CN117385008A - 一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸检测技术，特别涉及一种基于发夹探针介导的指数扩增反应，用于痕量核酸的灵敏特异检测。本发明通过设计靶标特异性的发夹探针，通过聚合酶和切口酶介导的不断的延伸，切割，置换，实现指数扩增反应。本发明为核酸快速分析提供了一种简单的一锅法，无需复杂的引物设计，为即时检测提供了可能，在临床诊断和疾病治疗方面具有巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸检测技术，特别涉及一种基于发夹探针介导的指数扩增反应，用于痕量核酸的灵敏特异检测。
背景技术
在当今精准医学时代，准确高效地检测微量核酸对于疾病预防和早期诊断具有重要意义。基于扩增的方法是目前最实用的序列特异性核酸检测方法。在临床实践中，聚合酶链反应(PCR)通常是检测核酸的首选方法。然而，精确的热循环控制和专用设备的要求限制了其广泛应用。为了满足即时检测(POCT)和便携式诊断的迫切需求，已经开发了一系列等温扩增方法。其中，基于指数扩增的方法因其可提供高效的扩增效率(接近2n)和迅速的扩增速率(～108倍)而广受欢迎，例如指数扩增反应(EXPAR)，环介导等温扩增(LAMP)，指数链置换扩增(E-SDA)，指数滚环扩增(E-RCA)等。
尽管在核酸和蛋白质检测方面取得了令人印象深刻的优势和成功，但指数扩增的方法的方法仍然受到一些限制。(1)靶标长度有限。已知经典的基于EXPAR的方法适用于短的单链核酸(长度约10-30nt)，它可以与EXPAR扩增模板的5‘端杂交，并留下粘性末端用于启动DNA聚合。但当特征序列在3’端时，EXPAR只能由长的单链核酸直接引发。(2)非特异性扩增。为了用EXPAR方法分析长单链核酸和蛋白质，通常需要外源辅助探针作为引子来激活指数反应。.然而，外源探针可能会通过随机碰撞在没有靶标的情况下直接与模板杂交来启动扩增反应，这可能会导致大量的非特异性扩增。(3)在经典的EXPAR中，由于模板是对称的，由于引物或扩增产物不可避免地杂交到模板的5‘端，因此扩增效率大大降低。(4)由于靶标仅用作EXPAR中的引物，当非特异性序列触发引物延伸时，它可以不可逆地催化指数扩增反应，导致假阳性。相比之下，ESDA中是由以靶标为模板来进行延伸，也就是说只有正确的靶标才能触发后续的指数扩增反应，大大降低了非特异性序列带来的背景信号。然而，不幸地是，EXPAR和ESDA这两种方法的选择性都是基于引物和模板之间的核酸杂交，导致在识别单核苷酸变异方面的性能不尽如人意。因此，提高目标识别特异性和扩增性能的策略可能会大大拓展指数扩增反应在生物传感中的应用。
为了应对这一挑战，本发明利用DNA链置换的高特异性，开发了一种发夹探针介导的指数扩增反应(HEAR)策略，该策略能够进行灵敏和特异性的核酸检测痕量核酸。其工作原理是通过合理设计一对探针，其在靶标不存在时保持非活性结构。在目标存在的情况下，发夹1通过DNA链置换打开，最终通过聚合酶延伸和切口酶切生成目标互补链。靶标互补链又可以打开发夹2生成目标链，进一步引发指数扩增反应。一方面，该策略通过DNA链置换反应和目标作为模板表现出优异的特异性。另一方面，由于持续循环直到发夹用尽，该方法表现出令人满意的扩增效率。对于概念验证研究，let7a miRNA被用作目标模型。我们证明，与引物介导的指数扩增反应(PEAR)相比，HEAR检测具有更高的灵敏度和特异性，检测限达到～aM水平。该策略为核酸快速分析提供了一种简单的一锅法，无需复杂的引物设计，为即时检测提供了可能，在临床诊断和疾病治疗方面具有巨大潜力。
发明内容
本发明的目的是开发出一种简单、灵敏且特异的痕量核酸检测策略。
具体技术方案如下：
一种基于发夹探针介导的指数扩增反应，其检测方法包括以下步骤：
(1)发夹退火发夹探针在95℃5min，以每秒0.1℃的速率下降至25℃，并保持5min，放在4℃备用。
