CN117384907A - 抑制PCSK9表达的siRNA分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种抑制PCSK9表达的siRNA分子及其应用。具体为抑制PCSK9表达的siRNA分子(包括互补形成双链区的正义链和反义链)及其药物组合物。上述siRNA分子对PCSK9基因具有较高的沉默效率和持久的沉默效果，可应用于制备用于抑制PCSK9的蛋白表达的产品，制备用于降低血清中低密度脂蛋白或低密度脂蛋白胆固醇浓度的产品，以及制备用于缓解由PSCK9基因介导的疾病的症状的产品。

Description

抑制PCSK9表达的siRNA分子及其应用
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种抑制PCSK9表达的siRNA分子及其应用。
背景技术
脂蛋白分为5类，分别为：乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。其中，极低密度脂蛋白与低密度脂蛋白的密度小于1.0063 gmL，在体内的作用主要是参与胆固醇的代谢，将胆固醇从细胞转运到外周血液中。临床上较高水平的VLDL或LDL是导致众多心血管疾病的重要因素，特别是导致动脉粥样硬化最重要的原因之一。
枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)在肝，肾，小肠中均有表达，主要表达在肝中。PCSK9分子量72kD，由N端功能前区，催化域和一个未知功能的C端结构域三部分组成。PCSK9合成后，会自催化剪切掉N端前功能区，但掉下来的N端前功能区并不离去而是与其它两个结构域结合在一起，起到分子伴侣的作用，并且部分挡住催化域与底物的结合口袋。
PCSK9最早被认为其功能为与肝的再生及皮质神经元的分化有关。但后来Abifadel等人发现PCSK9突变与胆固醇的代谢有关，Horten等人在研究 SREBP时也发现PCSK9的mRNA水平与细胞胆固醇水平相关。用Adenovirus在小鼠转染过表达PCSK9也导致LDL的水平升高，同时LDL受体变少，但LDL的mRNA水平并没有变化。随后，Lagace TA等人发现PCSK9的转基因小鼠也有类似的现象，即LDL胆固醇水平上升，LDL受体水平下降。敲除PCSK9后，LDL受体水平上升，血浆中LDL胆固醇(LDLC)的水平大幅度降低。PCSK9不直接降解LDL受体，McNutt MC等人发现失去活性的PCSK9同样可以导致LDL受体水平下降。LDL与LDL受体结合后，复合体被内吞进内涵体中，内涵体内的酸性环境导致LDL受体的结构发生了变化，呈发夹状，结构的改变使LDL受体与LDL的结合力变弱，释放出LDL，LDL受体最终回到了细胞的表面，完成对LDL向细胞内的运送。但是当PCSK9与LDL受体通过LDL受体的EGF-A域结合后，LDL受体的构象变化被抑制了，导致LDL受体数量减少。血清中的LDLC是通过肝细胞表面的LDL受体结合后进入到肝细胞中的，PCSK9与LDL受体的结合使LDL受体减少，LDLC的吸收减少，因此抑制PCSK9的表达可以使LDL受体对LDLC的吸收增加。
人群中2%的非裔美国人的PCSK9有一到两个突变，这些突变导致他们的LDL胆固醇水平比正常人低约30%，在白种人中突变导致约15%的LDL胆固醇水平降低。女性PCSK9的水平比男性稍高，随时年龄增长，男性PCSK9水平下降，反之女性会升高，推测可能与雌性激素相关。PCSK9在调控LDL中发挥重要作用，而LDL水平与心血管疾病、血脂异常疾病等有着很强的相关性，因此PCSK9成为了治疗心血管疾病、血脂异常疾病等非常重要的靶点。此外2020年一项发表在Nature杂志的文献发现，PCSK9可通过降低肿瘤细胞表面MHC I分子表达，影响CD8+T细胞对肿瘤细胞的识别；而PCSK9敲除或PCSK9单抗则可增加肿瘤细胞MHC I分子表达，从而抑制肿瘤生长，表明PCSK9也参与肿瘤免疫的调节。
现有抑制PCSK9的药物研究主要集中在多肽，抗体，siRNA和ASO药物方面。多肽药物是通过设计开发类似LDL受体与PCSK9结合部位的结构，即EGF-A域，使PCSK9与多肽结合，减少PCSK9与LDL受体的结合。单抗技术是通过开发一类能特异结合到PCSK9近催化域的抗体，阻断PCSK9与LDL受体的结合，Amgen公司的evolocumab, Pfizer公司的bococizumab以及Sanofi和Regeneron公司的alirocumab等抗体进入临床研究，除Pfizer于2016年11月停掉了bococizumab外，其它两个抗体均已上市，用于降LDL治疗。ASO是反义核苷酸，能与mRNA结合，诱导RNase H对mRNA进行降解，同时其较强的结合力还可以阻碍mRNA的翻译。Ionis公司针对PCSK9研究开发的反义核苷酸药物已进入临床阶段。siRNA是一类小RNA，是天然存在的一类双链小核酸，长度19-25 bp，与沉默复合体结合后，正义链被降解，带有反义链的复合体通过反义链与mRNA互补结合，复合体中的酶将mRNA降解，在mRNA水平阻断基因的功能。目前，针对PCSK9的siRNA已有药物上市，为Alnylam公司开发的inclisiran，有着半衰期长，稳定，低毒，高效的优点。
上述抗体药物作用时间较短，一般每两周到每月注射一次，因此患者的依从性稍差，且抗体药物生产纯化工艺成本也较高。ASO药物由于作用的方式限制，其给药的剂量较大，生产成本较高，毒副作用也较大。此外，他汀类小分子药物能有效降低血液中低密度脂蛋白的浓度，需要每天服用，易产生耐药性，有部分病人也会对他汀类小分子药物不敏感。而siRNA药物具有作用时间长，一般半年到一年给药一次，给药量较小，给药周期长，生产成本相对较低的优点，因此，开发高效且稳定的siRNA药物一直是本领域研究人员所追求的目标。
发明内容
本发明通过对小干扰RNA(siRNA)进行修饰改造，设计得到修饰的siRNA分子，可用于高效且稳定地抑制PCSK9表达，制备用于治疗和/或预防与PCSK9相关疾病的产品。
本发明提出一种用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，包括互补形成双链区的正义链和反义链；
正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUm GsmUsB-3'，反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAm GfGmUmCmUsmAsmG-3'；
