CN117384170A - 一种Wnt通路抑制剂化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式4所示的Wnt通路抑制剂化合物及其合成方法，以及包含所述化合物的药物组合物，以及式4化合物用于预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病或免疫介导性疾病的用途。

Description

一种Wnt通路抑制剂化合物
本申请是申请号为“202280013624.X”的中国发明专利申请的分案申请。母案申请的申请日是2022年7月26日(PCT国际申请日)，中国国家申请号是“202280013624.X”(PCT国际申请号是PCT/CN2022/107727)，发明创造名称是“一种Wnt通路抑制剂化合物”。
母案申请以及本分案申请要求于2021年7月26日提交到中国国家知识产权局的发明名称为“一种Wnt通路抑制剂化合物”的中国专利申请202110847130.9的优先权，其内容通过引用以整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种杂环化合物，具体地涉及一种高活性的Wnt通路抑制剂及其制备方法和用途。
背景技术
Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中保守的通路。在正常的体细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与E-cadherin形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用。当Wnt信号通路未被激活时，细胞质内的β-catenin被磷酸化，并与APC、Axin和GSK3β等形成β-catenin降解复合物，从而启动泛素系统经蛋白酶体途径降解β-catenin，使细胞质内的β-catenin维持在较低水平。当细胞受到Wnt信号刺激时，Wnt蛋白与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合，激活后的Frizzled受体招募胞内Dishevelled蛋白，抑制GSK3β等蛋白形成的β-catenin降解复合物的降解活性，稳定细胞质中游离状态的β-catenin蛋白。胞浆中稳定积累的β-catenin进入细胞核后结合LEF/TCF转录因子家族，启动下游靶基因(如c-myc、c-jun，Cyclin D1等)的转录。Wnt/β-catenin信号通路的过度激活与多种癌症(包括结肠癌、胃癌、乳腺癌等)的发生密切相关。例如结直肠癌中广泛存在Wnt经典信号通路的异常激活和β-catenin蛋白的核内积聚现象,而通过抑制Wnt信号通路活性可以抑制例如结肠癌等癌症的增殖。85％以上的结直肠癌中均存在APC的突变，突变后的APC阻断β-catenin磷酸化降解，诱导结直肠癌的发生。此外，Axin突变、β-catenin自身突变也可引起β-catenin的胞内聚集，活化Wnt/β-catenin通路。
尽管已知抑制Wnt信号通路可以有效预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫介导性疾病，但目前现有技术中尚缺乏令人满意的有效的Wnt通路抑制剂化合物。因此，研究有效的Wnt通路抑制剂化合物，是现有技术中的需要。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种具有式4结构的抑制Wnt通路活性的化合物或其药学上可接受的盐、同位素衍生物、立体异构体：
在一个方面，本发明提供了一种制备如上所述具有式4结构的化合物的方法，包括如下步骤：
第一步：将顺式-3-BOC-氨基环丁醇1a，甲基磺酸酐和N,N-二异丙基乙胺溶解于二氯甲烷中，在室温条件下搅拌至反应结束，反应液用二氯甲烷稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到黄色固体1b；第二步：将化合物1b，化合物2a和碳酸铯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，在80℃条件下搅拌至反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到白色固体2b；第三步：将化合物3a，化合物3b，碳酸钾和18-冠-6溶解于1，4-二氧六环中，在80℃条件下搅拌至反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体3c；第四步：将化合物3c溶解在二氯甲烷中，滴加盐酸1，4-二氧六环溶液，在室温条件下搅拌至反应结束，反应液浓缩得到白色固体3d；第五步：将化合物3d和N,N-二异丙基乙胺溶解于1，4-二氧六环中，在100℃条件下搅拌至反应结束，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体3e；第六步：将化合物3e，碘甲烷和碳酸铯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，在80℃条件下搅拌至反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体3f；第七步：将化合物3f，化合物2b和三氟乙酸溶解在正丁醇中，在微波160℃的条件下反应至反应结束；反应液通过反相制备HPLC纯化，得到白色固体4。