(2)荧光检测流程为了检测不同浓度的miRNA，A部分溶液由发夹1和发夹2组成。B部分溶液由dNTP、聚合酶、切口核酸内切酶、CutSmart缓冲液、SYBR I和RNase-free组成。首先，将A部分溶液在室温下孵育5分钟。随后，将A部分和B部分在43℃下混合，并通过带有SYBR过滤器组的CFX96TM实时PCR检测系统以30秒的间隔监测荧光强度。所述步骤(1)中所用NaBH4是500ul 1mol/L。
所述步骤(2)中发夹1的浓度是200nM。
所述步骤(2)中发夹2的浓度是200nM。
所述步骤(2)中dNTP的浓度是250μM。
所述步骤(2)中聚合酶的类型是Bst DNA聚合酶。
所述步骤(2)中聚合酶的浓度是1.6U。
所述步骤(2)中聚合酶的类型是Nt.BsmAI切口核酸内切酶。
所述步骤(2)中聚合酶的浓度是5U。
所述步骤(2)中CutSmart缓冲液的浓度是1×。
所述步骤(2)中SYBR I的浓度是2×。
本发明利用发夹探针建立了一种特异和灵敏的核酸检测方法。根据靶标设计探针序列，发夹由一个含有切口识别位点、茎序列和立足点序列的环组成。其检测原理为当靶标与发夹1共存时，发夹1通过立足点介导的链置换打开。在DNA聚合酶存在的情况下，靶标沿着打开的发夹延伸，产生包含完整切口核酸内切酶识别位点的双链DNA(dsDNA)。切口核酸内切酶在双链复合体中的发夹1上产生链切割。然后，该切割位置继续启动置换、聚合和切口反应的连续循环，产生大量目标互补链(T')，这将导致第一个线性扩增反应。接下来，T'可以打开发夹2，引发类似的反应，产生大量与目标序列相同的单链DNA(ssDNA)，引起第二次线性扩增反应，两轮线性扩增相互循环实现指数扩增反应。最终信号由SYBR Green I实时监测，它可以插入dsDNA。
PAGE分析首先用于验证HEAR过程(附图1)。通过孵育HEAR实验所需的不同成分，研究了miRNA激活的等温扩增反应。泳道1-5分别是靶标、H1、H2和靶标-H1和靶标-H1-H2。与存在所有成分(泳道7)相比，当缺乏切口酶(泳道6)或者发夹2(泳道8)或者靶标(泳道9)，没有产生明显的延伸或者切割条带，证明了该方法的可行性。
为了进一步分析HEAR介导的核酸检测，使用SYBR Green I作为荧光染料进行了实时荧光测定(附图2)。当Bst聚合酶或Nt.BsmAI或H2不存在时，仅观察到微弱的荧光值，这归因于SYBR Green I嵌入dsDNA的能力。反应速率由拐点(POI)定量描述，拐点是实时荧光曲线最大斜率对应的时间。当反应的所有成分都存在时(红色实线)，POI值实时荧光曲线的长度约为11分钟。在没有靶标的情况下，观察到低强度荧光增益(红色虚线)，这可能是dNTP和发夹相互作用引起的非特异性扩增。与阳性样品相比，阴性样品的POI值(80分钟)要大得多，足以产生可区分的荧光信号。上述这些结果有力地证实了HEAR检测是由靶标正确启动和操作的，因此产生了“S”形生长的荧光曲线。
在43℃下验证了HEAR策略的定量性能(附图3)。对于高分辨率和高精度分析，将每个反应的POI值与靶标的浓度相对应，以对数标度绘制(附图4)。在100aM(1zmol)和10nM(0.1pmol)范围内，POI值随着靶标浓度的对数(lg)的增加而线性下降。其定量曲线方程为Y＝-27.26-4.17lg[C](R2＝0.99)，其中Y为POI值，[C]为miRNA浓度。然后检测限(LOD)评估为19aM(S/N＝3)，对应于每10μL 114个拷贝的miRNA。根据POI空白值，整个实验的反应时间约为90分钟。与其他miRNA等温核酸扩增技术相比，HEAR可以显着提高灵敏度和便利性。HEAR的LOD比其他方法低10到106倍，动态范围宽8个数量级。
