CN117402845A - 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用。本发明通过对来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的亮氨酸脱氢酶LeuDH，经过184位组氨酸突变成丙氨酸或260位丝氨酸突变成丙氨酸，获得一种亮氨酸脱氢酶突变体，以2‑酮丁酸为底物，催化生产L‑2‑氨基丁酸的过程中，该突变体显示出较高的催化活性，且对酮酸底物的耐受性大大提升，在较高浓度的2‑酮丁酸存在下仍具有较高酶活。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenases，LDH，EC1.4.1.9)是一种NADH依赖型的氧化还原酶，催化支链L-氨基酸的氧化脱氨和相应α-酮酸的可逆还原胺化，并具有反应条件温和、产物光学纯和转化效率高等优点。1961年，Sanwal等人最先在Bacillus cereus中克隆和表达了亮氨酸脱氢酶，随后，后人对不同菌株来源的亮氨酸脱氢酶基因进行克隆和异源表达，为一些手性非天然氨基酸的生物合成提供更多途径。
来源不同的亮氨酸脱氢酶具有不同的催化性质和功能，通过基因工程手段构建高酶活菌株可以改善反应。在制备L-2-氨基丁酸过程中，亮氨酸脱氢酶是反应的关键酶。L-2-氨基丁酸(L-2-ABA)作为一种非天然氨基酸是非常重要的医药中间体，广泛应用于医药合成领域，如抑菌抗结核药物盐酸乙胺丁醇，新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦。提供一种高活性的亮氨酸脱氢酶，去提高L-2-ABA的生产效率，具有重要的现实意义。
在工业生产中，理想的情况为投入的底物越多，得到的产物就越多，能解决多批次反应造成的高成本问题，也能增加生产的效益。但是往往在实际的酶促反应中存在底物或产物抑制等情况致使酶的催化活力降低，反应的情况往往无法达到需求，所以需要控制所加的底物浓度在合适的范围内。但是利用基因工程手段生产L-2-ABA时，存在明显的底物抑制。因此需要更高酶活的亮氨酸脱氢酶来降低或解除底物抑制。
发明内容
为了解决上述现有亮氨酸脱氢酶酶活不高的技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用。本发明通过对来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomycesintermedius)的亮氨酸脱氢酶LeuDH进行突变，提高亮氨酸脱氢酶对酮酸底物的耐受性，降低对高浓度底物酮酸的抑制效果，为L-α-氨基酸的高效制备提供具备工业价值的生物催化剂。
本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，184位组氨酸突变成丙氨酸或260位丝氨酸突变成丙氨酸。
本发明通过对来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomycesintermedius)的亮氨酸脱氢酶LeuDH，经过184位组氨酸突变成丙氨酸或260位丝氨酸突变成丙氨酸，获得一种亮氨酸脱氢酶突变体，以2-酮丁酸为底物，催化生产L-2-氨基丁酸的过程中，该突变体显示出较高的催化活性，且对酮酸底物的耐受性大大提升，在较高浓度的2-酮丁酸存在下仍具有较高酶活。
作为本发明上述技术方案的进一步优选，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或如SEQ ID NO.5所示。
进一步优选，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
同时，本发明提供了一种编码上述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
基于本发明提供的亮氨酸脱氢酶突变体，编码该亮氨酸脱氢酶突变体的基因仍应属于本发明的保护范围。
本发明还提供了携带上述基因的重组表达载体。
重组表达载体是一种用于将外源基因导入到宿主细胞中进行表达的DNA分子。基于上述本发明提供的亮氨酸脱氢酶突变体核苷酸序列，重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的亮氨酸脱氢酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，连接本发明的亮氨酸脱氢酶突变体核苷酸序列，均应属于本发明的保护范围。具体地，重组表达载体优选pET-28a。
作为优选，所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。
本发明还提供了携带上述述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
作为优选，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
另一方面，本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体，或上述基因，或上重组表达载体，或上述宿主细胞在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。
本发明还提供了一种制备L-2-氨基丁酸的方法，所述方法为以上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述宿主细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明通过对来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的亮氨酸脱氢酶LeuDH，经过184位组氨酸突变成丙氨酸或260位丝氨酸突变成丙氨酸，获得一种亮氨酸脱氢酶突变体，以2-酮丁酸为底物，催化生产L-2-氨基丁酸的过程中，该突变体显示出较高的催化活性，且对酮酸底物的耐受性大大提升，在较高浓度的2-酮丁酸存在下仍具有较高酶活。
附图说明