或者，正义链序列为5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUm UmUmGmU-3'，反义链序列为5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfA mGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
其中，A、U、G和C分别表示以腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶为碱基的核苷酸；m表示该字母m右侧相邻的一个核苷酸为2’-O-甲基修饰的核苷酸；f表示该字母f的右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸，s表示该字母s左右两端的核苷酸是通过硫代磷酸酯键连接，B表示无碱基核糖。
进一步地，还包括用于对siRNA分子进行配体修饰的配体基团，
配体修饰具体为采用配体基团对正义链的3'末端或5'末端进行修饰；
配体基团包括N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺衍生物中至少一种。
进一步地，配体基团包括LICA-1、LICA-2、LICA-3或L96；其中，
LICA-1的结构式为：
；
LICA-2的结构式为：
；
LICA-3的结构式为：
；
L96的结构式为：
。
进一步地，正义链与配体基团通过硫代磷酸酯键连接。
进一步地， siRNA分子具有如下(1)~(4)任一结构：
(1) 正义链序列为：5'-LICA-1-smAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
(2) 正义链序列为：5'-LICA-2-smAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
(3) 正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmUs-LICA-3-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
(4) 正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmUs-L96-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
本发明还提出一种药物组合物，包括上述任一siRNA分子和药学上可接受的载体。
本发明还提出上述任一项siRNA分子或任一项药物组合物在制备用于抑制PCSK9的蛋白表达的产品中的应用。
本发明还提出上述任一项siRNA分子或任一项药物组合物在制备用于降低血清中低密度脂蛋白或低密度脂蛋白胆固醇浓度的产品中的应用。
本发明还提出上述任一项siRNA分子或任一项药物组合物在制备用于缓解由PSCK9基因介导的疾病的症状的产品中的应用。
进一步地，由PSCK9基因介导的疾病包括心血管疾病、血脂异常疾病、肿瘤性疾病；其中，心血管疾病包括高胆固醇血症、高脂血症；血脂异常疾病包括脂代谢异常；肿瘤性疾病包括与PSCK9有关的黑色素瘤、转移性肝癌。
本发明具有以下优势：
本发明通过siRNA序列设计，从底层序列层面筛选出降解mRNA活性高的siRNA序列，再加入RNA修饰(包括序列间的硫代磷酸修饰，末端加入无碱基核糖等)，有效提高其活性和稳定性，延长药物在体内作用的时间。并且，在siRNA末端连接上定向靶器官肝的靶头分子配体基团，增加分子在肝的富集能力，最终开发出针对PCSK9沉默的高效，低毒，稳定长效的siRNA分子。将其用于抑制PCSK9表达，能高效敲降PCSK9，且稳定性强，可用于制备用于治疗/预防与PCSK9相关的疾病如心血管疾病、血脂异常疾病、肿瘤性疾病等的产品。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为Huh7细胞中PCSK9的活性(IC 50)；其中，RRG002-51 B1(第一次合成样品)和RRG002-52-D B1(第一批合成样品)的IC50分别为6.0 pM和4.0 pM；RRG002-51 B2(第二批合成样品，重复)和RRG002-52-D B2(第二批合成样品，重复)分别为5.6和2.9 pM, 均低于阳性对照的30.2 pM。
图2为Huh7细胞中的细胞毒性(CCK8)；从0.1 pM到500 nM的范围内，三个siRNA均未对Huh7的细胞活性造成明显影响。
图3为HepG2中的细胞毒性(CCK8)；从0.1 pM到500 nM的范围内，三个siRNA均未对HepG2的细胞活性造成明显影响。
图4为原代细胞RNA-sequencing；其中，A为阴性对照只加入了转染试剂，B为阳性对照，C为RRG002-51，D为RRG002-52-D。原代细胞转染后进行RNA测序发现，RRG002-51和RRG002-52-D的脱靶风险与阳性对照相似，均无脱靶风险。
图5为RRG002-50-D、RRG002-51、RRG002-56-D、RRG002-57-D对转基因小鼠PCSK9蛋白表达水平的影响。
图6为RRG002-50-D、RRG002-51、RRG002-53对转基因小鼠PCSK9蛋白表达水平的影响。
图7为RRG002-51、RRG002-54、RRG002-55对转基因小鼠PCSK9蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
一方面，本发明实施例提出一种用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，包括互补形成双链区的正义链和反义链；
正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUm GsmUsB-3'，反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAm GfGmUmCmUsmAsmG-3'；
或者，正义链序列为5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUm UmUmGmU-3'，反义链序列为5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfA mGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