为了评估构建的HEAR实验的特异性，let-7 miRNA家族成员(let-7a-g和i)被用作本研究的模型。这是因为它们的序列同源性高，甚至有的仅相差一个碱基。对应于let-7a的POI值可以与对应于其他let-7 miRNA家族的POI值完全分开(附图5)。并且其他let-7miRNA生成的实时荧光曲线不是标准的“S”形曲线，扩增效率受错配影响。这是由于我们原理的独特优势——每个循环中发夹和miRNA之间的双链置换反应。因此，即使是最难以区分的let7c(A>G)、let7f(G>A)和let7e(U>A)也能有效地与let-7a区分开来。
本专利提出了一种新的等温指数扩增策略。HEAR只需要两个设计简单的发夹探针即可快速轻松地一锅法检测核酸。该方法可以量化高达8个数量级的核酸，测定限为19aM。结果表明，HEAR方法在疾病诊断和生物医学研究方面具有巨大的潜力。
附图说明
图1扩增产物的PAGE电泳。
图2扩增产物的实时荧光曲线。
图3不同靶标触发的HEAR实时荧光定量曲线。
图4HEAR的POI与靶标浓度的对数之间的线性关系。
图5由let-7 miRNA家族触发的HEAR的实时荧光定量曲线。
具体实施方式
一种简单、灵敏且特异的痕量核酸检测策略，按以下步骤操作：
(1)发夹退火10微摩尔的发夹探针95℃5min，以每秒0.1℃的速率下降至25℃，并保持5min，放在4℃备用。
(2)荧光检测流程为了检测不同浓度的miRNA，A部分溶液由H1或P1和H2组成。B部分溶液由dNTP、Bst DNA聚合酶、Nt.BsmAI切口核酸内切酶、CutSmart缓冲、SYBR I和RNase-free组成。首先，将A部分溶液在室温下孵育5分钟。随后，将A部分和B部分在43℃下混合，并通过带有SYBR过滤器组的CFX96TM实时PCR检测系统以30秒的间隔监测荧光强度。
Claims (10)
1.一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其特征在于包括如下步骤：
(1)发夹退火：10微摩尔的发夹探针95℃5min，以每秒0.1℃的速率下降至25℃，并保持5min，放在4℃备用；
(2)荧光检测流程：为了检测不同浓度的miRNA，A部分溶液由H1或P1和H2组成，B部分溶液由dNTP、Bst DNA聚合酶、Nt.BsmAI切口核酸内切酶、CutSmart缓冲、SYBR I和RNase-free组成；首先，将A部分溶液在室温下孵育5分钟；随后，将A部分和B部分在43℃下混合，并通过带有SYBR过滤器组的CFX96TM实时PCR检测系统以30秒的间隔监测荧光强度。
2.如权利要求1所述的用两种发夹进行循环方法。
3.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中发夹1的浓度是1μΜ-10nM。
4.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中发夹2的浓度是1μΜ-10nM。
5.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中dNTP的浓度是1mΜ-10nM。
6.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中聚合酶的类型是Bst DNA聚合酶或者KF聚合酶。
7.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中聚合酶的浓度是10-0.1U。
8.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中切口酶类型是Nt.BsmAI切口核酸内切酶或Nb.BbvCI切口核酸内切酶或Nb.BbrDI切口核酸内切酶。
9.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中切口酶的浓度是10-0.1U。
10.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中CutSmart缓冲液的浓度是10×-1×。
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