进一步地，本发明还提供了一种药物组合物，包含本发明所述的化合物或其及药学上可接受的盐、同位素衍生物或立体异构体。
进一步地，本发明还提供了本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、同位素衍生物、立体异构体或者本发明所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病或免疫介导性疾病的药物中的用途。特别注意的是，在本文中，当提及式4结构的“化合物”时，一般地还涵盖其立体异构体、非对映异构体、对映异构体、外消旋混合物和同位素衍生物。
相应地，本发明提供了一种预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病或免疫介导性疾病的方法，包括向对象给予本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、同位素衍生物、立体异构体或者本发明所述的药物组合物。
本领域技术人员公知，一种化合物的盐、溶剂合物、水合物是化合物的替代性存在形式，它们都可以在一定条件下转化为所述化合物，因此，特别注意的是在本文中当提到式4结构的化合物时，一般地还包括它的可药用盐，进而还包括其溶剂合物和水合物。
相似地，在本文中当提到一种化合物时，一般地还包括其前药、代谢产物和氮氧化物。
本发明所述的可药用盐可使用例如以下的无机酸或有机酸而形成：“可药用盐”是指这样的盐，在合理的医学判断范围内，其适用于接触人和较低等动物的组织，而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等，称得上合理的受益/风险比。可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备所述盐，或单独通过将游离碱或游离酸与合适的试剂反应制备所述盐，如下概述。例如，游离碱功能可以与合适的酸反应。可药用的无机酸加成盐的示例是氨基与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有机酸(例如，醋酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用现有技术中的其他方法如离子交换形成的盐。其他可药用盐包括(适当时)无毒铵盐、季铵盐和用反离子形成的胺阳离子，例如，卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。
本发明的可药用盐可通过常规方法制备，例如通过将本发明的化合物溶解于与水可混溶的有机溶剂(例如丙酮、甲醇、乙醇和乙腈)，向其中添加过量的有机酸或无机酸水溶液，以使得盐从所得混合物中沉淀，从中除去溶剂和剩余的游离酸，然后分离所沉淀的盐。
本发明所述的前体或代谢物可以本领域公知的前体或代谢物，只要所述的前体或代谢物通过体内代谢转化形成化合物即可。例如“前药”是指本发明化合物的那些前药，在合理的医学判断范围内，其适用于接触人和更低等动物的组织，而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等，称得上合理的受益/风险比并且对其预期用途有效。术语“前药”是指在体内迅速经转化产生上述式的母体化合物的化合物，例如通过在体内代谢，或本发明化合物的N-去甲基化。
本发明所述的“溶剂合物”意指本发明化合物与一个或多个溶剂分子(无论有机的还是无机的)的物理缔合。该物理缔合包括氢键。在某些情形中，例如当一个或多个溶剂分子纳入结晶固体的晶格中时，溶剂化物将能够被分离。溶剂化物中的溶剂分子可按规则排列和/或无序排列存在。溶剂合物可包含化学计量或非化学计量的溶剂分子。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离的溶剂合物。示例性溶剂合物包括但不限于水合物、乙醇合物、甲醇合物和异丙醇合物。溶剂化方法是本领域公知的。
本发明所述的“立体异构”分为构象异构和构型异构，构型异构还可分为顺反异构和旋光异构(即光学异构)，构象异构是指具有一定构型的有机物分子由于碳、碳单键的旋转或扭曲而使得分子各原子或原子团在空间产生不同的排列方式的一种立体异构现象，常见的有烷烃和环烷烃类化合物的结构，如环己烷结构中出现的椅式构象和船式构象。“立体异构体”是指当本发明化合物含有一个或多个不对称中心，因而可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单一非对映异构体。本发明化合物有不对称中心，每个不对称中心会产生两个光学异构体，本发明的范围包括所有可能的光学异构体和非对映异构体混合物和纯的或部分纯的化合物。本发明所述的化合物可以以互变异构体形式存在，其通过一个或多个双键位移而具有不同的氢的连接点。例如，酮和它的烯醇形式是酮-烯醇互变异构体。各互变异构体及其混合物都包括在本发明的化合物中。所有式4化合物的对映异构体、非对映异构体、外消旋体、内消旋体、顺反异构体、互变异构体、几何异构体、差向异构体及其混合物等，均包括在本发明范围中。
本发明的“同位素衍生物”是指在本文中化合物被同位素标记的分子。通常用作同位素标记的同位素是：氢同位素，2H和3H；碳同位素：11C,13C和14C；氯同位素：35Cl和37Cl；氟同位素：18F；碘同位素：123I和125I；氮同位素：13N和15N；氧同位素：15O,17O和18O和硫同位素35S。这些同位素标记化合物可以用来研究药用分子在组织中的分布情况。尤其是氘3H和碳13C，由于它们容易标记且方便检测，运用更为广泛。某些重同位素，比如重氢(2H)，的取代能增强代谢的稳定性，延长半衰期从而达到减少剂量的目而提供疗效优势的。同位素标记的化合物一般从已被标记的起始物开始，用已知的合成技术象合成非同位素标记的化合物一样来完成其合成。
