CN117379556A - 一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞、制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞、制备及其应用，涉及生物医药技术领域。制备方法为：将正电性溶液与负电性溶液进行混合，正电性溶液为聚赖氨酸溶液或ε‑聚赖氨酸盐酸盐溶液，负电性溶液为脱氧核糖核酸溶液；通过发生液液相分离，得到含有功能成份的凝聚体液滴混悬液；将磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后进行真空旋转蒸发，直至有机溶剂挥发，得到脂质膜；将凝聚体液滴混悬液加入脂质膜中水化，直至脂质膜完全溶散，即得到功能化人造细胞；正电性溶液、负电性溶液和磷脂溶液中至少一种含有功能成分。本发明所构建基于复合凝聚体的功能化人造细胞具有类细胞膜和类细胞质的结构，具有良好的生理稳定性和生物相容性。

Description

一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞、制备及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞、制备及其应用。
背景技术
液-液相分离(Liquid-liquid phase separation，LLPS)是均匀的液相通过相互作用(电荷-电荷、氢键或π-π堆积等)分离成两个或多个不同组分的不混相液相的现象。多项独立的研究证实了LLPS是细胞中无膜细胞器形成的基础。这种凝聚体液滴内部分子拥挤、介电常数低于周围的水连续相、富含至少50％的水分、可富集外部的溶质、作为特定催化反应的场所，或在应激时作为储存特定酶的隔室，是生命体区隔和保护细胞内活性成分的自然选择。因此，体外构建凝聚体液滴用以模仿无膜细胞器的特征，成为一种简便高效的封装治疗药物的优化策略。首先，凝聚体液滴对治疗药物的负载具有普适性和高效性。治疗药物以非共价相互形式被浓缩于凝聚体液滴中，在不需要任何化学修饰的情况下可高效负载不同电荷和亲疏水性的小分子、生物大分子甚至纳米颗粒。其次，凝聚体液滴的成分简单且制备迅速。与脂质大囊泡、聚合物微球、凝胶等常规递送系统相比，凝聚体液滴通常是1-2两种材料在瞬间即可形成。在制备和装载药物时，不需要使用有机溶剂，可有效保留多肽、蛋白质、核酸和囊泡等生物药物的活性。这种成分简单、制备容易的特性对规模化生产中的工艺流程和质量控制具有重大意义。因此，发现和开发具有生理稳定性和生物相容性的基于凝聚体有望推动合成生物学和制药领域的发展。
然而，凝聚体的生物学应用仍然面临着多方面挑战。(1)合适的凝聚物质筛选困难：对于仅使用一种凝聚材料形成的简单凝聚体，还没有明确的设计规律来指导其合成；对于两种及以上凝聚材料所形成的复合凝聚体，物质的电荷密度、电荷长度、分子量和亲疏水性等固有属性均可能影响其相互作用，从而使其不发生相分离(保持均相溶液)或发生液固相分离(析出沉淀)，这为筛选仅发生LLPS的凝聚材料带来了极大的挑战。(2)生理稳定的凝聚体液滴的制备条件苛刻：在制备凝聚体时，外部环境因素包括酸碱度、温度和离子强度等，特别是离子强度，会对凝聚体的形成产生影响。当离子强度逐渐增加时，物质可能从固体聚集体转变为凝聚体液滴，最终形成均相溶液。一旦离子强度高于凝聚体的临界盐浓度，凝聚体将会解聚，从而转变为均匀的溶液。虽然有些凝聚体在低盐浓度下是稳定的，但它们仍然会在转移到高于临界盐浓度的溶液时解聚。目前，一些常见的凝聚液滴的临界盐浓度低于生理盐条件。(3)凝聚体的自融合特性：由于凝聚体固有的无膜特性使其发生自身融合，悬浮的凝聚体液滴在几分钟至几小时内聚集成大块的凝聚相，促成了凝聚体的不稳定性并限制了其给药途径。因此，为了使凝聚体能够更好地发挥其生物学应用的潜力，需要针对上述问题开展更为深入的研究，并探索解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，以克服现有技术中的凝聚体的稳定性不佳的技术问题，并实现其在生物体内的应用。本发明由聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐/脱氧核糖核酸通过LLPS所形成的复合凝聚体在生理盐浓度、pH和温度下具有的良好稳定性；且其可在不使用有机溶剂的条件下快速高效地包载物理化学性质多样的治疗药物，包括小分子、生物大分子和纳米粒等。通过改良的薄膜水化法，在复合凝聚体液滴表面覆盖磷脂膜，制备出具有类细胞膜和类细胞质结构的人造细胞。磷脂膜不仅能阻止复合凝聚体聚集，增加其结构稳定性和生物相容性，另外，聚乙二醇化磷脂膜还能在生物体内减少内皮网状系统的识别，从而延长人造细胞体循环时间，有效保护药物活性。