其中，A、U、G和C分别表示以腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶为碱基的核苷酸；m表示该字母m右侧相邻的一个核苷酸为2’-O-甲基修饰的核苷酸；f表示该字母f的右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸，s表示该字母s左右两端的核苷酸是通过硫代磷酸酯键连接，B表示无碱基核糖。
本发明实施例通过RNA序列设计，从底层序列层面提高siRNA降解mRNA的能力，再加入RNA修饰(包括序列间的硫代磷酸修饰，末端加入无碱基核糖等)，提高其活性和稳定性，延长药物在体内作用的时间。将其用于抑制PCSK9表达，能高效敲降PCSK9，且稳定性强，即对PCSK9基因的沉默效率更高，效果更持久。
本发明实施例的主要创新改进为对siRNA进行修饰，包括序列间的硫代磷酸修饰，末端加入无碱基核糖等特定修饰，如此创新改进可使得修饰后的siRNA分子，再被具有定向靶器官肝的配体基团修饰后，可使得活性分子递送至肝细胞稳定发挥其高活性。
具体地，用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，还包括用于对siRNA分子进行配体修饰的配体基团，配体修饰具体为采用配体基团对正义链的3'末端或5'末端进行修饰。本发明实施例中配体基团修饰后的siRNA分子，为在RNA末端连接上定向靶器官肝的靶头分子配体基团，可增加分子在肝的富集能力，进而得到靶向肝的针对PCSK9沉默的高效，低毒，稳定长效的siRNA分子。同时，原代细胞转染后RNA测序表明本发明的RNAi抑制剂脱靶风险较低，具有较好的应用前景。
在本发明一优选实施例中，配体基团包括N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺衍生物中至少一种。例如，配体基团可以包括一个或多个N-乙酰基半乳糖胺 (GalNAc)，或配体基团可以包括一个或多个N-乙酰基半乳糖胺衍生物。本发明实施例中，由于PCSK9主要表达在肝中，含有N-乙酰基半乳糖胺的配体基团作为定向靶器官肝的靶头分子，可使得siRNA分子定向递送至肝细胞，增加分子在肝的富集能力，从而高效发挥抑制PCSK9表达的功效。
在本发明一优选实施例中，配体基团包括LICA-1、LICA-2、LICA-3或L96；其中，
LICA-1的结构式为：
；
LICA-2的结构式为：
；
LICA-3的结构式为：
；
L96的结构式为：
。
需要指出，配体基团LICA-1、LICA-2、LICA-3或L96为本领域知悉的GalNAc递送载体。
在本发明一实施例中，正义链与配体基团通过硫代磷酸酯键连接。具体地，正义链与配体基团LICA-1、LICA-2、LICA-3或L96通过硫代磷酸酯键连接。
在本发明一优选实施例中，siRNA分子具有如下结构：正义链序列为：5'-LICA-1-smAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
在本发明一优选实施例中，siRNA分子具有如下结构：正义链序列为：5'-LICA-2-smAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
在本发明一优选实施例中，siRNA分子具有如下结构：正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmUs-LICA-3-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
在本发明一优选实施例中，siRNA分子具有如下结构：正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmUs-L96-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
具体地，配体基团LICA-1通过硫代磷酸酯键与siRNA的正义链5'末端核苷酸偶联后，所得siRNA分子具有式(I)所示结构：
式(I)；
其中，式(I)中R2为siRNA，包括互补形成双链区的正义链和反义链，
正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
具体地，配体基团LICA-2通过硫代磷酸酯键与siRNA的正义链5'末端核苷酸偶联，所得siRNA分子具有式(II)所示结构：
式(II)；
其中，式(II)中R2为siRNA，包括互补形成双链区的正义链和反义链，
正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
具体地，LICA-3通过硫代磷酸酯键与siRNA的正义链3'末端核苷酸偶联后，所得siRNA分子具有式(III)所示结构：
式(III)；
其中，式(III)中R2为siRNA，包括互补形成双链区的正义链和反义链，
正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmU-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
具体地，L96通过硫代磷酸酯键与siRNA的正义链3'末端核苷酸偶联后，所得siRNA分子具有式(IV)所示结构：
式(IV)；
其中，式(IV)中R2为siRNA，包括互补形成双链区的正义链和反义链，
正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmU-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
另一方面，本发明实施例还提出一种药物组合物，药物组合物包括上述任一siRNA分子和药学上可接受的载体。具体地，药学上可接受的载体包括磁性纳米粒、碳纳米管、壳聚糖等。
优选的，药物组合物还可以包括药学上可接受的其他组分。药学上可接受的其他组分包括盐水、pH缓冲液、稀释剂等。
又一方面，本发明实施例还提出上述任一siRNA分子或任一药物组合物在制备用于抑制PCSK9的蛋白表达的产品中的应用。本发明实施例中，产品能够抑制人、猴、大鼠或小鼠等的PCSK9表达。