本发明还提供了本发明化合物在制备用于预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病或免疫介导性疾病的药物中的用途。
此外，本发明提供了用于预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、注意力相关疾病或免疫介导性疾病的药物组合物，其包含本发明化合物作为活性成分。所述药物组合物可任选地包含可药用的载体。
此外，本发明提供了一种预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、注意力相关疾病或免疫介导性疾病的方法，其包括向有此需要的哺乳动物施用本发明化合物。
当将本发明化合物或其可药用盐与另外的用于治疗癌症或肿瘤的抗癌剂或免疫检查点抑制剂组合施用时，本发明化合物或其可药用盐可提供增强的抗癌作用。
当将本发明化合物或其可药用盐与另外的用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫介导性疾病的治疗剂组合施用时，本发明化合物或其可药用盐可提供增强的治疗作用。
本发明的化合物或其可药用盐可作为活性成分通过口服或肠胃外施用。活性成分的剂量可根据多个相关因素(例如待治疗对象的情况、疾病类型和严重性、施用速率和医生意见)进行调整。在某些情况下，小于以上剂量的量可能是合适的。如果不引起有害的副作用则可使用大于以上剂量的量并且该量可以每天以分次剂量施用。
除此之外，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤、癌症、病毒感染、器官移植排斥、神经退行性疾病、注意力相关疾病或自身免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的哺乳动物施用本发明的化合物或本发明的药物组合物。
可根据常规方法中的任何一种将本发明药物组合物配制成用于口服施用或肠胃外施用(包括肌内、静脉内和皮下途径、瘤内注射)的剂型，例如片剂、颗粒、粉末、胶囊、糖浆、乳剂、微乳剂、溶液或混悬液。
用于口服施用的本发明药物组合物可通过将活性成分与例如以下的载体混合来制备：纤维素、硅酸钙、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、磷酸钙、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、明胶、滑石、表面活性剂、助悬剂、乳化剂和稀释剂。
在本发明的注射施用的药物组合物中采用的载体的实例可以是水、盐溶液、葡萄糖溶液、葡萄糖样溶液(glucose-like solution)、醇、二醇、醚(例如，聚乙二醇400)、油、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油酯、表面活性剂、助悬剂和乳化剂。
本发明描述示例性实施方案的过程中，本发明的其它特征将变得显而易见，给出所述实施方案用于说明本发明而不意欲成为其限制，以下实施例使用本发明所公开的方法制备、分离和表征。
可以用有机合成领域的技术人员已知的多种方式来制备本发明的化合物，可使用下述方法以及有机合成化学领域中已知的合成方法或通过本领域技术人员所了解的其变化形式来合成本发明化合物。优选方法包括但不限于下文所述的这些。在适用于所使用试剂盒材料和适用于所实现转变的溶剂或溶剂混合物中实施反应。有机合成领域的技术人员将理解，分子上存在的官能性与所提出的转变一致。这有时需要加以判断改变合成步骤的顺序或原料以获得期望的本发明化合物。
具体实施方式
术语
如果无另外说明，用于本发明申请，包括说明书和权利要求书中的术语，定义如下。如果无另外说明，使用质谱、核磁、HPLC、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理的常规方法。在本申请中，如果无另外说明，使用“或”或“和”指“和/或”。
在说明书和权利要求书中，给定化学式或名称应涵盖其所有立体异构体和光学异构体及其中存在上述异构体的外消旋体。除非另外指明，否则所有手性(对映异构体和非对映异构体)和外消旋形式均在本发明范围内。所述化合物中还可存在C＝C双键、C＝N双键、环系统等的多种几何异构体，且所有上述稳定异构体均涵盖于本发明内。本发明描述了本发明化合物的顺式-和反式-(或E-和Z-)几何异构体，且其可分离成异构体的混合物或分开的异构体形式。本发明化合物可以光学活性或外消旋形式加以分离。用于制备本发明化合物和其中制备的中间体的所有方法均视为本发明的部分。在制备对映异构体或非对映异构体产物时，其可通过常规方法(例如通过色谱或分段结晶)进行分离。取决于方法条件，以游离(中性)或盐形式获得本发明的终产物。这些终产物的游离形式和盐均在本发明的范围内。如果需要的话，则可将化合物的一种形式转化成另一种形式。可将游离碱或酸转化成盐；可将盐转化成游离化合物或另一种盐；可将本发明异构体化合物的混合物分离成单独的异构体。本发明化合物、其游离形式和盐可以多种互变异构体形式存在，其中氢原子转置到分子的其它部分上且由此分子的原子之间的化学键发生重排。应当理解的是，可存在的所有互变异构体形式均包括在本发明内。
本文使用的术语“患者”是指通过本发明的方法进行治疗的有机体。这类有机体优选包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿、猴、马、牛、猪、犬、猫等)且最优选是指人类。