根据本发明第一方面，提供了一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将正电性溶液与负电性溶液进行混合，所述正电性溶液为聚赖氨酸溶液或ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液，所述负电性溶液为脱氧核糖核酸溶液；通过发生液液相分离，得到凝聚体液滴混悬液；
(2)将磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后进行真空旋转蒸发，直至有机溶剂挥发，得到脂质膜；
(3)将步骤(1)得到的凝聚体液滴混悬液加入步骤(2)得到的脂质膜中进行水化，直至所述脂质膜完全溶散，即得到所述基于复合凝聚体的功能化人造细胞；
其中，步骤(1)中所述正电性溶液、步骤(1)中所述负电性溶液以及步骤(2)中磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后得到的溶液中至少一种溶液含有功能成分。
优选地，所述正电性溶液和所述负电性溶液中含有的功能成分为酶类、小分子药物、多肽类药物、蛋白类药物、核酸类药物、纳米颗粒和生物囊泡中的至少一种。
优选地，所述磷脂上连接有药物或活性成分；
优选地，步骤(2)中，所述磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后，还包括向所得溶液中加入脂溶性的酶类、小分子药物、多肽类药物和蛋白类药物中的至少一种。
优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为(0.05-20):1。
优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为(0.2-10):1；
优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为(2.6-10):1。
优选地，所述正电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-6mg/mL，所述负电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-6mg/mL。
优选地，所述酶类为尿酸酶和过氧化氢酶。
根据本发明另一方面，提供了任意一项方法制备得到的基于复合凝聚体的功能化人造细胞。
根据本发明另一方面，提供了所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞用于制备药物递送系统的应用。
优选地，所述药物递送系统为高尿酸血症药物递送系统。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明成功克服了传统凝聚体液滴在药物递送中的挑战，筛选出的正电荷溶液和负电荷溶液具有合适的电荷性质，可制备具有生理稳定性的凝聚体液滴，有效解决现有的常规凝聚体无法在生物体内应用的局限。
(2)本发明提供的凝聚体液滴可快速且高效浓缩各类性质的生物活性成分，包括小分子药物、生物大分子药物和纳米粒，显著提高了药物装载成功率及包封效率，为多种疾病的联合治疗策略提供了更为广阔的前景。
(3)本发明提供的凝聚体液滴在封装各类活性成分时，不需要额外的使用有机溶剂和表面活性剂等，避免了有毒物质的引入，减少了对生物体的潜在危害，同时为制备工艺的监管和质量控制提供了便利。
(4)本发明通过在凝聚体表面引入聚乙二醇化的磷脂膜，成功提升了凝聚体的生物相容性和稳定性，解决常用复合凝聚体生理盐浓度不稳定，及诱发溶血的关键问题。所构建的人造细胞具有类细胞膜和类细胞质结构，更为接近真实生物细胞的构型，且在类细胞膜结构和类细胞质结构上均可进行功能化修饰，能够适应多样化的研究和应用需求。
(5)本发明提供的凝聚体液滴其制备方法具备简捷性，操作流程简单明了，制备过程耗时短，条件可控，因而具有高效生产的潜力。
(6)本发明优选地，功能化人造细胞能够简便地将尿酸酶和过氧化氢酶的循环催化系统限制在人造细胞内部，在有效降解尿酸的同时能够同步清除过氧化氢，减少过氧化氢对机体的伤害，在治疗高尿酸血症和减少肾脏损伤方面展现出明显优势。
附图说明
图1为实施例1制备的不同比例和不同浓度下聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体的浊度密度图。
图2为实施例2中优化复合比例后聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体的表面电荷性质和粒径大小。
图3为实施例3中聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体的形貌特征。
图4为实施例3中聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体在不同氯化钠浓度、pH和温度下的稳定性。