本发明实施例提出的siRNA分子用于抑制PCSK9表达均能高效敲降PCSK9，且稳定性强。本发明所得siRNA分子在Huh7细胞的PCSK9活性检测结果为：RRG002-51 B1(第一批合成样品)和RRG002-51 B2(第二批合成样品)的IC50分别为6.0 pM和5.6 pM, 均低于阳性对照的30.2 pM。本发明所得siRNA分子在转基因小鼠(PCSK9人源化小鼠)中给药后约20天达到药效峰值，RRG002-51、RRG002-53的敲降效率达到86%。给药后56天，阳性对照已回到基线，而修饰优化后的两组(RRG002-51、RRG002-53)敲降活性仍保持在61%。在另一个批次的转基因小鼠实验中，给药后第56天，RRG002-51敲降为73%，替换配体的修饰序列(RRG002-54、RRG002-55)敲降在70~80%左右。同时，原代细胞转染后RNA测序表明本发明的RNAi抑制剂脱靶风险较低，具有较好的应用前景。
又一方面，本发明实施例还提出上述任一siRNA分子或任一药物组合物在制备用于降低血清中LDL(低密度脂蛋白)或LDLC(低密度脂蛋白胆固醇)浓度的产品中的应用。
又一方面，本发明实施例还提出上述任一siRNA分子或任一药物组合物在制备用于缓解由PSCK9基因介导的疾病的症状的产品中的应用。
具体地，由PSCK9基因介导的疾病包括但不限于心血管疾病、血脂异常疾病、肿瘤性疾病。心血管疾病包括高胆固醇血症、高脂血症等。血脂异常疾病包括脂代谢异常。肿瘤性疾病包括与PSCK9有关的黑色素瘤、转移性肝癌等。
下面将结合实施例和附图详细阐述本发明。
实施例1RNA序列设计
人PCSK9基因转录产物的编码区(CD)序列来源于NCBI网站，将人PCSK9 mRNA的CD区输入在线siRNA设计平台http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html，在默认参数下生成的序列中选取前100对。再根据脱靶分析将生成的siRNA进行排序，脱靶分析是通过与人转录组进行比对，打分得出。在比对过程中最重要的是单链5'起第2-9个核苷酸，然后是第10和11个核苷酸，而末端的第1或第21个核苷酸对脱靶影响较小。比对后按重要性权重进行排序得到如下表1所示50对siRNA。
表1siRNA序列
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实施例2PCSK9蛋白含量及细胞活力检测方法
2.1、本发明涉及的ELISA检测细胞上清PCSK9蛋白含量的方法
2.1.1、细胞培养及转染
2.1.1.1、接种细胞(第一天)
接种1.5×105个/ml密度的HepG2或者0.75×105个/ml密度的Huh-7细胞至24孔板培养孔中，每孔500 μL体积，使转染时的细胞密度能够达到30~50%。将细胞板置于细胞培养箱中培养18-24 h。每种siRNA设置两个复孔。
2.1.1.2、转染(第二天)
转染前先换成新的DMEM培养基450 μL每孔。
Lipofectamine RNAiMAX稀释液的配制：根据转染的孔数计算Lipofectamine的配制体积，每组复孔需3.6 μL Lipofectamine与56.4 μL Opti-MEM培养基混合至终体积60 μL，颠倒混匀。
siRNA阳性对照(RRG002-0序列、RRG002-50-D序列)、阴性对照(仅添加转染试剂)及待测品稀释液的配制。取60 μL Lipofectamine稀释液与60 μL siRNA样品稀释液混合，吹打混匀。室温静置15 min。取50 μL混合液逐滴加入24孔板相应的孔中，轻摇24孔板混匀，置于细胞培养箱中培养。
2.1.1.3、培养基上清收集及细胞活力检测(第四天)
转染完成后48 h，收集每孔培养基上清200 μL至离心管中。如不立即检测，-80度保存。
2.1.2、ELISA检测PCSK9
PCSK9 ELISA试剂盒购自R&D Systems，货号：DY3888。
包被：终浓度2 μg/ml Capture Ab包被板子，100 μL每孔，4℃过夜。
封闭：弃Capture Ab，加Reagent diluent，300 μL每孔，室温2-3 h。
标准品配制：按照试剂盒说明将标准品复溶，浓度为32 ng/ml：稀释2倍至16 ng/ml，然后用Reagent diluent 2倍倍比稀释7个浓度。
取HepG2/Huh-7上清，稀释10倍。
洗板；洗板机洗板3遍，300 μL每孔，拍干。
加入标准品或样品，100 μL每孔，室温2 h。
洗板：洗板机洗板5遍，300 μL每孔，拍干。
加入100 μL Detection Ab，室温2 h。
洗板：洗板机洗板5遍，300 μL每孔，拍干。
加入100 μL Streptavidin-HRP，室温避光20 min。
洗板：洗板机洗板5遍，300 μL每孔，拍干。
显色：提前取出TMB溶液室温平衡，加入100 μL TMB，避光显色15 min，加入 50 μLELISA终止液。
酶标仪读板，450 nm和570 nm。OD450－OD570得到的值作为测得的OD值，再根据相应的标准曲线计算出样品浓度。
2.2、本发明涉及的CCK8法检测细胞活力的方法
在步骤2.1.1.2转染48小时后的24孔板细胞上清中每孔加入40 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1小时，用酶标仪测定在450 和650 nm处的吸光度。OD450－OD650得到的值作为测得的OD值，CCK8以处理组和对照组的OD值比值呈现。
实施例3siRNA未修饰序列的体外筛选
3.1、PCSK9蛋白表达水平的影响
为了评估siRNA敲低PCSK9 mRNA的体外活性，使用实施例2中2.1部分ELISA方法对表1中50对siRNA对PCSK9蛋白表达水平的影响进行体外活性的评估，结果见表2。
由表2可知，在两个浓度下(0.01 nM、0.001 nM)筛选siRNA的活性后发现，活性最强的仍为阳性对照RRG002-0的序列。
表2siRNA相对于阴性对照组的PCSK9蛋白表达水平(Huh7细胞)
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实施例4修饰序列的制备和筛选
4.1、修饰序列的制备
通过实施例3部分未修饰序列的筛选，发现活性最强的仍为阳性对照RRG002-0的序列。为了进一步提高活性，以阳性对照序列为基础，在阳性对照序列上进行了修饰模式的改造，包括序列间的硫代磷酸修饰、末端加入abasic和5(E)VP等修饰，以及配体基团修饰。修饰后的siRNA序列见表3。
表3中，siRNA-1、siRNA2为本发明提出的未修饰配体基团的siRNA分子。RRG002-51、RRG002-53、RRG002-54、RRG002-55为本发明提出的配体基团修饰后的siRNA分子，RRG002-50-D、RRG002-52-D、RRG002-56-D、RRG002-57-D为与本发明siRNA分子进行对比，突出本发明siRNA分子性能的参比siRNA分子。