本文使用的术语“有效量”意指将会引起例如研究人员或临床医师所寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的药物或药剂(即本发明化合物)的量。此外，术语“治疗有效量”意指这样的量：与未接受上述量的相应受试者相比，所述量导致改善的治疗、治愈、预防或减轻疾病、病症或副作用，或降低在疾病或病症的进展速度。有效量可以一个或多个给药、施用或剂量给予且不意欲被特定的制剂或给药途径限制。该术语还包括在其范围内的增强正常生理机能的有效量。
本文使用的术语“治疗”包括导致改善病症、疾病、障碍等的任何效果，例如减轻、减少、调节、改善或消除，或改善其症状。
术语“药用”在本文中用于指如下那些化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理医学判断的范围内，其适于与人类和动物的组织接触使用而无过高毒性、刺激性、过敏反应和/或其它问题或并发症，并与合理的益处/风险比相称。
本文使用的短语“药用载体”意指药用物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂包囊物质，其涉及将主题化合物从一个器官或身体的部分携带或运送至另一个器官或身体的部分。每种载体在与制剂的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。
术语“药物组合物”意指包含本发明化合物与至少一种其它药用载体的组合物。“药用载体”是指本领域中通常接受用于将生物活性剂递送至动物(具体为哺乳动物)的介质，包括(即)佐剂、赋形剂或媒介物，诸如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、矫味剂、芳香剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，这取决于给药模式和剂型的性质。
术语“可接受的”，如本文所用，指一个处方组分或活性成分对一般治疗目标的健康没有过分的有害影响。
术语“癌症”，如本文所用，指一种不能控制的细胞的异常生长，并且在某种条件下能够转移(传播)。这种类型的癌症包括但不限于，实体肿瘤(如膀胱、肠、脑、胸、子宫、心脏、肾、肺、淋巴组织(淋巴瘤)、卵巢、胰腺或其它内分泌器官(如甲状腺)、前列腺、皮肤(黑色素瘤)或血液瘤(如非白血性白血病)。
术语“联合给药”或其类似术语，如本文所用，指将几种所选的治疗药物给一个病人用药，以相同或不同的给药方式在相同或不同的时间给药。
术语“增强”或“能增强”，如本文所用，指预期的结果能够在效力或是持续时间方面都有增加或延长。因此，在增强药物的治疗效果方面，术语“能增强”指药物在系统中有提高或延长效力或持续时间的能力。本文所用的“增效值”，指在理想的系统中，能够最大限度地地增强另外一种治疗药物的能力。
术语“免疫性疾病”指对内源性或外源性抗原产生的不良或有害反应的疾病或症状。结果通常会造成细胞的功能障碍、或因此而破坏并造成机能障碍、或破坏可能产生免疫症状的器官或组织。
术语“试剂盒”与“产品包装”是同义词。
术语“受试者”或“病人”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，哺乳类：人、非人灵长类如猩猩、猿及猴类；农业动物如牛、马、山羊、绵羊、猪；家畜如兔、狗；实验动物包括啮齿类，如大鼠、小鼠及豚鼠等。非哺乳类动物包括但不限于，鸟、鱼等。在一优选的方面，所选哺乳动物是人。
术语“治疗”、“治疗过程”或“疗法”如本文所用，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生；改善或预防潜在代谢综合征；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防和/或治疗由疾病或症状引起的征兆。
如本文所用，某一化合物或药物组合物，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于或与给药有关的情况。
给药途径
适合的给药途径包括但不限于，口服、静脉注射、直肠、气雾剂、非肠道给药、眼部给药、肺部给药、经皮给药、阴道给药、耳道给药、鼻腔给药及局部给药。此外，仅作举例说明，肠道外给药，包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、髓内注射、心室注射、腹膜内注射、淋巴管内注射、及鼻内注射。
在一方面，此处描述的化合物给药方式是局部的而不是全身性的给药方式。在特定的具体实施方案中，长效制剂通过植入给药(例如皮下或肌肉)或通过肌肉注射。此外，在另一具体化实施方案中，药物通过靶向药物给药系统来给药。例如，由器官特异性抗体包裹的脂质体。在这种具体实施例中，所述脂质体被选择性地导向特定器官并被吸收。
本发明范围包括(单独或与药物载体组合)包含治疗有效量的至少一种本发明化合物作为活性成分的药物组合物。任选地，本发明化合物可单独使用、与本发明其它化合物组合使用或与一种或多种其它治疗剂(例如抗癌剂或其它药学活性物质)组合使用。
不考虑所选择的给药路径，通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物(其可以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药用剂量形式。
可改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平，从而获得对于实现特定患者的期望的治疗响应、组成和给药模式有效的而对患者无毒的活性成分量。