图5为实施例3中聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体内部的流动性确证。
图6为实施例6中聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体浓缩各类分子的荧光图像。
图7为实施例7中人造细胞的荧光图像。
图8-9为凝聚体和人造细胞的生物相容性研究；其中，图8凝聚体与人造细胞的溶血特性对比，图9为凝聚体与人造细胞的溶血特性对比。
图10为实施例10所制备的功能化人造细胞为循环催化系统所提供的空间限制在存在尿酸的条件下对细胞免受过氧化氢杀伤的保护效应。
图11为按照实施例7制备得到不含活性成分的人造细胞ArtPC组，按照实施例10制备得到含尿酸酶和过氧化氢酶的人造细胞Uri/Cat@ArtPC组，游离的尿酸酶和过氧化氢酶Uri/Cat组以及生理盐水Saline组在高尿酸血症小鼠中的降尿酸效果和缓解肾脏损伤的效果的评估。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将正电性溶液与负电性溶液进行混合，所述正电性溶液为聚赖氨酸溶液或ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液，所述负电性溶液为脱氧核糖核酸溶液；通过发生液液相分离，得到含有功能成份的凝聚体液滴混悬液；液液相分离的主要驱动力为静电相互作用；
(2)将磷脂溶于有机溶剂，得到磷脂溶液，然后进行真空旋转蒸发，直至有机溶剂挥发，得到脂质膜；
(3)将步骤(1)得到的凝聚体液滴混悬液加入步骤(2)得到的脂质膜中水化，直至所述脂质膜完全溶散，即得到所述基于复合凝聚体的功能化人造细胞；
所述正电性溶液、所述负电性溶液和所述磷脂溶液中至少一种含有功能成分。
一些实施例中，ε-聚赖氨酸盐酸盐和聚赖氨酸的分子量1000-20000Da。
一些实施例中，配置聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的溶液包括超纯水、氯化钠溶液、葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Hank's平衡盐溶液和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
一些实施例中，有机溶剂为三氯甲烷。
一些实施例中，所述凝聚体液滴的浓度为1mg/mL-10mg/mL，所述的聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比为20:1-1:20。
一些实施例中，步骤(2)中，所述磷脂还包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酸(DOPA)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)。
一些实施例中，步骤(2)中，所述聚乙二醇化磷脂还包括聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)、聚乙二醇化二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE-PEG)和聚乙二醇化十四酰磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG)。
一些实施例中，步骤(2)中，使用功能化修饰后的磷脂。
一些实施例中，步骤(3)中所述水化为采用旋转蒸发仪旋转水化，或在磁力搅拌器上搅拌水化。
一些实施例中，步骤(2)中，聚赖氨酸和脱氧核糖核酸所形成的凝聚体液滴表面为正电荷，即聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比大于2.4。
本发明的复合凝聚体以及基于复合凝聚体的功能化人造细胞用于制备药物递送系统的应用。
一些实施例中，本发明中，进一步将尿酸酶和过氧化氢酶包载进人造细胞内，其可在生物体内参与简单的代谢反应，有效降低高尿酸小鼠血尿酸水平并改善肾脏损伤。该基于复合凝聚体的功能化人造细胞具有良好的生理稳定性和生物相容性，易于在类细胞质的凝聚体内腔和类细胞膜的磷脂外膜进行功能化修饰，可广泛地在人造细胞和药物递送领域中应用。
以下为具体实施例
实施例1