表3 修饰序列
其中：m表示该字母m右侧相邻的一个核苷酸为2’-O-甲基(2’OMe)修饰的核苷酸，f表示该字母f的右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟(2’F)修饰的核苷酸，s表示PS即连接字母s左右两个核糖/基团的为硫代磷酸酯键，B表示去碱基(无碱基核糖)abasic，v表示5(E)VP，波浪线表示上一个或下一个核苷酸，具体修饰方式见下表4；
表4修饰方式示意
其中，2’-OMe表示核苷酸的2’H被甲氧基取代，2’-F表示核苷酸的2’H被氟取代，Abasic表示此位点的核苷酸的碱基已脱去，VP表示5’的P－O－C被P－C＝C取代，PS表示磷酸上的其中一个氧被S取代，Base是指碱基A、U、G或C。
具体地：
siRNA分子RRG002-51结构如式(I)所示：
式(I)中R2为siRNA-1，包括互补形成双链区的正义链和反义链，正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；DX3(即LICA-1)作为包括配体GalNAc的递送载体，与siRNA的正义链连接，DX3(即LICA-1)通过硫代磷酸酯键连接在siRNA-1的正义链5'端；
式(I)。
参比siRNA分子RRG002-52-D，相对于RRG002-51结构，反义链5'端加(E)VP修饰。
参比siRNA分子RRG002-56-D，相对于RRG002-51结构，正义链配体与siRNA序列间以磷酸酯键连接，而非硫代磷酸酯键，无配体连接的一侧无Abasic。
参比siRNA分子RRG002-57-D，相对于RRG002-51结构，正义链配体与siRNA序列间以磷酸酯键连接，而非硫代磷酸酯键。
参比siRNA分子RRG002-50-D，相对于RRG002-51结构，正义链和反义链的长度各多2 nt，正义链配体与siRNA序列间以磷酸酯键连接，而非硫代磷酸酯键，无配体连接的一侧无Abasic。正义链氟代的位置为7、9位，反义链氟代的位置为2、4、5、6、8、10、12、14、16、18位，正义链第11位为dT。
siRNA分子RRG002-54结构如式(II)所示：
式(II)中R2为siRNA-1，包括互补形成双链区的正义链和反义链，正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'； LICA-2作为包括配体GalNAc的递送载体，与siRNA的正义链连接，LICA-2通过硫代磷酸酯键连接在siRNA-1的正义链5'端；
式(II)。
siRNA分子RRG002-55结构如式(III)所示：
式(III)中R2为siRNA-2，包括互补形成双链区的正义链和反义链，正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmU-3'，反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；LICA-3作为包括配体GalNAc的递送载体，与siRNA的正义链连接，LICA-3通过硫代磷酸酯键连接在siRNA-2的正义链3'端；
式(III)。
siRNA分子RRG002-53结构如式(IV)所示：
式(IV)中R2为siRNA-2，包括互补形成双链区的正义链和反义链，正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmU-3'，反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；L96作为包括配体GalNAc的递送载体，与siRNA的正义链连接， L96通过硫代磷酸酯键连接在siRNA-2的正义链3'端；
式(IV)。
上述siRNA分子的制备方法，包括如下步骤：
(1)RNA固相合成方法
表1和表3内的siRNA可以委托合成公司进行固相合成获取，也可按如下方法进行合成：
siRNA的正义链和反义链是通过本领域熟知的亚磷酰胺核酸固相合成的方法制备，利用通用固相载体(Unylinker，Loading:50μmol/g)或配体固相载体起始循环，序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化(或硫代)四步反应；
1)合成条件如下：
核苷单体以0.05M浓度的乙腈溶液提供；
①脱保护。每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为10-25℃，反应时间为60秒，脱保护试剂为三氯乙酸的甲苯溶液(3％v/v)，三氯乙酸与固相载体上4，4 '-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
②偶联。每一步偶联反应条件均相同，包括温度为10-25℃，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)的0.25M乙腈溶液，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:5，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:3.3，反应时间为360秒。
③盖帽。每一步盖帽条件均相同，包括温度为10-25℃，反应时间为90秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐：N-甲基咪唑：固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
④氧化。每一步氧化反应条件相同，包括温度为10-25℃，反应时间为90秒，氧化试剂为浓度为 0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1，反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
⑤硫代。每一步硫代反应条件相同，包括温度为10-25℃，反应时间为90秒，硫代试剂为浓度为 0.25M的苯乙酰二硫化物(PADS)，PADS与硫代步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为40:1。最终，该步骤中固相载体缀合在siRNA正义链或反义链3 '末端。
2)裂解脱保护
固相合成结束后需要将RNA链从固相载体裂解下来并脱除保护基；