选定的剂量水平会取决于多种因素，包括所用的本发明的特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性；给药路径；给药时间；所用的特定化合物的排泄速率；吸收速率和程度；治疗的持续时间；与所用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质；所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前的医学史等医学领域公知的因素。
虽然本发明化合物可单独给药，但优选以药物制剂(组合物)形式给予化合物。
试剂盒/产品包装
在本说明书中被描述的所有特征(包括任何所述的权利要求、摘要),和/或任何方法或过程中涉及的所有步骤，均有可能以任意一种组合存在，除非某些特征或步骤在同一组合中是相互排斥的。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、等同或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为等同或相似特征的一般性例子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量(g)。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或等同的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
通用过程
未包括制备途径时，本发明所用原料与试剂均为已知产品，可以按照本领域已知的方法合成，或者可通过购买市售产品获得。使用的市售试剂均不需进一步纯化。
室温是指20-30℃。
反应实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行。氮气氛是指反应瓶连接一个约1L的氮气气球。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。氢气氛是指反应瓶连接一个约1L的氢气气球。
微波反应使用Initiator+微波反应器。
本发明化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用(Bruker AscendTM 500型)核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3),氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。以下简写用于NMR信号的多重性：s＝单峰，brs＝宽峰，d＝二重峰，t＝三重峰，m＝多重峰。偶合常数以J值列出，以Hz测量。
LC-MS的测定使用Thermo液质联用仪(UltiMate 3000+MSQ PLUS)。HPLC的测定使用Thermo高压液相色谱仪(UltiMate 3000)。反相制备色谱使用Thermo(UltiMate 3000)反相制备色谱仪。快速柱层析使用艾杰尔(FS-9200T)自动过柱机，硅胶预装柱使用三泰预装柱。薄层层析硅胶板用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
实施例1
(S)-4,5-二甲基-2-((反-3-(3,4,5-三氟苯氧基)环丁基)氨基)-4,5,9,10-四氢-6H,8H-吡啶并[3,2,1-脱]蝶啶-6-酮
化合物1由以下步骤制备：
第一步：将顺式-3-BOC-氨基环丁醇1a(250mg,1.34mmol)，甲基磺酸酐(465mg,2.67mmol)和N,N-二异丙基乙胺(517mg,4.01mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)中，在室温条件下搅拌过夜。TLC监测反应结束，反应液用二氯甲烷稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到黄色固体1b(300mg,收率84％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.23(d,J＝8.3Hz,1H),4.69-4.64(m,1H),3.63-3.60(m,1H),3.13(s,3H),2.70-2.62(m,2H),2.16-2.09(m,2H),1.37(s,9H)。
第二步：将化合物1b(300mg,1.13mmol)，化合物1c(251mg,1.70mmol)和碳酸铯(737mg,2.26mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，在80℃条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到白色固体1d(280mg,收率78％)。ESI-MS(m/z):318.6[M+H]+。
第三步：将化合物1d(280mg,882umol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，滴加盐酸1，4-二氧六环溶液(4M,1.10mL)，在室温条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液浓缩得到白色固体1e(170mg,收率75％)。ESI-MS(m/z):218.4[M+H]+。