本实施例对聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的凝聚浓度和比例进行了筛选，具体过程包括：将等质量浓度的聚赖氨酸和脱氧核糖核酸分别溶解于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，配置的浓度依次为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL和6mg/mL，按照图1中的质量比将等质量浓度的聚赖氨酸溶液和脱氧核糖核酸溶液进行混合，观察溶液立即变浑浊并使用全自动多功能酶标仪检测溶液的浊度初步确定是否形成凝聚体。根据图1的浊度等高线图显示凝聚材料的浓度和比例调节LLPS的发生。聚赖氨酸溶液和脱氧核糖核酸溶液的浓度在2-6mg/mL，聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比为10:1-1:5时溶液浊度均大于50％，可以充分形成凝聚体。
实施例2
按照实施例1中的方法，选用2mg/mL的聚赖氨酸溶液和脱氧核糖核酸溶液，对聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的凝聚质量比例进行了进一步优化。在聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比为1:1-3:1的范围内采用动态光散射粒度仪考察凝聚体液滴的粒径大小和电位。如图2显示，聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比在2.2:1-2.4:1范围内形成等电点凝聚体。当聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比大于等于2.6时，可制备稳定的正电荷凝聚体液滴。该正电荷凝聚体更适合于后续磷脂膜的覆盖。
实施例3
按照实施例2中的方法，制备最接近等电点的正电荷凝聚体，即聚赖氨酸和脱氧核糖核酸的质量比为2.6:1。将该正电荷凝聚体置于24孔细胞培养板中于白光显微镜下观察形貌。如图3所示，正电荷凝聚体成明亮的圆形气泡样结构。
实施例4
按照实施例3中的方法，制备最接近等电点的正电荷凝聚体，并用全自动多功能酶标仪考察了不同离子强度、温度和pH条件下的浊度变化，以评估聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体的结构稳定性。如图4所示，凝聚体生理盐浓度、温度和pH下浊度无明显变化，说明凝聚体液滴在这些条件下稳定存在。
实施例5
按照实施例3中的方法，制备最接近等电点的正电荷凝聚体，采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对凝聚体进行染色使其在激光共聚焦显微镜下具有蓝色荧光，并进一步使用共聚焦显微镜进行荧光漂白后恢复检测，用以考察凝聚体内部的液体流动性质。如图5所示，在漂白前，镜下所示的两颗凝聚体具有均匀分布的荧光强度。经光漂白后，右侧液滴上部荧光发生淬灭。其中，该正电荷凝聚体的恢复半衰期为4.453±0.294秒。证实凝聚体具备液体流动性质而非固态，从而荧光分子可在液滴内部扩散，荧光强度得以恢复。
实施例6
选择阿霉素、异硫氰酸荧光素、亚甲基蓝、异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白、磺基菁5标记的小干扰RNA和异硫氰酸荧光素标记的聚乳酸纳米粒作为代表荧光材料，评估液滴对各类物质的负载能力。配置阿霉素(368nM)、异硫氰酸荧光素(514nM)、亚甲基蓝(625nM)、异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(75nM)、Cy5-siRNA(2μM)和异硫氰酸荧光素标记的聚乳酸纳米粒(1mg/mL)的母液。将70μL负电荷或中性电荷荧光物质母液与1011μL聚赖氨酸溶液混合，再加入389μL脱氧核糖核酸溶液(2mg/mL)，制备凝聚体。相反，将正电荷荧光物质母液与脱氧核糖核酸溶液混合后，再加入聚赖氨酸溶液，制备凝聚体。如图6所示，微溶于水且带有正电荷的抗肿瘤药物阿霉素、微溶于水且带有负电荷的异硫氰酸荧光素、可溶于水且带有正电荷的亚甲基蓝、可溶于水且带有负电荷的生物大分子牛血清白蛋白，可溶于水且带有负电荷的生物大分子小干扰RNA以及纳米级颗粒均可以富集于聚赖氨酸/脱氧核糖核酸凝聚体中。因此，上述在理化性质上具有代表性的小分子物质、生物大分子物质以及纳米级颗粒均可负载在凝聚体中。
实施例7
按照实施例2中的方法，制备最接近等电点的正电荷凝聚体备用。将磷脂(80mol％DPPC和20mol％DSPE-PEG2000)溶解于三氯甲烷中，倒入圆底烧瓶中真空旋转蒸发30分钟制备磷脂薄膜。然后将凝聚体缓慢加入烧瓶底部，水化1小时。其中，磷脂与凝聚体的质量比为1:10。用移液枪将圆底烧瓶内的溶液轻轻转移至离心管中静置4小时。4小时后，将离心管置于离心机中，以3000rpm/min的转速离心10分钟后收集底部沉淀，重悬于磷酸盐缓冲液中，以此构建人造细胞。采用DAPI对凝聚体进行荧光标记，采用脂质红色荧光探针(DiI)对磷脂膜进行荧光标记。如图7所示，红色的环状荧光完整的圈套在蓝色的圆形荧光周围。对单个液滴进行逐层扫描后，获得人造细胞的3D重构图像。该图像证明了磷脂膜有效地包被在了凝聚体液滴表面，从而制备出了拥有类细胞质和类细胞膜结构的人造细胞。