裂解脱保护步骤如下：将固相载体放置于耐压试管中，加入28%氨水1.0-3.0mL，密闭置于50℃反应震荡或搅拌反应15小时。反应结束后，过滤后将滤液离心浓缩至干。若序列中含有2’-TBDMS保护基团，随后加入配置好的DMSO：三乙胺：三乙胺三氢氟酸盐=1:1:1的溶液350μL，70℃反应3小时，从而脱除核糖上的2 '-TBDMS保护。
3)纯化与脱盐
利用制备型反相色谱柱(SinoPak BEH AQ-C18)纯化核酸序列，洗脱剂A： 4mM三乙胺，50mM 六氟异丙醇水溶液，洗脱剂B：甲醇 ，洗脱梯度：10%-35%B梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用超滤离心管(再生纤维素材质，截留分子量3000)进行脱盐。
4)退火
按照上述方法得到siRNA的正义链和反义链，经过退火后得到双链siRNA；
退火操作如下，采用紫外分光光度计分别检测正义链和反义链浓度，按照1：1比例取正义链和反义链于同一容器中，加热至90℃保持5分钟，自然冷却至室温，使其通过氢键形成双链结构，退火完成得到siRNA双链。
(2)配体连接方法
当配体连接在正义链3'端时(RRG002-50-D、RRG002-53、RRG002-55)，用包括配体L96的固相载体(L96-CPG，成都先导药物开发股份有限公司，货号：GN-0003)Loading:41.88μmol/g作为原料起始循环，或用包括配体LICA-3的固相载体(LICA-3-CPG，上海兆维科技发展有限公司，货号ON-433)Loading:55μmol/g作为原料起始循环，序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化(或硫代)四步反应。具体制备过程与步骤(1)RNA固相合成方法保持一致，进而分别获得RRG002-50-D、RRG002-53以及RRG002-55。
当配体连接在正义链5'端(RRG002-51、RRG002-52-D、RRG002-54、RRG002-56-D、RRG002-57-D)时，用通用固相载体(Unylinker，Loading:50 μmol/g)作为原料起始循环，序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。5'末端配体DX3的缀合以0.1 M浓度的DX3亚磷酰胺单体(上海兆维科技发展有限公司，货号OP-026)的乙腈溶液为原料，5'末端配体LICA-2的缀合以0.1 M浓度的LICA-2亚磷酰胺单体(上海鼎新基因科技有限公司，自制，货号KAK4)的乙腈溶液为原料，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)的0.25M乙腈溶液，固相载体上连接的核酸序列与配体的亚磷酰胺单体的摩尔比为1:8，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:5，反应时间为600秒，其他步骤与步骤(1)RNA固相合成方法保持一致，进而分别获得RRG002-51、RRG002-52-D、RRG002-54、RRG002-56-D以及RRG002-57-D。
4.2修饰序列的筛选- PCSK9蛋白表达水平的影响
为了评估表3中RRG002-50-D，RRG002-51和RRG002-52-D这3对修饰siRNA敲低PCSK9 mRNA的体外活性，使用实施例2中2.1部分ELISA方法对表3中3对修饰siRNA对PCSK9蛋白表达水平的影响进行体外活性的评估，结果如表5，图1所示。
其中，图1为Huh7细胞中的PCSK9活性(IC50)，由图1可知，RRG002-51 B1(第一批合成样品)和RRG002-52-D B1(第一批合成样品)的IC50分别为6.0 pM和4.0 pM；RRG002-51B2(第二批合成样品，重复)和RRG002-52-D B2(第二批合成样品，重复)的IC50分别为5.6和2.9 pM，均低于阳性对照RRG002-50-D的30.2 pM。
表5修饰siRNA相对于阴性对照组的PCSK9蛋白表达水平(Huh-7细胞)
4.3修饰序列的筛选-细胞活性
为了评估修饰后siRNA对于细胞活性的影响，使用实施例2中2.2部分CCK8法对表3中的RRG002-50-D，51和52的siRNA对细胞活力的影响进行评估，结果如图2和图3所示，这三对siRNA在0.1 pM到500 nM的浓度范围内对Huh7和HepG2这两个细胞的活力都没有影响，毒性较低(图2、图3中的Inclisiran即为RRG002-50-D)。
4.4 原代细胞脱靶风险评估实验
为了验证修饰后siRNA在细胞中无脱靶风险，在人原代细胞中分别转染10 nMRRG002-50-D、51和52后做RNAseq分析，结果如图4所示。RRG002-51和RRG002-52-D的脱靶风险与阳性对照RRG002-50-D相似，均无脱靶风险。具体实验见下。
siRNA通过转染进入人原代肝细胞(PHHs)，过程如下：
1)siRNA稀释及转染试剂配置：用PBS稀释siRNA至终浓度的20倍(例如测试浓度为10nM，则稀释到200nM)，使用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂(Lipofectamine®RNAiMAX Transfection Reagent, Invitrogen -13778-150)： Opti-MEM™ I 减血清培养基(Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, Gibco-31985-070) = 1.5 : 23.5的比例按需配置两者混合液，室温孵育15分钟后待用。
2)人原代肝细胞(PHHs)复苏并计数：在上步孵育的同时，从液氮中取出冻存的人原代肝细胞(PHHs)(WBU)，放置于37℃水浴融化，待人原代肝细胞将近完全融化时取出。随后将融化的PHHs转移至含有10% 胎牛血清的细胞培养基中混匀，取出少量细胞悬浮液加入AO/PI双染试剂(Count star-RE010212)混匀，随后使用全自动细胞荧光分析仪(CountstarRigel2)计数并根据计数结果调整细胞密度为6.7×105cells/mL。
3)siRNA转染混合物配置：取100μL稀释好的siRNA加入到100μL 第1)步配置的混合液中，混匀，孵育15分钟。
4)铺板方案：将上述混合物以50μL/well的体积加入到预铺胶原的24孔板中，siRNA测试条件：1个浓度点，三复孔，对照组：空白转染试剂对照(PBS代替测试siRNA)和细胞孔对照。
