均，对比例1正丁醇和对比例2Van Clear透明剂处理后，菌柄横切细胞结构变形，呈现无规则丝状，表明这两种透明剂对菌柄横切的组织结构影响较大，严重破坏了组织完整性，而对比例3所述柠檬烯处理下的组织结构较完整，细胞壁结构清晰(如图1中g、h、i所示)；菌褶由菌髓、子实层基和子实层组成，对比例1～3透明处理后秀珍菇菌褶纵切面均为楔形，子实层均等地覆盖于菌褶的两面，子实层菌丝直立呈现近栅栏状排列，但对比例2Van-Clear透明剂处理后菌髓组织细胞间隙变大(如图1中j、k、l所示)。形态结构观察结果表明，对比例3所采用的柠檬烯更适合作为秀珍菇石蜡切片的透明剂。
如图2所示，对比例4所述方法制备切片秀珍菇菌盖内部有轻微变形，菌柄纵切组织可以观察到管状的菌丝结构，但菌丝形状完整性受到破坏，有轻微变形且紧密度降低，菌柄横切细胞壁结构较为清晰，菌褶结构较清晰，但总体浮色较重不便于观察。
表1不同染色处理方式秀珍菇子实体组织结构状态
如图3和表1所示，通过对不同染色处理的秀珍菇菌盖、菌褶和菌柄组织结构进行观察，对比例5所述1％番红溶液染色20min处理下(如图3中A、B、C所示)，秀珍菇菌盖透明度较好，能较清晰地观察到完整的菌盖结构，但细胞间隙变大，形态轻微改变，菌柄结构较完整，但成像较模糊，菌褶出现许多皲裂现象；对比例6所述1％番红溶液染色30min处理下(如图3中D、E、F所示)，秀珍菇菌盖结构被破坏较严重，菌柄结构完整无破损，但染色效果不好，成像模糊，菌褶结构较为完整；对比例7所述1％番红溶液染色40min处理下(如图3中G、H、I所示)，菌盖组织结构透明度较好，但组织结构轻微改变，细胞间隙变大，菌柄结构比较完整，但染色效果不佳，菌褶结构较为完整，但细胞间隙变大；对比例8所述先1％番红溶液染色2h后再用1％固绿溶液染色10-20s处理下(如图3中J、K、L所示)，菌盖和菌柄结构均较完整，菌褶结构有轻微的破损，但染色效果均不佳，成像模糊；实施例1所示先1％番红溶液染色4h后再用1％固绿溶液染色10-20s处理下(如图3中M、N、O所示)，菌盖、菌柄和菌褶组织结构均较完整，且染色效果较好，形态结构清晰；对比例9所述先1％番红溶液染色24h后再用1％固绿溶液染色10-20s处理下(如图3中P、Q、R所示)，菌盖、菌柄和菌褶形态结构不同程度上改变，且菌柄染色效果差，形态结构清晰度欠佳。
综上，实施例1所述的切片制备方法采用柠檬烯为透明剂，染色处理采用先1％番红溶液染色4h，后再用1％固绿溶液染色10-20s处理方式，对秀珍菇组织结构形态影响最小，染色效果最佳，适合秀珍菇子实体形态结构观察。本发明所述的秀珍菇石蜡切片方法具有透明度好、染色效果佳、耗时短的石蜡切片方法，此方法不仅可以最大程度的保持秀珍菇组织的完整性，同时具有透明效果较好，观察效果清晰等优点。
实验例2
秀珍菇黄斑病自然发病子实体组织结构观察
利用实施例1所述切片制备方法，对自然发病后秀珍菇的子实体菌盖、菌柄及菌褶进行形态结构观察，以健康秀珍菇子实体为对照，黄斑病发病菌株由广西农业科学院微生物所珍稀食用菌室提供。
结果如图4所示，健康的秀珍菇子实体菌盖表面饱满光滑、呈浅灰色，菌柄饱满呈乳白色(如图4左图所示)；而发病后菌盖表面不平滑，出现失水和成片黄化现象，菌柄变小发黄(如图4右图所示)；对健康秀珍菇与发病秀珍菇子实体组织进行石蜡切片后(如图5所示)，观察发现正常的菌盖表皮较平整，结构紧凑(如图5中L1所示)，而发病后细胞形态结构发生改变，细胞间隙变大(如图5中M1所示)，正常菌柄细胞分布稀松，细胞间隙错落有致(如图5中L2所示)，而发病后结构遭到破坏，细胞间隙变小(如图5中M2所示)，发病后菌褶形态结构改变最为明显，健康秀珍菇的菌褶自然伸展，表层菌丝直立呈现有规则、致密的近栅栏状排列(如图5中L3所示)，而发病后菌褶细胞皱缩，细胞形态结构被严重破坏，变形严重(如图5中M3所示)。
可见，本发明所述秀珍菇子实体组织切片的制备方法能够用于观察鉴定秀珍菇黄斑病，可以最大程度的保持秀珍菇组织的完整性，同时具有透明效果较好，观察效果清晰等优点。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种秀珍菇子实体组织切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)秀珍菇子实体进行固定和脱水处理，将脱水处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯无水乙醇混合液中，进行第一次透明处理；
(2)将步骤(1)所得第一次透明处理的秀珍菇子实体浸泡于柠檬烯中，进行第二次透明处理；
(3)将步骤(2)所得第二次透明处理的秀珍菇子实体进行浸蜡、包埋、切片、烘片、脱蜡和复水处理；
(4)将步骤(3)脱蜡和复水处理后的切片依次采用1％番红溶液和1％固绿溶液进行染色处理、封片，得秀珍菇子实体组织切片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述第一次透明处理的时间为30min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述第二次透明处理的时间为30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述的依次采用1％番红溶液和1％固绿溶液进行染色处理，包括以下步骤：
复水处理后的切片，采用1％番红溶液染色4h后，用70％乙醇洗涤3次，再采用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min，1％固绿溶液处理10～20s，用95％乙醇漂洗20s，然后无水乙醇浸泡1min，柠檬烯和无水乙醇混合液浸泡1min，柠檬烯浸泡2min。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述柠檬烯无水乙醇混合液中柠檬烯与无水乙醇的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述浸蜡，包括以下步骤：
第二次透明处理的秀珍菇子实体在柠檬烯石蜡混合液中第一次浸渍2h，第一次浸渍温度为58℃；在石蜡液中第二次浸渍1.5h，第二次浸渍温度为58℃；然后在新的石蜡液中第三次浸渍1.5h，第三次浸渍温度为58℃；
所述柠檬烯石蜡混合液中柠檬烯与石蜡的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述脱蜡和复水处理，包括以下步骤：
将烘片处理后的切片在柠檬烯中第一次浸泡20min，在新的柠檬烯中第二次浸泡20min，然后在无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇和70％乙醇依次浸泡处理，每次浸泡处理的时间均为1min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述固定、脱水处理，包括以下步骤：
秀珍菇子实体浸入FAA固定液中固定处理24h后，用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇和无水乙醇依次进行逐级脱水处理，每级脱水处理时间均为30min。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述FAA固定液由70％乙醇、乙酸、40％甲醛按照体积比90:5:5组成。
10.如权利要求1～9任一项所述的制备方法制备所得秀珍菇子实体组织切片在鉴定秀珍菇黄斑病中的应用。
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