第四步：将2,4-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶1f(1.7g，8.50mmol)和(S)-2-(甲基氨基)丙酸甲酯盐酸盐1g(1.70g，11.05mmol)溶解于四氢呋喃(40mL)中，加入三乙胺(2.58g，25.50mmol，3.53mL)，在室温条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物1h(1.1g，收率46％)。ESI-MS(m/z):281.2[M+H]+。
第五步：将化合物1h(1.1g，3.92mmol)溶解于四氢呋喃(20mL)中，加入盐酸水溶液(6N，0.65mL)和二氧化铂(88mg，0.39mmol)，反应体系用氢气球置换氢气，在室温氢气球压力下搅拌48小时，LCMS监测反应结束。反应液用甲醇稀释，过滤，滤液浓缩后通过硅胶柱层析纯化，得到白色固体1i(900mg，收率90％)。ESI-MS(m/z):253.2[M+H]+。
第六步：将化合物1i(50mg,197umol)，化合物1e(65mg,257umol)和一水对甲苯磺酸(3.7mg,19umol)溶解在正丁醇(2mL)中，在微波160℃的条件下反应2小时。LCMS监测反应结束。反应液通过反相制备HPLC纯化，得到白色固体1(13mg,收率15％)。ESI-MS(m/z):434.3[M+H]+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.90-6.82(m,3H),4.86-4.81(m,1H),4.42-4.36(m,1H),4.12(q,J＝6.8Hz,1H),4.05-4.00(m,1H),3.30-3.24(m,1H),2.94(s,3H),2.55-2.52(m,2H),2.48-2.38(m,2H),2.36-2.28(m,2H),1.97-1.88(m,1H),1.85-1.76(m,1H),1.23(d,J＝6.8Hz,3H)。
实施例2
(S)-4,5-二甲基-2-((反-3-((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)氧代)环丁基)氨基)-4,5,9,10-四氢-6H,8H-吡啶并[3,2,1-脱]蝶啶-6-酮
化合物2由以下步骤制备：
第一步：将化合物1b(500mg,1.88mmol)，化合物2a(461mg,2.83mmol)和碳酸铯(1.23g,3.77mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，在80℃条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到白色固体2b(500mg,收率79％)。ESI-MS(m/z):333.3[M+H]+。
第二步：将化合物2b(500mg,1.50mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，滴加盐酸1，4-二氧六环溶液(4M,1.88mL)，在室温条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液浓缩得到白色固体2c(300mg,收率74％)。ESI-MS(m/z):233.5[M+H]+。
第三步：将化合物1i(50mg,197umol)，化合物2c(68mg,256umol)和一水对甲苯磺酸(3.7mg,19umol)溶解在正丁醇(2mL)中，在微波160℃的条件下反应2小时。LCMS监测反应结束。反应液通过反相制备HPLC纯化，得到白色固体2(10.1mg,收率11％)。ESI-MS(m/z):449.2[M+H]+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.38(d,J＝2.8Hz,1H),7.83(d,J＝8.7Hz,1H),7.46(dd,J＝8.7,2.9Hz,1H),6.91(d,J＝6.9Hz,1H),5.05-5.00(m,1H),4.46-4.42(m,1H),4.12(q,J＝6.9Hz,1H),4.03-3.99(m,2H),3.28-3.25(m,1H),2.95(s,3H),2.50-2.38(m,4H),1.97-1.87(m,1H),1.84-1.77(m,1H),1.23(d,J＝6.7Hz,3H)。
实施例3
(R)-4,6-二甲基-N-(反-3-(3,4,5-三氟苯氧基)环丁基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[3,2,1-脱]
蝶啶-2-胺
化合物3由以下步骤制备：
第一步：将化合物3a(500mg,2.66mmol)，化合物3b(946mg,3.99mmol)，碳酸钾(1.47g,10.64mmol)和18-冠-6(351mg,1.33mmol)溶解于1，4-二氧六环(10mL)中，在80℃条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色固体3c(600mg,收率65％)。ESI-MS(m/z):345.3[M+H]+。
第二步：将化合物3c(600mg,1.74mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，滴加盐酸1，4-二氧六环溶液(4M,2.17mL)，在室温条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液浓缩得到白色固体3d(400mg,收率81％)。ESI-MS(m/z):245.3[M+H]+。