图1为实施例6得到的亮氨酸脱氢酶野生型及突变体对不同浓度2-酮丁酸耐受性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的亮氨酸脱氢酶(野生型)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；亮氨酸脱氢酶突变体H184A与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，184位组氨酸突变成丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；亮氨酸脱氢酶突变体S260A与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，260位丝氨酸突变成丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例1亮氨酸脱氢酶突变体的构建
以含有来源于中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的亮氨酸脱氢酶基因的pET-28a重组质粒作为模板。
引物设计：所述2个氨基酸位点分别为H184A、S260A，针对这2个位点设计突变引物，引物的核酸序列如表1所示。
表1定点突变引物序列
| Primer | Sequence(5＇－3＇) |
| H184A-F | GTTCAAGGTGTGGGCGCTGTCGCGTATGAACTG |
| H184A-R | CAGTTCATACGCGACAGCGCCCACACCTTGAAC |
| S260A-F | AAAGTAGTCGCTGGCGCTGCGAACAACCAGCTG |
| S260A-R | CAGCTGGTTGTTCGCAGCGCCAGCGACTACTTT |
| 28a-TiL-F | CTTTGTTAGCAGCCGGATCTCATTATTTGTTGTTGAAGTTGATCAGG |
| 28a-TiL-R | CGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGAATGGGTAAAATCTTCGACTACA |
采用全质粒PCR方法构建突变体质粒。PCR扩增体系如下：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTPs 1μL，PCR Buffer 1μL，灭菌ddH2O 20μL，DNA聚合酶1μL，总反应体系50μL。PCR反应条件：95℃预变性，3min，一个循环；95℃变性，30s，55℃退火，1min，72℃延伸，3min，5个循环；95℃变性，30s，68℃延伸，6min 30s，20个循环；68℃，13min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在20μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃过夜或者37℃下孵化3-4h。吸取5μL酶切产物进行感受态细胞转化，其余酶切产物质粒于-20℃冰箱保存备用。
实施例2亮氨酸脱氢酶突变体工程菌的构建
将实施例1经过酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板上，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有亮氨酸脱氢酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到亮氨酸脱氢酶突变体工程菌。经测序验证突变成功的菌液加入甘油并于-40℃冰箱保藏。亮氨酸脱氢酶野生型工程菌以突变体工程菌相同方法构建，不同之处在于亮氨酸脱氢酶的序列。
获得的亮氨酸脱氢酶突变体H184A、S260A核苷酸序列测序结果分别如序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.5所示，相应编码的蛋白质氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示。
实施例3亮氨酸脱氢酶突变体的诱导表达
将实施例2构建的亮氨酸脱氢酶突变体工程菌及亮氨酸脱氢酶野生型工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养过夜后转接于100mL的LB基中。接种量2％，培养温度37℃，转速200r/min，通气量1.0vvm。培养2h后加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导温度降低为25℃，诱导10h后，4℃，10000rpm离心10min收集湿菌体，于-40℃冰箱贮存备用。
实施例4亮氨酸脱氢酶突变体的分离纯化
取实施例3收集的湿菌体细胞0.5g，用10mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液洗涤2次，重悬于10mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液中，振荡摇匀后置超声波下破碎，破1s，停3s，总时长15min。细胞破碎液于10000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液即粗酶液并利用0.22μm滤膜过滤后用于酶的后续分离纯化。纯化柱为Ni-NTA柱，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液M20(20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以0.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液M20洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液M500(20mM磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为PB缓冲液(50mM,pH 7.5)，所得的纯酶液于4℃贮存备用
纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，结果表明得到电泳纯的重组亮氨酸脱氢及其突变体。
