CN118105344A

CN118105344A - 一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴、制备及其应用

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Publication number: CN118105344A
Application number: CN202410227647.1A
Authority: CN
Inventors: 张志平; 田尹梅; 胡倩
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2024-02-29
Filing date: 2024-02-29
Publication date: 2024-05-31

Abstract

本发明涉及一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴、制备及其应用，属于生物医药技术领域。制备方法为：将正电性溶液与负电性溶液进行混合，通过发生液液相分离，得到具有药物装载能力的凝聚体液滴混悬液；将肠溶包衣材料混悬液加入到凝聚体液滴混悬液中混合，即得到结肠靶向pH响应性凝聚微液滴；肠溶包衣材料需在pH＞7的环境下才能溶解，具有pH响应性。本发明所构建基于复合凝聚体的pH响应性凝聚微液滴具有胃肠极端生理环境稳定性、生物相容性和结肠靶向功能。

Description

一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴、制备及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴、制备及其应用。

背景技术

液-液相分离(Liquid-liquid phase separation，LLPS)是均匀的液相通过相互作用(电荷-电荷、氢键或π-π堆积等)分离成两个或多个不同组分的不混相液相的现象。复合凝聚体是两种带相反电荷的高分子聚合物在溶剂中发生液-液相分离，形成的一种高密度的聚电解质液体，其以球形液滴的形式存在。自20世纪中期发现凝聚体以来，凝聚体的研究主要聚焦于食品科学和合成细胞学上，尤其是仿生细胞和无膜细胞器，以探索生命的奥秘。通过在水性介质中简单的自组装，可以用不同的原材料容易地制备凝聚体，并自发富集小分子和生物大分子。因此，利用这些有利特性，最近的研究初步探讨了凝聚体在药物递送中的应用。此外，与广泛研究的载体如脂质体、微粒和纳米颗粒相比，凝聚层在装载药物时不需要有机溶剂或表面活性剂，这显著保护了药物的活性。这种成分简单、制备容易的特性对规模化生产中的工艺流程和质量控制具有重大意义。因此，开发具有生理稳定性和生物相容性的基于凝聚体的药物载体有望推动合成生物学和制药领域的发展。

然而，凝聚体的生物学应用仍然面临着多方面挑战。(1)合适的凝聚物质筛选困难：对于仅使用一种凝聚材料形成的简单凝聚体，还没有明确的设计规律来指导其合成；对于两种及以上凝聚材料所形成的复合凝聚体，改变物质的电荷密度、分子量和亲疏水性能等固有属性均可能影响其相互作用从而不能发生相分离或析出沉淀产生固体，这为筛选仅发生LLPS的凝聚材料带来了极大的挑战。(2)生理稳定的凝聚体液滴的制备条件苛刻：在制备凝聚体时，外部环境因素包括酸碱度、温度和离子强度等，特别是离子强度，会对凝聚体的形成产生影响。当离子强度逐渐增加时，物质可能从固体聚集体转变为凝聚体液滴，最终形成均相溶液。一旦离子强度高于凝聚体的临界盐浓度，凝聚体将会解聚，从而转变为均匀的溶液。虽然有些凝聚体在低盐浓度下是稳定的，但它们仍然会在转移到高于临界盐浓度的溶液时解聚。目前，一些常见的凝聚液滴的临界盐浓度低于生理盐条件。(3)凝聚体的自融合特性：由于凝聚体固有的无膜特性使其发生自身融合，随着时间的延长，凝聚体在介质中会聚集在一起，不能保持均匀分散的状态。因此，为了使凝聚体能够更好地发挥其生物学应用的潜力，需要针对上述问题开展更为深入的研究，并探索解决方案。