第三步：将化合物3d(400mg,1.63mmol)和N,N-二异丙基乙胺(632mg,4.90mmol)溶解于1，4-二氧六环(5mL)中，在100℃条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到黄色固体3e(150mg,收率44％)。ESI-MS(m/z):209.4[M+H]+。
第四步：将化合物3e(150mg,718umol)，碘甲烷(153mg,1.08mmol)和碳酸铯(468mg,1.44mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，在80℃条件下搅拌过夜。LCMS监测反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到黄色固体3f(100mg,收率62％)。ESI-MS(m/z):223.4[M+H]+。
第五步：将化合物3f(30mg,134umol)，化合物1e(68mg,256umol)和三氟乙酸(1.5mg,13umol)溶解在正丁醇(2mL)中，在微波160℃的条件下反应2小时。LCMS监测反应结束。反应液通过反相制备HPLC纯化，得到白色固体3(6.8mg,收率12％)。ESI-MS(m/z):404.2[M+H]+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.19(s,1H),7.30(d,J＝2.8Hz,1H),6.92-6.82(m,2H),6.04(d,J＝2.8Hz,1H),4.93-4.81(m,1H),4.46-4.41(m,1H),4.37-4.24(m,1H),3.64(dd,J＝12.4,3.9Hz,1H),3.35-3.30(m,1H),3.05(s,3H),2.48-2.42(m,2H),2.38-2.33(m,2H),1.42(d,J＝6.4Hz,3H)。
实施例4
(R)-4,6-二甲基-N-(反-3-((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)氧代)环丁基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[3,2,1-脱]蝶啶-2-胺
化合物4由以下步骤制备：
第一步：将化合物3f(30mg,134umol)，化合物2b(40mg,175umol)和三氟乙酸(1.5mg,13umol)溶解在正丁醇(2mL)中，在微波160℃的条件下反应2小时。LCMS监测反应结束。反应液通过反相制备HPLC纯化，得到白色固体4(9.3mg,收率16％)。ESI-MS(m/z):419.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.39(d,J＝2.8Hz,1H),8.20(s,1H),7.84(d,J＝8.7Hz,1H),7.47(dd,J＝8.7,2.9Hz,1H),7.30(d,J＝2.8Hz,1H),6.69(br s,1H),6.04(d,J＝2.8Hz,1H),5.08-5.02(m,1H),4.53-4.45(m,1H),4.35-4.25(m,1H),3.64(dd,J＝12.3,3.9Hz,2H),3.05(s,3H),2.50-2.40(m,4H),1.42(d,J＝6.4Hz,3H)。
Wnt通路抑制剂生物学筛选和结果
试验例1：Colo205-LUC-TCF/LEF-M1报告细胞系的构建
Colo205细胞系(中科院细胞库,Cat#TCHu102)购买于中科院细胞库，扩增传代培养后，于细胞的指数生长期，以lipo3000脂质体转染的方法，转染带有TCF/LEF转录因子驱动的萤光素酶报告质粒(Promega)。该质粒带有抗性基因，可以进行抗性筛选。转染在10cm培养皿中进行，使用无抗性的常规完全培养基。2天后，更换带有抗性的培养基，继续培养。之后每2天更换抗性培养基，并将悬浮细胞丢弃，原始培养基离心去除细胞和碎片后保留，作为适应性培养基。当细胞长满培养皿后，将细胞消化下来，计数，传代于96孔板，使每孔中含有的细胞数量平均为1.5个/孔，传代时使用适应培养基。其余细胞进行冻存。传代后培养4小时，让细胞贴壁，然后在显微镜下观察各孔的细胞数量。每孔仅1个细胞的孔进行标记，其为单克隆孔。而后正常培养，每2天更换培养基，并进行观察。前期单克隆细胞有继续生长的孔，进行2次标记，可更换为正常的带抗性培养基。当有单克隆孔中的细胞长满96孔板板孔时，将其消化传代到24孔培养板，24孔板长满后，传代到1个96孔板和1个6孔板，其中96孔板细胞传代到至少6孔，其中3孔加入已知的Wnt抑制剂，另外3孔不作处理。24h后，96孔板细胞加入萤光检测试剂，检测萤光强度。选择其中不处理时有萤光表达，且抑制后萤之光降低的细胞系，进一步培养。Colo205-LUC-TCF/LEF-M1细胞系为上述筛选出的细胞系之一，其生长曲线、细胞形态、细胞生长状态与原始Colo205细胞相似，且其加抑制剂处理和不处理的萤光信号之比在所有细胞系中属于较大的，比值在4h时抑制可达4-5倍，完全适用于后期的Wnt抑制剂的筛选。
试验例2：化合物对Colo205-LUC-TCF/LEF M1报告细胞系抑制能力的检测
Colo205-LUC-TCF/LEF M1细胞株为稳定转染pGL4.49-LUC2-TCF/LEF载体的报告工具细胞，其β-catenin Wnt通路持续激活，加入抑制剂后，Wnt通路被抑制，载体上TCF/LEF顺式元件调控的萤火虫萤光素酶表达量下降，后续加入检测底物后，检测到的光信号相应下降，从而检测出化合物的抑制效果。