实施例5亮氨酸脱氢酶野生酶及其突变体的比酶活及稳定性将实施例4得到的纯酶液进行以2-酮丁酸为底物的比酶活的测定，通过分光光度计在340nm处检测NADH吸光值变化以计算亮氨酸脱氢酶的氨化还原活力。酶活单位(U)的定义为：30℃下，每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量；比酶活为每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。其中反应体系为(200μL):2.5mg/mLNADH，30mg/mL 2-酮丁酸的NH4Cl·NH3·H2O缓冲液(0.9mol·L-1,pH9.5)和适量的纯酶。
结果显示，对于2-酮丁酸底物，亮氨酸脱氢酶野生型(WT)的比酶活是3.76±1.1U/mg，突变体H184A和S260A的比酶活分别是13.88±1.1U/mg、60.81±1.1U/mg。
实施例6亮氨酸脱氢酶野生酶及突变体对不同种类及不同浓度酮酸抑制测定将实施例3得到的纯酶重组亮氨酸脱氢及其突变体进行不同浓度的酮酸为底物的比酶活的测定，结果如图1所示。酮酸耐受性测定的方法与比酶活测定的方法相似，不同之处在于底物浓度范围变为0.1-10g/L，根据吸光度值的变化计算比酶活力。通过分光光度计在340nm处检测NADH吸光值变化以计算亮氨酸脱氢酶的氨化还原活力。当某浓度下残留的酶活性为最高酶活50％时，该浓度被定义为半抑制浓度，用于表征酶的可耐受底物浓度。其中，反应体系为(200μL):2.5mg/mL NADH，母液浓度为20mg/mL 2-酮丁酸，0.9mol·L-1NH4Cl·NH3·H2O(pH 7.5)缓冲液和0.2mg/mL终浓度的亮氨酸脱氢酶野生型或突变体纯酶。
测定结果表明对于2-酮丁酸耐受抑制作用，如图1所示，相比较亮氨酸脱氢酶野生型(WT)，184位氨基酸或260位氨基酸进行突变的两株突变菌H184A、S260A在相同蛋白浓度下，H184A的抑制曲线的下降趋势相比野生型且相似，且半抑制浓度为6.8g/L左右，比野生型的半抑制浓度3g/L高；突变体S260A的半抑制浓度为5.5g/L左右，也比野生型高，并且抑制曲线下降趋势较野生型明显较快。由图1可知，H184A、S260A两个突变体较野生型可能会减弱NAD+的结合强度，促使NAD+快速解离，降低高浓度底物抑制的作用。
实施例7亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体H184A工程菌制备L-α-氨基丁酸将实施例3得到的亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体H184A工程菌进行2-酮丁酸底物的转化。转化体系是：1g湿菌体，50mL的400mM 2-酮丁酸钠溶解在100mM的PB缓冲液中(pH 7.5)并利用氨水将pH重新调到7.5，50mL的400mM甲酸铵，0.2mg/mL终浓度的亮氨酸脱氢酶野生型或突变体纯酶，终浓度约4mg/mL的甲酸脱氢酶，于30℃、300r/min进行转化，以50％氨水溶液以保持反应液pH为7.5。在不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
HPLC分析条件：在EP管中依次加入待测样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5mL无水乙醇，再加入2mLpH 9.5的100mM硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 100mM KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μL,250mm×4.6mm)，流动相：50mM醋酸钠缓冲液:甲醇63:35，检测器：紫外检测器，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：20μL，流速：1.0mL/min。
HPLC检测结果表明野生型亮氨酸脱氢酶的全细胞催化效率明显低于突变体H184A，在200mM 2-酮丁酸底物浓度下反应1h后，突变体H184A全细胞催化反应的L-2-氨基丁酸产量为3.3g/L，而野生型的催化反应的L-2-氨基丁酸产量为0.6g/L，说明野生型亮氨酸脱氢酶在高浓度酮酸底物条件存在下酶活明显受到抑制，而突变株H184A显著改善了酶受高浓度酮酸底物抑制。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于：所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，184位组氨酸突变成丙氨酸或260位丝氨酸突变成丙氨酸。
2.如权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于：编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3或如SEQIDNO.5所示。
3.如权利要求2所述的一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于：编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
4.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。
7.携带权利要求4所述基因或权利要求5所述重组质粒的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
9.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求4所述基因，或权利要求5~6任一项所述重组表达载体，或权利要求7~8任一项所述宿主细胞在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。
10.一种制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：以权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求7或8所述宿主细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。
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