溃疡性结肠炎是发生在结肠的特发性肠道炎症性疾病。2023年，全球溃疡性结肠炎的患病人数预计达到500万例，且在全球范围内的发病率也在不断上升。受累患者通常表现为直肠出血、腹泻和体重减轻，一些患者需要住院治疗，更严重者需要进行结肠切除术，该疾病严重影响着患者的生活质量。溃疡性结肠炎具有疾病的复发-缓解特征，其治疗目标是诱导和维持疾病的缓解期。因此，溃疡性结肠炎患者通常需要长期的治疗。但是，目前用于溃疡性结肠炎治疗的药物大多结肠靶向效果较差，多数口服药物在胃部会被破坏或吸收，导致最终到达结肠炎症部位的药物减少，不能达到有效药物浓度。因此，研发一种能抵抗胃肠道极端环境，并在结肠部位，即pH＞7的环境下响应性释放内部药物的递送载体对溃疡性结肠炎的长期口服治疗有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，以克服现有技术中的凝聚体的稳定性和靶向性较差的技术问题，并实现其在生物体内的应用。本发明由正电性溶液和负电性溶液通过LLPS形成的复合凝聚体在生理盐浓度、胃酸胃蛋白酶和37℃下具有良好稳定性；且其可在不使用有机溶剂的条件下快速高效地包载物理化学性质多样的治疗药物，包括小分子和生物大分子等。通过与肠溶材料混悬液混合来制备结肠靶向pH响应性凝聚微液滴。肠溶材料作为外壳不仅能阻止复合凝聚体聚集，增加其结构稳定性和生物相容性，还能减少药物在极端胃肠环境中的释放，有效保护药物活性，提高药物的靶向性。

根据本发明第一方面，提供了一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，包括以下步骤：

(1)将正电性溶液与负电性溶液进行混合，通过发生液液相分离，得到凝聚微液滴混悬液；

(2)将肠溶包衣材料溶解于酸性缓冲液中，得到肠溶包衣材料混悬液；将所述肠溶包衣材料混悬液加入到步骤(1)得到的凝聚微液滴混悬液中，充分混匀后，即得到结肠靶向pH响应性凝聚微液滴。

优选地，步骤(1)中，与所述正电性溶液与负电性溶液同时混合的还包括药物。

优选地，所述药物为中药活性成分、纳米颗粒、小分子药物、多肽类药物、蛋白类药物、核酸类药物和生物囊泡中的至少一种。

优选地，步骤(1)中，所述正电性溶液为DEAE-葡聚糖溶液，所述负电性溶液为聚对苯乙烯磺酸钠溶液、硫酸软骨素钠盐溶液或聚丙烯酸溶液。

优选地，步骤(2)中，所述肠溶包衣材料为甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物尤特奇S100。

优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为1:(0.05 -4)；

优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为1:(0.125-2)；

优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为1:(0.25-2)；

优选地，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为1:(0.25-1)。

优选地，所述正电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-5mg/mL，所述负电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-5mg/mL。

优选地，步骤(2)中，所述肠溶包衣材料与凝聚微液滴的质量比为1:(5-20)。

根据本发明另一方面，提供了任意一项方法制备得到的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴。

根据本发明另一方面，提供了所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴用于制备药物递送系统的应用；

优选地，所述药物递送系统为溃疡性结肠炎药物递送系统。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明成功克服了传统凝聚体液滴在药物递送中的挑战，制备出了具有生理稳定性的凝聚体液滴，有效解决现有的常规凝聚体无法在生物体内应用的局限，可抵抗极端胃肠道环境，将治疗药物靶向递送至结肠病变部位。

(2)本发明提供的凝聚体微液滴可快速且高效负载各类性质的生物活性成分，包括小分子药物和生物大分子药物，显著提高药物装载及包封效率。

(3)本发明提供的凝聚体微液滴在封装各类活性成分时，不需要额外的使用有机溶剂和表面活性剂等，避免了有害物质的引入，减少了对生物体的潜在危害，同时为制备工艺的监管和质量控制提供了便利。