实施例8
按照实施例1、实施例3和实例7制备凝聚体和人造细胞备用。取健康昆明小鼠全血500μL，置于肝素钠湿化的离心管中摇晃均匀。在4℃下以3000rpm/min的转速离心10min分离血浆和红细胞，同时从离心管底部收集红细胞，以避免上层的白细胞和血小板。用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，将红细胞加入到含有超纯水、生理盐水、不同浓度的凝聚体和人造细胞中，使每个样品中含有2％(w/v)的红细胞。样品于37℃恒温摇床孵育4小时后，以3000rpm/min的转速离心10min。将离心管中的上清液吸入96孔板，使用全自动多功能酶标仪测定540nm处吸光度，计算各样品溶血率。如图8所示，在5mg/mL的浓度下凝聚体的溶血率高达39.7±0.7％。相较于无膜的凝聚体，人造细胞的溶血率得到明显的改善。
实施例9
按照实施例1、实施例3和实例7制备凝聚体和人造细胞备用。通过MTT法检测凝聚体和人造细胞对树突状细胞和静脉内皮细胞活力的影响，在细胞水平评价凝聚体和人造细胞的安全性。将两种细胞以每孔104个的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL完全培养基。培养12小时后，更换为含不同浓度凝聚体或人造细胞的空白培养基。继续培养24小时后，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，在培养箱中继续培养4小时。每孔缓慢吸除培养基，然后加入150μL二甲基亚砜。待底部紫色晶体完全溶解后，检测各孔在490nm处的吸光度。如图9所示，在浓度达到500μg/mL后,凝聚体对树突状细胞和静脉内皮细胞均产生杀伤作用，细胞存活率低于85％。当浓度范围升至1000μg/mL时，人造细胞没有造成使两种细胞的存活率下降，而此时凝聚体可以使接近半数的细胞死亡。因此，膜化后的凝聚体，即人造细胞具有更好的生物相容性。
实施例10
按照实施例7的方法，制备人造细胞(命名为ArtPC)。在聚赖氨酸溶液中加入尿酸酶(Uri)和过氧化氢酶(Cat)后，再与脱氧核糖溶液混合制备凝聚体。将富集有尿酸酶和过氧化氢酶的凝聚体液滴按照实施例7的方法制备具有分解尿酸并清除过氧化氢功能的人造细胞，即为基于复合凝聚体的功能化人造细胞(命名为Uri/Cat@ArtPC)。
实施例11
按照实施例7的方法，制备基于复合凝聚体的功能化人造细胞Uri/Cat@ArtPC。通过MTT法检测尿酸分解的副产物过氧化氢对树突状细胞和静脉内皮细胞活力的影响。以每孔104个的密度将两种细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL完全培养基。继续培养12小时，向两种细胞中加入含有尿酸或不含尿酸的培养基后，进行以下5组处理：培养基(阴性对照组Saline)、过氧化氢(阳性对照组H2O2)、Uri、游离的Uri和Cat(命名为Uri/Cat)和Uri/Cat@ArtPC。继续培养24小时后，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，在培养箱中继续培养4小时。每孔缓慢吸除培养基，然后加入150μL二甲基亚砜。待底部紫色晶体完全溶解后，检测各孔在490nm处的吸光度计算各组的细胞活力。如图10所示，在无尿酸条件下，与Saline组和Uri/Cat@ArtPC组相比，游离Uri组和Uri/Cat组细胞活力略有下降，这可能是由于这些剂量的异源蛋白Uri和Cat的毒性所致。ArtPC对Uri和Cat的封装可降低其毒性。在尿酸存在的情况下，Uri组的细胞毒性与阳性对照组H2O2组相似。而游离的Uri/Cat组仅能轻微提高细胞活力，Uri/Cat@ArtPC组能有效保护细胞免受过氧化氢损伤。虽然Cat可以分解尿酸降解的副产物过氧化氢，但Uri/Cat组与Uri/Cat@ArtPC组相比并没有达到预期的保护效果。因此，使用ArtPC作为Uri载体并进一步装载Cat可有效提供空间限制，提高治疗的安全性。
实施例12(高尿酸血症的治疗)