5)细胞培养：6.7×105cells/mL 浓度的PHHs以450μL/well的体积加入到步骤4)预铺胶原的24孔板中。受试siRNA终浓度为10nM。细胞置于5% CO2、37℃孵箱中培养24小时。
mRNA表达二代测序过程如下：
1)根据制造商(核糖核酸提取试剂盒(RNeasy® Mini Kit，Qiagen-74106)，无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶(Qiagen-79254_RNase-Free DNase Set))的指南从细胞中纯化总RNA。
2)使用微量紫外-可见分光光度计(Nanodrop One)检测总RNA的浓度，根据制造商(安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100 Bioanalyzer)、安捷伦核糖核酸分析试剂盒(Agilent RNA 6000 Nano Kit，Agilent-5067-1511))的指南分析RNA完整性。
3)根据制造商(转录组文库构建试剂盒(VAHTS® Universal V6 RNA-seqLibrary Prep Kit for Illumina，Vazyme-NR604))的指南进行文库制备。
4)根据制造商(荧光仪(Qubit 4 fluorometer，Thermo Fisher Scientific)、双链脱氧核糖核酸高灵敏度浓度测定试剂盒(Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit，ThermoFisher Scientific-Q33231))的指南检测文库浓度，根据制造商(安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100 Bioanalyzer)、安捷伦脱氧核糖核酸分析试剂盒(Agilent DNA 1000 Kit，Agilent-5067-1504))分析文库片段大小。
5)根据制造商(测序仪(NextSeq 550，Illumina)、二代测序高通量输出试剂盒(NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (300 Cycles)，Illumina-20024908))的指南进行文库测序。
实施例5siRNA分子转基因小鼠体内活性检测
该实施例主要用于测试不同修饰所得的参比siRNA分子RRG002-50-D、RRG002-56-D、RRG002-57-D 转基因小鼠体内活性检测效果相对于本发明siRNA分子RRG002-51较差。
取30只6-8周雄性PCSK9人源化小鼠(南模生物，C57BL/6J-Pcsk9em2(hPCSK9)Smoc，货号NM-HU-00075)进行siRNA体内活性检测，小鼠随机分为5组，每组6只，分组为：
PBS对照组；RRG002-50-D (3 mg/kg)阳性对照组；RRG002-51 (3 mg/kg)治疗组；RRG002-56-D (3 mg/kg)治疗组；RRG002-57-D (3 mg/kg)治疗组。
在第-1天(给药前)获得小鼠给药前血浆样品(后颔下)。第一天用PBS稀释给药样品进行皮下注射，给药剂量为3 mg/kg，给药浓度为0.3 mg/ml(采用PBS溶解)，给药1次。于第28天采集血浆(后颔下)。
血浆中PCSK9蛋白水平用PCSK9 ELISA试剂(R&D systems)检测。以基线时(给药前)的PCSK9蛋白水平为基准计算相对比例。结果见图5。
由图5可得，PBS组血浆平均PCSK9含量为27.82 ng/ml，阳性对照组平均PCSK9含量为10.50 ng/ml，RRG002-56-D组平均PCSK9含量为14.49 ng/ml，RRG002-57-D组平均PCSK9含量为11.29 ng/ml，RRG002-51组平均PCSK9含量为4.74 ng/ml。
可见，RRG002-57-D和RRG002-56-D的区别是在配体连接siRNA的对侧加Abasic碱基，其体内敲低效果有所提高。RRG002-51与RRG002-57-D的区别是在配体与siRNA连接的中间加硫代磷酸酯键修饰，RRG002-51的体内敲低效果大大提高，且相同剂量下小鼠中药效优于阳性对照。该实施例说明，在配体与siRNA连接处使用硫代磷酸酯键修饰、在配体与siRNA连接的对侧使用Abasic修饰可以提高序列的体内活性。
实施例6siRNA分子转基因小鼠体内活性检测
(1)第一批实验RRG002-50-D、RRG002-51、RRG002-53转基因小鼠体内活性检测
为了评估修饰siRNA分子(RRG002-50-D、RRG002-51，RRG002-53)的体内活性，取24只6-8周雄性PCSK9人源化小鼠(南模生物，C57BL/6J-Pcsk9em2(hPCSK9)Smoc，货号NM-HU-00075)进行siRNA体内活性检测，小鼠随机分为4组，每组6只，分组为：
PBS对照组；RRG002-50-D (3 mg/kg)阳性对照组；RRG002-51 (3 mg/kg)治疗组；RRG002-53 (3 mg/kg)治疗组。
在第-1天(给药前)获得小鼠给药前血浆样品(后颔下)。第一天用PBS稀释给药样品进行皮下注射，给药剂量为3 mg/kg，给药浓度为0.3 mg/ml(采用PBS溶解)，给药1次。分别于第14、21、28、35、42、49、56天采集血浆(后颔下)。
血浆中PCSK9蛋白水平用PCSK9 ELISA试剂(R&D systems)检测。以基线时(给药前)的PCSK9蛋白水平为基准计算相对比例。结果见图6。
由图6可得，所有给药组在给药后约20天均达到药效峰值，敲降效率达到最高，其中阳性对照达到77%，而进行修饰优化的两组(RRG002-51，RRG002-53)更是达到86%的敲降。
可见，RRG002-51和53的区别是把不同GalNAc(DX3、L96)配体缀合在了正义链的不同端，RRG002-51是DX3连接在5'端，而RRG002-53是 L96连接在3'端，其余修饰模式基本相同。给药后56天，阳性对照已回到基线，而修饰优化后的两组敲降活性仍保持在61%。由此可得，不管从药效高低，还是药效的持续时间来看，相对阳性对照均取得了显著提升。同时也说明，本发明提供的修饰模式的活性在不同位置连接不同的配体，均能取得了较好的药效。
(2)第二批实验RRG002-51、RRG002-54、RRG002-55转基因小鼠体内活性检测
为了评估修饰siRNA分子(RRG002-51、RRG002-54、RRG002-55)的体内活性，取24只6-8周雄性PCSK9人源化小鼠(南模生物，C57BL/6J-Pcsk9em2(hPCSK9)Smoc，货号NM-HU-00075)进行siRNA体内活性检测，小鼠随机分为4组，每组5只，分组为：