(4)本发明提供的凝聚体微液滴其制备方法具有简捷性，操作流程简单明了，制备过程耗时短，条件可控，因而具有高效生产的潜力。

(5)本发明优选地，通过在凝聚体表面引入尤特奇S100形成保护外壳，成功提升了凝聚体的生物相容性和稳定性，解决常用复合凝聚体生理盐浓度不稳定，易发生药物泄露等问题。

(6)本发明优选地，提供的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴将治疗药物大黄素靶向递送至溃疡性结肠炎的病变部位，到达结肠后外壳尤特奇S100溶解，凝聚微液滴缓慢释放药物，有效缓解溃疡性结肠炎症状，减少各种炎症因子对结肠的进一步损伤，同时还可以修复损伤的结肠上皮和调节肠道菌群平衡，在治疗溃疡性结肠炎和减少结肠损伤方面展现出明显优势。

附图说明

图1为实施例1制备的不同比例和不同浓度下DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚体的浊度密度图。

图2为实施例2中优化复合比例后DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚体电位。

图3为实施例3中DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚体的形貌特征和粒径大小。

图4为实施例3中DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚体在不同氯化钠浓度和pH下的稳定性。

图5为实施例3中DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚体内部的流动性确证。

图6为实施例6中DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚体装载各类分子的荧光图像。

图7为实施例7中结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的荧光图像。

图8为实施例8中凝聚体和结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的生物相容性研究。

图9为实施例9中凝聚体和结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的体外药物释放研究。

图10为实施例10中为凝聚体和结肠靶向pH响应性凝聚微液滴在体内的生物分布。

图11为按照实施例7制备得到不含尤特奇S100外壳的凝聚微液滴EMO@Coac组，按照实施例10制备得到含尤特奇S100外壳EMO@EU-Coac组，游离的大黄素组以及生理盐水Control组在溃疡性结肠炎小鼠中的缓解结肠炎症效果和降低结肠损伤的效果的评估。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明中一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，包括以下步骤：

(1)将正电性溶液与负电性溶液进行混合，优选地，所述正电性溶液为DEAE-葡聚糖溶液，所述负电性溶液为聚对苯乙烯磺酸钠溶液；通过发生液液相分离，得到具有药物装载能力的凝聚体微液滴混悬液；液液相分离的主要驱动力为静电相互作用；

(2)将肠溶包衣材料溶解于酸性的磷酸盐缓冲液中，以得到肠溶包衣材料混悬液；

(3)将步骤(2)得到的肠溶包衣材料混悬液加入到步骤(1)得到的凝聚体液滴混悬液，两种混悬液充分混合，即得到结肠靶向pH响应性凝聚微液滴；

所述肠溶包衣材料需在pH＞7的环境下才能溶解，结肠部位的pH为7.4，具有结肠靶向pH响应性。

一些实施例中，聚对苯乙烯磺酸钠的分子量70000Da。

一些实施例中，配置DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的溶液包括超纯水、氯化钠溶液、葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Hank's平衡盐溶液。

一些实施例中，所述凝聚体微液滴的浓度为1mg/mL-5mg/mL。

所述的DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为1:(0.05 -4)。

一些实施例中，步骤(2)中，所述肠溶包衣材料是甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯(1:2)共聚物尤特奇S100。

一些实施例中，步骤(3)中所述尤特奇S100与凝聚体微液滴的质量比为1:(5–20)。

本发明的复合凝聚体以及基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴用于制备药物递送系统的应用。

一些实施例中，本发明中，进一步将大黄素包载进结肠靶向pH响应性凝聚微液滴内，其可在生物体内有效缓解溃疡性结肠炎小鼠结肠损伤水平。该基于复合凝聚体的pH响应性凝聚微液滴具有良好的生理稳定性、生物相容性和结肠靶向能力，可广泛地在药物递送领域中应用。