采用含次黄嘌呤500mg/kg和氧嗪酸钾1000mg/kg的0.5％羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃的方法建立昆明小鼠高尿酸血症模型。高尿酸血症模型构建成功后，各组给予相关药物治疗。分组如下：(1)健康小鼠给予生理盐水处理命名Saline组。(2)高尿酸小鼠用生理盐水治疗命名为Model组。(3)高尿酸小鼠用ArtPC治疗命名为ArtPC组。(4)高尿酸小鼠用游离的Uri和Cat治疗命名为Uri/Cat组。(5)高尿酸小鼠接受Uri/Cat@ArtPC指定Uri/Cat@ArtPC(保证Uri和Cat含量一致)。整个实验期间测量小鼠体重，根据每只小鼠体重计算静脉注射量。分别于第7、9、11、13天尾尖采血，采用EA-11尿酸检测仪(检测下限为180μM)测定血尿酸浓度。实验结束后，解剖小鼠的肾脏，进行苏木素-伊红染色。如图11所示，ArtPC组和model组的检测时的血尿酸水平始终维持在600μmol/L以上。在第11天时，Uri/Cat组和Uri/Cat@ArtPC组的水平可分别降至481±53μmol/L和302±71μmol/L。在13天，Uri/Cat@ArtPC组的血尿酸水平已经显著低于Uri/Cat组，与健康小鼠无显著性差异。苏木素-伊红染色显示Saline组肾实质区正常，肾小管上皮细胞完整，管腔间隙正常，无炎症细胞浸润和坏死的迹象。相比之下，在模型组中肾小管结构消失，伴有极为明显的管腔扩张和上皮细胞萎缩，偶见细胞核消失。肾小囊壁层细胞扁平并伴有肾小囊腔的间隙扩大。ArtPC组肾脏损伤程度与Model组相似，未见改善。Uri/Cat治疗组肾小管管腔扩张程度减小，但管腔内有粉色无结构物质。Uri/Cat@ArtPC治疗组管腔仅轻微扩张并保留了完整的肾小管结构。因此本发明中的基于复合凝聚体的功能化人造细胞具备很高的应用价值和推广价值，尤其是作为生物药物递送平台，可进一步增加其治疗效果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将正电性溶液与负电性溶液进行混合，所述正电性溶液为聚赖氨酸溶液或ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液，所述负电性溶液为脱氧核糖核酸溶液；通过发生液液相分离，得到凝聚体液滴混悬液；
(2)将磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后进行真空旋转蒸发，直至有机溶剂挥发，得到脂质膜；
(3)将步骤(1)得到的凝聚体液滴混悬液加入步骤(2)得到的脂质膜中进行水化，直至所述脂质膜完全溶散，即得到所述基于复合凝聚体的功能化人造细胞；
其中，步骤(1)中所述正电性溶液、步骤(1)中所述负电性溶液以及步骤(2)中磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后得到的溶液中至少一种溶液含有功能成分。
2.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，所述正电性溶液和所述负电性溶液中含有的功能成分为酶类、小分子药物、多肽类药物、蛋白类药物、核酸类药物、纳米颗粒和生物囊泡中的至少一种。
3.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，所述磷脂上连接有药物或活性成分；
优选地，步骤(2)中，所述磷脂和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂后，还包括向所得溶液中加入脂溶性的酶类、小分子药物、多肽类药物和蛋白类药物中的至少一种。
4.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为(0.05-20):1。
5.如权利要求4所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为(0.2-10):1；
优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为(2.6-10):1。
6.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，所述正电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-6mg/mL，所述负电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-6mg/mL。
7.如权利要求2或3所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞的制备方法，其特征在于，所述酶类为尿酸酶和过氧化氢酶。
8.如权利要求1-7任意一项方法制备得到的基于复合凝聚体的功能化人造细胞。
9.如权利要求8所述的基于复合凝聚体的功能化人造细胞用于制备药物递送系统的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物递送系统为高尿酸血症药物递送系统。
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