向96孔细胞培养板的每孔中加入100μL，最高浓度20μM的化合物，化合物浓度做3倍梯度稀释。然后向各孔中接种10000个稳定转染过报告基因的colo205细胞和100μL培养基，同时进行相应的处理作为阳性、阴性对照孔。将细胞放入5％CO2细胞培养箱，37℃培养4h，4小时后，去除培养液，向各孔添加含相应的萤火虫荧光素酶底物的试剂(Promega)100μL，测定荧光素酶报告基因的活性。用SpectraMax在全波长模式下读取发光强度。仅由DMSO处理的细胞的光信号强度为阳性对照，无细胞孔的光信号强度为阴性对照，计算化合物的IC50的浓度。Colo 205报告基因检测数据汇总于下表1。
表1化合物对Colo205-LUC-TCF/LEF报告基因抑制的IC50值
试验例3：化合物对Wnt突变细胞株(Colo205、DU4475、NCI-H929和HepG2)和非Wnt突变细胞株(Hela和RKO)的增殖抑制试验
试验中使用的细胞株为Wnt通路持续激活的，且其增殖为Wnt通路依赖型的Colo205、DU4475、NCI-H929和HepG2细胞系；而正常情况下Wnt通路不激活，且增殖不依赖于Wnt通路的HELA和RKO细胞系作为对照细胞系，判断本发明的化合物对于Wnt依赖的增殖的抑制作用不是由于其它非特异毒性造成的。
将培养于各自培养基中的Colo205、Du4475、NCI-H929、HepG2、HELA和RKO细胞株在对数生长期时处理，收集细胞后制备成已知浓度的均匀的细胞悬液，然后向96孔细胞培养板中加入细胞悬液，使每孔中含有1000个细胞。放入5％CO2胞培养箱，37℃培养20-24h。第二天向各细胞培养孔中加入已经完全溶解的，3倍梯度稀释的化合物，使细胞培养孔中的最终最高浓度为20μM，继续培养96h。本试验使用Promega的细胞活性检测试验进行检测，细胞增殖越多，则最终的信号强度越强。检测仪器为SpectraMax，全波长模式。仅加入DMSO的孔作为阳性对照孔，未接种细胞的孔为阴性对照孔，计算化合物对于Wnt持续激活或增殖依赖的细胞的增殖抑制的IC50值，以及对于Wnt未激活的或增殖不依赖的细胞的增殖抑制的IC50值，评估化合物对于Wnt通路的抑制作用和对于正常细胞的毒性作用。结果如下表2所示。
表2化合物对Wnt突变细胞株的增殖抑制的IC50值
上述结果表明，本发明化合物对于突变细胞株Colo205、DU4475、NCI-H929和HepG2具有显著的抑制活性，而对Hela和RKO细胞株基本不具有显著抑制活性，这表明本发明化合物具有显著的且选择性的Wnt通路抑制作用。

Claims (4)

1.一种具有式4结构的化合物或其药学上可接受的盐、同位素衍生物、立体异构体：
2.一种制备如权利要求1所述的具有式4结构的化合物的方法，包括如下步骤：
第一步：将顺式-3-BOC-氨基环丁醇1a，甲基磺酸酐和N,N-二异丙基乙胺溶解于二氯甲烷中，在室温条件下搅拌至反应结束，反应液用二氯甲烷稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到黄色固体1b；
第二步：将化合物1b，化合物2a和碳酸铯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，在80℃条件下搅拌至反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到白色固体2b；
第三步：将化合物3a，化合物3b，碳酸钾和18-冠-6溶解于1，4-二氧六环中，在80℃条件下搅拌至反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体3c；
第四步：将化合物3c溶解在二氯甲烷中，滴加盐酸1，4-二氧六环溶液，在室温条件下搅拌至反应结束，反应液浓缩得到白色固体3d；
第五步：将化合物3d和N,N-二异丙基乙胺溶解于1，4-二氧六环中，在100℃条件下搅拌至反应结束，反应液浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体3e；
第六步：将化合物3e，碘甲烷和碳酸铯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，在80℃条件下搅拌至反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，有机相通过无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体3f；
第七步：将化合物3f，化合物2b和三氟乙酸溶解在正丁醇中，在微波160℃的条件下反应至反应结束；反应液通过反相制备HPLC纯化，得到白色固体4。
3.药物组合物，包括权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、同位素衍生物、立体异构体。
4.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、同位素衍生物、立体异构体以及权利要求3所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症、肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病或免疫介导性疾病的药物中的用途。
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