以下为具体实施例

实施例1

本实施例筛选了DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的凝聚浓度和比例，具体过程包括：将等质量浓度的DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠分别溶解于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，配置的浓度依次为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL，按照图1中的质量比将等质量浓度的DEAE-葡聚糖溶液和聚对苯乙烯磺酸钠溶液进行混合，溶液立即变浑浊并使用全自动多功能酶标仪检测溶液的浊度初步确定是否形成凝聚微液滴。根据图1的浊度等高线图确定DEAE-葡聚糖溶液和聚对苯乙烯磺酸钠溶液的浓度在1-5mg/mL，DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为1:(0.05-4)时溶液均有浊度，该质量比范围内可形成凝聚微液滴。特别地，DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为1：(0.125-2)时溶液浊度大于50％，可以形成更多凝聚微液滴。

实施例2

按照实施例1中的方法，选用5mg/mL的DEAE-葡聚糖溶液和聚对苯乙烯磺酸钠酸溶液，对DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的凝聚质量比例进行了进一步优化。如图2所示，在DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为1:2–4:1的范围内采用动态光散射粒度仪考察凝聚微液滴的电位。

实施例3

按照实施例2中的方法，制备DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为2:1的凝聚微液滴。将该凝聚体置于共聚焦小皿中于共聚焦显微镜白光下观察形貌，并统计尺寸。如图3所示，DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚微液滴成明亮的球形气泡样结构，平均粒径为3.12±0.74微米。

实施例4

按照实施例3中的方法，制备DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为2:1的凝聚体，用全自动多功能酶标仪考察不同离子强度和pH条件下的浊度变化，以评估DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠的结构稳定性。如图4所示，凝聚微液滴在生理盐浓度和pH下浊度无明显变化，说明凝聚微液滴在这些条件下稳定存在。

实施例5

按照实施例3中的方法，制备DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为2:1的凝聚微液滴，采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对凝聚微液滴进行染色使其在激光共聚焦显微镜下具有蓝色荧光，并进一步使用共聚焦显微镜进行荧光漂白后恢复实验，用以考察凝聚微液滴内部的液体流动性质。如图5所示，在漂白前，镜下所示的两颗凝聚微液滴具有均匀分布的荧光强度。经光漂白后，左下侧液滴上部荧光发生淬灭，21秒后可完全恢复。其中，该凝聚微液滴的恢复半衰期为3.66±0.66秒。证实凝聚微液滴具备液体流动性质而非固态，从而荧光分子可在液滴内部扩散，荧光强度得以恢复。

实施例6

选择罗丹明B、香豆素6、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、异硫氰酸荧光素和罗丹明B标记的牛血清白蛋白作为代表荧光材料，评估液滴对各类物质的负载能力。配制罗丹明B(5mg/mL)、香豆素6(5mg/mL)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(5mg/mL)、异硫氰酸荧光素(5mg/mL)和罗丹明B标记的牛血清白蛋白(5mg/mL)的母液。将1μL荧光物质母液与600μL DEAE-葡聚糖溶液混合，再加入300μL聚对苯乙烯磺酸钠溶液(5mg/mL)，制备凝聚微液滴。如图6所示，可溶于水的罗丹明B、微溶于水的香豆素6、微溶于水的4',6-二脒基-2-苯基吲哚、微溶于水的异硫氰酸荧光素、可溶于水的罗丹明B标记的牛血清白蛋白均可以富集于DEAE-葡聚糖/聚对苯乙烯磺酸钠凝聚微液滴中。因此，上述在理化性质上具有代表性的小分子物质、生物大分子物质、可溶性分子以及难溶性分子均可负载在凝聚微液滴中。