PBS对照组；RRG002-51 (3 mg/kg)治疗组；RRG002-54 (3 mg/kg)治疗组；RRG002-55 (3 mg/kg)治疗组。
在第-1天(给药前)获得小鼠给药前血浆样品(后颔下)。第一天用PBS稀释给药样品进行皮下注射，给药剂量为3 mg/kg，给药浓度为0.3 mg/ml(采用PBS溶解)，给药1次。分别于第7、14、21、28、35、42、56、70天采集血浆(后颔下)。
血浆中PCSK9蛋白水平用PCSK9 ELISA试剂(R&D systems)检测。以基线时(给药前)的PCSK9蛋白水平为基准计算相对比例。结果见图7。
如图7所示，所有给药组在给药后第7-21天达到药效峰值。在给药后第56天，RRG002-51敲降为73%，RRG002-54敲降为87%，RRG002-55敲降为76%。在给药后第70天，RRG002-51敲降为66%，RRG002-54敲降为83%，RRG002-55敲降为65%。
可见，RRG002-51和RRG002-54是把不同GalNAc(LICA-1/DX3、LICA-2)配体缀合在了正义链的5'端；RRG002-53和RRG002-55是把不同GalNAc(L96、LICA-3)配体缀合在了正义链的3'端，其余修饰模式基本相同。故本发明提供的修饰模式的活性在不同位置连接不同的配体，均能取得了较好的药效。
需要指出，不同批次实验，由于动物批次不同，年龄差异、状态差异，从而使得效果略有差别，但最终体现的整体结果一致。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，其特征在于，包括互补形成双链区的正义链和反义链；
所述正义链序列为：5'-mAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUm UmGsmUsB -3'，所述反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAm AmCfAmGfGmUmCmUsm AsmG-3'；
或者，所述正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCm UmUmUmUmGmU-3'，所述反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAm AmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
其中，A、U、G和C分别表示以腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶为碱基的核苷酸；m表示该字母m右侧相邻的一个核苷酸为2’-O-甲基修饰的核苷酸；f表示该字母f的右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸，s表示该字母s左右两端的核苷酸是通过硫代磷酸酯键连接，B表示无碱基核糖。
2.如权利要求1所述的用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，其特征在于，
还包括用于对siRNA分子进行配体修饰的配体基团，
所述配体修饰具体为采用配体基团对正义链的3'末端或5'末端进行修饰；
所述配体基团包括N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺衍生物中至少一种。
3.如权利要求2所述的用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，其特征在于，
所述配体基团包括LICA-1、LICA-2、LICA-3或L96；其中，
LICA-1的结构式为：
；
LICA-2的结构式为：
；
LICA-3的结构式为：
；
L96的结构式为：
。
4.如权利要求2或3所述的用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，其特征在于，
所述正义链与所述配体基团通过硫代磷酸酯键连接。
5.如权利要求4所述的用于抑制PCSK9表达的siRNA分子，其特征在于，
所述siRNA分子具有如下(1)~(4)任一结构：
(1)正义链序列为：5'-LICA-1-smAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
(2)正义链序列为：5'-LICA-2-smAmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGsmUsB-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
(3)正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmUs-LICA-3-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'；
(4)正义链序列为：5'-BsmAsmGmAmCmCmUfGmUfUfUfUmGmCmUmUmUmUmGmUs-L96-3'，
反义链序列为：5'-mAsfCsmAmAmAfAmGmCmAmAmAmAmCfAmGfGmUmCmUsmAsmG-3'。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1~5任一项所述的siRNA分子和药学上可接受的载体。
7.权利要求1~5任一项所述的siRNA分子或权利要求6所述的药物组合物在制备用于抑制PCSK9的蛋白表达的产品中的应用。
8.权利要求1~5任一项所述的siRNA分子或权利要求6所述的药物组合物在制备用于降低血清中低密度脂蛋白或低密度脂蛋白胆固醇浓度的产品中的应用。
9.权利要求1~5任一项所述的siRNA分子或权利要求6所述的药物组合物在制备用于缓解由PSCK9基因介导的疾病的症状的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
所述由PSCK9基因介导的疾病包括心血管疾病、血脂异常疾病、肿瘤性疾病；其中，所述心血管疾病包括高胆固醇血症、高脂血症；所述血脂异常疾病包括脂代谢异常；所述肿瘤性疾病包括与PSCK9有关的黑色素瘤、转移性肝癌。
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