实施例7

按照实施例3中的方法，制备DEAE-葡聚糖和聚对苯乙烯磺酸钠的质量比为2:1的凝聚微液滴备用。将肠溶包衣材料溶解于pH 5.5的磷酸盐缓冲液中，以得到肠溶包衣材料混悬液。肠溶包衣材料混悬液加入凝聚体液滴混悬液，两种混悬液充分混合，即得到结肠靶向pH响应性凝聚微液滴。其中，肠溶包衣材料与凝聚微液滴的质量比为1:20。采用DAPI对凝聚微液滴进行荧光标记，采用异硫氰酸荧光素(FITC)对肠溶包衣材料进行荧光标记。如图7所示，绿色的环状荧光较完整的圈套在蓝色的圆形荧光周围。对单个液滴进行逐层扫描后，获得结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的3D重构图像。该图像证明了肠溶包衣材料有效地包被在了凝聚微液滴表面，从而制备出了拥有外壳结构的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴。

实施例8

按照实施例1、实施例3和实施例7制备凝聚体和结肠靶向pH响应性凝聚微液滴备用。通过MTT法检测凝聚体和结肠靶向pH响应性凝聚微液滴对巨噬细胞和结肠上皮细胞活力的影响，在细胞水平评价凝聚体和pH响应性凝聚微液滴的安全性。将两种细胞以每孔10⁴个的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL完全培养基。培养12小时后，更换为含不同浓度凝聚体或结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的完全培养基。继续培养24小时后，每孔加入10μLMTT(5mg/mL)，在培养箱中继续培养4小时。每孔缓慢吸除培养基，然后加入150μL二甲基亚砜。待底部紫色晶体完全溶解后，检测各孔在490nm处的吸光度。如图8所示，膜化后的凝聚体，即结肠靶向pH响应性凝聚微液滴具有更好的生物相容性。

实施例9

按照实施例1和实施例3制备凝聚体(命名为Coac)。在制备的凝聚体中加入大黄素溶液，静置4小时得到富集大黄素的凝聚微液滴(命名为EMO@Coac)。将富集有大黄素的凝聚微液滴按照实施例7的方法制备具有结肠靶向能力的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴(命名为EMO@EU-Coac)。使用透析法考察EMO@EU-Coac中大黄素在模拟胃肠液中的释放。通过调节磷酸盐缓冲液的pH形成模拟胃液(pH 1.2)、模拟小肠液(pH 6.8)和模拟结肠液(pH 7.4)，得到释放介质。在释放介质中加入1％吐温80(w/v)以增加大黄素的溶解度。将1mL的EMO@Coac和EMO@EU-Coac分别加入到透析袋中(MWCO 3500)，透析袋放入装有10mL释放介质的离心管中，离心管置于37℃、100rpm的摇床中。释放介质按照以下时间更换：0～2小时(模拟胃液)、2～6小时(模拟小肠液)、6～96小时(模拟结肠液)。在第1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96小时各取2mL释放介质用于检测大黄素的释放量，同时去除原有的释放介质，加入10mL新鲜释放介质。采用高效液相色谱法检测大黄素的释放量，并计算大黄素的累计释放量。如图9所示，膜化后的凝聚体，即结肠靶向pH响应性凝聚微液滴可避免药物在胃和小肠中的释放，能将大量药物递送至结肠部位。

实施例10

采用染料吲哚菁绿(ICG)作为荧光示踪剂进行分布研究。对20～21g的C57BL/6雄性小鼠通过灌胃方式连续6天给予剂量为4g/kg的硫酸葡聚糖钠盐，形成急性溃疡性结肠炎小鼠模型。第7天时，将老鼠随机分为3组(命名为Free ICG组，ICG@Coac组，ICG@EU-Coac组)，然后以吲哚菁绿为20μg/只的剂量灌胃给药，在灌胃后2、6、12、24小时使用近红外小动物活体成像仪进行活体荧光成像拍摄。并在6、12和24小时对小鼠进行解剖，取胃至结肠的末端段，获得小鼠的离体荧光成像。如图10所示，在相同的给药条件下，游离ICG在胃肠道保留时间最短，第6小时时荧光明显减弱。第12小时时，ICG@Coac组的荧光信号显著低于ICG@EU-Coac组。给药24小时后，ICG@EU-Coac组在结肠部位还能观察到明显的荧光信号，说明ICG@EU-Coac能在肠道滞留更长时间。同时因为尤特奇S100的存在，更多的ICG被递送到结肠部位，使得ICG@EU-Coac组在各个时间点的荧光强度均强于另外两组。

实施例11(急性溃疡性结肠炎的治疗)

对20～21g的C57BL/6雄性小鼠通过灌胃方式连续6天给予剂量为4g/kg的硫酸葡聚糖钠盐，形成急性溃疡性结肠炎小鼠模型。从第4天开始给予相关药物治疗，并选用临床一线药物5-氨基水杨酸作为阳性对照药物,大黄素的剂量为10mg/kg/d,5-氨基水杨酸的剂量为200mg/kg/d。分组如下：(1)健康小鼠给予磷酸盐缓冲液处理命名Control组。(2)溃疡性结肠炎小鼠用磷酸盐缓冲液治疗命名为Model组。(3)溃疡性结肠炎小鼠用游离大黄素治疗命名为EMO组。(4)溃疡性结肠炎小鼠用Coac治疗命名为Coac组。(5)溃疡性结肠炎小鼠用EMO@Coac治疗命名为EMO@Coac组。(6)溃疡性结肠炎小鼠用EU-Coac治疗命名为EU-Coac组。(7)溃疡性结肠炎小鼠用EMO@EU-Coac治疗命名为EMO@EU-Coac组。(8)溃疡性结肠炎小鼠用5-氨基水杨酸治疗命名为5-ASA组。整个实验期间测量小鼠体重，监测小鼠活动状态，用疾病健康指数DAI表示小鼠活动状态。实验结束后，解剖小鼠的结肠，进行长度测量。如图11所示，与Control组相比，Model组小鼠的结肠明显减短(7.34±0.65cm vs.4.07±0.21cm)，这表明UC模型的成功建立。与其他组相比，EMO@EU-Coac明显改善了小鼠结肠缩短(各组结肠长度为EMO@EU-Coac组：7.00±0.52cm；EMO组：5.64±0.76cm；Coac组：4.89±0.30cm；EMO@Coac组：5.90±0.48cm；EU-Coac组：4.74±0.22cm；5-ASA组：5.87±0.72cm)。在体重变化方面，Model组在10天后体重下降了32％，EMO@EU-Coac组的老鼠体重从第8天开始不再降低，同时还有较明显的升高，其他治疗组均未出现体重升高的趋势。EMO@EU-Coac组的老鼠DAI增长速度明显低于模型组和其他治疗组，在第8天时DAI开始下降。结肠长度、体重变化和DAI评分均说明EMO@EU-Coac对小鼠的溃疡性结肠炎症状具有一定的缓解作用。因此本发明中的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴具备很高的应用价值和推广价值，尤其是作为生物药物递送平台，可进一步增加其治疗效果。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，与所述正电性溶液与负电性溶液同时混合的还包括药物。

3.如权利要求2所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，所述药物为中药活性成分、纳米颗粒、小分子药物、多肽类药物、蛋白类药物、核酸类药物和生物囊泡中的至少一种。

4.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述正电性溶液为DEAE-葡聚糖溶液，所述负电性溶液为聚对苯乙烯磺酸钠溶液、硫酸软骨素钠盐溶液或聚丙烯酸溶液。

5.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述肠溶包衣材料为甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物尤特奇S100。

6.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，所述正电性溶液中的溶质和所述负电性溶液中的溶质的质量比为1:(0.05-4)；

7.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，所述正电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-5mg/mL，所述负电性溶液中溶质的浓度为1mg/mL-5mg/mL。

8.如权利要求1所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述肠溶包衣材料与凝聚微液滴的质量比为1:(5-20)。

9.如权利要求1-8任意一项方法制备得到的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴。

10.如权利要求9所述的基于复合凝聚体的结肠靶向pH响应性凝聚微液滴用于制备药物递送系统的应用；

优选地，所述药物递送系统为溃疡性结肠炎药物递送系统。